JPH03112498A - カンピロバクター検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 以下余白 ［産業上の利用分野］ 本発明は、臨床検査、あるいは食品検査でのカンピロバ
クタ−の検出に関するものである。

［従来の技術と問題点　］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、カンピロバクタ−と同定するまでには、増菌
培養、分離培養を経て同定試験を行わなければならない
、同定試験にはＭｆＭ鏡検査、生化学的性状検査を行わ
なければならない、各培養段階に要する時間は、１８〜
２４時間であり、その後の検査にかかる時間を合計する
と３〜４日もの長時間を要する。

一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプ
ローブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられ
るようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標
識修飾したプローブにより膜上、あるいは他の支持体上
でハイブリダイゼーションを行い、これを検出する場合
、細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るのが
難しい。

［発明の目的］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりカンピロバ
クタ−由来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高
感度なカンピロバクタ−の検査法を提供することにある
。

［問題点を解決するための手段および作用　１本発明は
、オリゴヌクレオチドを１ライマーとして用いた遺伝子
増幅法でカンピロバクタ−を選択的に検出することを特
徴としている。遺伝子増幅は、　５ａｉｋｉらが、　開
発したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎ法（以下、略してＰＣＲ法；　　５ｃｉｅｎｃｅ
、２３０、１３５０　（１９８５）　）をもとに行って
いる。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（
本発明の場合はカンピロバクタ−の染色体遺伝子）を検
出する場合、その領域の両端の一方は土類を他方は一鎖
をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするような
オリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本
鎖状態にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重
合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核
酸を再び１本鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせ
る。この一連の操作を繰り返すことで２つのプライマー
にはさまれた領域は検出できるまでにコピー数が増大し
てくる。検体としては、臨床検査材料、例えば、糞便、
尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材料で
もよい、これら材料をＰＣＲ反応の試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲ反応は進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲ反
応を進行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製で
きる０本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌク
レオチドは、選択性や検出感度および再現性から考えて
、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持っ
た核酸フラグメントで、化学合成あるいは天然のどちら
でもよい、また、プライマーは、特に検出用として標識
されていなくてもよい、　　プライマーが規定している
力ンビロバクターの染色体遺伝子における増幅領域は、
５０塩基から２０００塩基となればよい、鋳型依存性ヌ
クレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを
用いているが、この酵素の起源については９０〜９５℃
の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来でもよ
い、熱変性温度は、９０〜９５℃、プライマーをハイブ
リダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃
、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとした
ＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。

検出は酵素反応液をそのまま、アガロースゲル電気泳動
にかけることで増幅された核酸断片の存在およびその長
さがＮ認できる。その結果から、検体中に、プライマー
が認識すべき配列を持った核酸が存在しているかどうか
判定することができる。

この判定は、そのままカンピロバクタ−の有無を判定す
るものとなる。増幅された核酸断片の検出には、その他
の電気泳動やクロマトグラフィーも有効である。

Ｃ実施例］ （実施例１） 検ｍ裂 カンピロバクタ−用ＰＣＲプライマーの性能試験には表
１に示した８株のカンピロバクタ−（Ｃａｍｐｙｌｏｂ
ａｃｔｅｒ　ｊｅＪｕｎｉ）を用いて下記の方法により
検体の調製を行った。カンピロバクタ−の培養は密閉容
器内、ＧＡＭ培地に植菌し、カンピロバクタ−用ガス発
生袋（ＢＢＬ社製）によるガス環境下で２〜３日培養し
た６回収した菌体は適当な無機塩Ｍ新液で洗浄した後、
水冷下、リゾチーム（終濃度１　ｍｇ／ｍ　＋　）を添
加することで溶菌させた０次に、ＳＤＳ　（終濃度１％
）とプロテアーゼＫ（終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加
し５０℃、３０分加温し、再び水冷下に置いた。そして
、フェノール処理、エタノール沈澱を行って沈澱物を回
収しそれを１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に溶かした物を検体とした。波長２６０ｎｍの吸光度の
値より換算した核酸量は１μｇ／ｍ１である。

−　マー 特許請求範囲第１項に示した配列（（ａ）、（ｂ））を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は島
津ＤＮＡ合成機Ｎ５−１を用い、トリエステル法により
行った０合成したオリゴヌクレオチド断片の精製はＣ１
８逆相カラムをｍいて行った。

二二上 前記検体液を３μｌを用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
μｌ、１０×反応用バッファー３μｍ、　　ｄＮＴＰ溶
液４．８μｍ、プライマー（１）１．５μｍ、プライマ
ー（２）１．５μｍそして耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０
．１５μｌを加え、３０μｍの反応液を調製しな、　　
この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ
社製）を５０μｌ加え反応液上に重層する。各添加され
た液の内容を下記に示す。

１０×反応用バッフＦ−：　　５００ｍＭ　　ＫＣＩ。

１００ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３＞。

１５ｍＭ　　ＭｇＣＩ２．　０．　１％（ｗ／ｖ）ゼラ
チン ｄＮＴＰ溶液：　　ｄＡＴＰ、　　ｄＣＴＰ、　　ｄＧ
ＴＰ。

ｄＴＴＰを混合させたもので、各終濃度が１．２ｍＭ プライマー（ａ）および（ｂ）：　　前述した化学合成
精製品の各水溶液（５０ＤＵ／　ｍｌ　＞ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：　　Ｔａｑ　　ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｓ　ｕｎｉｔ／　＋ｓｌ；　　Ｐｅｒｋｉｎ
　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製） 反応条件は、次の通りである。

熱変性＝　９４℃　１分 アニーリング：　３７℃　１分 重合反応；　６０″ｃ　１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを４２サイク
ル（総所要時間約４時間）行った。

これらの操作は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ
ｓ社製　ＤＮＡＴｈｅｒ纏ａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上記反
応条件をプログラムすることにより行った。

１且 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。

アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ）とし、臭化エ
チジウム（０，５μｇ／ｍ　ｌ　）を含むものを用いた
。泳動の電気的条件は、定電圧１００ｖ、時間は３０分
行った。操作方法ならびに他の条件はＭａｎｉａｔｉｓ
等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）
に記載されている技法で行った０反応液の他に分子量マ
ーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較により
、ゲル中、紫外線光等で検出されたヌクレオチド断片の
長さを算出した。

級Ｉ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅＪｕｎｉについては
１．２キロ塩基対の大きさの増幅ＤＮＡ断片が生じた。

これは、８且株の全てに共通した現象であり、カンピロ
バクタ−の選択的検出にこのプライマーの組合せが有効
であることを強く示唆するものである。

表 菌株名 分与機関番号 実施例１で得られた結果が、カンピロバクタ−（Ｃｏｍ
ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅＪｕｎｉ）に対し選択的な
ものか確かめるため、臨床検査においてカンピロバクタ
−以外で検査対象となり得る菌種について比較検討した
。

方法は、実施例１に示したものと同じであるが、Ｃｌｏ
ｓｔｒｌｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ　ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃ目１ｕ
ｓ　ａｃｉｄｏｐｈｌｌｕｓについては嫌気的条件下、
３７℃で終夜培養を行い、ＰＣＲ法に適用しうる試料を
調製しな。

検体の調製において培養した菌は、表２の縦の見出しに
示した１ｏ菌株である。また、ヒト胎盤由来Ｄ　Ｎ　Ａ
　（Ｈｕ＋＊ａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ）はｌμｓ／ｍｌ
の濃度のものを調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた
。　　結果を表２に示す、１ａ内の数値は増幅されたＤ
ＮＡの大きさを示しており、単位はキーロ塩基対である
。カンピロバクタ−と同じ塩基配列を染色体遺伝子内に
この菌種が持っていれば実施例１の結果と同じ長さ（１
，２キロ塩基対）のヌクレオチド断片が検出されるはず
である。従って、この菌種由来の増幅されたヌクレオチ
ドはカンピロバクタ−の染色体遺伝子を認識して生成さ
れたもと容易に区別し検出できることがわがる。なお、
本発明の実施例にに用いているアガロース電気泳動を前
述の泳動条件行えば１００塩基対以下の範囲であれば５
から１０塩基対、１００がら５００塩基対の範囲であれ
ば１ｏがら２ｏ塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区
別することがでる。さらに、アクリルアミドなどをゲル
に用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度を向上
させれば、選択的検出における信頼度は、さらに高まる
ものと考えられる。

表　　　２ 菌種名　　　保存機関略号および株番号Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｊｅＪｕｎｉ　　　ＪＣＭ２０１３Ｃａ
ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ　　　　ＪＣＭ２５
２９１．２ ［発明の効果］ 本発明では、ＰＣＲ法を用いたことで、カンピロバクタ
−の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度
と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性を得ることができる。また
、高い検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の
前処理が簡便で済む、しかも、反応時間が短く、検出も
簡単な時間が４時間、検出にかかる操作が３０分である
。

また、検出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム
による核酸染色法をもちいることで、プライマー等に標
識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが確認できる
ので結果の信頼性が高いものとなる。

し四１丈；

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中に存在するカンピロバクター（Ｃａｍｐｙ
   ｌｏｂａｃｔｅｒＪｅｊｕｎｉ）を選択的に検出するた
   めのオリゴヌクレオチド、または、カンピロバクターの
   染色体遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし
   、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成
   されたオリゴヌクレオチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 【遺伝子配列があります】・・・（ａ） 【遺伝子配列があります】・・・（ｂ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
2. （２）請求項第１項に記載された配列のうち、少なくと
   も１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライ
   マーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に
   増幅させることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
   ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
   合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
   した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反
   応の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
   鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマー
   によるハイブリダイゼーションを繰り返すことにより特
   定のヌクレオチド配列が増幅され、電気泳動、クロマト
   グラフィーで増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
   在しているか否かを判定することでカンピロバクターの
   検出を行うことを含む方法。
3. （３）請求項第２項記載の方法における反応物を用いア
   ガロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色
   を行うことによる検出方法。