JPH07114720B2 - 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH07114720B2 JPH07114720B2 JP3086424A JP8642491A JPH07114720B2 JP H07114720 B2 JPH07114720 B2 JP H07114720B2 JP 3086424 A JP3086424 A JP 3086424A JP 8642491 A JP8642491 A JP 8642491A JP H07114720 B2 JPH07114720 B2 JP H07114720B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは食品検査での易熱性腸内毒
素（ＬＴ）を産生する大腸菌の検出に関するものであ
る。
中毒にかかる検査、あるいは食品検査での易熱性腸内毒
素（ＬＴ）を産生する大腸菌の検出に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品、
または拭き取り材料の場合、毒素原性大腸菌と同定する
までには、増菌培養、分離培養を経て、純培養、および
確認培養を行わなければならない。さらに引き続いて、
血清学的検査、腸内毒素産生試験、その他の生化学的試
験を行うことで、はじめて毒素原性大腸菌と同定され
る。 各培養段階に要する時間は、１８〜２４時間であ
り、その後の検査にかかる時間を合計すると１週間もの
長時間を要する。
または拭き取り材料の場合、毒素原性大腸菌と同定する
までには、増菌培養、分離培養を経て、純培養、および
確認培養を行わなければならない。さらに引き続いて、
血清学的検査、腸内毒素産生試験、その他の生化学的試
験を行うことで、はじめて毒素原性大腸菌と同定され
る。 各培養段階に要する時間は、１８〜２４時間であ
り、その後の検査にかかる時間を合計すると１週間もの
長時間を要する。
【０００３】易熱性腸内毒素（以下、ＬＴ）を検出する
目的であれば、逆受身ラテックス凝集反応を利用した腸
内毒素検出用キットも市販されているが、コレラ菌腸内
毒素（以下、ＣＴ）とＬＴとは互いに免疫学的に抗原共
通性を有することが知られており、このためＣＴとＬＴ
とを区別して検出することが困難である。
目的であれば、逆受身ラテックス凝集反応を利用した腸
内毒素検出用キットも市販されているが、コレラ菌腸内
毒素（以下、ＣＴ）とＬＴとは互いに免疫学的に抗原共
通性を有することが知られており、このためＣＴとＬＴ
とを区別して検出することが困難である。
【０００４】また、検体としては、純培養され、さら
に、ある程度菌種の同定に関して、絞り込みが行われた
ものを必要としている。この絞り込みの段階までの操作
が煩雑であり、長時間を要する。しかも、このキットに
かかる時間だけでも２０〜２４時間も必要とする。
に、ある程度菌種の同定に関して、絞り込みが行われた
ものを必要としている。この絞り込みの段階までの操作
が煩雑であり、長時間を要する。しかも、このキットに
かかる時間だけでも２０〜２４時間も必要とする。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記したように、従来
の方法はいずれも、毒素原性大腸菌と同定するまでには
非常に複雑な操作と長時間を要し、迅速性を要求される
臨床検査等に向かなかった。
の方法はいずれも、毒素原性大腸菌と同定するまでには
非常に複雑な操作と長時間を要し、迅速性を要求される
臨床検査等に向かなかった。
【０００６】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより膜上、あるいは
他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これを
検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選択
性を得るのが難しい。
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより膜上、あるいは
他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これを
検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選択
性を得るのが難しい。
【０００７】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成
反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術によ
り毒素原性大腸菌由来の核酸を検出するもので、簡便、
迅速かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において提供す
ることを目的とする。
反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術によ
り毒素原性大腸菌由来の核酸を検出するもので、簡便、
迅速かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において提供す
ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、毒素原性大腸
菌由来の核酸と選択的にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす毒素原
性大腸菌のみを選択的に検出することを特徴としてい
る。
菌由来の核酸と選択的にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす毒素原
性大腸菌のみを選択的に検出することを特徴としてい
る。
【０００９】本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、検
体中に存在する毒素原性大腸菌の産生する易熱性腸内毒
素（heat-labile toxin, ＬＴ）遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相
補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドで
あって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴ−（３’）・・・・(a) （５’）ｄ−ＣＣＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣ−（３’）・・・・(b) （５’）ｄ−ＡＣＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴ−（３’）・(c) （５’）ｄ−ＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣ−（３’）・(d) （５’）ｄ−ＡＣＣＧＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡ−（３’）・・(e) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
体中に存在する毒素原性大腸菌の産生する易熱性腸内毒
素（heat-labile toxin, ＬＴ）遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相
補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドで
あって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴ−（３’）・・・・(a) （５’）ｄ−ＣＣＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣ−（３’）・・・・(b) （５’）ｄ−ＡＣＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴ−（３’）・(c) （５’）ｄ−ＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣ−（３’）・(d) （５’）ｄ−ＡＣＣＧＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡ−（３’）・・(e) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【００１０】ここで、遺伝子増幅は、Saiki らが開発し
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法；Science 230,1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は毒素原性大腸菌のＬＴ遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１
本鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせる。この一
連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法；Science 230,1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は毒素原性大腸菌のＬＴ遺伝子）を検出する場合、
その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ
認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌク
レオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にし
た試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１
本鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせる。この一
連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
【００１１】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。
【００１２】これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【００１３】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
【００１４】プライマーが規定している腸炎ビブリオ菌
の特定遺伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は、
５０塩基から２，０００塩基、望ましくは、１００塩基
から１，０００塩基となればよい。
の特定遺伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は、
５０塩基から２，０００塩基、望ましくは、１００塩基
から１，０００塩基となればよい。
【００１５】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイ
ズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合
反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ
を２０から４２サイクル行って増幅させる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイ
ズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合
反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ
を２０から４２サイクル行って増幅させる。
【００１６】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのままＬＴを産出する大腸菌
の有無を判定するものとなる。増幅されたヌクレオチド
断片の検出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィ
ー、ＤＮＡプロ−ブ法も有効である。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのままＬＴを産出する大腸菌
の有無を判定するものとなる。増幅されたヌクレオチド
断片の検出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィ
ー、ＤＮＡプロ−ブ法も有効である。
【００１７】
【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により毒
素原性大腸菌由来のＬＴを検出するもので、簡便、迅速
かつ高感度な検出ができる。
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により毒
素原性大腸菌由来のＬＴを検出するもので、簡便、迅速
かつ高感度な検出ができる。
【００１８】
【実施例】（実験例１）検体の調製 毒素原性大腸菌の検索には、表１〜表１３の縦の見出し
に示した下痢症患者から分離した大腸菌４９２株を用い
た。これらの菌株は京都大学医学部微生物学教室（主
任、竹田美文教授）から分与された。それぞれの菌株を
適当な増菌培地に接種し、３７ ℃、好気的条件下で終
夜培養を行い、その培地１. ５ｍｌから遠心操作により
菌体を回収した。１０ｍｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７. ５）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを１ｍｇ
／ｍｌとなるように溶かした液０. ５ｍｌで懸濁させ、
３７ ℃、１０分で溶菌させた。前記緩衝液で飽和させ
たフェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混
合比１：１）を溶菌液に加え、よく撹はんした。遠心
後、上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成
分を沈澱させた。その沈澱物を前記緩衝液１ｍｌに溶か
して、これを検体とした。
に示した下痢症患者から分離した大腸菌４９２株を用い
た。これらの菌株は京都大学医学部微生物学教室（主
任、竹田美文教授）から分与された。それぞれの菌株を
適当な増菌培地に接種し、３７ ℃、好気的条件下で終
夜培養を行い、その培地１. ５ｍｌから遠心操作により
菌体を回収した。１０ｍｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７. ５）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを１ｍｇ
／ｍｌとなるように溶かした液０. ５ｍｌで懸濁させ、
３７ ℃、１０分で溶菌させた。前記緩衝液で飽和させ
たフェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混
合比１：１）を溶菌液に加え、よく撹はんした。遠心
後、上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成
分を沈澱させた。その沈澱物を前記緩衝液１ｍｌに溶か
して、これを検体とした。
【００１９】プライマーの合成 易熱性腸内毒素を産生する大腸菌のＬＴ遺伝子の塩基配
列（Yamamoto,T., T.Tamura and T.Yokota (1984):Prim
ary structure of heat-labile enterotoxin produced
by Eschelichia coli pathogenic for humans. J. Bio
l. Chem., 259:5037-5044 および Yamamoto, T., T.Go
jobori and T.Yokota (1987):Evolutionary origin of
pathogenic determinants in enterotoxigenic Eshelic
hia coliand Vibrio cholerae O1. J. Bateriol., 169:
1352-1357 ）から請求項第１項に示した配列（(a) 、
(b) 、(c) 、(d) 、および(e) ）を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成
はサイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイ
オリサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホア
ミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチド
の精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィーで行った。
列（Yamamoto,T., T.Tamura and T.Yokota (1984):Prim
ary structure of heat-labile enterotoxin produced
by Eschelichia coli pathogenic for humans. J. Bio
l. Chem., 259:5037-5044 および Yamamoto, T., T.Go
jobori and T.Yokota (1987):Evolutionary origin of
pathogenic determinants in enterotoxigenic Eshelic
hia coliand Vibrio cholerae O1. J. Bateriol., 169:
1352-1357 ）から請求項第１項に示した配列（(a) 、
(b) 、(c) 、(d) 、および(e) ）を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成
はサイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイ
オリサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホア
ミダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチド
の精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラ
フィーで行った。
【００２０】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌水１６. ０５μ
ｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４. ８μ
ｌ、プライマー（1 ）１. ５μｌ、プライマー（2 ）
１. ５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５
μｌを加えて３０μｌの反応液を調製した。この反応液
の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０μ
ｌ加え、反応液上に重層した。各添加された液の内容、
およびプライマー（1 ）と（2 ）の組合せを下記に示
す。
ｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４. ８μ
ｌ、プライマー（1 ）１. ５μｌ、プライマー（2 ）
１. ５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０. １５
μｌを加えて３０μｌの反応液を調製した。この反応液
の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０μ
ｌ加え、反応液上に重層した。各添加された液の内容、
およびプライマー（1 ）と（2 ）の組合せを下記に示
す。
【００２１】 １０ｘ反応緩衝液： 500mM KCl, 100mM Tris-HCl(pH8.3), 15mM MgCl2 , 0.1% (W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液： dATP, dCTP, dGTP, dTTP を混合させたもので各終濃度が 1.25mM プライマー（1 ）および（2 ）: 前述した化学合成精製品の各水溶液 （濃度 5 ODU/ml） プライマーの組合せ：前述の化学合成精製品で次のとお
りに３組つくり、実験に用いた。 反応条件は、次のとおりである。
りに３組つくり、実験に用いた。 反応条件は、次のとおりである。
【００２２】熱変性：９４ ℃、１分 アニーリング：５５ ℃、１分 重合反応：７２ ℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムすることにより行った。
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムすることにより行った。
【００２３】検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２４】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μl/ml）を含むものを用い
た。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、３０分で行
った。操作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著Mole
cular Cloning(1982) に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
し、臭化エチジウム（0.5 μl/ml）を含むものを用い
た。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、３０分で行
った。操作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著Mole
cular Cloning(1982) に記載されている技法で行った。
反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
【００２５】結果 前述したように、ＬＴ遺伝子は、既に塩基配列が決定さ
れており、本発明のオリゴヌクレオチオド、すなわちプ
ライマーがＰＣＲにより増幅させてくるヌクレオチドの
大きさは推定できる。それによると、プライマー（a ）
と（b ）、（c）と（d ）、および（e ）と（d ）の各
組を用いた場合には、それぞれ５８９、５５０および２
６４塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずで
ある。これらの推定値と増幅されたヌクレオチドの長さ
が一致した場合、各プライマーはＬＴ遺伝子の標的とし
ている領域を正しく増幅していると判断した。大腸菌の
臨床分離株４９２株を上記方法で検討し、増幅されてき
たヌクレオチドの長さを測定した結果を表１〜表１３に
示す。表１〜表１３プライマー（primer）欄中、＋と記
入されたものは、増幅されてきたヌクレオチドの長さが
推定値と一致したもの、また−は増幅ヌクレオチドが全
く検出されなかったものである。
れており、本発明のオリゴヌクレオチオド、すなわちプ
ライマーがＰＣＲにより増幅させてくるヌクレオチドの
大きさは推定できる。それによると、プライマー（a ）
と（b ）、（c）と（d ）、および（e ）と（d ）の各
組を用いた場合には、それぞれ５８９、５５０および２
６４塩基の長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずで
ある。これらの推定値と増幅されたヌクレオチドの長さ
が一致した場合、各プライマーはＬＴ遺伝子の標的とし
ている領域を正しく増幅していると判断した。大腸菌の
臨床分離株４９２株を上記方法で検討し、増幅されてき
たヌクレオチドの長さを測定した結果を表１〜表１３に
示す。表１〜表１３プライマー（primer）欄中、＋と記
入されたものは、増幅されてきたヌクレオチドの長さが
推定値と一致したもの、また−は増幅ヌクレオチドが全
く検出されなかったものである。
【００２６】同表で示されるように、各組合せのプライ
マーでＰＣＲを行うと、どれも、ＬＴ遺伝子を有する菌
株（表１〜表１３のＬＴgene欄が＋、２＋、およびｗの
もの）においてのみ、ヌクレオチドを増幅させている。
しかも、増幅されたヌクレオチドのすべては、推定され
たヌクレオチドの長さと一致している。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは毒素
原性大腸菌のＬＴ遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅していることが明らかである。
マーでＰＣＲを行うと、どれも、ＬＴ遺伝子を有する菌
株（表１〜表１３のＬＴgene欄が＋、２＋、およびｗの
もの）においてのみ、ヌクレオチドを増幅させている。
しかも、増幅されたヌクレオチドのすべては、推定され
たヌクレオチドの長さと一致している。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは毒素
原性大腸菌のＬＴ遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅していることが明らかである。
【００２７】（実験例２）実験例１で得られた結果が、
ＬＴを産生する大腸菌に対して選択的なものかどうかを
確かめるため、臨床検査において病原大腸菌以外で検査
対象となりうる菌種について比較検討した。
ＬＴを産生する大腸菌に対して選択的なものかどうかを
確かめるため、臨床検査において病原大腸菌以外で検査
対象となりうる菌種について比較検討した。
【００２８】方法は、実験例１に示したものと同じであ
るが、Clostridium perfringens 、Campylobacter jeju
ni、 Campylobacter coli 、Bacteroides flagilis、Ba
cteroides vulgatus、 およびLactobacillus acidophi
lus については嫌気的条件下、３７ ℃Ｃで終夜培養
を行い、ＰＣＲ法に適用しうる試料を調製した。検体の
調製において培養した菌は、表１４、１５の縦の見出し
に示した５０菌株である。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ
（Human placenta DNA）は１μｇ／ｍｌの濃度のものを
調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
るが、Clostridium perfringens 、Campylobacter jeju
ni、 Campylobacter coli 、Bacteroides flagilis、Ba
cteroides vulgatus、 およびLactobacillus acidophi
lus については嫌気的条件下、３７ ℃Ｃで終夜培養
を行い、ＰＣＲ法に適用しうる試料を調製した。検体の
調製において培養した菌は、表１４、１５の縦の見出し
に示した５０菌株である。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ
（Human placenta DNA）は１μｇ／ｍｌの濃度のものを
調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。
【００２９】結果を表１４、１５に示す。各組合せのプ
ライマーでＰＣＲを行ったが、３組のどのプライマーを
使用した場合についても、病原大腸菌以外の各種細菌の
ＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、易熱性
毒素産生性の大腸菌にのみ、選択的に反応するものと断
言できる。
ライマーでＰＣＲを行ったが、３組のどのプライマーを
使用した場合についても、病原大腸菌以外の各種細菌の
ＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、易熱性
毒素産生性の大腸菌にのみ、選択的に反応するものと断
言できる。
【００３０】一方、本発明では、ＣＴ産生性のVibrio c
holerae （表１５中、V.choleraeO1ctx+ ）とは全く交
叉反応を起こさないこともわかる。前述したように免疫
学的にはＣＴとＬＴとは抗原共通性をもっていて免疫学
的手法によっても、これらを区別することができなかっ
た。しかし、本発明ではＬＴ産生性大腸菌のみを明確に
検出することから、従来法に比べて信頼性がより高くな
ったと考えられる。
holerae （表１５中、V.choleraeO1ctx+ ）とは全く交
叉反応を起こさないこともわかる。前述したように免疫
学的にはＣＴとＬＴとは抗原共通性をもっていて免疫学
的手法によっても、これらを区別することができなかっ
た。しかし、本発明ではＬＴ産生性大腸菌のみを明確に
検出することから、従来法に比べて信頼性がより高くな
ったと考えられる。
【００３１】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ース電気泳動を前述の泳動条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、１０
０から５００塩基の範囲のヌクレオチドであれば、１０
から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別可能
である。さらに、アクリルアミドなどをゲルに用いるこ
とで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させること
ができ、ＬＴ遺伝子の選択的検出における信頼度は、さ
らに高まるものと考えられる。
ース電気泳動を前述の泳動条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、１０
０から５００塩基の範囲のヌクレオチドであれば、１０
から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別可能
である。さらに、アクリルアミドなどをゲルに用いるこ
とで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させること
ができ、ＬＴ遺伝子の選択的検出における信頼度は、さ
らに高まるものと考えられる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【表４】
【００３６】
【表５】
【００３７】
【表６】
【００３８】
【表７】
【００３９】
【表８】
【００４０】
【表９】
【００４１】
【表１０】
【００４２】
【表１１】
【００４３】
【表１２】
【００４４】
【表１３】
【００４５】
【表１４】
【００４６】
【表１５】
【００４７】なお、表中 ＬＴｇｅｎｅの欄（＋）：ＬＴ遺伝子を保有する 同 （２＋）: ＬＴ遺伝子を保有する 同 （ｗ）: ＬＴ遺伝子を保有する 同 （−）：ＬＴ遺伝子を保有しない Primer欄 （＋）：増幅されたヌクレオチドの長さが推定値と一致 したもの 同 （ｗ）：増幅されたヌクレオチドの長さが推定値と一致 しているが、増幅程度が少々弱いもの 同 （−）：増幅ヌクレオチドが全くみとめられなかったも の 表１〜１３における各菌株の入手先：京都大学医学部微
生物学教室 表１４、１５（No.1〜39) における各菌株の入手先： ATCC(American Type Culture Collection) JCM(理化学研究所微生物系統保存施設） IFO(発酵研究所） 表１５（No.41 〜50) における菌株の入手先：京都大学
医学部微生物学教室 表１５（No.51)における菌株の入手先：宝酒造株式会社
生物学教室 表１４、１５（No.1〜39) における各菌株の入手先： ATCC(American Type Culture Collection) JCM(理化学研究所微生物系統保存施設） IFO(発酵研究所） 表１５（No.41 〜50) における菌株の入手先：京都大学
医学部微生物学教室 表１５（No.51)における菌株の入手先：宝酒造株式会社
【００４８】
【効果】本発明ではＰＣＲ法を用いたことで、毒素原性
大腸菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。
大腸菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。
【００４９】また、高い検出感度のため多量の検体を必
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
【００５０】また、検出にアガロースゲル電気泳動と臭
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
【００５１】食中毒原因菌としての病原大腸菌を同定す
る際、ＬＴを産生しているかどうかの確認が重要となっ
ている。他の生物種でＬＴ産生能を持つものはないこと
から、プライマーが標的とするヌクレオチド配列にＬＴ
遺伝子を用いることで、病原大腸菌の選択的検出が可能
となる。
る際、ＬＴを産生しているかどうかの確認が重要となっ
ている。他の生物種でＬＴ産生能を持つものはないこと
から、プライマーが標的とするヌクレオチド配列にＬＴ
遺伝子を用いることで、病原大腸菌の選択的検出が可能
となる。
【００５２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】 検体中に存在する毒素原性大腸菌の生産
する易熱性腸内毒素（heat-labile toxin,ＬＴ）遺伝子
をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレ
オチド配列と相補的となるように化学結合されたオリゴ
ヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列
群、 （５´）ｄ−ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴ−（３´）・・・・(a) （５´）ｄ−ＣＣＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣ−（３´）・・・・(b) （５´）ｄ−ＡＣＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴ−（３´）・(c) （５´）ｄ−ＧＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣ−（３´）・(d) （５´）ｄ−ＡＣＣＧＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡ−（３´）・・(e) または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 請求項第１項に記載された配列のうち、
増幅されるべきヌクレオチド配列の両端を規定する２つ
のオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機
能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させるこ
とを特徴とする毒素原性大腸菌の検出方法であって、 検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に前記プ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離した
場合、その相補鎖は更なる鎖長反応の鋳型として機能
し、 前記プライマーによる同時の鎖長反応、プライマー鎖
長生成物の鋳型からの分離、そして更なるプライマーに
よるハイブリダイゼーションを繰り返すことにより特定
のヌクレオチド配列を増幅させ、 前記検体中に認識されるべきヌクレオチド配列が存在
しているか否かを判定することで毒素原性大腸菌の検出
を行う方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3086424A JPH07114720B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3086424A JPH07114720B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04320675A JPH04320675A (ja) | 1992-11-11 |
| JPH07114720B2 true JPH07114720B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=13886516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3086424A Expired - Lifetime JPH07114720B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07114720B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5468852A (en) * | 1992-02-18 | 1995-11-21 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02249499A (ja) * | 1989-03-24 | 1990-10-05 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
-
1991
- 1991-04-18 JP JP3086424A patent/JPH07114720B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02249499A (ja) * | 1989-03-24 | 1990-10-05 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04320675A (ja) | 1992-11-11 |
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