CN116103443A - 用于prrsv谱系1c变异株crispr检测的引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的引物组、试剂盒及其检测方法。具体地，本发明提供用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的引物组所述引物组包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的核酸扩增引物对。本发明所述的引物组能够用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测，使用CRISPR/Cas12a检测方法，能够高效、灵敏、特异性地检测PRRSV谱系1C变异株。

Description

用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的引物组、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及用于(PRRSV)谱系1C变异株CRISPR检测的引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive respiratory syndromevirus，PRRSV)是一种可以引起以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的猪繁殖与呼吸综合征的病毒，该病流行广，对养猪业危害严重。

PRRSV属于单分子线状单股正链RNA，全长约为15kb。PRRSV分为两个基因型：欧洲型(基因I型)和北美型(基因II型)。但由于PRRSV病毒基因变异，导致对于新型变异株的检测方法不准确，且一般的检测方法无法区分出经典株和变异株，因此需要开发新的方法检测PRRSV谱系变异株。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)谱系1C变异株CRISPR检测的引物组、试剂盒及其检测方法，能够高效、灵敏、特异性地检测PRRSV谱系1C变异株。

根据本发明的一个方面，提出了用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的引物组，包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的核酸扩增引物对。

在本发明的一些实施方式中，所述的引物组还包括如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的crDNA引物对。

在本发明的一些实施方式中，所述的PRRSV谱系1C变异株含有两个PRRSV谱系1C变异株序列的基因核苷酸，其中，一个为全基因序列，GenBank登录号为MW887655.1；另一个为测序获得的长度为603bp的序列，基因序列为(5’-3’)：ATGTTGGGGAAATGCTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGCTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTGTTTTGTTGCGCTCGTCAACGCCAACAACAGCAGCAGCTCCCATTTACAGTTGATTTATAACCTGACGATATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTAAATGAAAGATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTCGTTATCTTTCCTGTGTTGACTCATATCGTCTCTTACGGTGCCCTTACCACTAGCCATTTTCTTGACACGGTCGGCTTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTATTGAGTAGCATTTACGCTGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGATTTGCTTCGCCATTAGGTTGGCGAAAAATTGCATGTCCTGGCGCTACTCATGCACCAGATATACCAATTTTCTCCTGGATACTAAGGGCAAACTCTACCGCTGGCGGTCATCCGTCATTATAGAGAAAGGGGGTAAAGTGGATGTTGGGGGTCACTTAATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTGTAACCAAGATTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCATAG。

根据本发明的另一个方面，提出了用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的试剂盒，包括：上述引物组、核酸扩增试剂、crRNA转录试剂和Cas12a酶。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸扩增试剂为RPA或RAA扩增试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述crRNA转录试剂包括缓冲液、NTP、T7 RNA聚合酶中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述探针的两端分别连接荧光基团，所述荧光基团选自FAM、TAMRA、TET、HEX、Cy3、Cy5和ROX中的至少一种。

根据本发明的再一个方面，提出了用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的检测方法，包括以下步骤：

S1、提取待检测样本的DNA；

S2、使用上述核酸扩增引物组和核酸扩增试剂对步骤S1中获得的DNA进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

S3、将crRNA、探针和Cas12a酶与步骤S2中得到的核酸扩增产物混合，对所述核酸扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应；

S4、通过荧光检测确定检测结果。

在本发明的一些实施方式中，所述的方法为非诊断性和非治疗性方法。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3中所述crRNA通过crRNA转录试剂将上述所述crDNA引物对转录为所述crRNA。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述将所述crDNA序列转录为所述crRNA，具体包括以下步骤：将所述crDNA引物对的上下游序列退火形成双链；将用T7转录试剂盒转录双链得到的crRNA纯化后即得到纯度较高crRNA。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括RPA扩增反应或RAA扩增反应。

在本发明中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)和重组酶介导的扩增技术(recombinase-aidamplification，RAA)均为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中均使用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，在37℃恒温下进行核酸快速扩增。其不同点在于重组酶的来源不同，RPA体系的重组酶来源于T4噬菌体，RAA体系的重组酶来源于细菌或者真菌。在本发明的一些实例中，均可购买商业化的RPA或RAA体系的核酸扩增试剂进行反应。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3中所述CRISPR/Cas12a反应的反应温度约为39℃，所述CRISPR/Cas12a反应的时间为30～40min。

在本发明中，CRISPR/Cas12a作为一种新兴的生物技术，可以用于病原菌的快速恒温检测。Casl2a能在crRNA的引导下特异识别并裂解富含T核苷酸PAM序列的dsDNA，并在特定的位点裂解靶标链实现检测的目的。将RPA扩增技术与Cas12a偶联，使用RPA扩增技术进行靶标DNA扩增,再加入CRISPR体系，Cas12a-crRNA复合物结合靶标DNA后，激活了反式切割活性，切割体系中的标记荧光基团，产生荧光信号。该方法的主要特点在于高效快速、操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于实时现场检测。高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。

在本发明的一些具体的实施方式中，有益效果至少包括：本发明实施例设计的引物组具有极高的特异性及灵敏度，能够准确检测PRRSV谱系1C变异株，且对PRRSV的欧洲型和美洲型经典株及其它类别病毒检测呈阴性；本发明实施例的检测方法使用CRISPR/Cas12a技术能在30～40min内完成高效率的基因扩增，CRISPR/Cas12a扩增的灵敏度是普通RAA扩增的100倍，检测限可达10²CFU/mL，时间短、操作方便、灵敏度高、结果判断简单。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中RPA引物1检测PRRSV谱系1C变异株不同浓度质粒的凝胶电泳图；

图2为本发明实施例1中RPA引物2检测PRRSV谱系1C变异株不同浓度质粒的凝胶电泳图；

图3为本发明实施例3中RPA引物2检测PRRSV谱系1C变异株不同浓度质粒的凝胶电泳图；

图4为本发明实施例2中CRISPR检测PRRSV谱系1C变异株的敏感性的检测荧光实验图，

图5为本发明实施例3中CRISPR检测PRRSV谱系1C变异株的特异性的检测荧光实验图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

术语

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

术语“crRNA”是指CRISPR RNA。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：CRISPR检测的引物组及其检测方法

1、RPA引物、crRNA的设计与合成

从NCBI下载63个不同国家和地区分离的代表性的PRRSV全基因组序列，其中两个基因序列为PRRSV谱系1C变异株序列：一个为全基因序列，GenBank登录号为MW887655.1；另一个为测序获得的长度为603bp的序列，基因序列为(5’-3’)：

ATGTTGGGGAAATGCTTGACCGCGGGCTGTTGCTCGCAATTGCTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTGTTTTGTTGCGCTCGTCAACGCCAACAACAGCAGCAGCTCCCATTTACAGTTGATTTATAACCTGACGATATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTAAATGAAAGATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTCGTTATCTTTCCTGTGTTGACTCATATCGTCTCTTACGGTGCCCTTACCACTAGCCATTTTCTTGACACGGTCGGCTTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTATTGAGTAGCATTTACGCTGTCTGTGCCCTGGCTGCGTTGATTTGCTTCGCCATTAGGTTGGCGAAAAATTGCATGTCCTGGCGCTACTCATGCACCAGATATACCAATTTTCTCCTGGATACTAAGGGCAAACTCTACCGCTGGCGGTCATCCGTCATTATAGAGAAAGGGGGTAAAGTGGATGTTGGGGGTCACTTAATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTGTAACCAAGATTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCCATAG。

PRRSV谱系1C变异株基因组的特征：经生物信息学分析，PRRSV谱系1C变异株主要表现为单个碱基突变或多了碱基联系突变，这些突变不影响PCR扩增产物的限制性酶切多态性分析电泳的结果，单是临床感染表现为致病性增强，区别PRRSV谱系1C变异株处理常规的PCR扩增产物测序，亦可利用本研究建立的CRISPR方法进行鉴别诊断，本发明建立的CRISPR检测方法的crRNA可以有效识别PRRSV谱系1C变异株突变的核酸序列。

根据上述PRRSV谱系1C变异株基因组共设计合成3套RPA引物(本实施例设计的引物和crRNA主要针对上述提供的603bp的序列)及1条相应的crDNA。引物以及crDNA序列见表1。引物及crDNA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，利用H7 RNA合成试剂盒按照说明书操作将合成的crDNA转录为crRNA，-80℃保存。

表1.PRRSV谱系1C变异株RPA引物及crDNA序列

2、RPA扩增以PRRSV谱系1C阳性(1C变异)质粒DNA作为模板，同时设置空白对照，利用上述表1中的RPA引物分别进行RPA扩增。

RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、上下游引物各2μL(10μM)、模板2μL、最后再加入醋酸镁溶液2.5μL，总反应体系50μL。RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15min。RPA检测的灵敏度介于1×10⁴拷贝/μL至1×10³拷贝/μL，RPA引物3的扩增效率最高。

图1、图2和图3分别表示RPA引物1～RPA引物3检测PRRSV谱系1C变异株不同浓度质粒，其中，M:DNA分子质量标准DL2000；孔1-8：质粒浓度分别为1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10⁰拷贝/μL、0拷贝/μL。在同一曝光强度下，引物1和引物3扩增后电泳显示3个条带，也就是检测限为1×10⁴拷贝/μL，但是引物3的扩增产物浓度更高；另外，引物2扩增后电泳显示2个条带，也就是检测限为1×10⁵拷贝/μL，检测灵敏度低于引物1和引物3。因此，本实施例证明RPA引物3的扩增效率最高

3、CRISPR/Cas12a方法的建立

将上述利用RPA引物3的扩增产物做为CRISPR/Cas12a的DNA模板。在八连管中，依次加入14μL的双蒸水、2μL 10×Buffer、纯化的crRNA 1μL、2μL RPA产物、10μmol/L探针0.5μL以及0.5μL Cas12a酶，总反应体系为20μL。加完体系立即置于恒温扩增仪上39℃收集荧光信号30至40分钟。

实施例2：CRISPR/Cas12a方法进行灵敏度测试

将阳性质粒梯度稀释后，提取其靶标DNA，按照实施例1中CRISPR/Cas12a方法，加入2μL 10×Cas12 buffer，1μL crRNA，0.5μL探针(10μM)，0.5μL Cas 12a酶(10μM)以及不同浓度DNA，加水至反应总体系为20μL，39℃恒温扩增仪收集荧光信号40分钟。

为测试建立的CRISPR方法的敏感性，将PRRSV谱系1C阳性质粒进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为模板浓度分别为1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10⁰拷贝/μL、0拷贝/μL的模板。结果显示，CRISPR检测模板的下限量为10²拷贝/μL(图4)。

图4表示CRISPR检测PRRSV谱系1C变异株的敏感性，其中，孔1至孔8的模板浓度分别为1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10⁰拷贝/μL、0拷贝/μL。证明本实施例的检测方法对于PRRSV谱系1C变异株的检测灵敏度高。

实施例3：CRISPR/Cas12a方法进行特异性试验分析

将PRRSV变异株、欧洲型、美洲株阳性质粒和另外5种猪病病毒的阳性核酸利用CRISPR/Cas12a进行检测。CRISPR/Cas12a体系及反应条件：加入2μL 10×Cas12 buffer，1μL crRNA，0.5μL探针(10μM)，0.5μL Cas 12a酶(10μM)以及2μL RPA扩增产物，加水至反应总体系为20μL，39℃恒温扩增仪收集荧光信号30分钟。由图5可以看出，反应约5min后荧光强度逐渐升高，阳性样品的荧光值随着反应时间的延长逐渐升高，其他病毒样品的荧光值无明显变化。

图5表示CRISPR检测PRRSV谱系1C变异株的特异性，其中，孔1为PRRSV谱系1C阳性质粒，孔2至孔8分别为PRRSV欧洲型、PRRSV美洲型、CSFV、PPV、FMDV、ASFV和阴性对照。证明本实施例的检测方法对于PRRSV谱系1C变异株的检测特异性高，能够区分欧洲型和美洲型经典株以及其它猪病病毒。

实施例4：CRISPR检测PRRSV谱系1C变异株与荧光RT-PCR的一致性

为了验证建立的CRISPR方法的可靠性，将CRISPR方法用于检测46份核酸，其中含有11份核酸为模拟的不同核酸浓度的PRRSV谱系1C变异株阳性样本，阳性样本的荧光PCR检测的Ct值为28-36之间，荧光PCR检测方法为本研究建立的荧光RT-PCR方法(prrsv L1CVF2/R2/P2)。结果显示，经CRISPR检测10份阳性核酸呈显著荧光信号扩增，而所有阴性样品均未检测到荧光信号，特异性高(100％)，灵敏度较好(90.91％)，κ值介于0.81-1.00之间(κ＝0.94)，说明本研究建立普通PCR方法的检测结果与标准规定的检测结果几乎完全一致。CRISPR与RT-PCR检测结果对比见表2。

表2.CRISPR与荧光PCR检测PRRSV谱系1C变异株结果的一致性比较

通过与标准中的PCR方法比较,本实施例建立的CRISPR方法的特异性为：35/(35+0)＝100.00％；灵敏性为:10/(10+1)＝90.91％；Po＝(10+35)/46＝97.83％；Pe＝10/46×11/46+35/46×36/46＝64.74％；к＝(Po-Pe)/(1-Pe)＝0.94。

从上述结果可知，使用本发明的引物、试剂和方法检测PRRSV谱系1C变异株阳性样本的特异性高、灵敏度高，具有很好的检测效果，能够准确、有效地检测该种类型的猪病病毒，对生猪饲养和疾病防治有重要价值。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的引物组，其特征在于，包括：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列的核酸扩增引物对；以及如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示序列的crDNA引物对。

2.用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的引物组、核酸扩增试剂、crRNA转录试剂和Cas12a酶。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂为RPA或RAA扩增试剂。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA转录试剂包括缓冲液、NTP、T7RNA聚合酶中的至少一种。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.用于PRRSV谱系1C变异株CRISPR检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待检测样本的DNA；

S2、使用如权利要求1中所述核酸扩增引物对和核酸扩增试剂对步骤S1中获得的DNA进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

S3、将crRNA、探针和Cas12a酶与步骤S2中得到的核酸扩增产物混合，对所述核酸扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应；

S4、通过荧光检测确定检测结果。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述crRNA通过crRNA转录试剂将crDNA引物对转录为所述crRNA，所述的crDNA引物对如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述将所述crDNA序列转录为所述crRNA，具体包括以下步骤：

将所述crDNA引物对的上下游序列退火形成双链；

将用T7转录试剂盒转录双链得到的crRNA纯化后即得到纯度较高crRNA。

9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括RPA扩增反应或RAA扩增反应。

10.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述CRISPR/Cas12a反应的反应温度约为39℃，所述CRISPR/Cas12a反应的时间为30～40min。

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