JPH11332598A - ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH11332598A JPH11332598A JP10149748A JP14974898A JPH11332598A JP H11332598 A JPH11332598 A JP H11332598A JP 10149748 A JP10149748 A JP 10149748A JP 14974898 A JP14974898 A JP 14974898A JP H11332598 A JPH11332598 A JP H11332598A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、食中毒・下痢症にかかる検査におけ
る、簡便、迅速、かつ高感度なＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の
検査法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１
遺伝子と選択的にハイブリダイズする配列番号１、２の
オリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチド
をプライマーとして遺伝子増幅に用いている。これによ
り、本菌の病原因子の一つであるＶＴ１を産生する菌の
みを選択的に検出することを特徴としている。
る、簡便、迅速、かつ高感度なＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の
検査法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１
遺伝子と選択的にハイブリダイズする配列番号１、２の
オリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチド
をプライマーとして遺伝子増幅に用いている。これによ
り、本菌の病原因子の一つであるＶＴ１を産生する菌の
みを選択的に検出することを特徴としている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、とりわ
け食中毒検査もしくは下痢症検査におけるＥＨＥＣまた
はＶＴＥＣ、およびＶＴ１遺伝子の検出に関するもので
ある。
け食中毒検査もしくは下痢症検査におけるＥＨＥＣまた
はＶＴＥＣ、およびＶＴ１遺伝子の検出に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣは、出血性大腸
炎に代表される食中毒症状のみでなく、小児の溶血性尿
毒症症候群（hemolytic uremic syndrome）の原因菌と
もなることが認められ、近年、臨床検査では、本菌の検
出が重要視されつつある。
炎に代表される食中毒症状のみでなく、小児の溶血性尿
毒症症候群（hemolytic uremic syndrome）の原因菌と
もなることが認められ、近年、臨床検査では、本菌の検
出が重要視されつつある。
【０００３】ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）にかかる検査では、
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体からＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行う必要がある。ところが、これらの培養段階に要する
時間は、それぞれ１８〜２４時間であり、総所要時間に
すると３〜４日となり、非常に長時間である。ＥＨＥＣ
（ＶＴＥＣ）の血清型としては、現在、Ｏ１５７：Ｈ７
が代表的であるが、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）においては、
血清型と起病性とは必ずしも一致するものではないの
で、血清型による同定だけでは起因菌としての判定に困
難が生じる場合が多い。したがって、現在のＥＨＥＣ
（ＶＴＥＣ）検査法では、迅速性および簡便性に欠け、
実効的でない。
検査材料は患者の糞便、食品、または患者の周辺環境か
ら採取された水（飲料水、河川水等）である。これらの
検体からＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）を検出し、同定しようと
する場合、直接分離培養、一次確認培養試験、二次確認
培養試験を経て抗血清による凝集反応試験に至る操作を
行う必要がある。ところが、これらの培養段階に要する
時間は、それぞれ１８〜２４時間であり、総所要時間に
すると３〜４日となり、非常に長時間である。ＥＨＥＣ
（ＶＴＥＣ）の血清型としては、現在、Ｏ１５７：Ｈ７
が代表的であるが、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）においては、
血清型と起病性とは必ずしも一致するものではないの
で、血清型による同定だけでは起因菌としての判定に困
難が生じる場合が多い。したがって、現在のＥＨＥＣ
（ＶＴＥＣ）検査法では、迅速性および簡便性に欠け、
実効的でない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オリゴヌク
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１
遺伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ食中毒・
下痢症にかかる検査における、簡便、迅速、かつ高感度
なＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査法を提供することにあ
る。
レオチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させる
遺伝子増幅技術により、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１
遺伝子を検出するもので、臨床検査、とりわけ食中毒・
下痢症にかかる検査における、簡便、迅速、かつ高感度
なＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査法を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＥＨＥＣ（Ｖ
ＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子と選択的にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチド
をプライマーとして遺伝子増幅に用いている。これによ
り、本菌の病原因子の一つであるＶＴ１を産生する菌の
みを選択的に検出することを特徴としている。
ＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子と選択的にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドを作製し、このオリゴヌクレオチド
をプライマーとして遺伝子増幅に用いている。これによ
り、本菌の病原因子の一つであるＶＴ１を産生する菌の
みを選択的に検出することを特徴としている。
【０００６】ここで、プライマーは、検体中に存在する
腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia co
li、以下、ＥＨＥＣ）またはベロ毒素産生性大腸菌（Ve
rocytotoxin-producing Escherichia coli、以下、ＶＴ
ＥＣ）の産生するベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝
子（以下、ＶＴ１遺伝子）をコードするヌクレオチド配
列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるよ
うに化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成
ヌクレオチドが以下の配列、 配列番号１： （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’）・・・（ａ） 配列番号２： （５’）ｄ−ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ−（３’）・・（ｂ） または対応する相補的配列を有する。
腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia co
li、以下、ＥＨＥＣ）またはベロ毒素産生性大腸菌（Ve
rocytotoxin-producing Escherichia coli、以下、ＶＴ
ＥＣ）の産生するベロ毒素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝
子（以下、ＶＴ１遺伝子）をコードするヌクレオチド配
列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるよ
うに化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成
ヌクレオチドが以下の配列、 配列番号１： （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’）・・・（ａ） 配列番号２： （５’）ｄ−ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ−（３’）・・（ｂ） または対応する相補的配列を有する。
【０００７】遺伝子増幅は、Saikiらが開発したPolymer
ase Chain Reaction法（以下、ＰＣＲ法と略する；Scie
nce 230, 1350(1985)）をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのＶＴ１遺伝子）を検出す
る場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖を
それぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオ
リゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖
状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重
合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核
酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせ
る。この一連の操作を繰り返すことで、２つのプライマ
ーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大し
てくる。
ase Chain Reaction法（以下、ＰＣＲ法と略する；Scie
nce 230, 1350(1985)）をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合
は、ＥＨＥＣまたはＶＴＥＣのＶＴ１遺伝子）を検出す
る場合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖を
それぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオ
リゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖
状態にした試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重
合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核
酸を再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせ
る。この一連の操作を繰り返すことで、２つのプライマ
ーに挟まれた領域は検出できるまでにコピー数が増大し
てくる。
【０００８】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
【０００９】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもいてもよい。プライマーが規定
しているＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子のヌクレ
オチド配列における増幅領域は、５０塩基から２,００
０塩基、望ましくは、１００塩基から１,０００塩基と
なればよい。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもいてもよい。プライマーが規定
しているＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子のヌクレ
オチド配列における増幅領域は、５０塩基から２,００
０塩基、望ましくは、１００塩基から１,０００塩基と
なればよい。
【００１０】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５゜Ｃの温度で活性を保持してい
れば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜
９５゜Ｃ、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリ
ング操作の温度は３７〜６５゜Ｃ、重合反応は５０〜７
５゜Ｃで、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４
２サイクル行って増幅させる。
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５゜Ｃの温度で活性を保持してい
れば、どの生物種由来でもよい。熱変性の温度は９０〜
９５゜Ｃ、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリ
ング操作の温度は３７〜６５゜Ｃ、重合反応は５０〜７
５゜Ｃで、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４
２サイクル行って増幅させる。
【００１１】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままＶＴ１遺伝子をもつＥＨ
ＥＣ（ＶＴＥＣ）菌の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
法やクロマトグラフィーも有効である。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さを確認できる。そ
の結果から検体中にプライマーが認識すべき配列を持っ
たヌクレオチドが存在しているかどうか判定することが
できる。この判定は、そのままＶＴ１遺伝子をもつＥＨ
ＥＣ（ＶＴＥＣ）菌の有無を判定するものとなる。増幅
されたヌクレオチド断片の検出には、その他の電気泳動
法やクロマトグラフィーも有効である。
【００１２】また、臭化エチジウムによる核酸染色や前
記プライマーの１つを有するオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして機能させ、膜上、あるいはその他支持体上の
標的ヌクレオチド配列を選択的に検出してもよい。
記プライマーの１つを有するオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして機能させ、膜上、あるいはその他支持体上の
標的ヌクレオチド配列を選択的に検出してもよい。
【００１３】
【実施例】（実施例１）検体の調製 使用したＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）は、患者等から由来した
もので、総計３２９株を用いた。各菌株をＬＢ培地（１
％トリプトン、０.５％イーストエクストラクト、およ
び１％塩化ナトリウムに接種し、３７゜Ｃ、好気的条件
下で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７.５（以下ＴＥ緩衝液）で
１０倍に希釈し、９５゜Ｃで１０分間の加熱処理を行っ
た後、これらを遠心し、その上清を検体とした。
もので、総計３２９株を用いた。各菌株をＬＢ培地（１
％トリプトン、０.５％イーストエクストラクト、およ
び１％塩化ナトリウムに接種し、３７゜Ｃ、好気的条件
下で、終夜振とう培養を行った。各菌株培養液を１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７.５（以下ＴＥ緩衝液）で
１０倍に希釈し、９５゜Ｃで１０分間の加熱処理を行っ
た後、これらを遠心し、その上清を検体とした。
【００１４】プライマーの合成 ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子の塩基配列（Taka
o, T et al.,Microb.Pathog.,5:357-369(1988)）から、
請求項第１項に示した各配列を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、
サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオ
リサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミ
ダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの
精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーで行った。
o, T et al.,Microb.Pathog.,5:357-369(1988)）から、
請求項第１項に示した各配列を選び、それと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、
サイクロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオ
リサーチ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミ
ダイト法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの
精製はＣ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーで行った。
【００１５】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７.０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４.８
μｌ、プライマー(1)１.０μｌ、プライマー(2)１.０μ
ｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０.１５μｌを加
えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応液の
入った容器にミネラルオイル（SIGMA社製）を５０μｌ
加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内容、お
よびプライマー(1)と(2)の組合せは、次のとおりであ
る。
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４.８
μｌ、プライマー(1)１.０μｌ、プライマー(2)１.０μ
ｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０.１５μｌを加
えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応液の
入った容器にミネラルオイル（SIGMA社製）を５０μｌ
加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内容、お
よびプライマー(1)と(2)の組合せは、次のとおりであ
る。
【００１６】10x反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tris
-HCl pH8.3,15mM 塩化マグネシウム, 0.1%(w/V)ゼラチ
ン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1)および(2): 前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表のと
おりに組合せて使用した。
-HCl pH8.3,15mM 塩化マグネシウム, 0.1%(w/V)ゼラチ
ン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1)および(2): 前述した化学合成精製品の水
溶液（濃度3.75 OD/ml） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表のと
おりに組合せて使用した。
【００１７】 プライマー(1) ＋ プライマー(2) (a) ＋ (b) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus社製） 反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４゜Ｃ、１分 アニーリング： ５５゜Ｃ、１分 重合反応： ７２゜Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
（5 unit/ml; PerkinElmer Cetus社製） 反応条件は、次のとおりである。 熱変性： ９４゜Ｃ、１分 アニーリング： ５５゜Ｃ、１分 重合反応： ７２゜Ｃ、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。
【００１８】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V）とし、臭化エチジ
ウム（0.5μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版（1
989）に記載されている技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。ア
ガロースゲルはゲル濃度３％（W/V）とし、臭化エチジ
ウム（0.5μl/ml）を含むものを用いた。泳動の条件は
定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操作方法ならびに他
の条件は、Maniatis等著 Molecular Cloning 第２版（1
989）に記載されている技法で行った。反応液の他に分
子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較に
よりヌクレオチド断片の長さを算出した。
【００１９】コロニーハイブリダイゼーション試験 ＶＴ１遺伝子、またはＶＴ２遺伝子にそれぞれ特異的な
オリゴクレオチドプローブを用いて、Grunsteinの方法
（Grunstein, M. and Hogness, D., Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961 (1975)）にしたがって行った。
オリゴクレオチドプローブを用いて、Grunsteinの方法
（Grunstein, M. and Hogness, D., Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961 (1975)）にしたがって行った。
【００２０】結果 前述したようにＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）のＶＴ１遺伝子
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅するヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。それ
によるとプライマー(a)と(b)の組合せでは、６０９塩基
（または６０９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。
は、すでに塩基配列が決定されており、本発明のオリゴ
ヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣＲにより増
幅するヌクレオチドの大きさは容易に推定できる。それ
によるとプライマー(a)と(b)の組合せでは、６０９塩基
（または６０９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。
【００２１】これらの推定値と増幅されたヌクレオチド
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せはＶＴ
１遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株はＶＴ１遺伝子を有していると判断
した。被験菌株３４７株で調べた結果を表１ー１〜１ー
３に示した。プライマーの組合せは、コロニーハイブリ
ダイゼーション試験で、ＶＴ１遺伝子陽性と判断された
菌株ＤＮＡのみを増幅し、ＶＴ１遺伝子陰性の菌株ＤＮ
Ａとは全く反応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子を
正しく増幅し、ＶＴ１遺伝子を有するＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）を正確に検出していることを示している。
の長さが一致した場合、このプライマーの組合せはＶＴ
１遺伝子中の標的としている領域を正しく増幅してお
り、かつ、当該菌株はＶＴ１遺伝子を有していると判断
した。被験菌株３４７株で調べた結果を表１ー１〜１ー
３に示した。プライマーの組合せは、コロニーハイブリ
ダイゼーション試験で、ＶＴ１遺伝子陽性と判断された
菌株ＤＮＡのみを増幅し、ＶＴ１遺伝子陰性の菌株ＤＮ
Ａとは全く反応しなかった。すなわち、ＶＴ１遺伝子を
正しく増幅し、ＶＴ１遺伝子を有するＥＨＥＣ（ＶＴＥ
Ｃ）を正確に検出していることを示している。
【００２２】
【表１−１】
【００２３】
【表１−２】
【００２４】
【表１−３】 （実施例２）実施例１で得られた結果がＶＴ１遺伝子を
もつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対して、選択的なものかど
うかを確かめるため、臨床検査において検査対象とな
る、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）以外の下痢症菌等の遺伝子に
ついて本発明のプライマーが反応するかどうかを調べ
た。方法は検体の調製法を除いて、実施例１で示したも
のと同じである。
もつＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）に対して、選択的なものかど
うかを確かめるため、臨床検査において検査対象とな
る、ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）以外の下痢症菌等の遺伝子に
ついて本発明のプライマーが反応するかどうかを調べ
た。方法は検体の調製法を除いて、実施例１で示したも
のと同じである。
【００２５】検体の調製 表２中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７゜Ｃ、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Cl
ostridium perfringens、Campylobacter jejuni、Bacte
roides fragili s、Bacteroides vulgatus、およびLacto
bacillus acidophilusである）。各菌株培養液０.５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７.５に溶解したＮ-アセチルムラミニダーゼ溶液、お
よびアクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／
ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７゜Ｃ
で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させた
フェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合
比１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、
上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を
沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かし
て検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human plac
enta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、こ
れも同様にＰＣＲを行わせた。
し、３７゜Ｃ、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養
を行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Cl
ostridium perfringens、Campylobacter jejuni、Bacte
roides fragili s、Bacteroides vulgatus、およびLacto
bacillus acidophilusである）。各菌株培養液０.５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐ
Ｈ７.５に溶解したＮ-アセチルムラミニダーゼ溶液、お
よびアクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／
ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７゜Ｃ
で１０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液で飽和させた
フェノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合
比１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、
上層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を
沈澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かし
て検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human plac
enta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、こ
れも同様にＰＣＲを行わせた。
【００２６】結果 表２に試験結果を示す。表中のプライマーの全ての組合
せは、一部の赤痢菌（Shigella dysenteriae type I）
のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々
のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅することはな
かった。また、Shigella dysenteriae type IがＶＴ１
遺伝子を有しており、ＶＴ１遺伝子の有無のみでは、Ｅ
ＨＥＣ（ＶＴＥＣ）とShigella dysenteriae type Iと
の鑑別が不可能なことは、学界で周知である。したがっ
て、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマー
は、ＶＴ１遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。なお、本発明の実施例で用いている
アガロースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１０
０塩基（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチ
ドであれば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００
から５００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれ
ば、１０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さ
の違いを区別可能である。さらに、アクリルアミドなど
をゲル材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精
度を向上させることができ、ＶＴ１遺伝子の選択的検出
における信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
せは、一部の赤痢菌（Shigella dysenteriae type I）
のＤＮＡを除いて、下痢症菌ＤＮＡをはじめとする種々
のＤＮＡについて、それらのＤＮＡを増幅することはな
かった。また、Shigella dysenteriae type IがＶＴ１
遺伝子を有しており、ＶＴ１遺伝子の有無のみでは、Ｅ
ＨＥＣ（ＶＴＥＣ）とShigella dysenteriae type Iと
の鑑別が不可能なことは、学界で周知である。したがっ
て、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマー
は、ＶＴ１遺伝子を有する菌にのみ、選択的に反応する
ものと断言できる。なお、本発明の実施例で用いている
アガロースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１０
０塩基（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチ
ドであれば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００
から５００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれ
ば、１０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さ
の違いを区別可能である。さらに、アクリルアミドなど
をゲル材に用いることで、ヌクレオチドの長さの測定精
度を向上させることができ、ＶＴ１遺伝子の選択的検出
における信頼度は、さらに高まるものと考えられる。
【００２７】
【表２】
【００２８】
【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よびＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の病原因子の一つであるＶＴ
１の遺伝子（ＶＴ１遺伝子）を標的とするプライマーを
用いたことにより、ＶＴ１遺伝子を有する菌の検出にお
いて、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、あ
るいは、それ以上の数のプライマーで反応が規定される
ことによる高い選択性とが得られる。また、検出感度が
高いので、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡
便で済む。本発明における実施例では、反応時間３時
間、検出にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検
出にアガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる
核酸染色法を用いることで、プライマー等を標識せずに
検出が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを
確認できるので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
よびＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の病原因子の一つであるＶＴ
１の遺伝子（ＶＴ１遺伝子）を標的とするプライマーを
用いたことにより、ＶＴ１遺伝子を有する菌の検出にお
いて、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２つ、あ
るいは、それ以上の数のプライマーで反応が規定される
ことによる高い選択性とが得られる。また、検出感度が
高いので、多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡
便で済む。本発明における実施例では、反応時間３時
間、検出にかかる操作が３０分であった。そのうえ、検
出にアガロースゲル電気泳動法と臭化エチジウムによる
核酸染色法を用いることで、プライマー等を標識せずに
検出が行える。しかも増幅されたヌクレオチドの長さを
確認できるので、試験結果の信頼性は高いものとなる。
【００２９】ＥＨＥＣ（ＶＴＥＣ）の検査には、発見患
者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞の
ない正確な結果が要求される。また、本発明は、ＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）の１病原因子であるＶＴ１をコードして
いるＶＴ１遺伝子を選択的に検出するものである。した
がって、本発明により、起因菌としてのＥＨＥＣ（ＶＴ
ＥＣ）の検出を正確に行うことが可能となる。
者の迅速・適切な治療および防疫措置のために、遅滞の
ない正確な結果が要求される。また、本発明は、ＥＨＥ
Ｃ（ＶＴＥＣ）の１病原因子であるＶＴ１をコードして
いるＶＴ１遺伝子を選択的に検出するものである。した
がって、本発明により、起因菌としてのＥＨＥＣ（ＶＴ
ＥＣ）の検出を正確に行うことが可能となる。
【００３０】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ １９塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ
【００３１】 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Escherichia coli 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】検体中に存在する腸管出血性大腸菌（ente
rohemorrhagic Escher ichia coli、以下、ＥＨＥＣ）ま
たはベロ毒素産生性大腸菌（Verocytotoxin-producing
Escherichia coli、以下、ＶＴＥＣ）の産生するベロ毒
素１型（以下、ＶＴ１）の遺伝子（以下、ＶＴ１遺伝
子）をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌ
クレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオ
リゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の
配列、 （５’）ｄ−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧ−（３’） ・・・（配列番号１；ａ） （５’）ｄ−ＣＴＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＧ−（３’） ・・・（配列番号２；ｂ） または対応する相補的配列の少なくとも連続した１０塩
基を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項第１項に記載された配列のうち、少
なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応の
プライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選
択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 (１)検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
イマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 （２）得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖
に分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる
鎖長反応の鋳型として機能し、 （３）これら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−
ションを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列
が増幅され、電気泳動、またはクロマトグラフィーで増
幅されたヌクレオチド断片を検出し、 （４）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
在しているか否かを判定することでＥＨＥＣまたはＶＴ
ＥＣの検出を行うことを含む方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10149748A JPH11332598A (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10149748A JPH11332598A (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11332598A true JPH11332598A (ja) | 1999-12-07 |
Family
ID=15481910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10149748A Pending JPH11332598A (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11332598A (ja) |
-
1998
- 1998-05-29 JP JP10149748A patent/JPH11332598A/ja active Pending
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