CN117947195A

CN117947195A - 用于检测沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法

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Publication number: CN117947195A
Application number: CN202410188690.1A
Authority: CN
Inventors: 龚建森; 张笛; 盛中伟; 许明; 董永毅; 张萍; 李婷婷; 窦新红; 吴坤; 陈莉
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2024-02-20
Filing date: 2024-02-20
Publication date: 2024-04-30

Abstract

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法，所述试剂盒包括F引物、R引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述单链核酸报告分子为5’‑/6‑FAM/TTTTTTTT/BHQ1/‑3’。本发明成功开发了一种沙门氏菌检测试剂盒，采用本发明的试剂盒进行检测，核酸扩增和检测同步进行，无需开盖检测。实验结果表明，本发明沙门氏菌检测系统具有较好的特异性和灵敏度。

Description

用于检测沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella,SAL)是全世界重要的食源性病原体之一，可引起严重的公共卫生问题。全球每年有超过1.53亿例肠胃炎病例和57000人死于SAL。迄今为止，已鉴定出2600多种SAL血清型。其中，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌是引起人类肠胃炎的两种主要血清型。通常，食用受污染的食物是SAL介导的感染的主要来源。在中国，SAL在细菌性食物中毒中排名第一，约占70％-80％。因此，一种准确、快速的SAL检测方法对于阻断食源性疾病的爆发和维护公众健康至关重要。

基于细菌培养的方法已用于SAL检测很长时间，该检测方法基于实验室、耗时并且劳动密集。迄今为止，基于聚合酶链式反应(PCR)的方法也已广泛用于SAL检测，目前被认为是诊断金标准。然而，由于所需仪器复杂、要求技术人员经验丰富并且反应周期长等因素的限制，该方法难以在资源有限的地区实施。等温扩增克服了基于PCR的方法的缺点，并在恒定温度下进行，而不需要特定的设备，如LAMP(环介导的等温扩增)和重组酶聚合酶扩增(RPA)。此外，相关的基于LAMP或RPA的平台在检测SAL方面表现出高灵敏度和特异性。然而，等温扩增试验的假阳性结果相对较高。为了解决这一问题，将等温扩增技术引入CRISPR/Cas系统(成簇的规则间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白)，以提高准确性。一些基于CRISPR的分子诊断系统已经成功创建用于SAL检测，如LAMP-CRISPR/Cas12、RPA-CRISPR/Cas12和RPA-CRISPR/Cas13。预扩增和CRISPR/Cas检测是上述基于CRISPR的方法的两个主要分离步骤。因此，该反应很难避免多次手动操作造成的污染。

发明内容

针对上述问题，本发明拟建立一种单管RPA-CRISPR/Cas的沙门氏菌快速检测体系，忽略了冗余的开帽过程，以避免实际不便和交叉污染。

本发明的目的是提出一种基于CRISPR的沙门氏菌检测体系及试剂盒。为了实现本发明的上述目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种基于CRISPR的沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F引物、R引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQID NO.16所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括：缓冲液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒中，每50μL包括：

本发明另一方面还涉及一种基于CRISPR检测沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：

采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。

在本发明的一个优选实施方式中，所述检测的温度为30℃～50℃，优选37℃～42℃，更优选40℃～42℃。

在本发明的一个优选实施方式中，所述检测方法中的核酸扩增和检测可同步进行，中间不需要开盖。

在本发明的一个优选实施方式中，所述沙门氏菌包括选自下组的一种或两种以上沙门氏菌：鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌、波斯坦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、双亚利桑那沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、邦戈尔沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。

本发明将重组酶聚合酶扩增(RPA)技术与基于CRISPR/Cas12b的系统在一锅平台上开发了一种新的沙门氏菌诊断系统(RPA-CRISPR/Cas12b)，即一管法或一锅法或一步法，核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。实验结果表明，本发明的沙门氏菌感染检测系统是简单和准确的。

附图说明

图1是本发明的原理图。

图2是实施例1的沙门氏菌RPA引物筛选实验的RPA产物电泳图。

图3是实施例1的沙门氏菌CRISPR一管法体系sgRNA筛选的结果图(图中NTC为无模板阴性对照，下同)。

图4是实施例1的沙门氏菌CRISPR一管法Cas蛋白和sgRNA用量优化实验结果图。

图5是实施例1的沙门氏菌CRISPR一管法体系反应温度筛选实验结果图。

图6是实施例1的沙门氏菌CRISPR一管法体系反应探针筛选实验结果图。

图7是实施例1的沙门氏菌CRISPR一管法体系灵敏度测试的结果图。

图8是实施例1的沙门氏菌CRISPR一管法体系特异性测试的结果图。

术语

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“CRISPR”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。

术语“CRISPR-Cas”：一种独特的源自细菌和古细菌的基因组元件，作为一种适应性免疫防御系统，以抵御入侵的噬菌体或外来核酸。该系统由成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(简称Cas蛋白、Cas)组成。

术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR相关蛋白(有些文献翻译为CRISPR-Cas效应蛋白、CRISPR/Cas效应蛋白、CRISPR-Cas效应子、CRISPR/Cas效应子)，可以为V型Cas蛋白或VI型Cas蛋白。V型Cas蛋白，其一旦在向导RNA引导下与顺式切割底物结合形成Cas蛋白-向导RNA-顺式切割底物的三元复合物，就可以诱发其反式切割活性，即随机切割单链核酸及其等同物(核酸等同物如核酸类似物)。本具体实施方式所述的Cas蛋白为具有反式切割活性的蛋白。尤其是，在比进行等温扩增反应的体系温度更高的温度下，仍然具有活性，尤其是反式切割活性的Cas蛋白。

术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型的酶。

术语“Cas12b”、“C2c1”可互换使用，是指sgRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-B型的酶。

术语“PAM”是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是与CRISPR效应蛋白靶向的DNA序列直接相邻的短DNA序列，是Cas12a或Cas12b切割双链DNA所必须，比如，Cas12a的PAM为TTTV，AacCas12b的PAM为TTN序列。

术语“靶标DNA或RNA分子”，当待检的是核酸分子时，是待检DNA或RNA或其特异性部分；当待检的是非核酸分子时，靶标DNA或RNA分子是事先设计好的核酸序列。

术语“CRISPR一步法检测技术”(或简称一步法检测、一步法、一管法、一锅法)是在CRISPR分子诊断系统基础上发展出的一种快速、便捷式的检测技术，它可以在一个反应管中同步实现靶标核酸的扩增和检测。该技术采用CRISPR-Cas系统和等温扩增技术相结合，不需要将扩增后的核酸产物进行开盖操作，可以在短时间内特异性的检测出靶标核酸。CRISPR一步法检测技术是一种快速、准确、高灵敏度和高特异性的检测技术，不仅操作简便，而且能提升目前等温扩增技术的检测特异性。相比于传统的PCR技术，CRISPR一步法检测不需要复杂的温度控制和多步骤操作，具有更高的实时性和便携性。

术语“体系”应作为广义理解，可以为组合物、产品组合、试剂、试剂盒，也可以为含有前述组合物、产品组合、试剂、试剂盒的仪器设备，也可以为将组合物、产品组合、试剂、试剂盒用于检测时形成的混合物，以及含有前述混合物的仪器设备等等。

术语“体系温度”指体系(用于检测时形成的混合物)的温度。

术语的“向导RNA”是成熟的crRNA与tracrRNA融合作为向导RNA，或者成熟的crRNA与scoutRNA融合作为向导RNA，或者crRNA单独作为向导RNA。

一般而言，向导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat sequences，又称DR序列)和导向序列(guide sequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以包括crRNA和scoutRNA，还可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与顺式切割底物DNA具有足够互补性从而与所述顺式切割底物DNA杂交并引导CRISPR/Cas蛋白-向导RNA复合物与所述顺式切割底物DNA的特异性结合的多核苷酸序列，通常具有15-28nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与顺式切割底物DNA 100％互补。所述的导向序列不与反式切割报告分子中的核酸互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应顺式切割底物DNA之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的

匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在两个序列之间的该位置上是同一的。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Pro.Natl.Acad.Sci.USA85:244,Thompsonetal.,1994,Nucleic Acids Res 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,Genetics ComputerGroup)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。

术语“RPA”指重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)；术语“RAA”指重组酶介导链替换核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification，RAA)；术语“ERA”指酶促重组等温扩增技术(Enzymatic RecombinaseAmplification，ERA)。术语“MIRA”指多酶恒温快速扩增技术(Multienzyme Isothermal RapidAmplification，简称MIRA)，是一种恒温核酸快速扩增技术，依靠多种功能蛋白(解旋酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶等)协同作用，在常温下实现核酸快速扩增。这四种种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和，引物设计更简单等优点，且检测原理相似。

本具体实施方式提出了一种RNA。一种RNA，所述RNA序列如SEQ ID NO.16所示。该RNA的用途，是作为向导RNA，用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的组合物，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的产品组合，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是沙门氏菌的一管法检测。

在所述RNA的基础上，提出了一种组合物，所述组合物包括用于CRISPR核酸检测的组合物，所述用于CRISPR核酸检测的组合物包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA，序列如SEQ ID NO.16所示；及单链核酸报告分子。

所述组合式还包括用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的组合物，所述用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的组合物包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：

1.1)、F引物，所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和

1.2)、R引物，所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述组合物的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的产品组合，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的体系，所述检测是沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是沙门氏菌的一管法检测。

在所述向导RNA的基础上，还提出了一种产品组合，所述产品组合包括用于CRISPR核酸检测的产品组合，所述用于CRISPR核酸检测的产品组合包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA，序列如SEQ ID NO.16所示；及单链核酸报告分子。

V-B型Cas蛋白、向导RNA和单链核酸报告分子可以单独形成产品然后组合，也可以两两形成产品然后组合，还可以一起形成产品。

所述产品组合还包括用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的产品组合，所述用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的产品组合包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：

1.1)、F引物，所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和

1.2)、R引物，所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述产品组合的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是沙门氏菌的一管法检测。

在所述向导RNA的基础上，提出了一种试剂或试剂盒。

一种试剂或试剂盒，包括用于CRISPR核酸检测的试剂，所述用于CRISPR核酸检测的试剂包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA，序列如SEQ IDNO.16所示；及单链核酸报告分子。

所述试剂盒中，V-B型Cas蛋白、向导RNA和V-B型Cas蛋白可以分别容置于三个容器中，也可以容置于两个容器中，还可以容置于同一个容器中。

所述试剂或试剂盒还包括用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的试剂，所述用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的试剂包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：

1.1)、F引物，所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和

1.2)、R引物，所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述试剂盒中，所述引物组、聚合酶和dNTP可以分别容置于三个容器中，也可以容置于两个容器中，还可以容置于同一个容器中。

所述试剂或试剂盒还包括：缓冲液。

所述试剂或试剂盒的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是沙门氏菌的检测。

一种基于RPA/RAA/ERA/MIRA-CRISPR/Cas12b检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

使待检样本与以下物质接触：

如上文所述的组合物，或者如上文所述的产品组合，或者如上文所述的试剂，或者如上文所述的试剂盒；

测定信号的变化。

所述V-B型Cas蛋白是Cas12b；所述检测的温度为30℃～50℃，优选37～42℃，更优选40～42℃。

在另一优选例中，所述Cas12b的来源选自下组：嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、卡氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluskakegawensis)、大孢脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus macrosporangiidus)、芽孢杆菌属V3-13(Bacillus sp.V3-13)、外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黏胶球形菌纲细菌(Lentisphaeriabacterium)、非常脱硫弧菌(Desulfovibrio inopinatus)、沉积物莱西氏菌(Laceyella sediminis)、螺旋体细菌(Spirochaetes bacterium)、热生肿块芽胞杆菌(Tuberibacillus calidus)的Cas12b(TcCas12b)或其组合。

在另一优选例中，所述Cas12b的选自下组：来自嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)的Cas12b(AaCas12b)、来自卡氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus kakegawensis)的Cas12b(AkCas12b)、来自大孢脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus macrosporangiidus)的Cas12b(AmCas12b)、来自外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)的Cas12b(BhCas12b)、来自芽孢杆菌属(Bacillus)的BsCas12b、来自芽孢杆菌V3-13(Bacillus sp.V3-13)的Cas12b(Bs3Cas12b)、来自非常脱硫弧菌(Desulfovibrio inopinatus)的Cas12b(DiCas12b)、来自沉积物莱西氏菌(Laceyellasediminis)的Cas12b(LsCas12b)、来自螺旋体细菌(Spirochaetes bacterium)的Cas12b(SbCas12b)、来自热生肿块芽胞杆菌(Tuberibacillus calidus)的Cas12b(TcCas12b)。

在另一优选例中，所述Cas12b选自下组：AapCas12b、AacCas12b、AaCas12b、BthCas12b、AkCas12b、AmCas12b、BsCas12b、Bs3Cas12b、LsCas12b、BvCas12b、BrCas12b、EbCas12b或其组合。

在另一优选例中，所述沙门氏菌包括选自下组的一种或两种以上沙门氏菌：鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌、波斯坦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、双亚利桑那沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、邦戈尔沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。

具体实施方式

实施例1

1、实验材料与方法

1.1、实验仪器

表1实验仪器

仪器名称	仪器型号	生产厂家
			全自动医用PCR分析系统	SLAN-96S	上海宏石医疗科技有限公司
QuantStudio3实时荧光定量PCR系统	QuantStudio3	ThermoFisher
			QuantStudio5实时荧光定量PCR系统	QuantStudio5	ThermoFisher
Qubit荧光光度分度计	Qubit4	ThermoFisher
			AccuMini数字PCR系统	AccuMini	臻准生物科技(上海)有限公司
恒温水浴锅	BWS-10	上海一恒科学仪器有限公司

1.2、实验试剂

表2实验试剂

2、实验方法

2.1、沙门氏菌检测靶标选择

参考文献资料及相关序列分析比对，最终选择invA基因(SEQ ID NO.1)作为沙门氏菌特异性检测靶标，并构建含有invA基因序列的质粒pUC57-SAL_invA。

pUC57-SAL_invA质粒大小：2710bp+713bp＝3423bp。

使用Qubit测定100μLTE稀释的质粒浓度，其浓度平均值：27.9ng/μL。

计算浓度为：7.55×10⁹copies/μL。

2.2、沙门氏菌RPA引物设计

根据选择的沙门氏菌invA基因序列进行RPA引物设计，沙门氏菌invARPA引物设计序列参见表3。

表3沙门氏菌RPA引物

2.3、沙门氏菌RPA引物筛选

(1)沙门氏菌RPA反应体系

按照下表4准备反应体系，将上述反应体系手弹混匀，并短暂离心，然后将其加入到基础反应单元中，轻柔手弹基础反应单元使得冻干粉能充分溶解均匀，随后短暂离心将液体收集至管底。最后打开反应单元，向每个反应单元的管盖内侧加入5μL乙酸镁，然后向反应单元中加入5μL模板。

表4沙门氏菌RPA反应体系

试剂名称	体积(μL)
		缓冲液Ⅴ(RAA核酸扩增试剂盒自带，下同)	25
SAL_invA-F(10μM)	2
		SAL_invA-R(10μM)	2
无核酸酶水	11
		总量	40

反应程序为：恒温37℃，反应时间为30min。使用数字PCR定量的pUC57-SAL_invA质粒作为模板进行RPA引物筛选。RPA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并拍照分析。

参见图2，SAL_invA-RPA-1引物的RPA扩增产物电泳跑胶条带亮度最高，故选择SAL_invA-RPA-1为最佳扩增引物。后续实验如无特殊说明，均采用引物SAL_invA-RPA-1。

2.4、沙门氏菌sgRNA设计

根据沙门氏菌筛选出的性能较佳的RPA引物，在其扩增片段范围内进行相应的Cas12b sgRNA设计，序列详见表5所示，下划线部分序列为靶标序列。

表5沙门氏菌sgRNA序列

2.5、沙门氏菌CRISPR一管法检测体系建立

(1)沙门氏菌Cas12b sgRNA体外转录与纯化

使用吐露港生物的Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and PurificationKit(货号31904,ToloBio)试剂盒来进行Cas12b sgRNA的体外转录与纯化操作，具体流程如下所示。

①DNA转录模板制备

将Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit中的Cas12bSense Oligo与SAL_invA-sgRNA-R系列引物退火延伸反应完成后便可作为转录模板使用。

表6沙门氏菌Cas12b sgRNA体外转录oligo序列

a.退火延伸体系配制

表7退火延伸体系

组分	体积
		2×PCRMasterMix	10μL
Cas12bSenseOligo(10μM)	0.5μL
		SA_invA-sgRNA-R(10μM)	0.5μL
无核酸酶水	9μL

b.PCR退火延伸程序设置

表8PCR退火延伸程序

②Cas12b sgRNA体外转录

a.按下表试剂的顺序进行反应体系的配制。

表9反应体系

组分	体积
		5×TranscriptMax反应缓冲液	4μL
NTPmix	8μL
		TranscriptMaxEnzymeMix	2.1μL
无核酸酶水	0.9μL
		DNA转录模板	5μL

b.将上述试剂充分混匀，然后短暂离心，在37℃下孵育2-4h进行体外转录，延长转录时间可提高转录产量，如果转录产物用于CRISPR一管法检测，推荐过夜转录12-16h。

c.37℃孵育结束后，按照下表配制30μL的DNaseⅠ反应液加入到20μL的体外转录产物中，以去除转录体系中的DNA模板。

表10DnaseⅠ反应液

组分	体积
		2×DNaseⅠ缓冲液	25μL
DNaseⅠ	4μL
		无核酸酶水	1μL

DNaseⅠ反应条件：37℃，30min。

③Cas12b sgRNA转录产物磁珠纯化

a.首先将磁珠从4℃冰箱中取出，在室温中放置约30min，使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取25μL磁珠和50μL异丙醇加入到50μL待纯化的sgRNA样品中，用移液器吹打充分混匀。

b.室温孵育5min，使RNA结合到磁珠上。

c.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心移除上清。

d.保持样品置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇,漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。

e.重复步骤4，共漂洗2次。

f.保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5min。

g.将样品从磁力架上取出，加入50μL无核酸酶水，用移液器吹打以充分混匀，室温静置5min。

h.将样品置于磁力架5min，待溶液澄清后，小心转移上清至一个新的无核酸酶PCR管中，即得到纯化后的Cas12b sgRNA。

(2)沙门氏菌CRISPR一管法体系sgRNA筛选

在RPA反应体系的基础上，对沙门氏菌CRISPR一管法体系进行sgRNA的筛选，具体参见下表11所示。

表11沙门氏菌CRISPR一管法体系sgRNA筛选

反应程序为：恒温37℃，每间隔30s来采集FAM荧光通道信号，反应时间为45min。

根据图3可知，沙门氏菌CRISPR一步法体系中SAL_invA-1-sgRNA-1的性能最佳。后续实验如无特别说明，向导RNA均采用SAL_invA-1-sgRNA-1。

2.6、沙门氏菌CRISPR一管法检测体系优化

①CRISPR一管法Cas蛋白和sgRNA用量优化

根据表11筛选出的沙门氏菌CRISPR一管法检测体系来继续优化CRISPR一管法检测体系中的Cas蛋白和sgRNA用量。

表12沙门氏菌CRISPR一管法中Cas蛋白和sgRNA用量优化

试剂名称	体积(μL)
		缓冲液V	25
SAL_invA-F1(10μM)	2
		SAL_invA-R1(10μM)	2
SAL_invA-1-sgRNA-1(10μM)	0.3125/0.625/1.25/2.5
		AapCas12b(10μM)	0.3125/0.625/1.25/2.5
8C-FQ探针(10μM)	2.5
		无核酸酶水	7.875/7.25/6/3.5
乙酸镁	5
		模板	5
总量	50

从图4结果中可知，sgRNA和Cas12b浓度为250nM时荧光强度最高，为沙门氏菌CRISPR一步法体系Cas蛋白和sgRNA最佳用量。后续实验如无特殊说明，均采用sgRNA和Cas12b浓度为250nM。

②CRISPR一管法反应温度优化

按照下表13进行CRISPR一步法体系反应温度筛选，反应温度筛选范围为37-42℃，间隔1℃进行筛选测试，每间隔30s来采集FAM荧光通道信号，反应时间为45min。

表13沙门氏菌CRISPR一步法体系反应温度筛选测试

从图5结果可知，沙门氏菌CRISPR一步法体系反应体系最佳反应温度是42℃，在此温度条件下，CRISPR一步法体系的荧光强度最高。后续实验如无特殊说明，均采用反应温度是42℃。

③CRISPR一管法反应探针优化

在表格13的CRISPR一步法反应体系的基础上，测试不同探针对CRISPR一步法检测体系的影响，不同探针序列如下表14所示。

表14探针序列

探针名称	序列(5’-3’)
		8A-FQ	5’-/6-FAM/AAAAAAAA/BHQ1/-3’
8T-FQ	5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’
		8C-FQ	5’-/6-FAM/CCCCCCCC/BHQ1/-3’
8G-FQ	5’-/6-FAM/GGGGGGGG/BHQ1/-3’

从图6结果可知，沙门氏菌CRISPR一步法体系反应体系所用的探针最佳为8T-FQ，8A-FQ与8C-FQ也可采用。后续实验如无特殊说明，均采用探针8T-FQ。

2.7、沙门氏菌CRISPR一管法检测体系的灵敏度测试和特异性测试

根据优化后沙门氏菌CRISPR一步法检测体系进行灵敏度和特异性测试，沙门氏菌CRISPR一步法检测体系参见下表15。

表15沙门氏菌CRISPR一步法体系

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反应程序为：恒温42℃，每间隔30s来采集FAM荧光通道信号，反应时间为45min。

①沙门氏菌CRISPR一步法检测体系灵敏度测试：

将定量后的pUC57-SAL_invA质粒，按照100copies/test、50copies/test、25copies/test、12.5copies/test、6.25copies/test梯度浓度进行测试，每个浓度测试10个重复。

根据图7可知，沙门氏菌CRISPR一步法体系最低检出限LoD为60.0copies/test。

②沙门氏菌CRISPR一步法检测体系特异性测试

使用提取的15种沙门氏菌基因组核酸和17种非沙门氏菌基因组核酸进行沙门氏菌CRISPR一步法检测体系特异性测试。

表16沙门氏菌特异性验证细菌名称

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从图8可知，沙门氏菌CRISPR一步法体系检测不同种的沙门氏菌均能检测出，非沙门氏菌均不能被检测出。

本具体实施方式的有益效果如下：

(1)初步建立沙门氏菌CRISPR一管法检测体系，检测时间为45min，最低检测限为60.0copies/test，具有检测快速、操作便捷等特性，同时也具有较高的检测灵敏度。

(2)使用CRISPR一管法检测体系不用二次开盖加样，不仅能避免气溶胶污染发生，同时利用CRISPR技术能提升等温扩增检测的特异性，避免出现假阳性结果的风险。

附：pUC57-SAL_invA质粒合成

构建含有沙门氏菌SAL_invA保守序列的质粒pUC57-SAL_invA，SAL_invA序列如下(SEQ ID NO.1)。

AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTA

TGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTG

GCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTC

CTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT

TATCTTGATTGAAGCCGATGCCGGGGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGG

CGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTT

ATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTAT

GCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGC

CGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGAC

GGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCCATTGCCGGCATCATTATCATCTTTGTGAAC

TTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTATGGATTTATCCTCCGCTCTGT

CTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCC

以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于CRISPR的沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F引物、R引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：缓冲液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒中，每50μL包括：

缓冲液25μL；

F引物2μL，浓度10μM；

R引物2μL，浓度10μM；

向导RNA 1.25μL，浓度10μM；

Cas12b 1.25μL，浓度10μM；

单链核酸报告分子2.5μL，浓度10μM；

无核酸酶水6μL；

Mg²⁺5μL；

待检样本5μL。

5.一种基于CRISPR检测沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：

采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。

6.根据权利要求5所述的方法，所述检测的温度为30℃～50℃，优选37℃～42℃，更优选40℃～42℃。

7.根据权利要求5所述的方法，所述检测方法中的核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。

8.根据权利要求5所述的方法，所述沙门氏菌包括选自下组的一种或两种以上沙门氏菌：鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌、波斯坦沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、双亚利桑那沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、邦戈尔沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。