CN115747353A

CN115747353A - 一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN115747353A
Application number: CN202210260047.6A
Authority: CN
Inventors: 薛俊欣; 蒋原; 杨捷琳; 申进玲; 李健
Original assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Current assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组、试剂、试剂盒及检测方法。本发明所述的引物组包括CRISPR/Cas12a引物组及crDNA引物组，其碱基序列分别如SEQ ID No.1、2、3和4所示。该检测方法使用RPA扩增技术进行靶标DNA扩增，再与CRISPR/Cas12a体系偶联，等温条件下扩增，用荧光检测仪检测扩增结果的荧光曲线，以判断待测样品里是否存在单核细胞增生李斯特菌。本发明的检测方法快捷迅速、特异性强、灵敏度高、不需要特殊仪器,在疾病监测、临床诊断和食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

Description

一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组、试剂、试剂盒及检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LMO)，是一种食源性人兽共患病病原，为革兰氏阳性杆菌，主要以食物为传染媒介，是最为致命的食源性致病菌之一。它对环境适应能力强，在低温、高盐和极端pH等不利条件下仍然具有生长能力，可在4℃缓慢生长，所形成的生物膜有利于其产生持久性污染，是几乎所有食物的重要传染源。人类一旦感染发病后，可引起血液和脑组织感染进而导致败血症、脑膜炎等疾病，因为其人畜共患的特点，受感染的动物也成为扩大其感染流行率的载体，严重威胁人类的健康。同时，由于食品动物在生产、屠宰、销售等环节均有受污染的可能，这为单核细胞增生李斯特菌的定植、生长及传播提供了便利条件，相关食品召回和环境消杀也造成了一定的经济损失。因此，开发单核细胞增生李斯特菌的快速检测方法，及早和准确地检出单核细胞增生李斯特菌具有重要的意义。

目前针对单核细胞增生李斯特菌的检测方法以细菌培养、生化反应和血清学分型为主，虽然传统培养方法对实验设备的要求不高，但是检测的周期较长，且不利于大批量的样品检测，同时也费时费力，无法满足当前检测工作中对样品进行快速检测的要求。随着分子生物学的快速发展，以聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)为核心的核酸扩增技术逐渐应用广泛，可以快速进行多批量样本检测，大大缩短了检测时间。PCR和定量PCR技术将检测时间缩短到几个小时，但对实验室设备的依赖限制了它们用于现场检测，特别是在偏远地区。近年来，已经建立了几种等温核酸扩增技术如环等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)等，避免了昂贵和复杂的热循环仪的使用，可以满足现场检测的需求，但是由于LAMP其特异性方面的缺陷容易导致假阳性，干扰检测准确性。因此，仍需要开发更加准确快速检测方法来克服这些不足。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组，能够基于CRISPR/Cas12a方法对单核细胞增生李斯特菌进行快速、准确、高效的检测。

本发明还提出一种具有上述引物组的试剂和/或试剂盒。

本发明还提出一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的方法。

根据本发明的第一个方面，提出了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组，所述引物组包括CRISPR/Cas12a引物组和crDNA引物组；

所述CRISPR/Cas12a引物组包括如SEQ ID NO.1所示序列的CRISPR/Cas12a上游引物，和如SEQ ID NO.2所示序列的CRISPR/Cas12a下游引物；

所述crDNA引物组包括如SEQ ID NO.3所示序列的crDNA上游引物，和如SEQ IDNO.4所示序列的crDNA下游引物。

根据本发明的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明的引物组可以通过基于CRISPR/Cas12a方法对单核细胞增生李斯特菌进行快速、准确、高效的检测；其中，crDNA引物组通过使用crRNA转录试剂进行转录，制备得到对应的crRNA，CRISPR/Cas12a引物组用于对待测样本中的提取的DNA进行扩增得到核酸扩增产物，将制备得到的crRNA作为CRISPR/Cas12a反应体系的反应物对上述核酸扩增产物进行检测，可获得敏度、准确、快速的检测结果，判断待测样本内是否含有单核细胞增生李斯特菌。

根据本发明的第二个方面，提出了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的试剂，所述试剂包括上述引物组中的至少一种。

根据本发明的第三个方面，提出了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括crRNA转录试剂、核酸扩增试剂、探针和Cas12a酶中的至少一种。

在本发明中，所述crRNA转录试剂用于制备crRNA，通过使用如SEQ ID NO.3所示序列的crDNA上游引物，和如SEQ ID NO.4所示序列的crDNA下游引物，转录制备得到对应的crRNA；

所述核酸扩增试剂用于对待检测样本中提取的DNA进行核酸扩增反应，通过使用如SEQ ID NO.1所示序列的CRISPR/Cas12a上游引物，和如SEQ ID NO.2所示序列的CRISPR/Cas12a下游引物，扩增得到核酸扩增产物；

将上述得到的crRNA、核酸扩增产物、Cas12a酶进行CRISPR/Cas12a反应，通过荧光检测确定样本中是否存在单核细胞增生李斯特菌。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述crRNA转录试剂包括缓冲液、NTP、T7RNA聚合酶中的至少一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述核酸扩增试剂为RPA或RAA扩增试剂。

在本发明中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)和重组酶介导的扩增技术(recombinase-aidamplification，RAA)均为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中均使用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，在37℃恒温下进行核酸快速扩增。其不同点在于重组酶的来源不同，RPA体系的重组酶来源于T4噬菌体，RAA体系的重组酶来源于细菌或者真菌。在本发明的一些实例中，均可购买商业化的RPA或RAA体系的核酸扩增试剂进行反应。

在本发明的一些实施方式中，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。其中，探针的核苷酸序列SEQ ID NO.5：CACCGACGGCGAGACCGACTTT。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述探针的两端分别连接荧光基团，所述荧光基团选自FAM、TAMRA、TET、HEX、Cy3、Cy5和ROX中的至少一种。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述探针的核苷酸序列为FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMRA。

根据本发明的第四个方面，提出了一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待检测样本的DNA；优选地，使用细菌基因组提取试剂盒提取待测样本的DNA；

S2、使用上述引物组中的CRISPR/Cas12a引物组对步骤S1中获得的DNA进行核酸扩增反应得到核酸扩增产物；

S3、将上述引物组中的crDNA引物组转录为crRNA；优选地，利用H7 RNA合成试剂盒进行转录；

S4、利用步骤S3中制备的crRNA对步骤S2中制备的核酸扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应；

S5、通过荧光检测确定检测结果。

根据本发明的一种具体的实施方式的检测方法，至少具有以下有益效果：本发明的检测方法使用等温核酸扩增技术(例如RPA/RAA扩增技术)进行靶标DNA扩增，再与CRISPR/Cas12a体系偶联，在42℃的等温条件扩增30min，用荧光检测仪检测扩增结果的荧光曲线，以判断待测样品里是否存在单核细胞增生李斯特菌；该方法能够对单核细胞增生李斯特菌进行快速、准确、高效的检测，具有较高的特异性和灵敏度。

在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括RPA扩增反应或RAA扩增反应。

在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S4中所述CRISPR/Cas12a反应的反应温度约为42℃，所述CRISPR/Cas12a反应的时间为15～30min。

在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S5中所述检测结果根据是否出现“S”型扩增曲线判断。出现“S”型扩增曲线时，说明待测样本中含有单核细胞增生李斯特菌。

本发明针对动物性食品链中单核细胞增生李斯特菌进行检测，以核酸扩增技术为核心，通过建立一系列的核酸检测方法，建立一种更加快速、精确、稳定的检测方法。对方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析，其检测灵敏度高，可在短时间内完全结果检测，准确性高。该方法具有快读、可定量、敏感度高等特点。

CRISPR/Cas12a作为一种新兴的生物技术，可以用于病原菌的快速恒温检测。Casl2a能在crRNA的引导下特异识别并裂解富含T核苷酸PAM序列的dsDNA，并在特定的位点裂解靶标链实现检测的目的。将RPA扩增技术与Casl2a偶联，使用RPA扩增技术进行靶标DNA扩增，再加入CRISPR体系，Casl2a-crRNA复合物结合靶标DNA后，激活了反式切割活性，切割体系中的标记荧光基团，产生荧光信号。该方法的主要特点在于高效快速、操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于实时现场检测。高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例2中的分别利用设计合成的2对RAA引物检测单增李斯特菌阳性质粒的凝胶电泳图，其中，质粒的浓度分别为10⁹拷贝/μL、10⁸拷贝/μL、10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL和0拷贝/μL；

图2为本发明实施例5中CRISPR/Cas12a方法的建立，其中，曲线1、2分别为单核细胞增生李斯特菌751、535，曲线3为阴性对照；

图3为本发明实施例6中CRISPR/Cas12a灵敏度检测实验结果，其中，实验曲线1-6分别对应单核细胞增生李斯特菌751的菌液浓度10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL，曲线7为空白对照；

图4为本发明实施例7中CRISPR/Cas12a方法对常见致病菌特异性验证实验结果，其中曲线1为单核细胞增生李斯特菌751，曲线2-8分别为英诺克李斯特菌、格氏李斯特菌、斯氏李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌以及空白对照的扩增结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

材料试剂：以下实施例中使用试剂均为市售商品，所用引物根据如表1序列进行商业合成。

实施例1 RAA引物、crRNA的设计与合成

鉴于单增李斯特菌与其他食源性细菌的同源性较高，发明人通过对O基因序列进行比，经过大量的筛选，共设计出了2套扩增引物及相应的crDNA。引物序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1单增李斯特菌RAA扩增引物

实施例2 RAA扩增方法的灵敏度检测

使用实施例1中的2套引物进行RAA扩增方法的灵敏度检测，扩增具体过程为：

S1、梯度模板的制备：单增李斯特菌O基因阳性质粒由本实验室构建，利用Nanodrop2000检测质粒浓度后，将质粒分别稀释为10⁸拷贝/μL、10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL和0拷贝/μL。

S2、RAA扩增：利用实施例1设计的两对引物，模板为上述不同浓度稀释的质粒，进行RAA扩增。按照50μL反应体系，每支冻干粉中加上下游引物各2μL(10μM)，水化缓冲液41.5μL，模板2μL，醋酸镁2.5μL。反应条件为37℃30min。

S3、扩增产物纯化：将2组扩增产物分别加入苯酚氯仿后震荡并10000g，离心5min。

S4、吸取步骤S3中2组水相成分利用1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增。结果如图1所示，图中M为DL2000，1-10和11-20泳道的质粒浓度分别为10⁹拷贝/μL、10⁸拷贝/μL、10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL和0拷贝/μL。11-20为LMO Cas12 F和LMO Cas12 R扩增产物，1-10为LMO Cas12 F 2和LMO Cas12 R2扩增产物。图中结果显示：采用引物LMO Cas12 F和LMO Cas12 R电泳法检测到阳性质粒的最低拷贝数为10⁴拷贝/μL，采用引物LMO Cas12 F2和LMO Cas12 R2电泳法检测到阳性质粒的最低拷贝数为10⁵拷贝/μL，引物LMO Cas12 F和LMO Cas12 R的扩增效率高于引物LMO Cas12F 2和LMO Cas12 R2。

通过对RAA扩增方法的灵敏度检测以及引物的筛选，选择引物对LMO Cas12 F和LMO Cas12 R作为最佳引物用于试剂盒中。

RAA实施例3：用于单增李斯特菌检测的引物组

本实施例提供了用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组，包括检测单核细胞增生李斯特菌的CRISPR/Cas12a引物组及crDNA引物组，其序列如表1所示：

表1.用于单核细胞增生李斯特菌CRISPR/Cas12a扩增的引物

上述单核细胞增生李斯特菌的CRISPR/Cas12a引物组及crDNA引物组浓度均为100μM；均由上海生物工程有限公司合成。

上述引物组主要用于基于CRISPR/Cas12a方法的单核细胞增生李斯特菌检测，其中，crDNA引物组用于制备crRNA，方法如下(T7转录)：

(1)将crDNA上下游引物(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)等比例混合，在95℃变性5分钟，室温孵育5分钟使其延伸形成双链。双链crDNA用T7转录试剂盒体外转录为crRNA，转录体系为无核酸酶的水12μL、10×Reaction Buffer(反应缓冲液)2μL、dNTP mix 2μL(10mM)、crDNA 2μL以及T7 RNA聚合酶，总反应体系20μL。将上述体系混合后37℃孵育3小时。

(2)转录结束后，加入1μL DNase I 37℃孵育15分钟去除痕量残留DNA，使用天漠RNA纯化试剂盒纯化后即得到纯度较高的crRNA，置于-80℃备用。转录合成的单增李斯特菌的crRNA序列为：AAUUUCUACUGUUGUAGAUCGGUGGCUCCGCAAAAGAUGAAGU。

实施例4：用于单增李斯特菌检测的试剂/试剂盒

本实施例提供了一种用于单增李斯特菌检测的试剂/试剂盒，包括：实施例3中的检测单核细胞增生李斯特菌的CRISPR/Cas12a引物组及crDNA引物组，还包括crRNA转录试剂、核酸扩增试剂、探针和Cas12a酶。

crRNA转录试剂用于制备crRNA，通过使用如SEQ ID NO.3所示序列的crDNA上游引物，和如SEQ ID NO.4所示序列的crDNA下游引物，转录制备得到对应的crRNA。crRNA转录试剂包括缓冲液、NTP、T7 RNA聚合酶。

核酸扩增试剂用于对待检测样本中提取的DNA进行核酸扩增反应，通过使用如SEQID NO.1所示序列的CRISPR/Cas12a上游引物，和如SEQ ID NO.2所示序列的CRISPR/Cas12a下游引物，扩增得到核酸扩增产物。本实施例中的核酸扩增试剂为RAA扩增试剂，能够实现恒温扩增。

实施例5：用于单增李斯特菌检测的方法

本实施例提供了一种用于单增李斯特菌检测的方法，具体过程为：

S1、采用细菌基因组提取试剂盒提取待测样品的DNA；

S2、先将crDNA上下游序列退火形成双链，将用T7转录试剂盒转录双链得到的crRNA纯化后即得到纯度较高crRNA，T7转录体系如表2所示；

表2.T7转录体系

S3、用上述CRISPR/Cas12a引物组进行RAA反应；

S4、RAA扩增产物加入到CRISPR/Cas12体系中，荧光检测仪42℃检测扩增结果的荧光曲线，反应体系如表3所示；

表3.CRISPR/Cas12反应体系

DNA模板	2μL
		10×buffer	2μL
crRNA	1μL
		10μmol/L探针	0.5μL
Cas12a酶	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	14μL

S5、结果判断：根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果。

以上检测方法具体通过下述实验过程建立和确证：

一、单核细胞增生李斯特菌RAA扩增

1)细菌培养及菌液的倍比稀释：将单核细胞增生李斯特菌751和535接种到营养肉汤中，摇床37℃，180rpm过夜培养得到菌液。用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M，pH＝7.4)10倍梯度稀释，制备不同浓度的活菌溶液，取适宜的3个连续梯度稀释液进行涂布平板计数；

2)目标DNA的提取：吸取1mL步骤1)中稀释的活菌溶液滴加到1.5mL离心管内，12000r/min离心2min，弃去上清液，用细菌总DNA分离试剂盒提取靶标DNA，储存在-20℃保存备用；

3)以单核细胞增生李斯特菌751和535的DNA作为模板，同时设置空白对照，利用实施例3中的CRISPR/Cas12a引物进行RAA扩增。

RAA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RAA反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、上下游引物各2μL(10μM)、模板2μL、最后再加入醋酸镁溶液2.5μL，总反应体系50μL。

RAA的反应条件：将上述RAA反应体系充分混匀，在3℃条件下，扩增15min。

以上步骤也为步骤S3中RAA的具体实现方法。

二、单核细胞增生李斯特菌的CRISPR/Cas12a方法的建立

将上述单核细胞增生李斯特菌751和535的RAA产物做为CRISPR/Cas12a的DNA模板。在八连管中，依次加入14μL的双蒸水、2μL 10×Buffer、纯化的crRNA 1μL、2μL上述RAA产物、10μmol/L探针0.5μL以及0.5μL Cas12a酶，总反应体系为20μL。本实施例中使用的探针为FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMRA，其中，FAM和TAMRA为荧光基团。在另一些实施例中，荧光基团还可以选择TET、HEX、Cy3、Cy5和ROX。记探针的序列为SEQ ID NO.5：CACCGACGGCGAGACCGACTTT。

加完后，体系立即置于恒温扩增仪上42℃收集荧光信号30分钟。实验结果如图2所示，其中曲线1、2分别为单核细胞增生李斯特菌751、535，曲线3为阴性对照。由实验结果可知，单核细胞增生李斯特菌751、535均检测出较强的荧光信号，阴性对照无荧光信号，证明本方法对于单核细胞增生李斯特菌具有较好的检测准确性，检测时间短，操作方便快速。

实施例6：检测方法的灵敏度测试实验

本实施例对所实施例5中建立的单核细胞增生李斯特菌的CRISPR/Cas12a方法进行灵敏度测试，具体步骤如下：

将单核细胞增生李斯特菌751菌液梯度稀释后，提取其靶标DNA，按照实施例5的实验方法进行不同浓度单增李斯特菌DNA的反应，加入2μL 10×Cas12 buffer，1μLcrRNA，0.5μL探针(10μM)，0.5μL Cas 12a酶(10μM)以及不同浓度单增李斯特菌靶标DNA，加水至反应总体系为20μL，42℃恒温扩增仪收集荧光信号30分钟。

实验结果如图3所示，由结果可知，本实施例中试剂盒和CRISPR/Cas12a检测方法的检测下限可以达到10³CFU/mL，证明其具有较高的检测灵敏度。

实施例7：检测方法的特异性验证实验

本实施例对所实施例5中建立的单核细胞增生李斯特菌的CRISPR/Cas12a检测方法进行特异性试验分析，本实施例中采用的菌株均由上海海关动植物与食品检验检疫技术中心提供，具体信息如表4所示：

表4.用于CRISPR/Cas12a特异性分析的菌株

将表4所列菌株按照实施例5中方法进行细菌培养及提取细菌DNA作为CRISPR/Cas12a反应模板。按照实施3所述的方法，进行CRISPR/Cas12a扩增。

CRISPR/Cas12a扩增体系及扩增条件：加入2μL 10×Cas12 buffer，1μL crRNA，0.5μL探针(10μM)，0.5μL Cas 12a酶(10μM)以及不同菌株的靶标DNA，加水至反应总体系为20μL，42℃恒温扩增仪收集荧光信号30分钟。

实验结果如图4所示，从结果中可知，只有单核细胞增生李斯特菌751的扩增结果呈阳性，李斯特菌属的其他菌以及其他常见致病菌的检测结果与空白对照的扩增结果无差异，呈现阴性。该结果表明，本发明CRISPR/Cas12a引物、crDNA以及CRISPR/Cas12a方法的特异性良好。

由上述实施例可知，本发明所述的检测方法具有快捷迅速、操作简单、特异性强、灵敏度高等优点，适用于实时现场检测。

本发明实施例的有益效果至少包括：

1)特异性强：设计的引物具有较高的特异性，目标菌株与其他菌株均被正确鉴定；

2)响应速度快：CRISPR/Cas12a技术能在30min内完成高效率的基因扩增；

3)灵敏度高：CRISPR/Cas12a扩增的灵敏度是普通RAA扩增的100倍，检测限可达10³CFU/mL；

4)结果判定简单：可根据荧光检测仪上的荧光曲线判定结果；

5)操作简便：只需要简单的恒温仪器设备即可。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组、试剂、试剂盒及检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaagtggga aatctgtctc aggtgatgta ga 32

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttcccatt gcctatacaa caaacttctt aaaag 35

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaattaata cgactcacta taggg 25

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acttcatctt ttgcggagcc accgatctac aacagtagaa attccctata gtgagtcgta 60

ttaatttc 68

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgacggc gagaccgact tt 22

Claims

1.一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括CRISPR/Cas12a引物组和crDNA引物组；

所述crDNA引物组包括如SEQ ID NO.3所示序列的crDNA上游引物，和如SEQ ID NO.4所示序列的crDNA下游引物。

2.一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的试剂，其特征在于，所述试剂包括如权利要求1所述的引物组。

3.一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的试剂。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括crRNA转录试剂、核酸扩增试剂、探针和Cas12a酶中的至少一种。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA转录试剂包括缓冲液、NTP、T7RNA聚合酶中的至少一种。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂为RPA或RAA扩增试剂。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

8.一种用于单核细胞增生李斯特菌检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待检测样本的DNA；

S2、使用如权利要求1中所述的CRISPR/Cas12a引物组对步骤S1中获得的DNA进行核酸扩增反应得到核酸扩增产物；

S3、将如权利要求1中所述的crDNA引物组转录为crRNA；

S5、通过荧光检测确定检测结果。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括RPA扩增反应或RAA扩增反应。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述CRISPR/Cas12a反应的反应温度约为42℃，所述CRISPR/Cas12a反应的时间为15～30min。