JP2993314B2 - 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは、環境検査、食品検査での
毒素性ショック症候群毒素遺伝子（以下TSST-1遺伝子と
いう）を有する黄色ブドウ球菌の検出に関するものであ
る。
中毒にかかる検査、あるいは、環境検査、食品検査での
毒素性ショック症候群毒素遺伝子（以下TSST-1遺伝子と
いう）を有する黄色ブドウ球菌の検出に関するものであ
る。
【０００２】
【従来技術】食中毒にかかる検査では、検査材料は患者
の嘔吐物、糞便、患者が食した食品または患者の周辺環
境からの拭き取り材料の場合である。これらの材料から
黄色ブドウ球菌が検出・同定されるまでには、まず、増
菌培養、分離培養を経て純培養、および確認培養を行う
必要がある。
の嘔吐物、糞便、患者が食した食品または患者の周辺環
境からの拭き取り材料の場合である。これらの材料から
黄色ブドウ球菌が検出・同定されるまでには、まず、増
菌培養、分離培養を経て純培養、および確認培養を行う
必要がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、各培養
段階で要する時間は、１８〜２４時間であり、その後の
検査のかかる時間を合計すると約４日間となり、非常に
長時間である。確認培養における生化学試験では、好気
的発育性、ＶＰ反応性、硝酸塩の還元性、Ｔｗｅｅｎ８
０の水解性、ヒアルロニダーゼ活性、糖分解性等の諸性
状を調べる必要があり、操作的にも煩雑で時間や費用も
かかる。
段階で要する時間は、１８〜２４時間であり、その後の
検査のかかる時間を合計すると約４日間となり、非常に
長時間である。確認培養における生化学試験では、好気
的発育性、ＶＰ反応性、硝酸塩の還元性、Ｔｗｅｅｎ８
０の水解性、ヒアルロニダーゼ活性、糖分解性等の諸性
状を調べる必要があり、操作的にも煩雑で時間や費用も
かかる。
【０００４】また、黄色ブドウ球菌の場合、分離菌株の
外毒素（Toxic Shock Syndrome Toxin-1）産生性を試験
することが食中毒、および下痢症の最も確実な起病菌決
定法であると見なされているが、市販の簡便試薬キット
を使用しても、結果を得るまでに１８〜２０時間を要
し、迅速性に欠ける。
外毒素（Toxic Shock Syndrome Toxin-1）産生性を試験
することが食中毒、および下痢症の最も確実な起病菌決
定法であると見なされているが、市販の簡便試薬キット
を使用しても、結果を得るまでに１８〜２０時間を要
し、迅速性に欠ける。
【０００５】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
いたＤＮＡプローブ法、あるいはハイブリダイゼーショ
ン法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌ
クレオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、ある
いは他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、こ
れを検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と
選択性を得るのが難しい。
【０００６】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、黄色ブドウ球菌由来のTSST-1遺伝子を検出
するもので、簡便、迅速、かつ高感度な検査法を食中毒
検査、または下痢症検査に提供することにある。
核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅
技術により、黄色ブドウ球菌由来のTSST-1遺伝子を検出
するもので、簡便、迅速、かつ高感度な検査法を食中毒
検査、または下痢症検査に提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、黄色ブドウ球
菌のTSST-1遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす黄
色ブドウ球菌のうちTSST-1遺伝子を有する黄色ブドウ球
菌のみを選択的に検出することを特徴としている。
菌のTSST-1遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす黄
色ブドウ球菌のうちTSST-1遺伝子を有する黄色ブドウ球
菌のみを選択的に検出することを特徴としている。
【０００８】プライマーとして用いるオリゴヌクレオチ
ドは、TSST-1遺伝子をコードするヌクレオチド配列と相
補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドで
あって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＡＡＧＧＴＴＣ
ＡＴＧ−（３’）・・・・（ａ；配列番号１） （５’）ｄ−ＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡ
ＡＣ−（３’）・・・・（ｂ；配列番号２） （５’）ｄ−ＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡ
ＧＴＡＴ−（３’）・・・・（ｃ；配列番号３） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴ
ＴＴＣＡ−（３’）・・・・（ｄ；配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
ドは、TSST-1遺伝子をコードするヌクレオチド配列と相
補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドで
あって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＡＡＧＧＴＴＣ
ＡＴＧ−（３’）・・・・（ａ；配列番号１） （５’）ｄ−ＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡ
ＡＣ−（３’）・・・・（ｂ；配列番号２） （５’）ｄ−ＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡ
ＧＴＡＴ−（３’）・・・・（ｃ；配列番号３） （５’）ｄ−ＣＴＧＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴ
ＴＴＣＡ−（３’）・・・・（ｄ；配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
【０００９】また、上記オリゴヌクレオチドはＴの代わ
りにＵ（ウリジン）を用いても同様な効果が得られる。
りにＵ（ウリジン）を用いても同様な効果が得られる。
【００１０】ここで、遺伝子増幅は、Saiki らが開発し
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は黄色ブドウ球菌のTSST-1遺伝子）を検出する場
合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意する。それを熱変性により１本鎖状
態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合
反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸
を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。
この一連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟
まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大してく
る。
たPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してＰＣＲ
法; Science 230 1350(1985)）をもとに行っている。こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合は黄色ブドウ球菌のTSST-1遺伝子）を検出する場
合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意する。それを熱変性により１本鎖状
態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合
反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸
を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。
この一連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟
まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大してく
る。
【００１１】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。 しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すれば，ＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を含む試料液が調製できる。
【００１２】本発明でプライマーとして用いられる上記
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、少なくとも１０塩基以上の長さを持ったヌ
クレオチド断片で、化学合成あるいは天然のどちらでも
よい。また、プライマーは、特に検出用として標識され
ていなくてもよい。プライマーが規定している黄色ブド
ウ球菌のTSST-1遺伝子のヌクレオチド配列における増幅
領域は、５０塩基から２, ０００塩基、望ましくは１０
０塩基から １, ０００塩基となればよい。
オリゴヌクレオチドは選択性や検出感度、および再現性
から考えて、少なくとも１０塩基以上の長さを持ったヌ
クレオチド断片で、化学合成あるいは天然のどちらでも
よい。また、プライマーは、特に検出用として標識され
ていなくてもよい。プライマーが規定している黄色ブド
ウ球菌のTSST-1遺伝子のヌクレオチド配列における増幅
領域は、５０塩基から２, ０００塩基、望ましくは１０
０塩基から １, ０００塩基となればよい。
【００１３】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
る黄色ブドウ球菌のTSST-1遺伝子を増幅させる。 検出
はＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースゲル電気
泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片の存
在、およびその長さが確認できる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃の温度で活性を保持していれ
ば、どの生物種由来でもよい。熱変性温度は９０〜９５
℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操
作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、
この熱変性から重合反応までの操作を１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って、検体中に含まれ
る黄色ブドウ球菌のTSST-1遺伝子を増幅させる。 検出
はＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースゲル電気
泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片の存
在、およびその長さが確認できる。
【００１４】その結果から、検体中にプライマーが認識
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままTSST-1遺伝子を
もつ黄色ブドウ球菌の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
やクロマトグラフィーも有効である。
すべき配列を持ったヌクレオチドが存在しているかどう
かを判定できる。この判定は、そのままTSST-1遺伝子を
もつ黄色ブドウ球菌の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
やクロマトグラフィーも有効である。
【００１５】また、上記の（ａ）〜（ｄ）の配列の１つ
を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして機能さ
せ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオチド配
列を選択的に検出してもよい。この場合、オリゴヌクレ
オチドは標識物で修飾するのが好ましい。
を有するオリゴヌクレオチドをプローブとして機能さ
せ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオチド配
列を選択的に検出してもよい。この場合、オリゴヌクレ
オチドは標識物で修飾するのが好ましい。
【００１６】
【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により黄
色ブドウ球菌の特定遺伝子を検出するもので、簡便、迅
速かつ高感度な検出ができる。
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により黄
色ブドウ球菌の特定遺伝子を検出するもので、簡便、迅
速かつ高感度な検出ができる。
【００１７】
（実験例１）検体の調製 黄色ブドウ球菌は３４３株を用いた。これらの菌株は、
食中毒事例株あるいは環境分離株で、食中毒患者の下痢
便、嘔吐物、原因食品等から分離されたものである。各
菌株をブレインハートインフュージョン培地（ＢＢＬ社
製）に接種し、３７℃の好気的条件下で終夜振とう培養
を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液
ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍希釈し、９５℃
で５分間の加熱処理を行った後、これらを５０００rpm
で１分遠心し、その上清を検体とした。
食中毒事例株あるいは環境分離株で、食中毒患者の下痢
便、嘔吐物、原因食品等から分離されたものである。各
菌株をブレインハートインフュージョン培地（ＢＢＬ社
製）に接種し、３７℃の好気的条件下で終夜振とう培養
を行った。各菌株培養液を１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液
ｐＨ７．５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍希釈し、９５℃
で５分間の加熱処理を行った後、これらを５０００rpm
で１分遠心し、その上清を検体とした。
【００１８】プライマーの合成 黄色ブドウ球菌のTSST-1遺伝子の塩基配列（Blomster-H
autamaa et.al J.Biol.chem.26,15783-6(1986)）から、
請求項第１項に示した配列あるいはその相補鎖から (a)
から(d) を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。化学合成はサイクロンプラスＤＮ
Ａ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用
い、βーシアノエチルフォスホアミダイト法により行っ
た。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
autamaa et.al J.Biol.chem.26,15783-6(1986)）から、
請求項第１項に示した配列あるいはその相補鎖から (a)
から(d) を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。化学合成はサイクロンプラスＤＮ
Ａ合成装置（ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用
い、βーシアノエチルフォスホアミダイト法により行っ
た。合成したオリゴヌクレオチドの精製はＣ18逆相カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。
【００１９】ＰＣＲ 前記検体液３μl を用い、それに滅菌蒸留水１６．０５
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
μl 、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．８
μｌ、プライマー(1) １．５μｌ、プライマー(2) １．
５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。
【００２０】各使用した溶液の内容、およびプライマー
(1) と(2) の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたもので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の各水溶液 （濃度5 OD/ml ） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に
示した組合せで使用した。下表中、（ａ）〜（ｄ）は請
求項１に記載した合成ヌクレオチドに対応し、（ａ）は
配列番号１、（ｂ）は配列番号２、（ｃ）は配列番号
３、（ｄ）は配列番号４である。
(1) と(2) の組合せは次のとおりである。 10ｘ反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 0.1%(W/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたもので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の各水溶液 （濃度5 OD/ml ） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に
示した組合せで使用した。下表中、（ａ）〜（ｄ）は請
求項１に記載した合成ヌクレオチドに対応し、（ａ）は
配列番号１、（ｂ）は配列番号２、（ｃ）は配列番号
３、（ｄ）は配列番号４である。
【００２１】 プライマー(1) プライマー(2) （ｂ） （ｃ） （ａ） （ｄ） （ｂ） （ｄ） 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
ゼ（5 unit/ml; Perkin Elmer Cetus社製）。
【００２２】反応条件は、次のとおりである。 熱変性: ９４℃、１分 アニーリング: ５５℃、１分 重合反応: ７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイクル
（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、ＤＮ
Ａサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に上
記反応条件をプログラムして行った。
【００２３】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
【００２４】アガロースゲルはゲル濃度３％（W/V ）と
し、臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis 等著 Molecular
Cloning 第２版(1989)に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
し、臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis 等著 Molecular
Cloning 第２版(1989)に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
【００２５】逆受身ラテックス凝集反応（Reversed Pas
sive Latex Agglutination;RPLA 試験） 市販の黄色ブドウ球菌ＴＳＳＴ−１検出用ＲＰＬＡキッ
ト（ＴＳＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研株式会社製）
を購入し、付属の使用説明書に従い検体を調製して、試
験を行った。
sive Latex Agglutination;RPLA 試験） 市販の黄色ブドウ球菌ＴＳＳＴ−１検出用ＲＰＬＡキッ
ト（ＴＳＴ−ＲＰＬＡ「生研」デンカ生研株式会社製）
を購入し、付属の使用説明書に従い検体を調製して、試
験を行った。
【００２６】ただし、試験に供する検体については、エ
ンテロトキシンの産生を十分に行わせるために、一部条
件を変更して調製した。すなわち、使用説明書中では
『ブレインハートインフュージョン培地等で、３７℃、
１８〜２０時間振とう培養』のところを、本実施例で
は、ＢＢＬ社製のブレインハートインフュージョン培地
を使用し４８時間培養後、５０００ｒｐｍ、１分遠心し
た後の上清をＲＰＬＡ試験に供した。
ンテロトキシンの産生を十分に行わせるために、一部条
件を変更して調製した。すなわち、使用説明書中では
『ブレインハートインフュージョン培地等で、３７℃、
１８〜２０時間振とう培養』のところを、本実施例で
は、ＢＢＬ社製のブレインハートインフュージョン培地
を使用し４８時間培養後、５０００ｒｐｍ、１分遠心し
た後の上清をＲＰＬＡ試験に供した。
【００２７】結果 表１に本発明によるＰＣＲ法と従来のＴＳＴ−ＲＰＬＡ
との比較を示す。これによれば、本発明によれば、従来
法と同等またはそれ以上の感度で黄色ブドウ球菌のTSST
-1遺伝子が検出できることがわかる。なお、この表１中
の数字は、ＰＣＲ陽性が１８株でうち１７株がＲＰＬＡ
法でも陽性であり、３２５株がＰＣＲでもＲＰＬＡでも
陰性であったことを示す。すなわち、１株（ＰＣＲ陽
性、ＲＰＬＡ陰性）を除いてはＰＣＲとＲＰＬＡが一致
したことを示している。
との比較を示す。これによれば、本発明によれば、従来
法と同等またはそれ以上の感度で黄色ブドウ球菌のTSST
-1遺伝子が検出できることがわかる。なお、この表１中
の数字は、ＰＣＲ陽性が１８株でうち１７株がＲＰＬＡ
法でも陽性であり、３２５株がＰＣＲでもＲＰＬＡでも
陰性であったことを示す。すなわち、１株（ＰＣＲ陽
性、ＲＰＬＡ陰性）を除いてはＰＣＲとＲＰＬＡが一致
したことを示している。
【００２８】なお、一致しない１株をサザンハイブリダ
イゼーション法でＴＳＳＴ−１遺伝子の有無を調べたと
ころ遺伝子の存在が確認された。
イゼーション法でＴＳＳＴ−１遺伝子の有無を調べたと
ころ遺伝子の存在が確認された。
【００２９】
【表１】 また、図１に本発明のＰＣＲプライマーがどの位の感度
を有するかをテストした結果（電気泳動図）を示す。図
中１、２・・９はＰＣＲ反応に用いたＤＮＡのコピー数
を示しており、１は１０7 コピー、２は１０6 コピー、
３は１０5 コピー、４は１０4 コピー、５は１０3 コピ
ー、６は１０2 コピー、７は１０コピー、８は１コピ
ー、９は０コピーを示す。この図より、本発明によれば
ＤＮＡのコピー数が１０のときでも検出できることがわ
かる。
を有するかをテストした結果（電気泳動図）を示す。図
中１、２・・９はＰＣＲ反応に用いたＤＮＡのコピー数
を示しており、１は１０7 コピー、２は１０6 コピー、
３は１０5 コピー、４は１０4 コピー、５は１０3 コピ
ー、６は１０2 コピー、７は１０コピー、８は１コピ
ー、９は０コピーを示す。この図より、本発明によれば
ＤＮＡのコピー数が１０のときでも検出できることがわ
かる。
【００３０】（実験例２）実験例１で得られた結果がTS
ST-1遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、臨床検査において検査対象
となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒菌または下痢症菌等
の遺伝子について本発明のプライマーが反応するかどう
か調べた。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示
したものと同じである。
ST-1遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌に対して、選択的なも
のかどうかを確かめるため、臨床検査において検査対象
となる黄色ブドウ球菌以外の食中毒菌または下痢症菌等
の遺伝子について本発明のプライマーが反応するかどう
か調べた。方法は検体の調製法を除いて、実験例１で示
したものと同じである。
【００３１】検体の調製 表２中の各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種し、３
７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を行った
（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、表中のClos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides flagilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。
７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を行った
（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、表中のClos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides flagilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。
【００３２】各菌株培養液０. ５ｍｌから遠心操作によ
り、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７. ５に溶解した
Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液、およびアクロモペプチ
ダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ
／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０分間処理し、溶
菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロ
ロフォルムからなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に
加えて、よく撹拌した。
り、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌体を１回洗浄した。
この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７. ５に溶解した
Ｎ−アセチルムラミダーゼ溶液、およびアクロモペプチ
ダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ
／ｍｌとなるように加え、３７℃で１０分間処理し、溶
菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させたフェノールおよびクロ
ロフォルムからなる混合液（混合比１：１）を溶菌液に
加えて、よく撹拌した。
【００３３】遠心後、上層液を回収し、エタノール処理
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。
を行って、核酸成分を沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌ
のＴＥ緩衝液に溶かして検体とした。
【００３４】結果 表２に示すように、使用したプライマーは食中毒菌ＤＮ
Ａをはじめとする種々のＤＮＡの全てについて、それら
のＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本発
明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーはTSST-1
遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。また、表１に掲載されなかった残り
の各組合せについても同様な試験結果が得られた。
Ａをはじめとする種々のＤＮＡの全てについて、それら
のＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本発
明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーはTSST-1
遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。また、表１に掲載されなかった残り
の各組合せについても同様な試験結果が得られた。
【００３５】
【表２】
【００３６】
【効果】本発明ではＰＣＲ法を用いたことで、黄色ブド
ウ球菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。
ウ球菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。
【００３７】また、高い検出感度のため多量の検体を必
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。
【００３８】また、検出にアガロースゲル電気泳動と臭
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
【００３９】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＡＡＧＧＴＴ
ＣＡＴＧ
ＣＡＴＧ
【００４０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２１塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＡ
ＡＡＣ
ＡＡＣ
【００４１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣ
ＡＧＴＡＴ
ＡＧＴＡＴ
【００４２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Staphylococcus aureus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＡ
ＴＴＴＣＡ
ＴＴＴＣＡ
【図１】アガロース電気泳動図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，261（33）（1986）ｐ．15783− 15786
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在する黄色ブドウ球菌（ Staph
ylococcus aureus）の有する毒素性ショック症候群毒素
遺伝子（TSST-1遺伝子）をコードするヌクレオチド配列
を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるよう
に化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌ
クレオチドが以下の配列群、 （５')ｄ−ＣＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＴＡＡＧＧＴＴＣＡＴＧ−（３') ・・・・（ａ；配列番号１） （５')ｄ−ＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡＡＣ−（３') ・・・・（ｂ；配列番号２） （５')ｄ−ＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＧＴＡＴ−（３') ・・・・（ｂ；配列番号３） （５')ｄ−ＣＴＧＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡ−（３'） ・・・・（ｂ；配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とするオ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項1項に記載された各オリゴヌクレオ
チドの配列のうち、増幅されるべきヌクレオチド配列の
両端を規定する２種のオリゴヌクレオチドを鎖長反応の
プライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選
択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の1本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの
重合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる同
時の鎖長反応の鋳型として機能し、 （ｃ）これら2種のプライマーによる同時の鎖長反応、
プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たな
プライマーによるハイブリダイゼーションを繰り返すこ
とにより、特定のヌクレオチド配列が増幅され、増幅さ
れたヌクレオチド断片を検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することで毒素性ショック症候
群毒素遺伝子（TSST-1遺伝子）を有する黄色ブドウ球菌
の検出を行うことを特徴とする黄色ブドウ球菌の検出方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9925593A JP2993314B2 (ja) | 1993-04-26 | 1993-04-26 | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9925593A JP2993314B2 (ja) | 1993-04-26 | 1993-04-26 | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06303976A JPH06303976A (ja) | 1994-11-01 |
| JP2993314B2 true JP2993314B2 (ja) | 1999-12-20 |
Family
ID=14242609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9925593A Expired - Lifetime JP2993314B2 (ja) | 1993-04-26 | 1993-04-26 | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2993314B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669399B1 (en) * | 1994-02-28 | 2003-10-01 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
-
1993
- 1993-04-26 JP JP9925593A patent/JP2993314B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６１（３３）（１９８６）ｐ．１５７８３−１５７８６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06303976A (ja) | 1994-11-01 |
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