JP2885081B2 - エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
- Publication number
- JP2885081B2 JP2885081B2 JP6203649A JP20364994A JP2885081B2 JP 2885081 B2 JP2885081 B2 JP 2885081B2 JP 6203649 A JP6203649 A JP 6203649A JP 20364994 A JP20364994 A JP 20364994A JP 2885081 B2 JP2885081 B2 JP 2885081B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- perfringens
- oligonucleotide
- enterotoxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒検査、もしくは下痢症検査におけるエンテロトキシ
ン産生性ウェルシュ菌、およびウェルシュ菌のエンテロ
トキシン遺伝子の検出に関するものである。
中毒検査、もしくは下痢症検査におけるエンテロトキシ
ン産生性ウェルシュ菌、およびウェルシュ菌のエンテロ
トキシン遺伝子の検出に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ウェルシュ菌は偏性嫌気性であり、増殖
条件が悪くなると芽胞を形成する。また自然界（土壌、
下水、河川等）にも広く分布し、ヒトや家畜の腸管内常
在菌でもある。これらの理由からか、ウェルシュ菌食中
毒の原因食品としては、獣肉、魚介類の調理食品が加熱
調理された後、不適切に放置されたものが多い。
条件が悪くなると芽胞を形成する。また自然界（土壌、
下水、河川等）にも広く分布し、ヒトや家畜の腸管内常
在菌でもある。これらの理由からか、ウェルシュ菌食中
毒の原因食品としては、獣肉、魚介類の調理食品が加熱
調理された後、不適切に放置されたものが多い。
【０００３】ウェルシュ菌食中毒にかかる検査では、患
者の糞便および食品が主な検体となる。これらの検体中
からウェルシュ菌を検出し、同定する場合には、嫌気条
件下で増菌培養および分離培養を行い、得られた菌コロ
ニ−数個について生化学性状試験を行う。
者の糞便および食品が主な検体となる。これらの検体中
からウェルシュ菌を検出し、同定する場合には、嫌気条
件下で増菌培養および分離培養を行い、得られた菌コロ
ニ−数個について生化学性状試験を行う。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところが、これらの培
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜４８時間であ
り、総所要時間にすると５〜６日となり、非常に長時間
である。しかもウェルシュ菌は自然界に広く分布するの
で、食中毒検査の原因菌であるとするには、ウェルシュ
菌の検出知見だけでは不十分である。さらに患者糞便か
らのエンテロトキシン検出、分離菌のエンテロトキシン
産生検査、血清型別および推定原因食品中の菌数測定等
の知見が必要であり、検査に費やす時間と労力は極めて
大きいと言える。したがって、現在のウェルシュ菌検査
法では、迅速性および簡便性に欠け、実効的でなかっ
た。
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜４８時間であ
り、総所要時間にすると５〜６日となり、非常に長時間
である。しかもウェルシュ菌は自然界に広く分布するの
で、食中毒検査の原因菌であるとするには、ウェルシュ
菌の検出知見だけでは不十分である。さらに患者糞便か
らのエンテロトキシン検出、分離菌のエンテロトキシン
産生検査、血清型別および推定原因食品中の菌数測定等
の知見が必要であり、検査に費やす時間と労力は極めて
大きいと言える。したがって、現在のウェルシュ菌検査
法では、迅速性および簡便性に欠け、実効的でなかっ
た。
【０００５】そこで、本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒・下痢症にかかる検査に簡便、迅速、かつ高感度な
ウェルシュ菌の検査法を提供することを目的とする。
中毒・下痢症にかかる検査に簡便、迅速、かつ高感度な
ウェルシュ菌の検査法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、ウェルシュ菌
のエンテロトキシン遺伝子に選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、ウェルシュ菌
の食中毒病原因子であるエンテロトキシンを産生する菌
のみを選択的に検出することを特徴としている。
のエンテロトキシン遺伝子に選択的にハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして遺伝子増幅に用い、ウェルシュ菌
の食中毒病原因子であるエンテロトキシンを産生する菌
のみを選択的に検出することを特徴としている。
【０００７】本発明で用いるプライマーは、検体中に存
在するエンテロトキシン産生性のウェルシュ菌（entero
toxin producing clostridium perfringens)のエンテロ
トキシン遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列のいずれかからなるオリゴヌクレオチ
ド、 (5')d-ＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣ-
(3')（ａ;配列番号１） (5')d-ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣ-
(3')（ｂ;配列番号２） (5')d-ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧＣＣ-
(3')（ｃ;配列番号３） (5')d-ＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴ
-(3')(d;配列番号４） (5')d-ＴＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴＣ-
(3')(ｅ;配列番号５） (5')d-ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣ-
(3')(ｆ;配列番号６） (5')d-ＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧ-
(3')(ｇ;配列番号７） (5')d-ＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡＧ-
(3')(ｈ;配列番号８） (5')d-ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＣ-
(3')(ｉ;配列番号９） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
在するエンテロトキシン産生性のウェルシュ菌（entero
toxin producing clostridium perfringens)のエンテロ
トキシン遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列のいずれかからなるオリゴヌクレオチ
ド、 (5')d-ＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣ-
(3')（ａ;配列番号１） (5')d-ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣ-
(3')（ｂ;配列番号２） (5')d-ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧＣＣ-
(3')（ｃ;配列番号３） (5')d-ＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴ
-(3')(d;配列番号４） (5')d-ＴＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴＣ-
(3')(ｅ;配列番号５） (5')d-ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣ-
(3')(ｆ;配列番号６） (5')d-ＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧ-
(3')(ｇ;配列番号７） (5')d-ＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡＧ-
(3')(ｈ;配列番号８） (5')d-ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＣ-
(3')(ｉ;配列番号９） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００８】遺伝子増幅は、Saiki らが開発したPolyme
rase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略する；Sc
ience 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。この方
法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ウェルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子の塩基配列
を有する領域）を検出する場合、その領域の両端の一方
は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイ
ゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意し、そ
れを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳
型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能
させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び
同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すこ
とで、２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるま
でにコピー数が増大してくる。このＰＣＲ法に用いる試
薬は、上記オリゴヌクレイチド、４種のヌクレオチド
（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを少なくとも含んでいる必要があり、本発明はこれら
試薬のキットをも提供する。
rase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略する；Sc
ience 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。この方
法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ウェルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子の塩基配列
を有する領域）を検出する場合、その領域の両端の一方
は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイ
ゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用意し、そ
れを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳
型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能
させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び
同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰り返すこ
とで、２つのプライマーに挟まれた領域は検出できるま
でにコピー数が増大してくる。このＰＣＲ法に用いる試
薬は、上記オリゴヌクレイチド、４種のヌクレオチド
（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを少なくとも含んでいる必要があり、本発明はこれら
試薬のキットをも提供する。
【０００９】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【００１０】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
【００１１】プライマーが規定しているウェルシュ菌の
エンテロトキシン遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２, ０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１, ０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来で
もよい。
エンテロトキシン遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２, ０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１, ０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来で
もよい。
【００１２】熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマー
をハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７
〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイク
ルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させ
る。
をハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７
〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイク
ルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させ
る。
【００１３】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままエンテロトキシン遺伝子
をもつウェルシュ菌の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
法やクロマトグラフィーも有効である。さらに、臭化エ
チジウムによる核酸染色による検出でも良い。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままエンテロトキシン遺伝子
をもつウェルシュ菌の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
法やクロマトグラフィーも有効である。さらに、臭化エ
チジウムによる核酸染色による検出でも良い。
【００１４】
【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させる遺伝子増幅技術により、
ウェルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子を検出するもの
である。
のプライマーとして機能させる遺伝子増幅技術により、
ウェルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子を検出するもの
である。
【００１５】
（実施例１）検体の調製 使用したウェルシュ菌は患者等から由来したもので、各
菌株保存機関から分与された総計１１株を用いた。各菌
株の培養は、ＧＡＭブイヨン（日水製薬）、３７℃、嫌
気的条件下で１晩行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍
に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、こ
れらを遠心し、その上清を検体とした。
菌株保存機関から分与された総計１１株を用いた。各菌
株の培養は、ＧＡＭブイヨン（日水製薬）、３７℃、嫌
気的条件下で１晩行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ７. ５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍
に希釈し、９５℃で１０分間の加熱処理を行った後、こ
れらを遠心し、その上清を検体とした。
【００１６】プライマーの合成 文献（Maruke van Damme-Jongsten, Antonie van Leeuw
enhoek, 56:181-190(1989)に記載されたウェルシュ菌の
エンテロトキシン遺伝子の塩基配列から、請求項第１項
に示した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌ
クレオチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプ
ラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法に
より行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18
逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行っ
た。
enhoek, 56:181-190(1989)に記載されたウェルシュ菌の
エンテロトキシン遺伝子の塩基配列から、請求項第１項
に示した各配列を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌ
クレオチドを化学合成した。化学合成は、サイクロンプ
ラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社
製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト法に
より行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18
逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行っ
た。
【００１７】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
【００１８】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml）。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ml）。
【００１９】プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製
品を下表のとおりに組合せて使用した。
品を下表のとおりに組合せて使用した。
【００２０】 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (a) ＋ (f) (b) ＋ (g) (c) ＋ (g) (d) ＋ (h) (e) ＋ (i) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus 社製）。
（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus 社製）。
【００２１】反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４℃、１分。
【００２２】アニーリング： ５５℃、１分 重合反応： ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００２３】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２４】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μl/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
し、臭化エチジウム（0.5 μl/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
【００２５】なお、電気泳動図の一部を図１に示す。図
１の上段が、プライマー(b) ＋(g)の組み合わせ、下段
がプライマー(c) ＋(g) の組み合わせである。図中、Ｍ
は分子量マーカー、レーン１〜１３は、各々１；ATCC 1
2925、２；ATCC 12924、３；ATCC 12922、４；ATCC 129
20、５；ATCC 12916、６；ATCC 12915、７；ATCC 1291
8、８；ATCC 12919、９；ATCC 12921、１０；JCM 1296
１１；JCM 1416、１２；JCM 1382、１３；ＴＥ（ネガ
ティブコントロール）を示す。
１の上段が、プライマー(b) ＋(g)の組み合わせ、下段
がプライマー(c) ＋(g) の組み合わせである。図中、Ｍ
は分子量マーカー、レーン１〜１３は、各々１；ATCC 1
2925、２；ATCC 12924、３；ATCC 12922、４；ATCC 129
20、５；ATCC 12916、６；ATCC 12915、７；ATCC 1291
8、８；ATCC 12919、９；ATCC 12921、１０；JCM 1296
１１；JCM 1416、１２；JCM 1382、１３；ＴＥ（ネガ
ティブコントロール）を示す。
【００２６】サザンーハイブリダイゼーション試験 ウェルシュ菌エンテロトキシン遺伝子に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いて、Tadaらの方法（Tada,
J. et al., Mol. Cell. Probe. 6, 477(1992)）に準じ
て行った。
ヌクレオチドプローブを用いて、Tadaらの方法（Tada,
J. et al., Mol. Cell. Probe. 6, 477(1992)）に準じ
て行った。
【００２７】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販のウェルシュ菌エンテロトキシン検出用ＲＰＬＡキ
ット（ＰＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研製）を購入
し、付属の使用説明書に従い、検体を調製して試験を行
った。
sive Latex Agglutination；RPLA）試験 市販のウェルシュ菌エンテロトキシン検出用ＲＰＬＡキ
ット（ＰＥＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研製）を購入
し、付属の使用説明書に従い、検体を調製して試験を行
った。
【００２８】結果 前述したようにウェルシュ菌のエンテロトキシン遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(a) と(f) の組合せでは、４７３
塩基（または４７３塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。そ
れによるとプライマー(a) と(f) の組合せでは、４７３
塩基（または４７３塩基対）の長さのヌクレオチドが増
幅されてくるはずである。
【００２９】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、エ
ンテロトキシン遺伝子中の標的としている領域を正しく
増幅しており、かつ、当該菌株はエンテロトキシン遺伝
子を有していると判断した。
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せは、エ
ンテロトキシン遺伝子中の標的としている領域を正しく
増幅しており、かつ、当該菌株はエンテロトキシン遺伝
子を有していると判断した。
【００３０】被験菌株１１株で調べた結果を表１に示
す。さらに、各プライマーの組合せにより増幅されたヌ
クレオチドが、目的とするウェルシュ菌エンテロトキシ
ン遺伝子の一部の領域であることをサザンハイブリダイ
ゼーション試験で確認した。試験結果を図２に示す。図
２は、図１と対応しており、図２中の上段が、プライマ
ー(b) ＋(g) の組み合わせ、下段がプライマー(c) ＋
(g) の組み合わせで、図中、Ｍは分子量マーカー、レー
ン１〜１３は、各々１；ATCC 12925、２；ATCC 12924、
３；ATCC 12922、４；ATCC 12920、５；ATCC 12916、
６；ATCC 12915、７；ATCC 12918、８；ATCC 12919、
９；ATCC 12921、１０；JCM 1296 １１；JCM 1416、１
２；JCM 1382、１３；ＴＥ（ネガティブコントロール）
を示す。
す。さらに、各プライマーの組合せにより増幅されたヌ
クレオチドが、目的とするウェルシュ菌エンテロトキシ
ン遺伝子の一部の領域であることをサザンハイブリダイ
ゼーション試験で確認した。試験結果を図２に示す。図
２は、図１と対応しており、図２中の上段が、プライマ
ー(b) ＋(g) の組み合わせ、下段がプライマー(c) ＋
(g) の組み合わせで、図中、Ｍは分子量マーカー、レー
ン１〜１３は、各々１；ATCC 12925、２；ATCC 12924、
３；ATCC 12922、４；ATCC 12920、５；ATCC 12916、
６；ATCC 12915、７；ATCC 12918、８；ATCC 12919、
９；ATCC 12921、１０；JCM 1296 １１；JCM 1416、１
２；JCM 1382、１３；ＴＥ（ネガティブコントロール）
を示す。
【００３１】すなわち、本発明のプライマーは、ウェル
シュ菌エンテロトキシン遺伝子を正しく増幅し、その遺
伝子をもつウェルシュ菌を正確に検出していることを示
している。
シュ菌エンテロトキシン遺伝子を正しく増幅し、その遺
伝子をもつウェルシュ菌を正確に検出していることを示
している。
【００３２】
【表１】 （実施例２）実施例１で得られた結果がエンテロトキシ
ン遺伝子をもつウェルシュ菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、ウェルシュ菌以外の主なClostr
idium 属菌および臨床検査において検査対象となるウェ
ルシュ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について、本発明の
プライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の
調製法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
ン遺伝子をもつウェルシュ菌に対して、選択的なものか
どうかを確かめるため、ウェルシュ菌以外の主なClostr
idium 属菌および臨床検査において検査対象となるウェ
ルシュ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について、本発明の
プライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の
調製法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
【００３３】検体の調製 表２及び表３中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培
地に接種し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終
夜培養を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株
は、全てのClostridium 属菌、Campylobacter jejuni、
Campylobacter coli、Bacteroides fragilis、Bacteroid
es vulgatus、およびLactobacillus ac idophilus であ
る）。各菌株培養液０. ５ｍｌから遠心操作により、菌
体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
地に接種し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終
夜培養を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株
は、全てのClostridium 属菌、Campylobacter jejuni、
Campylobacter coli、Bacteroides fragilis、Bacteroid
es vulgatus、およびLactobacillus ac idophilus であ
る）。各菌株培養液０. ５ｍｌから遠心操作により、菌
体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
【００３４】この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。
【００３５】遠心後、上層液を回収し、エタノール処理
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。また、ヒト胎盤由
来ＤＮＡ（Human placenta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃
度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
【００３６】結果 表２及び表３に一部のプライマーの組合せにおける試験
結果を示す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、それ
らのＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本
発明のプライマーはウェルシュ菌のエンテロトキシン遺
伝子と選択的に反応するものと断言できる。
結果を示す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢
症菌ＤＮＡをはじめとする種々のＤＮＡについて、それ
らのＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本
発明のプライマーはウェルシュ菌のエンテロトキシン遺
伝子と選択的に反応するものと断言できる。
【００３７】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル
材に用いると、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上さ
せることができるので、ウェルシュ菌エンテロトキシン
遺伝子の選択的検出における信頼度は、さらに高まるも
のと考えられる。
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル
材に用いると、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上さ
せることができるので、ウェルシュ菌エンテロトキシン
遺伝子の選択的検出における信頼度は、さらに高まるも
のと考えられる。
【表２】
【表３】
【００３８】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よびウェルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキ
シン遺伝子を標的とするプライマーを用いたことによ
り、エンテロトキシン遺伝子を有する菌の検出におい
て、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、ある
いは、それ以上の数のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性とが得られる。また、検出感度が高
いので、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便
で済む。本発明における実施例では、反応時間３時間、
検出にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検出に
アガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる核酸
染色法を用いることで、プライマー等を標識せずに検出
が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを確認
できるので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
よびウェルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキ
シン遺伝子を標的とするプライマーを用いたことによ
り、エンテロトキシン遺伝子を有する菌の検出におい
て、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、ある
いは、それ以上の数のプライマーで反応が規定されるこ
とによる高い選択性とが得られる。また、検出感度が高
いので、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便
で済む。本発明における実施例では、反応時間３時間、
検出にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検出に
アガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる核酸
染色法を用いることで、プライマー等を標識せずに検出
が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを確認
できるので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
【００３９】ウェルシュ菌にかかる食中毒の検査には、
発見患者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、
遅滞のない正確な結果が要求される。また、本発明は、
ウェルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキシン
をコードしている遺伝子を選択的に検出するものであ
る。したがって、本発明により、食中毒起因菌としての
ウェルシュ菌の検出を迅速かつ正確に行うことが可能と
なる。
発見患者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、
遅滞のない正確な結果が要求される。また、本発明は、
ウェルシュ菌の食中毒病原因子であるエンテロトキシン
をコードしている遺伝子を選択的に検出するものであ
る。したがって、本発明により、食中毒起因菌としての
ウェルシュ菌の検出を迅速かつ正確に行うことが可能と
なる。
【００４０】
【配列表】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣ
【００４１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＧ
ＴＣ
ＴＣ
【００４２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡ
ＧＣＣ
ＧＣＣ
【００４３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴ
ＧＧＡＴ
ＧＧＡＴ
【００４４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡ
ＣＴＣ
ＣＴＣ
【００４５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴ
ＴＣＣ
ＴＣＣ
【００４６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡ
ＡＧＧ
ＡＧＧ
【００４７】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；８ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴ
ＡＧ
ＡＧ
【００４８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；９ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Clostridium perfringens 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴ
ＴＣ
ＴＣ
【図１】アガロース電気泳動図
【図２】サザンハイブリダイゼーション像
Ｍ；分子量マーカー、１；ATCC 12925、２；ATCC 1292
4、３；ATCC 12922、４；ATCC 12920、５；ATCC 1291
6、６；ATCC 12915、７；ATCC 12918、８；ATCC 1291
9、９；ATCC 12921、１０；JCM 1296 １１；JCM 141
6、１２；JCM 1382、１３；ＴＥ（ネガティブコントロ
ール）
4、３；ATCC 12922、４；ATCC 12920、５；ATCC 1291
6、６；ATCC 12915、７；ATCC 12918、８；ATCC 1291
9、９；ATCC 12921、１０；JCM 1296 １１；JCM 141
6、１２；JCM 1382、１３；ＴＥ（ネガティブコントロ
ール）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．61 （８）ｐ．3429−3439（1993) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】検体中に存在するエンテロトキシン産生性
のウェルシュ菌（enterotoxin producing clostridium
perfringens)のエンテロトキシン遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相
補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドで
あって、合成ヌクレオチドが以下の配列のいずれかから
なるオリゴヌクレオチド、 (5')d-ＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＣＣ-
(3')（ａ;配列番号１） (5')d-ＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣ-
(3')（ｂ;配列番号２） (5')d-ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧＣＣ-
(3')（ｃ;配列番号３） (5')d-ＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＴ
-(3')(d;配列番号４） (5')d-ＴＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴＣ-
(3')(ｅ;配列番号５） (5')d-ＧＡＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣ-
(3')(ｆ;配列番号６） (5')d-ＧＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＡＴＣＡＡＧＧ-
(3')(ｇ;配列番号７） (5')d-ＡＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＴＡＧ-
(3')(ｈ;配列番号８） (5')d-ＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＣ-
(3')(ｉ;配列番号９） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチ
ド、４種のヌクレオチド（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを少なくとも含むウェルシュ
菌検出用試薬キット。 - 【請求項３】 請求項第１項に記載された配列のうち、
少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応
のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を
選択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 (1) 検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
イマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 (2) 得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖
長反応の鋳型として機能し、 (3) これら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−シ
ョンを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列が
増幅され、増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 (4) その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することでエンテロトキシン産生
性ウェルシュ菌の検出を行うことを含む方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6203649A JP2885081B2 (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6203649A JP2885081B2 (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856697A JPH0856697A (ja) | 1996-03-05 |
| JP2885081B2 true JP2885081B2 (ja) | 1999-04-19 |
Family
ID=16477549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6203649A Expired - Lifetime JP2885081B2 (ja) | 1994-08-29 | 1994-08-29 | エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2885081B2 (ja) |
-
1994
- 1994-08-29 JP JP6203649A patent/JP2885081B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１（８）ｐ．３４２９−３４３９（１９９３） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0856697A (ja) | 1996-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rijpens et al. | Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens | |
| EP0669399A2 (en) | Oligonucleotides and method for detecting bacteria | |
| EP0556504B1 (en) | Oligonucleotides for detecting Vibrio parahaemolyticus | |
| Watterworth et al. | Multiplex PCR-DNA probe assay for the detection of pathogenic Escherichia coli | |
| JP2792462B2 (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2775663B2 (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| US6165724A (en) | Oligonucleotides for detecting enteric hemorrhagic E.coli and detection method using the same | |
| JP2885081B2 (ja) | エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3419299B2 (ja) | ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3414261B2 (ja) | 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3134907B2 (ja) | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3141976B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2993314B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3331977B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH03112498A (ja) | カンピロバクター検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 | |
| JPH07114719B2 (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07114720B2 (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH119281A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH05317098A (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0789959B2 (ja) | ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH05227999A (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH11332598A (ja) | ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0789958B2 (ja) | サルモネラ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07236500A (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0349697A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080212 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090212 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100212 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100212 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110212 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110212 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120212 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120212 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130212 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140212 Year of fee payment: 15 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |