JP3067850B2 - オリゴヌクレオチド及びそれを用いた乳酸菌の検出法 - Google Patents
オリゴヌクレオチド及びそれを用いた乳酸菌の検出法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、オリゴヌクレオチド及
びそれを用いた乳酸菌の検出法に関し、詳しくは食品、
特ににビールの品質に悪影響を及ぼすL.brevisをはじめ
とする乳酸菌の検出法に関するものである。
びそれを用いた乳酸菌の検出法に関し、詳しくは食品、
特ににビールの品質に悪影響を及ぼすL.brevisをはじめ
とする乳酸菌の検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】食品、特
にビール製造において乳酸菌[ ラクトバチルス（Lactob
acillus)属またはペディオコッカス(Pediococcus) 属 ]
はその耐酸性と耐アルコール性から最も重要な有害菌で
あり、その高感度かつ迅速な検出法が待望されてきた。
しかしながら、従来の培養法による乳酸菌の検出には数
日を要し、抗体による方法は選択性には優れているが、
検出感度が劣る。また、菌体内ＡＴＰを抽出し、ルシフ
ェラーゼ−ルシフェリンを用いて蛍光分析を行う方法は
乳酸菌の検出感度に優れるけれども選択性に劣る。さら
に、最近オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプローブ法
あるいはハイブリダイゼーション法が試みられるように
なってきたが、これらの方法も十分な検出感度と選択性
を得るのが難しい。このように、従来より種々の方法が
開発されてはいるものの、いずれも一長一短があり、検
出感度，選択性ともに優れた乳酸菌の検出方法は未だ存
在しないのが現状である。
にビール製造において乳酸菌[ ラクトバチルス（Lactob
acillus)属またはペディオコッカス(Pediococcus) 属 ]
はその耐酸性と耐アルコール性から最も重要な有害菌で
あり、その高感度かつ迅速な検出法が待望されてきた。
しかしながら、従来の培養法による乳酸菌の検出には数
日を要し、抗体による方法は選択性には優れているが、
検出感度が劣る。また、菌体内ＡＴＰを抽出し、ルシフ
ェラーゼ−ルシフェリンを用いて蛍光分析を行う方法は
乳酸菌の検出感度に優れるけれども選択性に劣る。さら
に、最近オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプローブ法
あるいはハイブリダイゼーション法が試みられるように
なってきたが、これらの方法も十分な検出感度と選択性
を得るのが難しい。このように、従来より種々の方法が
開発されてはいるものの、いずれも一長一短があり、検
出感度，選択性ともに優れた乳酸菌の検出方法は未だ存
在しないのが現状である。
【０００３】そこで、本発明の目的は、オリゴヌクレオ
チドを核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝
子増幅技術により乳酸菌、特にラクトバチルス・ブレビ
ス（L.brevis）由来の5S rRNA 遺伝子を検出する方法に
関し、食品の微生物管理検査に有用な、乳酸菌の簡便，
迅速かつ高感度な検出法を提供することにある。
チドを核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝
子増幅技術により乳酸菌、特にラクトバチルス・ブレビ
ス（L.brevis）由来の5S rRNA 遺伝子を検出する方法に
関し、食品の微生物管理検査に有用な、乳酸菌の簡便，
迅速かつ高感度な検出法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段および作用】本発明は、検
体中に存在する乳酸菌を選択的に検出するためのオリゴ
ヌクレオチドまたは乳酸菌の5S rRNA 遺伝子をコードす
るヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列
と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチ
ドであって、該ヌクレオチドが以下の配列群 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’・・・（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’・・・（ｂ） の少なくとも１つを有するか、または該配列に対応する
相補的配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチ
ド並びに上記配列群のうち、少なくとも１つを有するオ
リゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能さ
せ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させた後、検
体内に認識されるべき配列が存在しているか否かを判定
することにより乳酸菌の検出を行うことを特徴とする乳
酸菌の検出方法を提供するものである。
体中に存在する乳酸菌を選択的に検出するためのオリゴ
ヌクレオチドまたは乳酸菌の5S rRNA 遺伝子をコードす
るヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列
と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチ
ドであって、該ヌクレオチドが以下の配列群 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’・・・（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’・・・（ｂ） の少なくとも１つを有するか、または該配列に対応する
相補的配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチ
ド並びに上記配列群のうち、少なくとも１つを有するオ
リゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能さ
せ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させた後、検
体内に認識されるべき配列が存在しているか否かを判定
することにより乳酸菌の検出を行うことを特徴とする乳
酸菌の検出方法を提供するものである。
【０００５】本発明は、乳酸菌、特にラクトバチルス・
ブレビスの5S rRNA 遺伝子と選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、乳酸菌を選択
的に検出することを特徴としている。
ブレビスの5S rRNA 遺伝子と選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、乳酸菌を選択
的に検出することを特徴としている。
【０００６】本発明において、遺伝子増幅は例えばSaik
i らが開発したPolymerase Chain Reaction 法（Scienc
e 230,1350(1985)、以下、ＰＣＲ法と略すことがあ
る。) に基づいて行うことができる。この方法は、ある
特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合はラクトバ
チルス・ブレビスの5S rRNA 遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオチド重合反応の
プライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び
１本鎖に分離したのち、再び同様な反応を起こさせるも
のである。この一連の操作を繰り返すことにより、２つ
のプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー
数が増大してくる。
i らが開発したPolymerase Chain Reaction 法（Scienc
e 230,1350(1985)、以下、ＰＣＲ法と略すことがあ
る。) に基づいて行うことができる。この方法は、ある
特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合はラクトバ
チルス・ブレビスの5S rRNA 遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオチド重合反応の
プライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び
１本鎖に分離したのち、再び同様な反応を起こさせるも
のである。この一連の操作を繰り返すことにより、２つ
のプライマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー
数が増大してくる。
【０００７】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを
持ったヌクレオチド断片で、以下の配列群 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’・・・（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’・・・（ｂ） の少なくとも１つを有するか、または該配列に対応する
相補的配列を有するものである。このオリゴヌクレオチ
ドは化学合成で得られるものあるいは天然のもののどち
らでも良い。また、プライマーは特に検出用として標識
されていなくても良い。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを
持ったヌクレオチド断片で、以下の配列群 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’・・・（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’・・・（ｂ） の少なくとも１つを有するか、または該配列に対応する
相補的配列を有するものである。このオリゴヌクレオチ
ドは化学合成で得られるものあるいは天然のもののどち
らでも良い。また、プライマーは特に検出用として標識
されていなくても良い。
【０００８】プライマーが規定している増幅領域は、５
０塩基から２０００塩基、望ましくは１００塩基から１
０００塩基となれば良い。鋳型依存性ヌクレオチド重合
反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるが、この
酵素の起源については９０〜９５℃の温度で活性を有し
ていれば、どの生物種由来であっても良い。熱変性温度
は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせるア
ニーリング操作は３７〜６５℃、好ましくは４０〜６０
℃、重合反応は５０〜７５℃、好ましくは７０〜７５℃
であり、これを１サイクルとして２０から４０サイクル
行って増幅させる。
０塩基から２０００塩基、望ましくは１００塩基から１
０００塩基となれば良い。鋳型依存性ヌクレオチド重合
反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるが、この
酵素の起源については９０〜９５℃の温度で活性を有し
ていれば、どの生物種由来であっても良い。熱変性温度
は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせるア
ニーリング操作は３７〜６５℃、好ましくは４０〜６０
℃、重合反応は５０〜７５℃、好ましくは７０〜７５℃
であり、これを１サイクルとして２０から４０サイクル
行って増幅させる。
【０００９】乳酸菌の検出は、酵素反応液をそのままポ
リアクリルアミドゲル電気泳動又はアガロースゲル電気
泳動にかけることによって行われ、増幅されたヌクレオ
チド断片の存在及びその長さが確認できる。その結果か
ら、検体中にプライマーが認識すべき配列を持ったヌク
レオチドが存在しているかどうかを判定することができ
る。この判定は、そのまま乳酸菌の有無を判定するもの
となる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その
他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。
リアクリルアミドゲル電気泳動又はアガロースゲル電気
泳動にかけることによって行われ、増幅されたヌクレオ
チド断片の存在及びその長さが確認できる。その結果か
ら、検体中にプライマーが認識すべき配列を持ったヌク
レオチドが存在しているかどうかを判定することができ
る。この判定は、そのまま乳酸菌の有無を判定するもの
となる。増幅されたヌクレオチド断片の検出には、その
他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。
【００１０】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ 検体の調製 ラクトバチルス・ブレビス（ＪＣＭ１０５９T ）の培養
液１００μｌについてコロニーカウントによる菌数測定
を行う一方、同濃度の菌体培養液１００μｌに１５０μ
ｌの溶菌液Ａ〔（1.67M sucrose/0.67％ 2-mercaptoeth
anol/ 0.33 mg/ml zymolyase/ 0.33 mg/ml lysozyme/0.
67μg/ml mutanolysin)in 16.7 mM potassium phosphat
e buffer(pH 6.8 ）〕を添加し、３７℃で６０分処理し
た後、１５０μｌの溶菌液Ｂ〔（13.3mM MgCl2/2.7％ t
riton X-100/2.7 ％ diethyl pyrocarbonate/0.27 mg/m
l proteinase K/6.7％ SDS) in 10 mM potassium phosp
hate buffer(pH 6.8）〕を添加し、７０℃で１０分処理
して溶菌を行った。この後、フェノール／クロロホルム
抽出，エタノール沈澱処理を行って核酸成分を精製し、
１０μｌの緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA）に
溶かし、これを検体とした。
る。 実施例１ 検体の調製 ラクトバチルス・ブレビス（ＪＣＭ１０５９T ）の培養
液１００μｌについてコロニーカウントによる菌数測定
を行う一方、同濃度の菌体培養液１００μｌに１５０μ
ｌの溶菌液Ａ〔（1.67M sucrose/0.67％ 2-mercaptoeth
anol/ 0.33 mg/ml zymolyase/ 0.33 mg/ml lysozyme/0.
67μg/ml mutanolysin)in 16.7 mM potassium phosphat
e buffer(pH 6.8 ）〕を添加し、３７℃で６０分処理し
た後、１５０μｌの溶菌液Ｂ〔（13.3mM MgCl2/2.7％ t
riton X-100/2.7 ％ diethyl pyrocarbonate/0.27 mg/m
l proteinase K/6.7％ SDS) in 10 mM potassium phosp
hate buffer(pH 6.8）〕を添加し、７０℃で１０分処理
して溶菌を行った。この後、フェノール／クロロホルム
抽出，エタノール沈澱処理を行って核酸成分を精製し、
１０μｌの緩衝液(10mM Tris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA）に
溶かし、これを検体とした。
【００１１】プライマーの合成 ラクトバチルス・ブレビス（ＪＣＭ１０５９T ） 5S rR
NA遺伝子の配列(Woese, C.R. et al. J. Mol. Evol. 8,
143-153(1976)) から下記の配列を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。なお、Ｄ
ＮＡ合成および精製は宝酒造株式会社に委託した。 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’・・・（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’・・・（ｂ）
NA遺伝子の配列(Woese, C.R. et al. J. Mol. Evol. 8,
143-153(1976)) から下記の配列を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。なお、Ｄ
ＮＡ合成および精製は宝酒造株式会社に委託した。 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’・・・（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’・・・（ｂ）
【００１２】ＰＣＲ法 １０ｘ反応用バッファー，ｄＮＴＰ溶液及び耐熱性ＤＮ
ＡポリメラーゼはGene-Amp kits(Perkin Elmer Cetus社
製）を使用し、同説明書通りの量を用いた。反応条件は
以下の通りである。 熱変性：９４℃，１分 アニーリング：５０℃，２分 重合反応：７２℃，1.５分 熱変性からアニーリングを経て重合反応にいたる過程を
１サイクルとし、これを３５サイクル行った。
ＡポリメラーゼはGene-Amp kits(Perkin Elmer Cetus社
製）を使用し、同説明書通りの量を用いた。反応条件は
以下の通りである。 熱変性：９４℃，１分 アニーリング：５０℃，２分 重合反応：７２℃，1.５分 熱変性からアニーリングを経て重合反応にいたる過程を
１サイクルとし、これを３５サイクル行った。
【００１３】乳酸菌の検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出する方法
として、縦型の８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲルサイズ８０ｘ８０ｍｍ）を行った。ＰＣＲ処理後
の反応液から１０μｌを取り出し、電気泳動を行った。
なお、電気泳動はＴＢＥ溶液（89mM Tris/89mM boric a
cid/2mM EDTA(pH 8.0)) を用い、４３Ｖ／ｃｍで１２分
行った。その後、ゲルを臭化エチジウム溶液（0.５μg/
ml）にて染色し、紫外線照射によって視覚化した。反応
液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動
度の比較により、ヌクレオチドの長さを算出した。
として、縦型の８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲルサイズ８０ｘ８０ｍｍ）を行った。ＰＣＲ処理後
の反応液から１０μｌを取り出し、電気泳動を行った。
なお、電気泳動はＴＢＥ溶液（89mM Tris/89mM boric a
cid/2mM EDTA(pH 8.0)) を用い、４３Ｖ／ｃｍで１２分
行った。その後、ゲルを臭化エチジウム溶液（0.５μg/
ml）にて染色し、紫外線照射によって視覚化した。反応
液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動
度の比較により、ヌクレオチドの長さを算出した。
【００１４】結果 前述したように、ラクトバチルス・ブレビスの5S rRNA
遺伝子は既に塩基配列が明らかにされており、本発明の
オリゴヌクレオチド、すなわちプライマーがＰＣＲ法に
より増幅されてくるヌクレオチドの長さは推定できる。
それによると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、１１７
塩基対（bp) の長さのヌクレオチドが増幅されてくる筈
である。図１に示したものは、様々の濃度のラクトバチ
ルス・ブレビスを本法によって検出したものである。同
図からわかるように、増幅されたヌクレオチドの長さは
推定された通りであり、プライマー（ａ）と（ｂ）が５
ＳrRNA 遺伝子の標的としている領域を正しく増幅して
きていることを示している。さらに、１００μｌのサン
プル中にわずか１菌体（cell) でも存在すれば、検出可
能であることがわかる。
遺伝子は既に塩基配列が明らかにされており、本発明の
オリゴヌクレオチド、すなわちプライマーがＰＣＲ法に
より増幅されてくるヌクレオチドの長さは推定できる。
それによると、プライマー（ａ）と（ｂ）では、１１７
塩基対（bp) の長さのヌクレオチドが増幅されてくる筈
である。図１に示したものは、様々の濃度のラクトバチ
ルス・ブレビスを本法によって検出したものである。同
図からわかるように、増幅されたヌクレオチドの長さは
推定された通りであり、プライマー（ａ）と（ｂ）が５
ＳrRNA 遺伝子の標的としている領域を正しく増幅して
きていることを示している。さらに、１００μｌのサン
プル中にわずか１菌体（cell) でも存在すれば、検出可
能であることがわかる。
【００１５】実施例２ 本法を実際の工場の現場等で用いることを考えた場合、
まず食品から菌体を捕獲し、検体の量を１００μｌにま
でスケールダウンする必要がある。そこで、以下の検討
を行った。 方法 ２５０mlのビールに様々な数のラクトバチルス・ブレビ
スを加え、デュラポア親水性メンブレンフィルター（直
径４７mm、孔径0.２２μｍ、Millipore 社製）で吸引濾
過した後、フィルターを１０ml容器のチューブに入れ５
mlのエタノールを添加した。３０分振とうした後、フィ
ルターを取り除き、チューブ内のエタノールを濃縮乾固
した。しかる後、１００μｌの滅菌水に溶かした。これ
を菌体懸濁液として実施例１に記載した方法でラクトバ
チルス・ブレビスの検出を行った。その結果を図２に示
す。
まず食品から菌体を捕獲し、検体の量を１００μｌにま
でスケールダウンする必要がある。そこで、以下の検討
を行った。 方法 ２５０mlのビールに様々な数のラクトバチルス・ブレビ
スを加え、デュラポア親水性メンブレンフィルター（直
径４７mm、孔径0.２２μｍ、Millipore 社製）で吸引濾
過した後、フィルターを１０ml容器のチューブに入れ５
mlのエタノールを添加した。３０分振とうした後、フィ
ルターを取り除き、チューブ内のエタノールを濃縮乾固
した。しかる後、１００μｌの滅菌水に溶かした。これ
を菌体懸濁液として実施例１に記載した方法でラクトバ
チルス・ブレビスの検出を行った。その結果を図２に示
す。
【００１６】結果 図から明らかなように、図１の場合と同様に、１１７bp
の長さのヌクレオチドの増幅がみられ、２５０mlのビー
ル中にわずか３０菌体存在すれば、検出できることがわ
かる。なお、実施例１に比べて検出感度が落ちる原因と
しては、菌体がフィルター内に留まって完全には洗い出
されないことが最大の原因であると考えられる。何故な
らば、ビールによる濾過操作を省いて、菌体とフィルタ
ーをそれぞれ１０ml容チューブに入れた場合には、検出
感度の低下はほとんどないからである。
の長さのヌクレオチドの増幅がみられ、２５０mlのビー
ル中にわずか３０菌体存在すれば、検出できることがわ
かる。なお、実施例１に比べて検出感度が落ちる原因と
しては、菌体がフィルター内に留まって完全には洗い出
されないことが最大の原因であると考えられる。何故な
らば、ビールによる濾過操作を省いて、菌体とフィルタ
ーをそれぞれ１０ml容チューブに入れた場合には、検出
感度の低下はほとんどないからである。
【００１７】実施例３ 実施例１及び実施例２で得られた結果が乳酸菌に対し選
択的なものかどうかを確かめるため、乳酸菌及びその他
の食品一般細菌、そして酵母について比較検討した。方
法は、実施例１に示したものと同じであるが、各菌体の
濃度は１００μｌのサンプル当たり１０4cells以上とな
るようにした。結果を表１に示す。表１において、１１
７bpの長さのヌクレオチドの増幅がみられたものは＋、
増幅がみられなかったものは−と表示した。ラクトバチ
ルス・ブレビスをはじめ乳酸菌については１１７bpの長
さのヌクレオチドの増幅が認められるが、その他の微生
物については増幅が認められないことから乳酸菌を容易
に区別し、選択的に検出できることがわかった。
択的なものかどうかを確かめるため、乳酸菌及びその他
の食品一般細菌、そして酵母について比較検討した。方
法は、実施例１に示したものと同じであるが、各菌体の
濃度は１００μｌのサンプル当たり１０4cells以上とな
るようにした。結果を表１に示す。表１において、１１
７bpの長さのヌクレオチドの増幅がみられたものは＋、
増幅がみられなかったものは−と表示した。ラクトバチ
ルス・ブレビスをはじめ乳酸菌については１１７bpの長
さのヌクレオチドの増幅が認められるが、その他の微生
物については増幅が認められないことから乳酸菌を容易
に区別し、選択的に検出できることがわかった。
【００１８】
【表１】 表１ ──────────────────────────────────── 菌株名 １１７bpの増幅 ──────────────────────────────────── Lactobacillus brevis JCM 1059T ＋ Lactobacillus pastorianus JCM 1113 ＋ Lactobacillus casei JCM 1163 ＋ Pediococcus damnosus JCM 5886 T ＋ Corynebacterium facians IAM 1079 − Microbacterium flavum IAM 1642 − Sarcina lutea IFO 3232 − Streptococcus lactis IFO 12007 − Pseudomonas fragi IAM 1650 − Escherichia coli JM109 − Saccharomyces cerevisiae W34 − ────────────────────────────────────
【００１９】
【発明の効果】本発明では遺伝子の増幅を行うにあた
り、ＰＣＲ法を用いているため、乳酸菌の検出において
遺伝子増幅による高い検出感度と、２つあるいはそれ以
上のプライマーで反応が規定されることによる高い選択
性を得ることができる。また、高い検出感度のため多量
の検体を必要とせず、しかも検体の前処理が簡便で済
む。その上、本発明によれば、反応時間が短く、検出も
簡単な機材だけで行うことができ、操作も容易なため、
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば実施例の場
合、ＰＣＲ反応時間が約５時間、検出にかかる時間が約
４０分である。また、乳酸菌の検出にポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動又はアガロースゲル電気泳動と臭化エチ
ジウムによる核酸染色法を用いることで、プライマー等
に標識せずに検出を行うことができる。しかも、核酸の
長さが確認できるので、結果の信頼性が高いものとな
る。
り、ＰＣＲ法を用いているため、乳酸菌の検出において
遺伝子増幅による高い検出感度と、２つあるいはそれ以
上のプライマーで反応が規定されることによる高い選択
性を得ることができる。また、高い検出感度のため多量
の検体を必要とせず、しかも検体の前処理が簡便で済
む。その上、本発明によれば、反応時間が短く、検出も
簡単な機材だけで行うことができ、操作も容易なため、
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば実施例の場
合、ＰＣＲ反応時間が約５時間、検出にかかる時間が約
４０分である。また、乳酸菌の検出にポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動又はアガロースゲル電気泳動と臭化エチ
ジウムによる核酸染色法を用いることで、プライマー等
に標識せずに検出を行うことができる。しかも、核酸の
長さが確認できるので、結果の信頼性が高いものとな
る。
【００２０】
【図１】 実施例１のポリアクリルアミドゲル電気泳動
の結果を示しており、図中のレーンはＭがＤＮＡサイズ
マーカー（φＸ１７４／HaeIII、digest) 、Ｎがネガテ
ィブコントロール（菌数０）、１がラクトバチルス・ブ
レビスの菌数１個、２が同菌数８個、３が同菌数５０
個、４が同菌数１０3 個、5 が同菌数１０4 個を示す。
の結果を示しており、図中のレーンはＭがＤＮＡサイズ
マーカー（φＸ１７４／HaeIII、digest) 、Ｎがネガテ
ィブコントロール（菌数０）、１がラクトバチルス・ブ
レビスの菌数１個、２が同菌数８個、３が同菌数５０
個、４が同菌数１０3 個、5 が同菌数１０4 個を示す。
【図２】 実施例２のポリアクリルアミドゲル電気泳動
の結果を示しており、図中のレーンはＭがＤＮＡサイズ
マーカー（φＸ１７４／HaeIII、digest) 、Ｎがネガテ
ィブコントロール（菌数０）、１がラクトバチルス・ブ
レビスの菌数５個、２が同菌数３０個、３が同菌数１０
2 個を示す。
の結果を示しており、図中のレーンはＭがＤＮＡサイズ
マーカー（φＸ１７４／HaeIII、digest) 、Ｎがネガテ
ィブコントロール（菌数０）、１がラクトバチルス・ブ
レビスの菌数５個、２が同菌数３０個、３が同菌数１０
2 個を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/10 C12Q 1/04 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ／Ｌ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ
Claims (5)
- 【請求項１】 検体中に存在する乳酸菌を選択的に検出
するためのオリゴヌクレオチドまたは乳酸菌の5S rRNA
遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、その
ヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成された
オリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチドが以下の
配列群 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−
３’・・・（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−
３’・・・（ｂ） の少なくとも１つを有するか、または該配列に対応する
相補的配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項２】 オリゴヌクレオチドが、請求項１に記載
された各オリゴヌクレオチドの配列のうち、少なくとも
連続した１０塩基以上を含むものであるオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項３】 請求項１に記載された配列群のうち、少
なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応の
プライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選
択的に増幅させた後、検体内に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することにより乳酸菌の検出を
行うことを特徴とする乳酸菌の検出方法。 - 【請求項４】 請求項３記載の方法における反応物から
電気泳動又はクロマトグラフィーにより、増幅されたヌ
クレオチドを分離し、該ヌクレオチドの分子量を決定す
ることにより乳酸菌の検出を行う請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 請求項３記載の方法における反応物を用
い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はアガロース電
気泳動及び臭化エチジウムによる核酸染色を行うことに
より乳酸菌の検出を行う請求項３記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3191114A JP3067850B2 (ja) | 1991-07-05 | 1991-07-05 | オリゴヌクレオチド及びそれを用いた乳酸菌の検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3191114A JP3067850B2 (ja) | 1991-07-05 | 1991-07-05 | オリゴヌクレオチド及びそれを用いた乳酸菌の検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0515400A JPH0515400A (ja) | 1993-01-26 |
| JP3067850B2 true JP3067850B2 (ja) | 2000-07-24 |
Family
ID=16269099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3191114A Expired - Lifetime JP3067850B2 (ja) | 1991-07-05 | 1991-07-05 | オリゴヌクレオチド及びそれを用いた乳酸菌の検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3067850B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19945964A1 (de) * | 1999-09-24 | 2001-04-05 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Verfahren und Nukleinsäuren zum Nachweis von brauereirelevanten Mikroorganismen |
-
1991
- 1991-07-05 JP JP3191114A patent/JP3067850B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0515400A (ja) | 1993-01-26 |
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