CN117947194A - 一种印第安纳沙门氏菌分子检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种印第安纳沙门氏菌分子检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN117947194A CN202410188685.0A CN202410188685A CN117947194A CN 117947194 A CN117947194 A CN 117947194A CN 202410188685 A CN202410188685 A CN 202410188685A CN 117947194 A CN117947194 A CN 117947194A
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张笛
龚建森
盛中伟
沈海玉
董永毅
李婷婷
吴坤
许明
窦新红
王怡
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Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR的印第安纳沙门氏菌检测试剂盒及其方法，所述试剂盒包括F引物、R引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述单链核酸报告分子为5’‑/6‑FAM/CCCCCCCC/BHQ1/‑3’。本发明成功开发了一种印第安纳沙门氏菌检测试剂盒，采用本发明的试剂盒进行检测，核酸扩增和检测同步进行，无需开盖检测。实验结果表明，本发明印第安纳沙门氏菌检测系统具有较好的特异性和灵敏度。

Description

一种印第安纳沙门氏菌分子检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种基于CRISPR的印第安纳沙门氏菌检测试剂盒及其方法。
背景技术
沙门氏菌是世界各地众所周知的食源性病原体，是食源性疾病爆发的主要原因，严重威胁着人类健康，每年造成巨大的经济损失。在全球范围内，每年估计发生9380万例沙门氏菌感染和15.5万例相关死亡。印第安纳沙门氏菌于1955年首次从美国印第安纳州一名患有呕吐、腹泻和发烧的患病女孩身上分离出来。该病原体随后在北美和欧洲引起了人类和哺乳动物的感染。最初，它在中国很少被报道，但最近显示出流行率的显著增加，并出现出高水平的耐药性。先前的报告表明，所有分离的印第安纳沙门氏菌都是从鸡肉产业链中分离出来的。因此，在日常生活中很容易通过家禽产品被印第安纳沙门氏菌感染。印第安纳沙门氏菌的极度扩张对全球公共卫生造成了越来越大的威胁。为了保持健康，防止由印第安纳沙门氏菌引起的食源性疾病的爆发，我们希望提供一种方便的印第安纳沙门氏菌早期检测方法。
到目前为止，微生物培养是印第安纳沙门氏菌鉴定的传统方法，耗时费力导致效率低。目前，基于聚合酶链反应(PCR)的方法已成为一种常规的检测方法，并广泛应用于印第安纳沙门氏菌的检测。然而，这些工具高度依赖于专业的设备、经验丰富的操作人员和较长的反应时间。为了解决这一问题，已经发现了几种等温扩增技术并用于检测，如环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA，类似技术还有RAA、ERA、MIRA)。这些方法由于仪器安装简单、省时、程序简单的显著优点，因此应用迅速。然而，还需要付出大量的努力来提高特异性。最近，成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)系统为病原体检测提供了新的解决方案。Cas效应子(如Cas12a、Cas12b和Cas13a)在特异性RNA引导的核酸酶的存在下，识别和切割靶标序列后，可以对非靶标单链RNA和DNA进行旁路切割活性。此外，一些基于CRISPR/Cas的平台已被用于核酸检测，包括SHERLOCK(SpecificHigh-sensitivityEnzymatic ReporterUnLOCKing)、HOLMES(One-Hour-LowcostMultipurposehighly Efficient System)、DETECTR(DNA Endonuclease-TargetedCRISPRTrans Reporter)等。通常，预扩增和基于CRISPR检测是大多数CRISPR检测系统的两个主要独立步骤，不能完全避免多次操作和气溶胶的污染。目前基于CRISPR的印第安纳沙门氏菌一步鉴定方法仍未建立。这是由于CRISPR一步法/一管法体系建立过程中需要解决等温扩增反应与CRISPR反应体系这两种反应体系的兼容问题，CRISPR反应中的顺式切割活性可以切割扩增模板，对扩增反应有影响，此外CRISPR反应中的反式切割活性可以切割扩增引物等，因此要建立基于CRISPR的印第安纳沙门氏菌的一步法/一管法必须要解决等温扩增反应与CRISPR反应体系的兼容性问题，这具有极高的难度。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于CRISPR的印第安纳沙门氏菌检测试剂盒及其方法。为了实现本发明的上述目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种基于CRISPR的印第安纳沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F引物、R引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/CCCCCCCC/BHQ1/-3’。
在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。
在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括：缓冲液。
在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒中，每50μL包括：
本发明另一方面还涉及一种基于CRISPR检测印第安纳沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：
采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。
在本发明的一个优选实施方式中，所述检测的温度为30℃～50℃，优选37℃～42℃，更优选40℃～42℃。
在本发明的一个优选实施方式中，所述检测方法中的核酸扩增和检测可同步进行，中间不需要开盖。
本发明将重组酶聚合酶扩增(RPA)技术与基于CRISPR/Cas12b的系统在一锅平台上开发了一种新的印第安纳沙门氏菌诊断系统(RPA-CRISPR/Cas12b)，即一管法或一锅法或一步法，核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。实验结果表明，本发明的印第安纳沙门氏菌感染检测系统是简单和准确的。
附图说明
图1是本发明的原理图。
图2是实施例1下的印第安纳沙门氏菌RPA引物筛选实验结果图。
图3是实施例1下的印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系sgRNA筛选实验结果图。
图4是实施例1下的印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法Cas蛋白和sgRNA用量优化实验结果图。
图5是实施例1下的印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系反应温度优化实验结果图。
图6是实施例1下的印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系反应探针优化实验结果图。
图7是实施例1下的印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系检测灵敏度的结果图。
图8是实施例1下的印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系检测特异性的结果图。
术语
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
术语“CRISPR”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。
术语“CRISPR-Cas”：一种独特的源自细菌和古细菌的基因组元件，作为一种适应性免疫防御系统，以抵御入侵的噬菌体或外来核酸。该系统由成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(简称Cas蛋白、Cas)组成。
术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR相关蛋白(有些文献翻译为CRISPR-Cas效应蛋白、CRISPR/Cas效应蛋白、CRISPR-Cas效应子、CRISPR/Cas效应子)，可以为V型Cas蛋白或VI型Cas蛋白。V型Cas蛋白，其一旦在向导RNA引导下与顺式切割底物结合形成Cas蛋白-向导RNA-顺式切割底物的三元复合物，就可以诱发其反式切割活性，即随机切割单链核酸及其等同物(核酸等同物如核酸类似物)。本具体实施方式所述的Cas蛋白为具有反式切割活性的蛋白。尤其是，在比进行等温扩增反应的体系温度更高的温度下，仍然具有活性，尤其是反式切割活性的Cas蛋白。
术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型的酶。
术语“Cas12b”、“C2c1”可互换使用，是指sgRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-B型的酶。
术语“PAM”是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是与CRISPR效应蛋白靶向的DNA序列直接相邻的短DNA序列，是Cas12a或Cas12b切割双链DNA所必须，比如，Cas12a的PAM为TTTV，AacCas12b的PAM为TTN序列。
术语“靶标DNA或RNA分子”，当待检的是核酸分子时，是待检DNA或RNA或其特异性部分；当待检的是非核酸分子时，靶标DNA或RNA分子是事先设计好的核酸序列。
术语“CRISPR一步法检测技术”(或简称一步法检测、一步法、一管法、一锅法)是在CRISPR分子诊断系统基础上发展出的一种快速、便捷式的检测技术，它可以在一个反应管中同步实现靶标核酸的扩增和检测。该技术采用CRISPR-Cas系统和等温扩增技术相结合，不需要将扩增后的核酸产物进行开盖操作，可以在短时间内特异性的检测出靶标核酸。CRISPR一步法检测技术是一种快速、准确、高灵敏度和高特异性的检测技术，不仅操作简便，而且能提升目前等温扩增技术的检测特异性。相比于传统的PCR技术，CRISPR一步法检测不需要复杂的温度控制和多步骤操作，具有更高的实时性和便携性。
术语“体系”应作为广义理解，可以为组合物、产品组合、试剂、试剂盒，也可以为含有前述组合物、产品组合、试剂、试剂盒的仪器设备，也可以为将组合物、产品组合、试剂、试剂盒用于检测时形成的混合物，以及含有前述混合物的仪器设备等等。
术语“体系温度”指体系(用于检测时形成的混合物)的温度。
术语的“向导RNA”是成熟的crRNA与tracrRNA融合作为向导RNA，或者成熟的crRNA与scoutRNA融合作为向导RNA，或者crRNA单独作为向导RNA。
一般而言，向导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat sequences，又称DR序列)和导向序列(guide sequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以包括crRNA和scoutRNA，还可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与顺式切割底物DNA具有足够互补性从而与所述顺式切割底物DNA杂交并引导CRISPR/Cas蛋白-向导RNA复合物与所述顺式切割底物DNA的特异性结合的多核苷酸序列，通常具有15-28nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与顺式切割底物DNA 100％互补。所述的导向序列不与反式切割报告分子中的核酸互补。
在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应顺式切割底物DNA之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的
匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在两个序列之间的该位置上是同一的。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Pro.Natl.Acad.Sci.USA85:244,Thompsonetal.,1994,Nucleic Acids Res 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,Genetics ComputerGroup)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。
术语“RPA”指重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)；术语“RAA”指重组酶介导链替换核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification，RAA)；术语“ERA”指酶促重组等温扩增技术(Enzymatic RecombinaseAmplification，ERA)。术语“MIRA”指多酶恒温快速扩增技术(Multienzyme Isothermal RapidAmplification，简称MIRA)，是一种恒温核酸快速扩增技术，依靠多种功能蛋白(解旋酶、重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶等)协同作用，在常温下实现核酸快速扩增。这四种种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和，引物设计更简单等优点，且检测原理相似。
本具体实施方式提出了一种RNA。一种RNA，所述RNA序列如SEQ ID NO.23所示。该RNA的用途，是作为向导RNA，用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的组合物，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的产品组合，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是印第安纳沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是印第安纳沙门氏菌的一管法检测。
在所述RNA的基础上，提出了一种组合物，所述组合物包括用于CRISPR核酸检测的组合物，所述用于CRISPR核酸检测的组合物包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA；及单链核酸报告分子。
所述组合式还包括用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的组合物，所述用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的组合物包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：
1.1)、F引物，所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；和
1.2)、R引物，所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
所述组合物的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的产品组合，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的体系，所述检测是印第安纳沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是印第安纳沙门氏菌的一管法检测。
在所述RNA的基础上，还提出了一种产品组合，所述产品组合包括用于CRISPR核酸检测的产品组合，所述用于CRISPR核酸检测的产品组合包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA；及单链核酸报告分子。
V-B型Cas蛋白、向导RNA和单链核酸报告分子可以单独形成产品然后组合，也可以两两形成产品然后组合，还可以一起形成产品。
所述产品组合还包括用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的产品组合，所述用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的产品组合包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：
1.1)、F引物，所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；和
1.2)、R引物，所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
上述产品组合的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是印第安纳沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是印第安纳沙门氏菌的一管法检测。
在所述RNA的基础上，提出了一种试剂或试剂盒。
一种试剂或试剂盒，包括用于CRISPR核酸检测的试剂，所述用于CRISPR核酸检测的试剂包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA；及单链核酸报告分子。
所述试剂盒中，V-B型Cas蛋白、向导RNA和V-B型Cas蛋白可以分别容置于三个容器中，也可以容置于两个容器中，还可以容置于同一个容器中。
所述试剂或试剂盒还包括用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的试剂，所述用于RPA/RAA/ERA/MIRA核酸扩增的试剂包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：
1.1)、F引物，所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；和
1.2)、R引物，所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
所述试剂盒中，所述引物组、聚合酶和dNTP可以分别容置于三个容器中，也可以容置于两个容器中，还可以容置于同一个容器中。
所述试剂或试剂盒还包括：缓冲液。
所述试剂或试剂盒的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是印第安纳沙门氏菌的检测。
一种基于RPA/RAA/ERA/MIRA-CRISPR/Cas12b检测印第安纳沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
使待检样本与以下物质接触：
如上文所述的组合物，或者如上文所述的试剂，或者如上文所述的试剂盒；
测定信号的变化。
所述V-B型Cas蛋白是Cas12b；所述检测的温度为30℃～50℃，优选37～42℃，更优选40～42℃。
在另一优选例中，所述Cas12b的来源选自下组：嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、卡氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluskakegawensis)、大孢脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus macrosporangiidus)、芽孢杆菌属V3-13(Bacillus sp.V3-13)、外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黏胶球形菌纲细菌(Lentisphaeriabacterium)、非常脱硫弧菌(Desulfovibrio inopinatus)、沉积物莱西氏菌(Laceyella sediminis)、螺旋体细菌(Spirochaetes bacterium)、热生肿块芽胞杆菌(Tuberibacillus calidus)的Cas12b(TcCas12b)或其组合。
在另一优选例中，所述Cas12b的选自下组：来自嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)的Cas12b(AaCas12b)、来自卡氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus kakegawensis)的Cas12b(AkCas12b)、来自大孢脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus macrosporangiidus)的Cas12b(AmCas12b)、来自外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)的Cas12b(BhCas12b)、来自芽孢杆菌属(Bacillus)的BsCas12b、来自芽孢杆菌V3-13(Bacillus sp.V3-13)的Cas12b(Bs3Cas12b)、来自非常脱硫弧菌(Desulfovibrio inopinatus)的Cas12b(DiCas12b)、来自沉积物莱西氏菌(Laceyellasediminis)的Cas12b(LsCas12b)、来自螺旋体细菌(Spirochaetes bacterium)的Cas12b(SbCas12b)、来自热生肿块芽胞杆菌(Tuberibacillus calidus)的Cas12b(TcCas12b)。
在另一优选例中，所述Cas12b选自下组：AapCas12b、AacCas12b、AaCas12b、BthCas12b、AkCas12b、AmCas12b、BsCas12b、Bs3Cas12b、LsCas12b、BvCas12b、BrCas12b、EbCas12b或其组合。
具体实施方式
实施例1
1、实验材料与方法
1.1、实验仪器
表1实验仪器
仪器名称 仪器型号 生产厂家
全自动医用PCR分析系统 SLAN-96S 上海宏石医疗科技有限公司
QuantStudio3实时荧光定量PCR系统 QuantStudio3 ThermoFisher
QuantStudio5实时荧光定量PCR系统 QuantStudio5 ThermoFisher
Qubit荧光光度分度计 Qubit4 ThermoFisher
AccuMini数字PCR系统 AccuMini 臻准生物科技(上海)有限公司
恒温水浴锅 BWS-10 上海一恒科学仪器有限公司
1.2、实验试剂
表2实验试剂
2、实验方法
2.1、印第安纳沙门氏菌检测靶标选择
通过参考文献资料及相关序列分析比对，最终选择A7P63_09100基因(SEQ IDNO.1)作为印第安纳沙门氏菌特异性检测靶标，并构建含有A7P63_09100基因序列的质粒pUC57-SI_A7P63_09100。
pUC57-SI_A7P63_09100质粒大小：2710bp+615bp＝3325bp，其中，2710bp是pUC57载体序列，615bp是需要构建合成的靶标序列(SEQ ID NO.1)长度。
使用Qubit测定100μLTE稀释的质粒浓度，其浓度平均值：19.25ng/μL。
计算浓度为：5.36×109copies/μL。
2.2、印第安纳沙门氏菌RPA引物设计
根据选择的印第安纳沙门氏菌A7P63_09100基因序列进行RPA引物设计，印第安纳沙门氏菌SI_A7P63_09100引物设计序列参见表3。
表3印第安纳沙门氏菌RPA引物
2.3、印第安纳沙门氏菌RPA引物筛选
(1)印第安纳沙门氏菌RPA反应体系
按照下表4准备反应体系，将上述RPA反应体系手弹混匀，并短暂离心，然后将其加入到RPA试剂盒自带的基础反应单元中，轻柔手弹基础反应单元使得冻干粉能充分溶解均匀，随后短暂离心将液体收集至管底。最后打开反应单元，向每个反应单元的管盖内侧加入5μL乙酸镁，然后向反应单元中加入模板。
表4印第安纳沙门氏菌RPA反应体系
试剂名称 体积(μL)
缓冲液Ⅴ(RAA核酸扩增试剂盒自带，下同) 25
SA_invA-F(10μM) 2
SA_invA-R(10μM) 2
无核酸酶水 11
Total 40
反应程序为：恒温37℃，反应时间为30min。使用数字PCR定量的pUC57-SI_A7P63_09100质粒作为模板进行RPA引物筛选。
参见图2，SI_A7P63_09100-RPA-5引物的扩增产物电泳跑胶目的条带最为明显，故选择SI_A7P63_09100-RPA-5为最佳扩增引物。后续实验如无特别说明，均采用SI_A7P63_09100-RPA-5。
2.4、印第安纳沙门氏菌sgRNA设计
根据印安纳沙门氏菌筛选出的性能较佳的RPA引物SI_A7P63_09100-RPA-5，在其扩增片段范围内进行相应的Cas12b sgRNA设计，序列详见表5所示，备注：下划线部分序列为靶标序列。
表5印第安纳沙门氏菌sgRNA序列
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2.5、印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法检测体系建立
(1)印第安纳沙门氏菌Cas12b sgRNA体外转录与纯化
使用吐露港生物的Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and PurificationKit(货号31904,ToloBio)试剂盒来进行Cas12b sgRNA的体外转录与纯化操作，具体流程如下所示。
①DNA转录模板制备
将Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit中的Cas12bSense Oligo与SI_A7P63_09100-sgRNA-R系列引物退火延伸反应完成后便可作为转录模板使用。
表6印第安纳沙门氏菌Cas12b sgRNA体外转录oligo序列
a.退火延伸体系配制
表7退火延伸体系
组分 体积
2×PCRMasterMix 10μL
Cas12bSenseOligo(10μM) 0.5μL
SI_A7P63_09100-sgRNA-R(10μM) 0.5μL
无核酸酶水 9μL
b.PCR退火延伸程序设置
表8 PCR退火延伸程序
②Cas12b sgRNA体外转录
a.按下表试剂的顺序进行反应体系的配制。
表9反应体系
b.将上述试剂充分混匀，然后短暂离心，在37℃下孵育2-4h进行体外转录，延长转录时间可提高转录产量，如果转录产物用于CRISPR一管法检测，推荐过夜转录12-16h。
c.37℃孵育结束后，按照下表配制30μL的DNaseⅠ反应液加入到20μL的体外转录产物中，以去除转录体系中的DNA模板。
表10 DNaseⅠ反应液
组分 体积
2×DNaseⅠ缓冲液 25μL
DNaseⅠ 4μL
无核酸酶水 1μL
DNaseⅠ反应条件：37℃，30min。
③Cas12b sgRNA转录产物磁珠纯化
a.首先将磁珠从4℃冰箱中取出，在室温中放置约30min，使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取25μL磁珠和50μL异丙醇加入到50μL待纯化的sgRNA样品中，用移液器吹打充分混匀。
b.室温孵育5min，使RNA结合到磁珠上。
c.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心移除上清。
d.保持样品置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇,漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。
e.重复步骤4，共漂洗2次。
f.保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5min。
g.将样品从磁力架上取出，加入50μLNuclease-free water，用移液器吹打以充分混匀，室温静置5min。
h.将样品置于磁力架5min，待溶液澄清后，小心转移上清至一个新的Nuclease-free PCR管中，即得到纯化后的Cas12b sgRNA。
(2)印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系筛选
在RPA反应体系的基础上，对印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系进行sgRNA的筛选，具体参见下表11所示。
表11印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系筛选
试剂名称 体积(μL)
缓冲液V 25
SI_A7P63_09100-F5(10μM) 2
SI_A7P63_09100-R5(10μM) 2
SI_A7P63_09100-5-sgRNA(10μM) 1.25
AapCas12b(10μM) 1.25
HOLMESssDNAreporter(10μM) 2.5
无核酸酶水 6
乙酸镁(RAA核酸扩增试剂盒自带，下同) 5
模板 5
总量 50
反应程序为：恒温37℃，每间隔30s来采集FAM荧光通道信号，反应时间为45min。
根据图3可知，印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系中SI_A7P63_09100-5-sgRNA-10性能最佳。后续实验，如无特别说明，均采用SI_A7P63_09100-5-sgRNA-10。
2.6、印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法检测体系优化
①CRISPR一管法Cas蛋白和sgRNA用量优化
根据表11筛选出的印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法检测体系来继续优化CRISPR一管法检测体系中的Cas蛋白和sgRNA用量。
表12印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法中Cas蛋白和sgRNA用量优化
试剂名称 体积(μL)
缓冲液V 25
SI_A7P63_09100-F5(10μM) 2
SI_A7P63_09100-R5(10μM) 2
SI_A7P63_09100-5-sgRNA(10μM) 0.3125/0.625/1.25/2.5
AapCas12b(10μM) 0.3125/0.625/1.25/2.5
HOLMESssDNAreporter(报告分子)(10μM) 2.5
无核酸酶水 7.875/7.25/6/3.5
乙酸镁 5
模板 5
总量 50
反应程序为：恒温37℃，每间隔30s来采集FAM荧光通道信号，反应时间为45min。
根据图4可知，SI-5-sgRNA10体系中sgRNA和Cas12b浓度为125nM和250nM时起峰较快且信号较好。后续实验，如无特别说明，均采用sgRNA和Cas12b浓度为250nM。
②CRISPR一管法反应温度优化
按照表12筛选的最佳结果来进行印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法反应体系的配制，反应温度按照37-42℃来进行最佳反应温度的筛选。结果见图5。根据图5可知，41℃最佳。后续实验，如无特别说明，均采用41℃。
③CRISPR一管法反应探针优化
为了选择ssDNA报告分子(即探针)，共设计并测试了4个探针，分别命名为8A-FQ、8T-FQ、8C-FQ和8G-FQ，见表13。如图6所示，只有8G-FQ探针在有或没有目标核酸序列的反应中都没有产生荧光信号。8A-FQ探针的荧光强度在NTC与试验组之间无显著性差异。与8T-FQ相比，8C-FQ中NTC与试验组之间的荧光强度差异要大得多。后续实验，如无特别说明，均采用8C-FQ。
表13探针序列
HOLMESssDNAreporter Sequence(5’-3’)
8A-FQ 5’-/6-FAM/AAAAAAAA/BHQ1/-3’
8T-FQ 5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’
8C-FQ 5’-/6-FAM/CCCCCCCC/BHQ1/-3’
8G-FQ 5’-/6-FAM/GGGGGGGG/BHQ1/-3’
2.7、印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法检测体系的灵敏度测试和特异性实验
①灵敏度测试：将SI质粒进行2倍梯度稀释，每个梯度测试5个重复，具体浓度如下：200copies/Test,100copies/Test,50copies/Test,25copies/Test,12.5copies/Test，选择95％的检出率作为最低检出限LoD。结果见图7，其LoD为14.4copies/test。
②特异性实验：使用22株沙门氏菌(包括4株印第安纳沙门氏菌)和8株非沙门氏菌基因组核酸进行特异性验证实验。结果见图8，测试结果表明印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法体系只能检测到4株印第安纳沙门氏菌，其它沙门氏菌和非沙门氏菌均检测不到。
本具体实施方式的有益效果如下：
(1)初步建立印第安纳沙门氏菌CRISPR一管法检测体系，检测时间为45min，具有检测快速、操作便捷等特性，同时也具有较高的检测灵敏度。
(2)使用CRISPR一管法检测体系不用二次开盖加样，不仅能避免气溶胶污染发生，同时利用CRISPR技术能提升等温扩增检测的特异性，避免出现假阳性结果的风险。
(3)整个反应时间比传统的PCR方法短。RPA-CRISPR/Cas12的反应温度低，所有混合物都可以预制备。因此，没有精密的仪器和特殊的技术人员的要求。
(4)与Cas12a不同，Cas12b具有广泛的温度适应能力，在37℃到60℃的温度下工作，这与RPA在37℃时的重组酶的热谱重叠。此外，Cas12b几乎不允许sgRNA与靶DNA序列存在错配，因此比CRISPR/Cas12a检测方法具有更高的特异性和准确性。在本具体实施方式中，RPA-CRISPR/Cas12b在临床样本检测中的特异性高于PCR。因此，RPA-CRISPR/Cas12b方法有助于减少临床样本检测中的假阳性结果。
附：
构建含有印第安纳沙门氏菌A7P63_09100保守基因序列的质粒pUC57-SI_A7P63_09100，A7P63_09100序列如下(SEQ ID NO.1)：
ATGTTAAAATTTAGGACGATTTTTTTAAAGAAGATTTTTACATTGAAGAATTCAATCCTTGCCCGTCGCGGGGCTGTTATCGTTATTGTTTCAGCAGTTTTTACATCAATAATGTTTTTTGCCCATAGTTGGGCATCTGACAAAGAAGTGGCAATGACACTTTCCGTTCTTAACAGCAATGAGTATAACTTTTCATCAACTTCGGATGTTCTATCTACCACTCGAAAAGAATACGAAAAGAAACATGCTTTAGAAATAAAAGAGAAAAATGATAAAGAGTTCGAAGAATGTGAAATTCAAAACGAAAACTCGAAACTACCATGTTTGAATGGAAATGAATTTTCAGTAGCGACACAATGGAAAATAAATGGAGTAAATAGCTCTTGTAATGAATATGATATGCAGGGAGATTCTGGTAAGGGATATGACTCTGAATCTCAATGTAAAATTAGTCTCAATAAATGGTTAAAAGAAAATAATAAAATAACTCCATGGCATATAGCCCAAACTTCATTTTTCTGGTTAGACATTACTGGTTTACTGTTTATGTTTGGAGGGTTTTTGACAACTCTTTTTGCTGGAATGCGAGCGTTATGGGGTAAATCAGATTCTTAA
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于CRISPR的印第安纳沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F引物、R引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/CCCCCCCC/BHQ1/-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒中，每50μL包括：
缓冲液25μL；
F引物2μL，浓度10μM；
R引物2μL，浓度10μM；
向导RNA 1.25μL，浓度10μM；
Cas12b 1.25μL，浓度10μM；
单链核酸报告分子2.5μL，浓度10μM；
无核酸酶水6μL；
Mg2+5μL；
待检样本5μL。
5.一种基于CRISPR检测印第安纳沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：
采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。
6.根据权利要求5所述的方法，所述检测的温度为30℃～50℃，优选37℃～42℃，更优选40℃～42℃。
7.根据权利要求5所述的方法，所述检测方法中的核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。
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