CN117535432A - 基于RPA-CRISPR/Cas12a大肠杆菌检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开基于RPA‑CRISPR/Cas12a大肠杆菌检测试剂盒，包括RPA扩增预混液和CRISPR/Cas12a检测预混液。CRISPR/Cas12a检测预混液包括ssDNA探针、Cas12a蛋白和CrRNA，其中CrRNA的设计无需考虑PAM位点的限制，从而使RPA扩增反应可与CRISPR‑Cas12a的检测过程在同一试管中进行。整个检测过程操作简单，避免了液体转移潜在的污染风险及环境污染，可实现在恒温条件在30分钟内对100CFU/mL的大肠杆菌进行检测。本发明具有灵敏度高、特异性强、反应时间快、稳定性强的特点，适用于各种常见的食品样品如：牛奶、水果、蔬菜等样品的大肠杆菌检测。

Description

基于RPA-CRISPR/Cas12a大肠杆菌检测试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全的现场快速检测领域，具体涉及一种基于RPA-CRIPSR/Cas12大肠杆菌检测试剂盒。

背景技术

食源性致病菌是全球范围内造成食品安全问题的主要因素之一，其导致的食品公共安全问题严重危害公众健康，并造成巨大的经济损失。食源性致病菌能够存在于食品中导致人或者动物患病的微生物。大肠杆菌是常见的食源性致病菌。食用被大肠杆菌污染过的水果、蔬菜、肉类和饮品容易发生腹泻、发烧、呕吐、肠胃炎和肠出血等症状，严重者甚至危及生命。因此，在食品的生产销售过程中对大肠杆菌进行快速精准检测，对于保障人们健康安全至关重要。

目前我国对大肠杆菌的检测主要包括培养法、基于核酸分子的分子生物学检测技术和基于免疫学的检测技术。传统的培养法是大肠杆菌检测的金标准，但是检测的过程复杂且耗时长，需要专业的人员进行操作。基于免疫学的检测方法灵敏度较低，无法直接对食品样品中的大肠杆菌进行检测。而且整个操作过程涉及多个步骤的试剂添加、洗脱和孵育。随着分子生物学的发展，一些核酸扩增方法如PCR、RPA、LAMP等被逐步用于大肠杆菌的检测。但是现用的分子生物学检测方法需要专业的操作人员进行检测，并且对设备的要求较高。操作的过程中也容易造成假阳性和气溶胶污染等问题。

由于CRISPR/Cas12a的侧枝切割活性，被广泛的用于体外诊断领域。当CrRNA与目的核酸识别后能够激活Cas12a蛋白切割信号探针产生荧光。但是由于PAM位点的限制，传统的RPA-Cas12a技术需要先进行扩增再进行检测。两步法检测需要扩增产物的转移，这增加了操作的步骤并提高了污染的风险。因此，一种更方便快捷且适用于现场实时检测的方法对食品中大肠杆菌的检测具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一在于针对大肠杆菌，提出一种基于RPA-CRISPR/Cas12a大肠杆菌检测试剂盒，是一种无PAM位点限制，一步RPA-CRISPR/Cas12a的大肠杆菌检测试剂盒。区别于常规的CRISPR/Cas12a系统，该方法的CrRNA不依赖PAM位点。该方法可以将RPA反应与CRISPR检测集成到一个反应管中，避免了复杂的液体转移。

本发明的检测试剂盒包含：RPA扩增预混液和CRISPR/Cas12a预混液；其中RPA扩增预混液包括用于扩增RPA产物的正向引物RPA-F和反向引物RPA-R，其中CRISPR/Cas12a预混液包括ssDNA信号探针、Cas12a和CrRNA，所述ssDNA信号探针为两端分别修饰有荧光集团FAM和淬灭集团BHQ1的单链DNA，CrRNA为与目标片段互补配对的RNA序列，且不受PAM位点的限制。

其中，所述RPA-F的序列为GAATTAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTCAT(SEQ ID NO.1)；所述RPA-R的序列为ATTCACAAATATAAATAACTTGCTCATTCGATAG(SEQ ID NO.2)。

其中，所述ssDNA信号探针的序列为5‘FAM-TTATT-BHQ1 3’。

其中，所述与目标片段互补配对的CrRNA的序列为

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUCCUCAGCUAUAGGGUG(SEQ ID NO.8)。

作为优选，所述RPA预混液中还包括RPA Basic冻干粉，RPA Basic反应缓冲液，MgOAc以及DEPC水。

进一步的RPA预混液中包括500nM的RPA-F和RPA-R。

作为优选，所述CRISPR/Cas12a预混液包括LbCas12a、CrRNA和ssDNA信号探针。

进一步的，CRISPR/Cas12a预混液包括800nM LbCas12a、500nM CrRNA和800nM的ssDNA信号探针。

本发明目的之二是提供所述试剂盒在现场检测大肠杆菌中的应用，所述应用是在食品样品中快速检测大肠杆菌，所述食品样品包括各种常见的如：牛奶、水果、蔬菜。

所述大肠杆菌的浓度最低检测限为100CFU/mL。所述应用通过以下方法实现：

(1)采用水煮法热裂解提取大肠杆菌中的基因组DNA；

(2)将提取的基因组DNA、RPA预混液、Cas12预混液混匀，然后在37℃中反应20分钟；

(3)反应结束后，用470～520nm波长的LED灯检测和观察荧光信号。

其中，优选的，步骤(2)中混匀的具体操作如下：在一管冻干酶中加入RPA Basic反应缓冲液、正向引物RPA-F(10uM)、反向引物RPA-R(10uM)、DEPC水、LbCas12a、CrRNA和ssDNA，最后加入MgOAc和基因组DNA进行一步法反应。

所述基因组DNA为含有或者不含有rfbE基因上一段区别于其他物种的保守序列的模板DNA。

相较于现有技术，本发明具有以下优点：本发明通过设计不依赖PAM位点CrRNA，实现了一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测，由于CrRNA的非PAM位点设计使RPA扩增反应可以与CRISPR-Cas12a的检测过程在同一试管中进行。整个检测过程操作简单，避免了液体转移潜在的污染风险及环境污染。相比于其他分子检测技术，应用本发明试剂盒，不需要昂贵的大型仪器设备，不需要复杂的移液操作，避免因移液步骤造成的污染。本发明开发的检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间快、稳定性强的特点，能够适用于各种常见的食品样品如：牛奶、水果、蔬菜等样品的大肠杆菌检测。整个检测过程操作简单，避免了液体转移潜在的污染风险及环境污染，可实现在恒温条件在30分钟内对100CFU/mL的大肠杆菌进行检测。本发明建立的方法可以用于大肠杆菌的现场检测，有利于在食品生鲜市场、学校和超市等基层场景中进行推广应用，降低消费者的感染风险，为食源性致病菌大肠杆菌的快速现场检测提供依据。

附图说明

图1为本发明提供的RPA-CRISPR/Cas12a一锅法检测大肠杆菌的原理图。

图2为本发明提供的针对大肠杆菌的特异性RPA引物的筛选结果图。

图3为本发明提供的RPA-CRISPR/Cas12a一锅法结果验证图。

图4为本发明提供的不同食源性致病菌进行的特异性检测的终点荧光柱状图和实时荧光曲线结果图。

图5为本发明提供的不同大肠杆菌基因组浓度进行的灵敏度检测的终点荧光柱状图和实时荧光曲线结果图。

图6为本发明提供的加标奶粉中不同大肠杆菌菌液浓度进行的灵敏度检测的终点荧光柱状图和实时荧光曲线结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步进行说明。

实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

本发明所提供的基于一步RPA-CRISPR/Cas12a检测大肠杆菌DNA的方法基本原理如图1所示：大肠杆菌的靶基因在RPA扩增反应下进行指数扩增，同时CrRNA能够与识别目标片段互补配对，进而激活Cas12a的侧枝切割活性。激活后的Cas12a能够非特异性的切割ssDNA荧光探针，通过检测荧光信号来检测大肠杆菌。

实施例1特异性靶基因筛选及RPA扩增方法建立

1、靶基因筛选及引物设计

本发明针对大肠杆菌的rfbE基因目的片段设计了三对RPA引物，所述引物和目的片段如表1所示：

表1所述RPA引物和目的片段

2、RPA扩增反应

RPA扩增反应的反应体系如下所示：RPA Basic反应缓冲液29.5μL，280mM MgOAc2.5μL，10μM上游引物2.4μL，10μM下游引物2.4μL，模板5μL，DEPC水8.2μL。配置好的反应体系在37℃条件下反应20分钟。将扩增产物有蛋白酶K处理后，用2％的琼脂糖凝胶跑120v的电泳30min。利用小动物成像仪对扩增产物的结果进行观察，结果如图2所示。根据扩增产物的条带粗细观察，引物对1的效果最好。

实施例2一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

1、大肠杆菌基因组提取

通过水煮模板法对大肠杆菌进行核酸提取。大肠杆菌悬浊液直接95℃热裂解10min，将裂解后的溶液直接用于RPA-CRISPR/Cas12a反应。

2、CrRNA序列的设计和一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测体系的构建

根据目标片段的序列设计了一段CrRNA，具体的序列如下：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUCCUCAGCUAUAGGGUG(SEQ ID NO.8)。一步法的反应是将RPA反应与CRISPR反应集成在一管中进行。反应体系的组成如表2所示：

表2 RPA-CRISPR/Cas12a检测体系。

反应成分	体积(μL)
		(10μM)上游引物	2.4
(10μM)下游引物	2.4
		RPA Buffer	29.5
(20μM)Cas12a	1
		(10μM)CrRNA	4
(100μM)F-Q	0.4
		DEPC水	2.8
DNA模板	5
		(280mM)MgoAC	2.5
总计	50

其中，ssDNA报告分子的序列为：5‘FAM-TTATT-BHQ1 3’。

取热裂解后的模板按照上表的反应体系配置之后在37℃反应30min。反应结果如图3所示。结果显示该方法能够实现对大肠杆菌的一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测。

3、一步法RPA-CRISPR/Cas12a的特异性测试

采用水煮模板法对大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行核酸提取。将提取后的模板和水进行一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测，结果如图4所示。结果表明该方法对大肠杆菌具有很高的特异性，且检测过程中不存在交叉反应。

实施例3一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的灵敏度测试

1、基因组灵敏性检测

含有大肠杆菌rfbE目标片段的质粒标准品由生工(上海)生物合成。将质粒标准品梯度稀释为1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL，1×10²copies/μL和1×10¹copies/μL，同时以DEPC水为阴性对照。按照实例2中的表2配置反应体系。将反应体系置于酶标仪中反应并采集实时荧光信号。反应结果如图5所示，该反应能够对低至1×10²copies/μL的质粒标准品进行检测。

2、菌液样品灵敏度检测

对培养后的菌液进行菌落计数，同时梯度稀释菌液使得其浓度分别为1×10⁴CFU/mL，1×10³CFU/mL和1×10²CFU/mL。采用水煮模板法对大肠杆菌进行核酸提取。取5μL裂解后的上清液按照表2配置反应体系。在37℃下反应40min，利用酶标仪采集实时荧光信号。反应结果如图6所示，该反应能够对低至1×10²CFU/mL的大肠杆菌进行检测。

从上述的各项实施例结果可以看出，本发明的方法可以对大肠杆菌进行快速、灵敏、特异和准确的检测。避免了样品或环境交叉污染。该方法具有较强的抗干扰能力，无须复杂的核酸提取步骤，只需要简单的热裂解就可以完成样品的前处理环节。该方法实现了一步法RPA-CRISPR/Cas12a检测，无须复杂的配液和液体转移环节，简化了实验的步骤，降低了气溶胶污染的可能性。综上所述，该方法可以实现快速准确现场大肠杆菌检测。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应当视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a大肠杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：RPA扩增预混液和CRISPR/Cas12a预混液，其中RPA扩增预混液包括用于扩增RPA产物的正向引物RPA-F和反向引物RPA-R，其中CRISPR/Cas12a预混液包括ssDNA、Cas12a和CrRNA，所述ssDNA为两端分别修饰有荧光集团FAM和淬灭集团BHQ1的单链DNA，CrRNA为与目标片段互补配对的RNA序列，且不受PAM位点的限制。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-F的序列如SEQ ID NO.1所示：GAATTAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTCAT，所述RPA-R的序列如SEQ ID NO.2所示：ATTCACAAATATAAATAACTTGCTCATTCGATAG，所述ssDNA的序列为：5‘FAM-TTATT-BHQ1 3’，所述CrRNA的序列如SEQ ID NO.8所示：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUCCUCAGCUAUAGGGUG。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA预混液中还包括RPA Basic冻干粉、RPABasic反应缓冲液、MgOAc、DEPC水、RPA-F和RPA-R。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a预混液还包括LbCas12a、CrRNA和ssDNA信号探针。

5.权利要求1所述试剂盒在现场检测大肠杆菌中应用，其特征在于，所述应用是在食品样品中快速检测大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用通过以下方法实现：

(1)采用水煮法提取大肠杆菌基因组DNA；

(2)将提取的基因组DNA加入到离心管中，与RPA-CRISPR/Cas12a预混液混匀，在37℃反应30分钟；

(3)反应结束后，用470～520nm波长的LED灯检测和观察荧光信号。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)混匀的具体操作如下：在一管冻干酶中加入29.5μL缓冲液、正向引物RPA-F、反向引物RPA-R、DEPC水、LbCas12a、CrRNA和的ssDNA信号探针，最后加入MgOAc和基因组DNA进行一步法反应。

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌的浓度最低检测限为100CFU/mL。