CN114836555A - 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法 - Google Patents

用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法，本发明提供的检测方法简化了多重PCR体系的优化过程，克服了传统的细菌耐药性的E‑Test实验研究方法分离和培养菌株的周期长、培养难度大的缺陷，本发明提供的方法检测时间两个小时左右，大大提升了检测效率；与普通多重PCR相比有较高的敏感性，灵敏度可测达到500copies/ml；特异性强，降低了引物的非特异性扩增。

Description

用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组 合、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是慢性活动性胃炎的直接病因，与消化性溃疡、黏膜相关性淋巴样组织淋巴瘤密切相关，是胃癌发生的危险因子。根除幽门螺杆菌是临床治疗慢性胃病的重要策略，不仅能加速消化性溃疡的愈合，而且能显著降低溃疡复发率，也可以减少早期胃癌术后的复发。目前，克拉霉素是临床上根除幽门螺杆菌治疗最常选用的抗生素之一，但随着克拉霉素等抗生素的广泛应用，幽门螺杆菌的耐药率逐年上升。
传统的细菌耐药性的研究方法为E-Test实验，但幽门螺旋杆菌是微需氧菌，分离和培养菌株的周期长，需要一周左右时间，并且培养难度大，成功率低，不能在第一时间给医师提供诊断和治疗依据。
目前已基本明确幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的机制是由于耐克拉霉素幽门螺杆菌的23S rRNA基因的V区发生点突变，导致核糖体构象改变，同时大环内酯类抗生素结合位点也随之发生改变，进而使幽门螺杆菌与大环内酯类药物亲合力减弱，导致药物不能阻止细菌的蛋白合成，最终产生耐药。克拉霉素耐药幽门螺杆菌23S rRNA基因中A2142C、A2142G、A2143G的突变率分别为1.5％、6.2％和84.6％。因此，应用PCR技术检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变得到一定认可，幽门螺杆菌对克拉霉素耐药研究也常以此为基础。
公开专利技术“多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒”(公开号：CN111850154A)提供了对23rRNA基因中A2142C和A2142G位点的试剂盒，然而熔解曲线毕竟是数学推导，在结果中也包含了仪器的误差，对扩增仪器的要求也较高。并且同一反应体系中进行多目标特异性扩增会出现引物非特异性结合。专利“一种试剂盒、试剂盒的使用方法、试剂盒的用途)(公开号：CN107312832A)提供了23S rRNA基因A2142G/C突变检测特异性引物对，其应用ARMS-PCR原理进行检测，条件摸索困难度高。
发明内容
为了克服现有技术检测对扩增仪器要求高、特异性差的问题，本发明提供一种侨联引物探针组合用于荧光定量PCR检测幽门螺旋杆菌点突变，还提供了一种试剂盒和检测方法，用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因的2142多态性位点的点突变A2142G，桥联引物由三个部分组成：5’端部分、3’端部分以及连接两端的多聚次黄嘌呤。
作为本发明的第一个目的，在于提供一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合，包括：
如SEQ ID No.1所示的上游引物HP-A2142G-DPOF的碱基序列GA之间插入I碱基，其碱基序列为：CTACCCGCGGCAAGACGGG(I)nAAGACCC；
如SEQ ID No.2所示的下游引物HP-A2142G-DPOR的碱基序列AG之间插入I碱基，其碱基序列为:TACTTCAA(I)nAGCCTCCCACCTAT；
如SEQ ID No.3所示探针HP-A2142G-DPOP，其碱基序列为:FAM-ACCCCGTGGACCTTTACTACAACT-BHQ1；
其中，I表示次黄嘌呤，n为次黄嘌呤的数量，选自数量为3-8个，优选5或者6。
作为本发明的第二个目的，在于提供一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的试剂盒，包括所述的用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合。
优选的，所述试剂盒还包括反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照；所述反应液包括dNTPs、Mg2+、Tris-HCl，所述酶混合液包括反转录酶、Taq DNA聚合酶。
采用本发明提供的试剂盒，可体外检测幽门螺旋杆菌感染患者胃粘膜组织样本或粪便样本中幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G。
作为本发明的第三个目的，在于提供一种幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G检测方法，包括以下步骤：
步骤(1)，提取待测样品中的核酸；
步骤(2)，以步骤(1)中提取的核酸为模板，进行荧光定量PCR扩增反应；
步骤(3)，根据FAM通道扩增曲线和CT值进行结果分析。
进一步的，步骤(2)中PCR反应体系以25μl计为：
Figure BDA0003694407140000031
进一步的，步骤(2)中荧光定量PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，采集FAM通道荧光，共40个循环。
进一步的，步骤(3)中，检测结果的判断标准为：CT值≤38且具有S型扩增曲线，则为幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G点突变阳性，CT值＞38或无CT值则为幽门螺杆菌23SrRNA基因A2142G点突变阴性。
作为本发明的第四个目的，在于提供所述的桥联引物探针组合在检测幽门螺杆菌点突变中的应用，以及所述的试剂盒在检测幽门螺杆菌点突变中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种用于荧光定量PCR检测幽门螺旋杆菌点突变的检测方法，该检测方法简化了多重PCR体系的优化过程，克服了传统的细菌耐药性的E-Test实验研究方法分离和培养菌株的周期长，培养难度大的缺陷，本发明提供的方法检测时间少于两个小时，大大提升了检测效率；
2、本发明提供的检测方法与普通多重PCR相比有较高的敏感性，灵敏度可测达到500copies/ml；特异性强，降低了引物的非特异性扩增。
3、相对于熔解曲线法，本申请采用桥联引物技术，避免了熔解曲线的结果误差和多重PCR的引物非特异性结合，适合点突变序列的检测。
4、同时，本申请采用的桥联引物法相对于ARMS-PCR原理，操作更加简单便捷，降低了引物的非特异性扩增，与之相比有较高的灵敏度。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为引物不同浓度下扩增效果图。
图2为特异性实验中检测结果图。
图3为灵敏度评价实验检测结果图。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：
1.材料与方法
1.1材料及设备
检测试剂：使用山东安珀生物科技有限公司的核酸提取试剂盒(磁珠法)，反应液、酶混合液采购自珠海宝锐生物科技有限公司，引物探针由上海百力格生物技术有限公司合成，实验样本是医院做胃镜检查患者的胃粘膜组织样本。
主要设备：山东安珀生物科技有限公司的全自动核酸提取仪AP-9601，西安天隆科技有限公司的全自动PCR分析系统。
1.2实验方法
1.2.1核酸提取
用无菌的胃镜钳取胃部黏膜组织样本，加入180微升D-PBS缓冲液和30微升蛋白酶K，进行震荡混匀使样本溶解消化，备用。
按照山东安珀生物科技有限公司的核酸提取试剂盒(磁珠法)说明书对实验样本进行核酸提取。将200微升处理好的样本加入酸提取试剂盒裂解液板孔里，加入20微升蛋白酶K溶液，将试剂按顺序放入核酸提取仪中，选择AP91005程序运行，运行结束后洗脱液板对应孔中则为提好的核酸，将核酸取到干净的离心管中备用。
1.2.2引物探针设计
参考桥联引物设计方法和要求，根据幽门螺杆菌23S rRNA基因的2142多态性位点A2142G点突变设计引物探针，序列如下：
如SEQ ID No.1所示的上游引物HP-A2142G-DPOF的碱基序列GA之间插入5个I碱基，其碱基序列为：CTACCCGCGGCAAGACGGGIIIIIAAGACCC；
如SEQ ID No.2所示下游引物HP-A2142G-DPOR的碱基序列AG之间插入5个I碱基，其碱基序列为:TACTTCAAIIIIIAGCCTCCCACCTAT；
如SEQ ID No.3所示探针HP-A2142G-DPOP，其碱基序列为FAM-ACCCCGTGGACCTTTACTACAACT-BHQ1。
1.2.3反应体系
Figure BDA0003694407140000051
其中，反应液组分为80％的DEPC水、10％的Tris-Cl、10％的KCl和MgCl2的混合物质。酶混合液组分为90％的DEPC水和10％的Taq酶。
反应条件为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒(采集FAM通道荧光)，共40个循环。
1.2.4特异性评价
按照1.2.3中的反应体系，以1.2.1中提取的4个非幽门螺旋杆菌样本和4个非目标点突变的幽门螺杆菌样本的核酸为模板，以存在A2142G点突变(AAGACGGGA)的样本为模板做阳性对照，以水为模板做阴性对照，对所建立反应体系的特异性进行评价。
1.2.5灵敏度评价
把转染了含有A2142点突变的特定幽门螺杆菌23S rRNA基因片段的大肠杆菌细胞样品做为检出限参考品，分别稀释到浓度为5000copies/ml、2000copies/ml、1000copies/ml、500copies/ml、200copies/ml，共5个模板浓度，分别取5μl做为模板按照1.2.3的方法进行灵敏度实验。
1.2.6退火温度敏感性实验
按照1.2.3中的反应体系，将反应条件中的退火温度设定为45℃-65℃，5℃为1个梯度共5个梯度，进行荧光定量PCR实验分析结果。
2.结果分析
2.1检测方法建立：
通过改变和对比反应体系，确定上下游引物终浓度0.3μM时候扩增效果最佳，探针终浓度0.1μM时候扩增效果最佳。不同浓度下扩增效果如图1所示。
2.2特异性评价
4个非幽门螺杆菌样本和4个不含目标点突变的幽门螺杆菌样本的核酸模板检测结果为阴性，存在A2142G点突变幽门螺杆菌的样本检测结果为阳性，结果如图2所示。表明所建立的检测方法具有良好的特异性，可用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因的2142多态性位点的点突变A2142G。
2.3灵敏度评价
检测结果如图3显示，浓度为500copies/ml样本检测CT值36-37，对该浓度的样本进行了20次重复检测，检出率为100％，浓度为50copies/ml样本，结果未检出，表明本发明的检测灵敏度达500copies/ml；另外，浓度为200copies/ml样本检测CT值在37-39，对该浓度的样本进行了20次重复检测，检出率为80％。可见，本方法检测灵敏度高。
2.4退火温度敏感性实验
在本发明退火温度敏感性实验中，退火温度设定为45℃-65℃五个梯度，在退火温度为60℃时扩增效果最佳。
实施例2：
根据幽门螺杆菌的目的基因序列分别设计了六套侨联引物(I碱基的个数为3-8个)，分别进行核酸扩增实验检测弱阳性质控品10次，根据反应的平均CT值可得出I碱基为5个或6个时效果最佳。
Figure BDA0003694407140000061
Figure BDA0003694407140000071
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方面而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 山东安珀生物科技有限公司
<120> 用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法
<130> 2022.06.10
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> HP-A2142G-DPOF
<400> 1
ctacccgcgg caagacggga agaccc 26
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> HP-A2142G-DPOR
<400> 2
tacttcaaag cctcccacct at 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> HP-A2142G-DPOP
<400> 3
accccgtgga cctttactac aact 24

Claims (10)

1.一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合，其特征在于，包括：
如SEQ ID No.1所示的上游引物HP-A2142G-DPOF的碱基序列GA之间插入I碱基，其碱基序列为：CTACCCGCGGCAAGACGGG(I)nAAGACCC；
如SEQ ID No.2所示的下游引物HP-A2142G-DPOR的碱基序列AG之间插入I碱基，其碱基序列为:TACTTCAA(I)nAGCCTCCCACCTAT；
如SEQ ID No.3所示探针HP-A2142G-DPOP；
其中，I表示次黄嘌呤，n为次黄嘌呤的数量，选自数量为3-8个。
2.根据权利要求1所述的一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合，其特征在于，所述上游引物和下游引物中分别插入5个或6个I碱基。
3.根据权利要求1或2任一项所述的一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合在检测幽门螺杆菌点突变中的应用。
4.一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照；所述反应液包括dNTPs、Mg2+、Tris-HCl，所述酶混合液包括反转录酶、Taq DNA聚合酶。
6.根据权利要求4或5任一项所述的一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的试剂盒在检测幽门螺杆菌点突变中的应用。
7.一种幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，提取待测样品中的核酸；
步骤(2)，以步骤(1)中提取的核酸为模板，进行荧光定量PCR扩增反应；
步骤(3)，根据FAM通道扩增曲线和CT值进行结果分析。
8.根据权利要求7所述的一种幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应体系以25μl计为：
Figure FDA0003694407130000021
9.根据权利要求8所述的一种幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G检测方法，其特征在于，步骤(2)中荧光定量PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，采集FAM通道荧光，共40个循环。
10.根据权利要求9所述的一种幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G检测方法，其特征在于，步骤(3)中，检测结果的判断标准为：CT值≤38且具有S型扩增曲线，则为幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G点突变阳性，CT值＞38或无CT值则为幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G点突变阴性。
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