CN108034741A - 一种双芽巴贝斯虫巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法 - Google Patents

一种双芽巴贝斯虫巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对双芽巴贝斯虫的RAP‑1为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术在诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫时，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于牛双芽巴贝斯虫病精准检测，应用前景广阔。

Description

一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式 PCR检测方法
技术领域
本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法。
背景技术
牛双芽巴贝斯虫是一类经蜱传播，红细胞内寄生的血液原虫，由该类寄生虫引起的巴贝斯虫病，是一种急性过程的季节性疾病，在世界上许多地区发生和流行，我国各地也常有发生，给畜牧业和国民经济造成巨大损失。牛感染该虫后，常出现贫血、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状，严重影响牛的健康。该病已经造成了巨大的经济损失，并呈世界范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。牛双芽巴贝斯虫是经蜱传播的一种血液原虫，寄生于哺乳动物红细胞、淋巴细胞和其他细胞中，也可以寄生在蜱的各种组织细胞中。双芽巴贝斯虫寄生于黄牛、奶牛、水牛和瘤牛的红细胞内，由微小牛蜱和扇头蜱等多种蜱经卵传播。双芽巴贝斯虫的临床诊断最基本的方法是血液涂片镜检，但是该方法只能用于对发病牛的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难，因为发病牛只痊愈后很难查到虫体。血清学检查也是牛双芽巴贝斯虫流行病学研究行之有效的方法，但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过，不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。敏感性更高的方法，例如常规PCR 检测技术也是诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点-低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内双芽巴贝斯虫含量较低时容易漏检。而且在检测牛双芽巴贝斯虫的过程中发现，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性和特异性更高的方法，例如反向线性斑点杂交技术(RBL)以及PCR-ELISA等也已经见诸于报道，但是这些方法都存在假阳性率高的缺点。
巢式PCR使用两套引物通过两轮PCR反应扩增靶基因DNA片段，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物结合在第一次PCR产物内部，反应特异性强、敏感性高。nPCR检测技术已广泛应用于病原体检测。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种双芽巴贝斯虫巢式 PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，建立一种精准、高效、实用的DNA检测方法。针对双芽巴贝斯虫的RAP-1为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，提供了一种双芽巴贝斯虫的nPCR特异性引物及检测试剂盒与nPCR检测方法，该方法可用于牛双芽巴贝斯虫病精准检测，应用前景广阔。
该方法可用于双芽巴贝斯虫病流行病学调查及快速检测。
本发明采用的技术解决方案是：一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：
引物BF1：5＇-CAT-CTA-ATT-TCT-CTC-CAT-ACC-CCT-CC-3′；
引物BR1：5＇-CCT-CGG-CTT-CAA-CTC-TGA-TGG-CAA-AG-3′；
引物BF2：5′-CGC-AAG-CCC-AGC-AGG-CCC-CGG-TGC-3′；
引物BR2：5′-CCG-ACC-TGG-ATA-GGC-TGT-GTC-ATG-3′。
一种双芽巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：
(一)权利要求1所述的两对特异性引物；
(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含双芽巴贝斯虫405bp基因片段；
(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；
(四)Taq酶。
所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。
一种双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)被检标本DNA提取：取微小牛蜱和扇头蜱数只，酒精清洗，每只蜱放入单独的1.5ml EP dof管，200μL PBS液浸没蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；
(2)以权利要求1中的外引物F1、R1扩增：在EP dof管中加入处理后的蜱标本DNA，同时设阴、阳性对照，10×PCR Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶， 25pmol/μL BF1，25pmol/μLBR1，DNA模板，ddH2O混匀后稍离心的50μL反应体系中进行第一轮PCR；
(3)以权利要求1中的内引物F2、R2扩增：以第一轮PCR产物DNA为模板，以F2、R2为第二套引物，在10×PCR Buffer 5μL，Mgcl22μL，dNTP 4μL，Taq酶0.5μL，25pmol/μL BF21μL，25pmol/μL BR2 1μL，DNA模板 2μL，ddH2O 34.5μL混匀后稍离心的50μL反应体系进行第二轮PCR；
(4)PCR产物鉴定：取第二轮PCR产物2μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(5)测序：将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。
所述的步骤(2)中的第一轮PCR反应条件为：
95℃预热5min；
95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；
末次延伸至72℃，保持10min。
所述的步骤(2)中的第二轮PCR反应条件为：
95℃预热5min；
95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；
末次延伸至72℃，保持10min。
所述的步骤(2)中第一轮PCR50μL反应体系中蜱样品基因组DNA模板量为5μl，10×PCR Buffer为5μL，Mgcl2为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为 0.5μL，25pmol/μL BF1为1μL，25pmol/μL BR1为1μL，ddH2O为31.5μL。
所述的步骤(4)中第二轮PCR50μL反应体系中第一轮PCR产物DNA模板量为2μl，10×PCR Buffer为5μL，Mgcl2为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为 0.5μL，25pmol/μL BF21μL，25pmol/μL BR2为1μL，ddH2O为34.5μL。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对双芽巴贝斯虫的RAP-1为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术在诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫时，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于牛双芽巴贝斯虫病精准检测，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明方法对RAP-1第一轮(由外引物扩增)PCR和第二轮(由内引物扩增)PCR产物的凝胶电泳图，其中1为BF1和BR1 PCR扩增结果； 2位BF2和BR2PCR扩增结果。
图2为巢式PCR敏感性试验结果。
图3为巢式PCR特异性试验结果。
基因序列表为RAP-1基因巢式PCR产物的测序结果，共172bp。
具体实施方式
设置巢式PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：
(1)EP dof管：反应管内含10×PCR Buffer、脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)、氯化镁(Mgcl2)。
(2)引物F1、引物R1、引物F2、引物R2。引物F1、引物R1、引物F2、引物R2分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段：
引物BF1：5＇-CAT-CTA-ATT-TCT-CTC-CAT-ACC-CCT-CC-3′；
引物BR1：5＇-CCT-CGG-CTT-CAA-CTC-TGA-TGG-CAA-AG-3′；
引物BF2：5′-CGC-AAG-CCC-AGC-AGG-CCC-CGG-TGC-3′；
引物BR2：5′-CCG-ACC-TGG-ATA-GGC-TGT-GTC-ATG-3′。
(3)阳性对照：该对照为含有目的基因片段的重组质粒，由本实验室构建。其方法是：将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒含双芽巴贝斯虫405bp基因片段。
(4)阴性对照，该对照为去离子水(ddH2O)；
(5)Taq酶。
操作程序：
(1)被检标本DNA提取：取蜱虫数只，75％的酒精清洗，每只蜱虫放入单独的1.5mlEP dof管，200μL PBS液浸没蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA TE)溶解，-20℃保存备用；
(2)外引物BF1、BR1扩增：在EP dof管中加入处理后的标本DNA，同时设阴、阳性对照，50μL反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，Mgcl2(25mM) 2μL，dNTP(2.5mM)4μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，25pmol/μL BF1 1μL， 25pmol/μL BR1 1μL，DNA模板5μL，ddH2O31.5μL，混匀后稍离心。
扩增条件为：
(3)内引物BF2、BR2扩增：以第一轮PCR产物DNA为模板(1μL)，以 BF2、BR2为第二套引物，50μL反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，Mgcl2 (25mM)2μL，dNTP(2.5mM)4μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，25pmol/μL BF2 1μL，25pmol/μL BR2 1μL，DNA模板2μL，ddH2O 34.5μL，混匀后稍离心。
扩增条件为：
(4)PCR产物鉴定
取第二轮PCR产物5μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(5)测序
将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。
(6)用核酸蛋白分析仪(Nanodrop2000)测得双芽巴贝斯虫的核酸浓度为 58ng/μL，按照公式拷贝数＝质粒浓度×阿伏伽德罗常数/(1个碱基对的平均分子质量×质粒总长度)，得出核酸浓度为1.3×109copies/μL。将100倍稀释后的双芽巴贝斯虫核酸模板进行10倍倍比稀释，单独使用BF1和BR1引物进行常规PCR扩增；按照优化好的反应条件，以第1轮PCR产物为模板，使用BF2 和BR2引物进行巢式PCR扩增，灭菌去离子水作为阴性对照。经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析巢式PCR的敏感性，结果如图2所示，证明本发明对双芽巴贝斯虫具有很高的敏感性。
(7)用本发明建立的巢式PCR检测方法对双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛环形泰勒虫和弓形虫的基因组DNA样品进行检测，灭菌去离子水作为阴性对照，检验此方法的特异性，结果如图3所示，证明本发明对双芽巴贝斯虫具有很强的特异性。
本发明提供了一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式 PCR检测方法，本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，针对双芽巴贝斯虫的RAP- 1为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有PCR检测技术在诊断寄生在蜱体内的巴贝斯虫时，牛双芽巴贝斯虫与牛巴贝斯虫之间常出现交叉反应的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于牛双芽巴贝斯虫病精准检测，应用前景广阔。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 王素华，帅江冰，张晓勇，吕继洲，袁淑辉，吴绍强，张晓峰
<120> 一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 172
<212> DNA
<213> Babesia bigemina
<400> 1
agcggttacg gcgagtacat gatgacccag gtgcctgcga tgacctcgtt cgctgagcgt 60
ttctccaaga tggctactaa gactctgttg gttaccgtca gcgactacgt ccatttgccc 120
gcgtacaaga ggtggtattg gaagttcaag gagttcattg tgaacttctt ta 172

Claims (8)

1.一种双芽巴贝斯虫巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：
外引物BF1：5＇-CAT-CTA-ATT-TCT-CTC-CAT-ACC-CCT-CC-3′；
内引物BR1：5＇-CCT-CGG-CTT-CAA-CTC-TGA-TGG-CAA-AG-3′；
外引物BF2：5′-CGC-AAG-CCC-AGC-AGG-CCC-CGG-TGC-3′；
内引物BR2：5′-CCG-ACC-TGG-ATA-GGC-TGT-GTC-ATG-3′。
2.一种双芽巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：
(一)权利要求1所述的两对特异性引物；
(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含双芽巴贝斯虫405bp基因片段；
(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；
(四)Taq酶。
3.根据权利要求2所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。
4.一种采用权利要求1所述的特异性引物的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)被检标本DNA提取：取微小牛蜱和扇头蜱数只，酒精清洗，每只蜱放入单独的1.5mlEP dof管，200μL PBS液浸没小牛蜱和扇头蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；
(2)以权利要求1中的外引物BF1、BR1扩增：在EP dof管中加入处理后的蜱标本DNA，同时设阴、阳性对照，10×PCR Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶，25pmol/μL BF1，25pmol/μL BR1，DNA模板，ddH2O混匀后稍离心的50μL反应体系中进行第一轮PCR；
(3)以权利要求1中的内引物BF2、BR2扩增：以第一轮PCR产物DNA为模板，以BF2、BR2为第二套引物，在10×PCR Buffer 5μL，Mgcl2 2μL，dNTP 4μL，Taq酶0.5μL，25pmol/μL BF2 1μL，25pmol/μL BR2 1μL，DNA模板2μL，ddH2O 34.5μL混匀后稍离心的50μL反应体系进行第二轮PCR；
(4)PCR产物鉴定：取第二轮PCR产物2μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(5)测序：将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。
5.根据权利要求4所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的第一轮PCR反应条件为：
95℃预热5min；
95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；
末次延伸至72℃，保持10min。
6.根据权利要求4所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的第二轮PCR反应条件为：
95℃预热5min；
95℃保持30s，56℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；
末次延伸至72℃，保持10min。
7.根据权利要求4所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)中第一轮PCR50μL反应体系中蜱样品基因组DNA模板量为5μl，10×PCR Buffer为5μL，Mgcl2为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为0.5μL，25pmol/μL BF1为1μL，25pmol/μL BR1为1μL，ddH2O为31.5μL。
8.根据权利要求2所述的双芽巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(4)中第二轮PCR50μL反应体系中第一轮PCR产物DNA模板量为2μl，10×PCR Buffer为5μL，Mgcl2为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为0.5μL，25pmol/μL BF2 1μL，25pmol/μL BR2为1μL，ddH2O为34.5μL。
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