CN117821630A

CN117821630A - 用于检测肠炎沙门氏菌的核酸检测试剂盒及方法

Info

Publication number: CN117821630A
Application number: CN202410188691.6A
Authority: CN
Inventors: 沈海玉; 龚建森; 盛中伟; 张笛; 李婷婷; 董永毅; 许明; 吴坤; 盛瑜; 窦新红
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2024-02-20
Filing date: 2024-02-20
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测肠炎沙门氏菌的一步法CRISPR/Cas12b检测试剂盒及方法，所述试剂盒包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；所述单链核酸报告分子为5’‑/6‑FAM/TTTTTTTT/BHQ1/‑3’。本发明成功开发了一种肠炎沙门氏菌检测试剂盒，采用本发明的试剂盒进行检测，核酸扩增和检测同步进行，无需开盖检测。实验结果表明，本发明肠炎沙门氏菌检测系统具有较好的特异性和灵敏度。

Description

用于检测肠炎沙门氏菌的核酸检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种用于检测肠炎沙门氏菌的新型检测试剂盒及非诊断性检测方法。

背景技术

肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis，SE)被确定为食源性沙门氏菌病(也称为胃肠炎)的主要原因，它在国内外导致了明显的发病率、死亡率和经济损失。在临床中，SE引起的沙门氏菌病的典型表现包括发热、腹泻、呕吐、偶尔出现侵袭性感染。一般来说，大多数SE是通过食用受污染的食物或饮用受污染的水获得，很少在人与人之间传播。因此，从食物来源中及时识别SE对于限制对公共卫生的影响至关重要。

传统的Kauffman-White(K-W)血清型分型作为沙门氏菌亚型方法已有80多年，该方法已鉴定出了2600多种沙门氏菌血清型。然而，传统的血清分型是耗时、不精确和低鉴别能力的。到目前为止，尽管传统的基于实时PCR的食品和环境样本中的SE检测方法已经非常有效，但其结果在很大程度上依赖于精确的仪器，训练有素的技术人员伴随着较长的反应周期。环介导等温扩增(LAMP)的出现和应用明显克服了基于PCR的SE检测方法的缺点，并明显减少了反应时间。然而，需要进一步努力解决LAMP的假阳性问题。因此，人们迫切需要一种简单、准确的SE检测方法。

目前，成簇的规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统为细菌检测提供了一种新的方法。CRISPR/Cas具有显著的生物学特征，包括序列可编程性和顺式切割的特异性，反式切割的信号放大效应，以及相对温和的反应温度，可能是一种重要的现代生物传感器系统。因此，一些基于CRISPR/Cas的平台已经被开发出来，并在SE检测方面具有较高的特异性优势。然而，大多数基于CRISPR/Cas的平台都是多步骤和耗时的，很难避免气溶胶的污染。

发明内容

为了解决上述问题，本发明拟建立一种单管RPA-CRISPR/Cas的SE的一步法和一锅法检测系统，忽略冗余的开帽过程，提高检测效率，避免交叉污染。

本发明的目的是提出一种基于CRISPR的肠炎沙门氏菌新型核酸检测试剂盒及其方法。为了实现本发明的上述目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种基于CRISPR的肠炎沙门氏菌新型核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述B3引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.35所示；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒还包括：缓冲液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒中，每25μL的体系包含：

10×LAMP缓冲液，2.5μL；

dNTP，1μL，浓度25mM；

Mg²⁺，2μL，浓度100mM；

10×LAMP引物，2.5μL；

甘氨酸，6μL，浓度2M；

单链核酸报告分子，1.25μL，浓度10μM；

Cas12b，2.5μL，浓度10μM

Bst，1μL，浓度8U/μL；

向导RNA，2.5μL，浓度10μM；

无核酸酶水，1.25μL；

待检样本，2.5μL。

本发明另一方面还涉及一种基于CRISPR检测肠炎沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：

采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。

在本发明的一个优选实施方式中，所述检测的温度为59～61℃，优选为59.5～60.5℃。

在本发明的一个优选实施方式中，所述检测方法中的核酸扩增和检测可同步进行，中间不需要开盖。

本发明将LAMP核酸扩增与CRISPR/Cas12b核酸检测结合成一步，建立了一种快速、灵敏、准确的SE检测方法。核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。实验结果表明，本发明的肠炎沙门氏菌感染检测系统是简单和准确的。

附图说明

图1是本发明的原理图。

图2是实施例1的肠炎沙门氏菌LAMP引物筛选结果图。

图3是实施例1的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法体系建立结果图(图中NTC为无模板阴性对照，下同)。

图4是实施例1的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法Cas蛋白和sgRNA用量优化结果图。

图5是实施例1的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法体系反应温度优化结果图，SE7-sgRNA-2一管法体系温度梯度测试梯度测试(模板质粒250copies/μL)。

图6是实施例1的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法体系单链核酸报告分子优化结果图。

图7是实施例1的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法试剂的添加剂优化的结果图。

图8是实施例1的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法的灵敏度实验的结果图。

图9是实施例1的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法的特异性实验的结果图。

具体实施方式

术语

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“CRISPR”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。

术语“CRISPR-Cas”：一种独特的源自细菌和古细菌的基因组元件，作为一种适应性免疫防御系统，以抵御入侵的噬菌体或外来核酸。该系统由成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(简称Cas蛋白、Cas)组成。

术语“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR相关蛋白(有些文献翻译为CRISPR-Cas效应蛋白、CRISPR/Cas效应蛋白、CRISPR-Cas效应子、CRISPR/Cas效应子)，可以为V型Cas蛋白或VI型Cas蛋白。V型Cas蛋白，其一旦在向导RNA引导下与顺式切割底物结合形成Cas蛋白-向导RNA-顺式切割底物的三元复合物，就可以诱发其反式切割活性，即随机切割单链核酸及其等同物(核酸等同物如核酸类似物)。本具体实施方式所述的Cas蛋白为具有反式切割活性的蛋白。尤其是，在比进行等温扩增反应的体系温度更高的温度下，仍然具有活性，尤其是反式切割活性的Cas蛋白。

术语“Cas12a”(旧称“Cpf1”)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-A型的酶。

术语“Cas12b”、“C2c1”可互换使用，是指sgRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V-B型的酶。

术语“PAM”是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是与CRISPR效应蛋白靶向的DNA序列直接相邻的短DNA序列，是Cas12a或Cas12b切割双链DNA所必须，比如，Cas12a的PAM为TTTV，AacCas12b的PAM为TTN序列。

术语“靶标DNA或RNA分子”，当待检的是核酸分子时，是待检DNA或RNA或其特异性部分；当待检的是非核酸分子时，靶标DNA或RNA分子是事先设计好的核酸序列。

术语“CRISPR一步法检测技术”(或简称一步法检测、一步法、一管法、一锅法)是在CRISPR分子诊断系统基础上发展出的一种快速、便捷式的检测技术，它可以在一个反应管中同步实现靶标核酸的扩增和检测。该技术采用CRISPR-Cas系统和等温扩增技术相结合，不需要将扩增后的核酸产物进行开盖操作，可以在短时间内特异性的检测出靶标核酸。CRISPR一步法检测技术是一种快速、准确、高灵敏度和高特异性的检测技术，不仅操作简便，而且能提升目前等温扩增技术的检测特异性。相比于传统的PCR技术，CRISPR一步法检测不需要复杂的温度控制和多步骤操作，具有更高的实时性和便携性。

术语“体系”应作为广义理解，可以为组合物、产品组合、试剂、试剂盒，也可以为含有前述组合物、产品组合、试剂、试剂盒的仪器设备，也可以为将组合物、产品组合、试剂、试剂盒用于检测时形成的混合物，以及含有前述混合物的仪器设备等等。

术语“体系温度”指体系(用于检测时形成的混合物)的温度。

术语的“向导RNA”是成熟的crRNA与tracrRNA融合作为向导RNA，或者成熟的crRNA与scoutRNA融合作为向导RNA，或者crRNA单独作为向导RNA。

一般而言，向导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat sequences，又称DR序列)和导向序列(guide sequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以包括crRNA和scoutRNA，还可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与顺式切割底物DNA具有足够互补性从而与所述顺式切割底物DNA杂交并引导CRISPR/Cas蛋白-向导RNA复合物与所述顺式切割底物DNA的特异性结合的多核苷酸序列，通常具有15-28nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与顺式切割底物DNA 100％互补。所述的导向序列不与反式切割报告分子中的核酸互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应顺式切割底物DNA之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在两个序列之间的该位置上是同一的。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Pro.Natl.Acad.Sci.USA85:244,Thompson etal.,1994,NucleicAcids Res22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA,Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。

本具体实施方式提出了一种RNA。一种RNA，所述RNA序列如SEQ ID NO.60所示。该RNA的用途，是作为向导RNA，用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的组合物，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的产品组合，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是肠炎沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是肠炎沙门氏菌的一管法检测。

在所述RNA的基础上，提出了一种组合物，所述组合物包括用于CRISPR核酸检测的组合物，所述用于CRISPR核酸检测的组合物包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA，序列如SEQ ID NO.60所示；及单链核酸报告分子。

所述组合式还包括用于LAMP核酸扩增的组合物，所述用于LAMP核酸扩增的组合物包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：

1.1)、F3引物，所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；

1.2)、B3引物，所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；

1.3)、FIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

1.4)、BIP引物，所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；和

1.5)、LB引物，所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。

所述组合物的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的产品组合，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的反式切割活性进行检测的体系，所述检测是肠炎沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是肠炎沙门氏菌的一管法检测。

在所述RNA的基础上，还提出了一种产品组合，所述产品组合包括用于CRISPR核酸检测的产品组合，所述用于CRISPR核酸检测的产品组合包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA，序列如SEQ ID NO.60所示；及单链核酸报告分子。

V-B型Cas蛋白、向导RNA和单链核酸报告分子可以单独形成产品然后组合，也可以两两形成产品然后组合，还可以一起形成产品。

所述产品组合还包括用于LAMP核酸扩增的产品组合，所述用于LAMP核酸扩增的产品组合包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：

1.1)、F3引物，所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；

1.2)、B3引物，所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；

1.3)、FIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

1.4)、BIP引物，所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；和

1.5)、LB引物，所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。

上述产品组合的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的试剂盒，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是肠炎沙门氏菌的检测，优选地，所述检测是肠炎沙门氏菌的一管法检测。

在所述向导RNA的基础上，提出了一种试剂或试剂盒。

一种试剂或试剂盒，包括用于CRISPR核酸检测的试剂，所述用于CRISPR核酸检测的试剂包括：V-B型Cas蛋白；向导RNA，所述向导RNA是如上文所述的RNA，序列如SEQ IDNO.60所示；及单链核酸报告分子。

所述试剂盒中，V-B型Cas蛋白、向导RNA和V-B型Cas蛋白可以分别容置于三个容器中，也可以容置于两个容器中，还可以容置于同一个容器中。

所述试剂或试剂盒还包括用于LAMP核酸扩增的试剂，所述用于LAMP核酸扩增的试剂包括引物组、聚合酶和dNTP，所述引物组包括以下引物：

1.1)、F3引物，所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；

1.2)、B3引物，所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；

1.3)、FIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；

1.4)、BIP引物，所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；和

1.5)、LB引物，所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。

所述试剂盒中，所述引物组、聚合酶和dNTP可以分别容置于三个容器中，也可以容置于两个容器中，还可以容置于同一个容器中。

所述试剂或试剂盒还包括：缓冲液。

所述试剂或试剂盒的用途是用于利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性的检测方法，或者用于制备利用V-B型Cas蛋白的顺式或反式切割活性进行检测的体系，所述检测是肠炎沙门氏菌的检测。

一种基于LAMP-CRISPR/Cas12b检测肠炎沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

使待检样本与以下物质接触：

如上文所述的组合物，或者如上文所述的产品组合，或者如上文所述的试剂，或者如上文所述的试剂盒；

测定信号的变化。

所述V-B型Cas蛋白是Cas12b；所述检测的温度为59～61℃，优选为59.5～60.5℃。

在另一优选例中，所述Cas12b的来源选自下组：嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)、卡氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacilluskakegawensis)、大孢脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus macrosporangiidus)、芽孢杆菌属V3-13(Bacillus sp.V3-13)、外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黏胶球形菌纲细菌(Lentisphaeriabacterium)、非常脱硫弧菌(Desulfovibrio inopinatus)、沉积物莱西氏菌(Laceyella sediminis)、螺旋体细菌(Spirochaetes bacterium)、热生肿块芽胞杆菌(Tuberibacillus calidus)的Cas12b(TcCas12b)或其组合。

在另一优选例中，所述Cas12b的选自下组：来自嗜酸脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)的Cas12b(AaCas12b)、来自卡氏脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus kakegawensis)的Cas12b(AkCas12b)、来自大孢脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus macrosporangiidus)的Cas12b(AmCas12b)、来自外村尚芽孢杆菌(Bacillus hisashii)的Cas12b(BhCas12b)、来自芽孢杆菌属(Bacillus)的BsCas12b、来自芽孢杆菌V3-13(Bacillus sp.V3-13)的Cas12b(Bs3Cas12b)、来自非常脱硫弧菌(Desulfovibrio inopinatus)的Cas12b(DiCas12b)、来自沉积物莱西氏菌(Laceyellasediminis)的Cas12b(LsCas12b)、来自螺旋体细菌(Spirochaetes bacterium)的Cas12b(SbCas12b)、来自热生肿块芽胞杆菌(Tuberibacillus calidus)的Cas12b(TcCas12b)。

在另一优选例中，所述Cas12b选自下组：AapCas12b、AacCas12b、AaCas12b、BthCas12b、AkCas12b、AmCas12b、BsCas12b、Bs3Cas12b、LsCas12b、BvCas12b、BrCas12b、EbCas12b或其组合。

本发明探索和优化了一步式LAMP-CRISPR/Cas12b系统进行SE检测的反应条件，实现了简单、准确、快速地检测SE。

实施例1

1、实验材料与方法

1.1、实验仪器

表1实验仪器

1.2、实验试剂

表2实验试剂

1.3、实验方法

1.3.1、肠炎沙门氏菌检测靶标选择

参考文献资料及相关序列分析比对，最终选择prot6E基因(SEQ ID NO.1)作为肠炎沙门氏菌特异性检测靶标，并构建含有prot6E序列的质粒pUC57-SE_prot6E。

pUC57-SE_prot6E质粒大小：2710bp+730bp＝3440bp。

使用Qubit测定100μLTE稀释的质粒浓度，其浓度平均值：23.3ng/μL。

计算浓度为：6.28×10⁹copies/μL。

1.3.2、肠炎沙门氏菌LAMP引物设计

根据选择的肠炎沙门氏菌prot6E基因序列进行LAMP引物设计，肠炎沙门氏菌prot6E LAMP引物设计序列参见表3。

表3肠炎沙门氏菌LAMP引物

1.3.3、肠炎沙门氏菌LAMP引物筛选

(1)LAMP引物mix配制

按照下表4引物用量比例来进行10×LAMP引物mix的配制，如果LAMP引物中没有使用Loop引物(LF/LB)，则使用无核酸酶水来代替相应体积占比。

表410×LAMP引物mix配制

(2)肠炎沙门氏菌LAMP反应体系

表5肠炎沙门氏菌LAMP反应体系

试剂名称	体积(μL)
		10×LAMP缓冲液	2.5
dNTPmix(25mM)	1.4
		MgSO₄(100mM)	1.75
10×SE_prot6ELAMP引物mix	2.5
		甘氨酸(2M)	6
100×SYTO-9	0.25
		Bst酶	1
无核酸酶水	7.1
		模板	2.5
总量	25

反应程序为：恒温60℃，每间隔30s来采集FAM荧光通道信号，反应时间为30min。使用数字PCR定量的pUC57-SE_prot6E质粒作为模板进行LAMP引物筛选。筛选结果见图2。SE_prot6E-LAMP-7最佳，后续实验如无特殊说明，均使用SE_prot6E-LAMP-7。

1.3.4、肠炎沙门氏菌sgRNA设计

根据肠炎沙门氏菌筛选出的性能较佳的LAMP引物，在其扩增片段范围内进行相应的Cas12b sgRNA设计，序列详见表6所示，下划线部分序列为靶标序列。

表6肠炎沙门氏菌sgRNA序列

1.3.5、肠炎沙门氏菌CRISPR一管法检测体系建立

(1)肠炎沙门氏菌Cas12b sgRNA体外转录与纯化

使用吐露港生物的Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and PurificationKit(货号31904,ToloBio)试剂盒来进行Cas12b sgRNA的体外转录与纯化操作，具体流程如下所示。

①DNA转录模板制备

将Cas12b High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit中的Cas12bSense Oligo与SE_prot6E-sgRNA-R系列引物退火延伸反应完成后便可作为转录模板使用。

表7肠炎沙门氏菌Cas12b sgRNA体外转录oligo序列

a.退火延伸体系配制

表8退火延伸体系配制

组分	体积
		2×PCRMasterMix	10μL
Cas12bSenseOligo(10μM)	0.5μL
		SE_prot6E-sgRNA-R(10μM)	0.5μL
无核酸酶水	9μL

b.PCR退火延伸程序设置

表9 PCR退火延伸程序设置

②Cas12b sgRNA体外转录

a.按下表试剂的顺序进行反应体系的配制。

表10反应体系

组分	体积
		5×TranscriptMax反应缓冲液	4μL
NTPmix	8μL
		TranscriptMaxEnzymeMix	2.1μL
无核酸酶水	0.9μL
		DNA转录模板	5μL

b.将上述试剂充分混匀，然后短暂离心，在37℃下孵育2-4h进行体外转录，延长转录时间可提高转录产量，如果转录产物用于CRISPR一管法检测，推荐过夜转录12-16h。

c.37℃孵育结束后，按照下表配制30μL的DNaseⅠ反应液加入到20μL的体外转录产物中，以去除转录体系中的DNA模板。

表11 DNaseⅠ反应液

组分	体积
		2×DNaseⅠ缓冲液	25μL
DNaseⅠ	4μL
		无核酸酶水	1μL

DNaseⅠ反应条件：37℃，30min。

③Cas12b sgRNA转录产物磁珠纯化

a.首先将磁珠从4℃冰箱中取出，在室温中放置约30min，使其温度平衡至室温。颠倒或涡旋振荡使磁珠充分混匀，吸取25μL磁珠和50μL异丙醇加入到50μL待纯化的sgRNA样品中，用移液器吹打充分混匀。

b.室温孵育5min，使RNA结合到磁珠上。

c.将样品置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心移除上清。

d.保持样品置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇,漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。

e.重复步骤4，共漂洗2次。

f.保持样品始终处于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5min。

g.将样品从磁力架上取出，加入50μL无核酸酶水，用移液器吹打以充分混匀，室温静置5min。

h.将样品置于磁力架5min，待溶液澄清后，小心转移上清至一个新的无核酸酶PCR管中，即得到纯化后的Cas12b sgRNA。

(2)肠炎沙门氏菌CRISPR一管法体系筛选

在LAMP反应体系的基础上，对肠炎沙门氏菌CRISPR一管法体系进行dNTP、MgSO₄浓度和sgRNA的筛选，具体参见下表12所示。dNTP及镁离子浓度梯度测试结果见图3。dNTP1.0mM最佳，Mg²⁺12mM最佳，后续实验如无特殊说明，均采用dNTP1.0mM，Mg²⁺12mM。

表12肠炎沙门氏菌CRISPR一管法体系筛选

反应程序为：恒温60℃，每间隔30s来采集FAM荧光通道信号，反应时间为45min。

1.3.6、肠炎沙门氏菌CRISPR一管法检测体系优化

①CRISPR一管法Cas蛋白和sgRNA用量优化

根据表12筛选出的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法检测体系来继续优化CRISPR一管法检测体系中的Cas蛋白和sgRNA用量。结果见图4，AapCas12b/sgRNA的浓度，250nM最佳。后续实验如无特殊说明，AapCas12b/sgRNA的浓度均采用250nM。

表13肠炎沙门氏菌CRISPR一管法中Cas蛋白和sgRNA用量优化

试剂名称	体积(μL)
		10×LAMP缓冲液	2.5
dNTPmix(25mM)	1
		MgSO₄(100mM)	2
10×SE_prot6ELAMP引物mix	2.5
		甘氨酸(2M)	6
HOLMESssDNAreporter(报告分子)(10μM)	1.25
		AapCas12b(10μM)	0.625/1.25/1.875/2.5
Bst(8U/μL)	1
		SE_prot6E-sgRNA(10μM)	0.625/1.25/1.875/2.5
无核酸酶水	5/3.75/2.5/1.25
		模板	2.5
总量	25

②CRISPR一管法探针序列及浓度优化

测试不同探针序列及浓度对CRISPR一管法检测体系的影响，不同探针序列如下表14所示。

表14探针序列

探针名称	序列(5’-3’)
		8A-FQ	5’-/6-FAM/AAAAAAAA/BHQ1/-3’
8T-FQ	5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’
		8C-FQ	5’-/6-FAM/CCCCCCCC/BHQ1/-3’
8G-FQ	5’-/6-FAM/GGGGGGGG/BHQ1/-3’

参见图5，8T-FQ效果最好。后续实验，如无特别说明，均采用8T-FQ。

③CRISPR一管法反应温度优化

按照表12、表13和表14筛选的最佳结果来进行肠炎沙门氏菌CRISPR一管法反应体系的配制，反应温度按照60-65℃，ΔT＝1℃来进行最佳反应温度的筛选。结果见图6，60℃最好。后续实验，如无特别说明，均采用反应温度60℃。

④CRISPR一管法试剂的添加剂优化。

按照表12、表13和表14筛选的最佳结果来进行肠炎沙门氏菌CRISPR一管法反应体系的配制，反应温度60℃，添加不同浓度的添加剂，得到结果见图7。结果表明，0.24M的甘氨酸最佳。后续实验，如无特别说明，均采用0.24M的甘氨酸。

1.3.6、肠炎沙门氏菌CRISPR一管法检测的灵敏性和特异性

按照表12、表13和表14筛选的最佳结果来进行肠炎沙门氏菌CRISPR一管法反应体系的配制，反应温度60℃，探针使用8T-FQ，反应温度为57℃，添加0.24M的甘氨酸。

①灵敏度实验：将肠炎沙门氏菌质粒进行稀释，每个浓度测试10个重复，具体浓度如下：100copies/test,75copies/test,50copies/test,25copies/test,12.5copies/test，选择95％的检出率作为最低检出限LoD，实验结果见图8，其LoD为42.6copies/test。

②特异性实验：使用提取的22种沙门氏菌基因组核酸和9种非沙门氏菌基因组核酸进行沙门氏菌属CRISPR一步法检测体系特异性测试。

表15肠炎沙门氏菌特异性验证细菌名称

从图9可知，肠炎沙门氏菌CRISPR一步法体系检测不同种的沙门氏菌，只能检测出肠炎沙门氏菌，其它沙门氏菌和非沙门氏菌均不能被检测出。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明建立的肠炎沙门氏菌CRISPR一管法检测体系，检测时间大约为45min，具有检测快速、操作便捷等特性，同时也具有较高的检测灵敏度。

(2)使用CRISPR一管法检测体系不用二次开盖加样，不仅能避免气溶胶污染发生，同时利用CRISPR技术能提升等温扩增检测的特异性，避免出现假阳性结果的风险。

附：构建含有肠炎沙门氏菌prot6E保守序列的质粒pUC57-SE_prot6E，prot6E序列如下(SEQ ID NO.1)：

CGTCGTTGCTGCTTCCGGGAATGACAGCCATGAGTATTTCACTTCCCGGCACCGCAGCA

ATGGTTGGGTTCGGGGGAGACTATACCTACAGGGGCACAATAACCGTAACCGGAGAGGC

GCTCATCGGTCCTGCTGTAGATGCAAGGGTGCCTAAGGTTAGTGTGACTCTCTGTAGCTC

GACCAAAGTGACGGTGGAACAATGCAACGCCCGGTTAGAGCGCAAAAATCAGGATGGC

TCATGGAATGTTGTGACAGGGATGCAGTGTACAGGGCAAAATAGCAATAATTTAAGTGT

GGTGACCCCCATCTCAAAAATCTATAAGCTCGTGTACGGCGATTTCTACCGTGTCGTTTTT

ATGAATGTGAGGGCGAGGTTTGAACCAAGTGGAGCAGCTGAGCATGGTTCGCGTTGTTT

TGTTGAAAAACAAAGCTACAGCTATGGGAATCCTGTCAGTGGAGGAGTACTGGAGTTGA

GTACATTGTCAGGTCAAACTGAACGTTTGGCTGCCTATGGCCAGCACGAGACGACATTC

TTGATGCCAGTCACTGCGGTCGATAAAACTTATATCGAATACCCGACCATGACCCGGTTG

AGTGTTGCTCCCGACGGAAGCGCGCGCGGACAGGTAGTCACCGTTGTGGGTCGTAACG

CACAAGTGAAATTTACCCTGAGGGAGGCTTATGGTAATAATAATTTGGGGCAGTATTGGA

TACCAACGGCTGCTAGCGG

以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于CRISPR的肠炎沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物、向导RNA、Cas12b蛋白、单链核酸报告分子；所述F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；所述B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；所述FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；所述BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；所述单链核酸报告分子为5’-/6-FAM/TTTTTTTT/BHQ1/-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括聚合酶和dNTP。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括：缓冲液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒中，每25μL的体系包含：

10×LAMP缓冲液，2.5μL；

dNTP，1μL，浓度25mM；

Mg²⁺，2μL，浓度100mM；

10×LAMP引物，2.5μL；

甘氨酸，6μL，浓度2M；

单链核酸报告分子，1.25μL，浓度10μM；

Cas12b，2.5μL，浓度10μM

Bst，1μL，浓度8U/μL；

向导RNA，2.5μL，浓度10μM；

无核酸酶水，1.25μL；

待检样本，2.5μL。

5.一种基于CRISPR检测肠炎沙门氏菌的方法，所述方法包括以下步骤：

采用上述试剂盒扩增待检样本，测定荧光信号的变化。

6.根据权利要求5所述的方法，所述检测的温度为59～61℃，优选为59.5～60.5℃。

7.根据权利要求5所述的方法，所述检测方法中的核酸扩增和检测同步进行，中间不需要开盖。