JP3414261B2 - 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、とりわ
け食中毒検査もしくは下痢症検査における病原性大腸菌
Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子の検出に関するもので
ある。
け食中毒検査もしくは下痢症検査における病原性大腸菌
Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子の検出に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】病原性大腸菌Ｏ１５７は、出血性大腸炎
に代表される食中毒症状のみでなく、小児の溶血性尿毒
症症候群（hemolytic uremic syndrome）の原因菌とも
なることが認められ、近年、臨床検査では、本菌の検出
が重要視されつつある。
に代表される食中毒症状のみでなく、小児の溶血性尿毒
症症候群（hemolytic uremic syndrome）の原因菌とも
なることが認められ、近年、臨床検査では、本菌の検出
が重要視されつつある。
【０００３】病原性大腸菌Ｏ１５７にかかる検査では、
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体から病原性大腸菌Ｏ１５７を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行わなければならない。ところが、これらの培養の各段
階における所要時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると３〜４日となり、非常に長時間
である。したがって、現在の腸管出血性大腸菌症の起因
菌の検査法は、迅速性および簡便性に欠けており、実効
的手段となり得ていない。一方、出血性大腸炎をおこす
病原性大腸菌の血清型としては、Ｏ１５７：Ｈ７が代表
的であり、腸管出血性大腸菌症の８０％以上を占めるこ
とが明らかとなっている。
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体から病原性大腸菌Ｏ１５７を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行わなければならない。ところが、これらの培養の各段
階における所要時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると３〜４日となり、非常に長時間
である。したがって、現在の腸管出血性大腸菌症の起因
菌の検査法は、迅速性および簡便性に欠けており、実効
的手段となり得ていない。一方、出血性大腸炎をおこす
病原性大腸菌の血清型としては、Ｏ１５７：Ｈ７が代表
的であり、腸管出血性大腸菌症の８０％以上を占めるこ
とが明らかとなっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オリゴヌク
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原
合成領域遺伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ
食中毒・下痢症にかかる検査における、簡便、迅速、か
つ高感度な病原性大腸菌症、とりわけ重篤な症状を引き
起こす腸管出血性大腸菌症の検査法を提供することにあ
る。
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原
合成領域遺伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ
食中毒・下痢症にかかる検査における、簡便、迅速、か
つ高感度な病原性大腸菌症、とりわけ重篤な症状を引き
起こす腸管出血性大腸菌症の検査法を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、病原性大腸菌
Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子と選択的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌク
レオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用いている。
これにより、大腸菌（Escherichia coli）のうち、Ｏ１
５７の血清型を有する菌のみを選択的に検出することを
特徴としている。
Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子と選択的にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌク
レオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用いている。
これにより、大腸菌（Escherichia coli）のうち、Ｏ１
５７の血清型を有する菌のみを選択的に検出することを
特徴としている。
【０００６】ここで、プライマーは、検体中に存在する
腸管出血性大腸菌症の主な起因菌である病原性大腸菌Ｏ
１５７のＯ抗原合成領域遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列を標的として、そのヌクレオチド配列と相補的と
なるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列のうち（ａ又はaの
相補鎖）と（ｃ又はｃの相補鎖）との組合せ、又は、
（ｂ又はｂの相補鎖）と（ｄ又はｄの相補鎖）との組合
せからなる。 （５’）ｄ−ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ−（３’） ・・・（配列番号１；ａ） （５’）ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−（３’） ・・・（配列番号２；ｂ） （５’）ｄ−ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ−（３’） ・・・（配列番号３；ｃ） （５’）ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−（３’） ・・・（配列番号４；ｄ）
腸管出血性大腸菌症の主な起因菌である病原性大腸菌Ｏ
１５７のＯ抗原合成領域遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列を標的として、そのヌクレオチド配列と相補的と
なるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列のうち（ａ又はaの
相補鎖）と（ｃ又はｃの相補鎖）との組合せ、又は、
（ｂ又はｂの相補鎖）と（ｄ又はｄの相補鎖）との組合
せからなる。 （５’）ｄ−ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ−（３’） ・・・（配列番号１；ａ） （５’）ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−（３’） ・・・（配列番号２；ｂ） （５’）ｄ−ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ−（３’） ・・・（配列番号３；ｃ） （５’）ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−（３’） ・・・（配列番号４；ｄ）
【０００７】遺伝子増幅は、Saikiらが開発したPolymer
ase Chain Reaction法（以下、ＰＣＲ法と略する；Scie
nce 230, 1350(1985)）をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子）を
検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするよ
うなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により
１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオ
チド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２
本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こ
させる。この一連の操作を繰り返すことで、２つのプラ
イマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増
大してくる。
ase Chain Reaction法（以下、ＰＣＲ法と略する；Scie
nce 230, 1350(1985)）をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子）を
検出する場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするよ
うなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により
１本鎖状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオ
チド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２
本鎖核酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こ
させる。この一連の操作を繰り返すことで、２つのプラ
イマーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増
大してくる。
【０００８】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーが
ハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存
在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面
活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進
行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【０００９】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていてもいなくともよい。プライマーが規定
している病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子
のヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基から
２,０００塩基、望ましくは、１００塩基から１,０００
塩基となればよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていてもいなくともよい。プライマーが規定
している病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子
のヌクレオチド配列における増幅領域は、５０塩基から
２,０００塩基、望ましくは、１００塩基から１,０００
塩基となればよい。
【００１０】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５゜Ｃの温度で活性を保持してい
れば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜
９５゜Ｃ、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリ
ング操作の温度は３７〜６５゜Ｃ、重合反応は５０〜７
５゜Ｃで、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４
２サイクル行って増幅させる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５゜Ｃの温度で活性を保持してい
れば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜
９５゜Ｃ、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリ
ング操作の温度は３７〜６５゜Ｃ、重合反応は５０〜７
５゜Ｃで、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４
２サイクル行って増幅させる。
【００１１】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままＯ１５７抗原合成領域遺
伝子をもつ大腸菌の有無を判定するものとなる。増幅さ
れたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動法
やクロマトグラフィーも有効である。また、上記プライ
マーの１つを有するオリゴヌクレオチドをプローブとし
て機能させ、膜上、あるいはその他支持体上の標的ヌク
レオチド配列を選択的に検出しても良い。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままＯ１５７抗原合成領域遺
伝子をもつ大腸菌の有無を判定するものとなる。増幅さ
れたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動法
やクロマトグラフィーも有効である。また、上記プライ
マーの１つを有するオリゴヌクレオチドをプローブとし
て機能させ、膜上、あるいはその他支持体上の標的ヌク
レオチド配列を選択的に検出しても良い。
【００１２】
【実施例】（実施例１）検体の調製
使用した腸管出血性大腸菌（以下、ＥＨＥＣという）
は、患者等から由来したもので、総計３４７株であっ
た。各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０.５％イー
ストエクストラクト、および１％塩化ナトリウム）に接
種し、３７゜Ｃ、好気的条件下で、終夜振とう培養を行
った。各菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７.５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５゜Ｃで
１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その
上清を検体とした。
は、患者等から由来したもので、総計３４７株であっ
た。各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０.５％イー
ストエクストラクト、および１％塩化ナトリウム）に接
種し、３７゜Ｃ、好気的条件下で、終夜振とう培養を行
った。各菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７.５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５゜Ｃで
１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その
上清を検体とした。
【００１３】プライマーの合成
病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子の塩基配
列（Shimizu,K.ら）から、請求項第１項に示した各配列
を選び、それらと同配列のオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は、β−シアノエチルフォスホアミダ
イト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精
製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーで行った。
列（Shimizu,K.ら）から、請求項第１項に示した各配列
を選び、それらと同配列のオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成は、β−シアノエチルフォスホアミダ
イト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精
製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーで行った。
【００１４】ＰＣＲ
前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７.０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４.８
μｌ、プライマー(1)１.０μｌ、プライマー(2)１.０μ
ｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０.１５μｌを加
えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応液の
入った容器にミネラルオイル（SIGMA社製）を５０μｌ
加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内容、お
よびプライマー(1)と(2)の組合せは、次のとおりであ
る。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４.８
μｌ、プライマー(1)１.０μｌ、プライマー(2)１.０μ
ｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０.１５μｌを加
えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応液の
入った容器にミネラルオイル（SIGMA社製）を５０μｌ
加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内容、お
よびプライマー(1)と(2)の組合せは、次のとおりであ
る。
【００１５】10x反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris
-HCl pH8.3, 15mM 塩化マグネシウム, 0.1%(w/V)ゼラチ
ン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1)および(2): 前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を組合せて
使用した。
-HCl pH8.3, 15mM 塩化マグネシウム, 0.1%(w/V)ゼラチ
ン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1)および(2): 前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を組合せて
使用した。
【００１６】プライマー(1) ＋ プライマー(2)
(a) ＋ (c)(b) ＋ (d)
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus社製） 反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４゜Ｃ、１分 アニーリング： ５５゜Ｃ、１分 重合反応： ７２゜Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus社製） 反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４゜Ｃ、１分 アニーリング： ５５゜Ｃ、１分 重合反応： ７２゜Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００１７】検出
反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V）とし、臭化エチジ
ウム（0.5μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版（1
989）に記載されている技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V）とし、臭化エチジ
ウム（0.5μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版（1
989）に記載されている技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００１８】抗Ｏ１５７血清による凝集試験
使用した菌株のＯ抗原がＯ１５７であるかどうか、市販
の抗Ｏ１５７血清（デンカ生研製）を用いた菌体の凝集
試験によって調べた。凝集試験の詳細は、抗血清に添付
の使用説明書に基づいた。結果 前述したように病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域
遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明の
オリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲに
より増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定でき
る。それによるとプライマー(a)と(c)の組合せでは、３
０５塩基（または３０５塩基対）の長さのヌクレオチド
が増幅されるはずであり、プライマー(b)と(d)の組合せ
では、４５７（または４５７塩基対）のヌクレオチドが
増幅されることになる。これらの推定値と実際に増幅さ
れたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプライマ
ーの組合せは、Ｏ抗原合成領域遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株は大腸菌
Ｏ１５７に特有のＯ抗原合成領域遺伝子を有していると
判断した。被験菌株３４７株で調べた結果を表１に示
す。各プライマーの組合せは、抗Ｏ１５７血清による凝
集試験で、血清型がＯ１５７であると判断された菌株の
ＤＮＡのみを増幅し、血清型がＯ１５７以外の菌株ＤＮ
Ａとは全く反応しなかった。すなわち、大腸菌Ｏ１５７
のＯ抗原合成領域遺伝子を正しく増幅し、Ｏ１５７の血
清型である腸管出血性大腸菌を正確に検出していること
を示している。
の抗Ｏ１５７血清（デンカ生研製）を用いた菌体の凝集
試験によって調べた。凝集試験の詳細は、抗血清に添付
の使用説明書に基づいた。結果 前述したように病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域
遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明の
オリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲに
より増幅させるヌクレオチドの大きさは容易に推定でき
る。それによるとプライマー(a)と(c)の組合せでは、３
０５塩基（または３０５塩基対）の長さのヌクレオチド
が増幅されるはずであり、プライマー(b)と(d)の組合せ
では、４５７（または４５７塩基対）のヌクレオチドが
増幅されることになる。これらの推定値と実際に増幅さ
れたヌクレオチドの長さが一致した場合、このプライマ
ーの組合せは、Ｏ抗原合成領域遺伝子中の標的としてい
る領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌株は大腸菌
Ｏ１５７に特有のＯ抗原合成領域遺伝子を有していると
判断した。被験菌株３４７株で調べた結果を表１に示
す。各プライマーの組合せは、抗Ｏ１５７血清による凝
集試験で、血清型がＯ１５７であると判断された菌株の
ＤＮＡのみを増幅し、血清型がＯ１５７以外の菌株ＤＮ
Ａとは全く反応しなかった。すなわち、大腸菌Ｏ１５７
のＯ抗原合成領域遺伝子を正しく増幅し、Ｏ１５７の血
清型である腸管出血性大腸菌を正確に検出していること
を示している。
【００１９】
【表１−１】
【００２０】
【表１−２】
【００２１】
【表１−３】
【００２２】
【表１−４】
（実施例２）実施例１で得られた結果が、Ｏ１５７抗原
をもつ大腸菌に対して、選択的なものかどうかを確かめ
るため、臨床検査において検査対象となる、腸管出血性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
をもつ大腸菌に対して、選択的なものかどうかを確かめ
るため、臨床検査において検査対象となる、腸管出血性
大腸菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプラ
イマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調製
法を除いて、実施例１で示したものと同じである。
【００２３】検体の調製
表２中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７゜Ｃ、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Cl
ostridium perfringens、Campylobacter jejuni、Bacte
roides fragili s、Bacteroides vulgatus、およびLacto
bacillus acidophilusである）。各菌株培養液０.５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７.５に溶解したＮ-アセチルムラミニダーゼ溶液、お
よびアクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／
ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７゜Ｃ
で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させた
フェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合
比１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、
上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を
沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かし
て検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human plac
enta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、こ
れも同様にＰＣＲを行わせた。
し、３７゜Ｃ、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Cl
ostridium perfringens、Campylobacter jejuni、Bacte
roides fragili s、Bacteroides vulgatus、およびLacto
bacillus acidophilusである）。各菌株培養液０.５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７.５に溶解したＮ-アセチルムラミニダーゼ溶液、お
よびアクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／
ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７゜Ｃ
で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させた
フェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合
比１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、
上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を
沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かし
て検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human plac
enta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、こ
れも同様にＰＣＲを行わせた。
【００２４】結果
表２に一部のプライマーの組合せにおける試験結果を示
す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢症菌ＤＮ
Ａをはじめとする種々のＤＮＡについて、それらのＤＮ
Ａを増幅することはなかった。したがって、本発明のオ
リゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、ＶＴ２遺伝
子を有する菌にのみ、選択的に反応するものと断言でき
る。なお、本発明の実施例で用いているアガロースゲル
電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基（または
１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであれば、５
から１０塩基（塩基対）、また、１００から５００塩基
（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１０から２
０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違いを区別可
能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル材に用い
ることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させる
ことができ、Ｏ抗原合成領域遺伝子の選択的検出におけ
る信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢症菌ＤＮ
Ａをはじめとする種々のＤＮＡについて、それらのＤＮ
Ａを増幅することはなかった。したがって、本発明のオ
リゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、ＶＴ２遺伝
子を有する菌にのみ、選択的に反応するものと断言でき
る。なお、本発明の実施例で用いているアガロースゲル
電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基（または
１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであれば、５
から１０塩基（塩基対）、また、１００から５００塩基
（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１０から２
０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違いを区別可
能である。さらに、アクリルアミドなどをゲル材に用い
ることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させる
ことができ、Ｏ抗原合成領域遺伝子の選択的検出におけ
る信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よび腸管出血性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大
腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子を標的とするプラ
イマーを用いたことにより、Ｏ１５７抗原を有する菌の
検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、
２つ、あるいは、それ以上の数のプライマーで反応が規
定されることによる高い選択性とが得られる。また、検
出感度が高いので、多量の検体を必要とせず、検体の前
処理も簡便で済む。本発明における実施例では、反応時
間３時間、検出にかかる操作が３０分であった。そのう
え、検出にアガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウム
による核酸染色法を用いることで、プライマー等を標識
せずに検出が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの
長さを確認できるので、試験結果の信頼性は高いものと
なる。
よび腸管出血性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大
腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域遺伝子を標的とするプラ
イマーを用いたことにより、Ｏ１５７抗原を有する菌の
検出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、
２つ、あるいは、それ以上の数のプライマーで反応が規
定されることによる高い選択性とが得られる。また、検
出感度が高いので、多量の検体を必要とせず、検体の前
処理も簡便で済む。本発明における実施例では、反応時
間３時間、検出にかかる操作が３０分であった。そのう
え、検出にアガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウム
による核酸染色法を用いることで、プライマー等を標識
せずに検出が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの
長さを確認できるので、試験結果の信頼性は高いものと
なる。
【００２７】腸管出血性大腸菌症の検査には、発見患者
の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞のな
い正確な結果が要求される。また、本発明は、腸管出血
性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大腸菌Ｏ１５７
の菌体の一部を構成している糖鎖抗原の遺伝子を選択的
に検出するものである。したがって、本発明により、腸
管出血性大腸菌症の起因菌の検出・決定を迅速かつ正確
に行うことが可能となる。
の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞のな
い正確な結果が要求される。また、本発明は、腸管出血
性大腸菌症の主要な起因菌である病原性大腸菌Ｏ１５７
の菌体の一部を構成している糖鎖抗原の遺伝子を選択的
に検出するものである。したがって、本発明により、腸
管出血性大腸菌症の起因菌の検出・決定を迅速かつ正確
に行うことが可能となる。
【００２８】
【配列表】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１
配列の長さ ２１塩基
配列の型 核酸
鎖の数 一本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 Genomic DNA
ハイポセティカル配列 ＮＯ
アンチセンス ＮＯ
起源 Escherichia coli
配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ
配列 ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ
【００２９】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２
配列の長さ ２０塩基
配列の型 核酸
鎖の数 一本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 Genomic DNA
ハイポセティカル配列 ＮＯ
アンチセンス ＮＯ
起源 Escherichia coli
配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ
配列 ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ
【００３０】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３
配列の長さ ２１塩基
配列の型 核酸
鎖の数 一本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 Genomic DNA
ハイポセティカル配列 ＮＯ
アンチセンス ＮＯ
起源 Escherichia coli
配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ
配列 ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ
【００３１】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４
配列の長さ ２１塩基
配列の型 核酸
鎖の数 一本鎖
トポロジー 直鎖状
配列の種類 Genomic DNA
ハイポセティカル配列 ＮＯ
アンチセンス ＮＯ
起源 Escherichia coli
配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ
配列 ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在する腸管出血性大腸菌症の主
な起因菌である病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原合成領域
遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的として、そ
のヌクレオチド配列と相補的となるように化学合成され
たオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以
下の配列のうち（ａ又はaの相補鎖）と（ｃ又はｃの相
補鎖）との組合せ、又は、（ｂ又はｂの相補鎖）と（ｄ
又はｄの相補鎖）との組合せからなる遺伝子増幅反応用
プライマー。 （５’）ｄ−ＡＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＴＴＧＴＡＧＣＡＣＣ−（３’） ・・・（配列番号１；ａ） （５’）ｄ−ＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＣ−（３’） ・・・（配列番号２；ｂ） （５’）ｄ−ＡＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＧ−（３’） ・・・（配列番号３；ｃ） （５’）ｄ−ＡＣＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＣＣ−（３’） ・・・（配列番号４；ｄ） - 【請求項２】請求項第１項に記載された配列のうち、
（ａ又はaの相補鎖）と（ｃ又はｃの相補鎖）との組合
せ、又は、（ｂ又はｂの相補鎖）と（ｄ又はｄの相補
鎖）との組合せを鎖長反応のプライマーとして機能さ
せ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることを
特徴とする方法であって、（１） 検体中の１本鎖状態
の標的ヌクレオチド配列にプライマーをハイブリダイズ
させ、４種のヌクレオチドの重合反応により鎖長反応を
行わせ、（２） 得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配
列を１本鎖に分離した場合、その相補鎖は他方のプライ
マーによる鎖長反応の鋳型として機能し、（３） これ
ら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−ションを繰
り返すことにより、特定のヌクレオチド配列が増幅さ
れ、電気泳動、またはクロマトグラフィーで増幅された
ヌクレオチド断片を検出し、（４） その結果、前記検
体中に認識されるべき配列が存在しているか否かを判定
することで病原性大腸菌Ｏ１５７Ｃの検出を行うことを
含む方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14975098A JP3414261B2 (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14975098A JP3414261B2 (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11332600A JPH11332600A (ja) | 1999-12-07 |
| JP3414261B2 true JP3414261B2 (ja) | 2003-06-09 |
Family
ID=15481947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14975098A Expired - Lifetime JP3414261B2 (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3414261B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1324133C (zh) * | 2003-12-22 | 2007-07-04 | 南开大学 | 对大肠杆菌o71型的o－抗原特异的核苷酸 |
| CN1316020C (zh) * | 2003-12-22 | 2007-05-16 | 南开大学 | 对大肠杆菌o74型的o－抗原特异的核苷酸 |
| CN103409517A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-11-27 | 福建省亚明食品有限公司 | 快速检测肠出血性大肠杆菌o157:h7的生物传感芯片 |
-
1998
- 1998-05-29 JP JP14975098A patent/JP3414261B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11332600A (ja) | 1999-12-07 |
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