JPH03112497A - 病原大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 以下余白 ［産業上の利用分野　］ 本発明は、臨床検査、ある、いは食品検査での易熱性毒
素（ＬＴ）を産生ずる病原大腸菌の検出に関するもので
ある。

［従来の技術と問題点］ 検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品または拭き取り材
料の場合、病原大腸菌と同定する才でには、増菌培養、
分離培養を経て純培養、確認培養を行わなければならな
い、さらに、血清学的検査、エンテロトキシン産生試験
、その他生化学的試験を行うことではじめて同定される
。各培養段階に要する時間は、１８〜２４時間であり、
その後の検査にかかる時間を合計すると１週間もの長時
間を要する。易熱性毒素（ＬＴ）であるエンテロトキシ
ンを検出する目的であれば逆受身ラテックス凝集反応を
利用したエンテロトキシン検出用キットも市販されてい
るがコレラ菌エンテロトキシン（ｃＴ）とＬＴは互いに
免疫学的に抗原共通性を有することが知られており、こ
のため、ＣＴとＬＴとを区別して検出することができな
い、また、検体として純培養され、ある程度菌種の同定
に関し絞り込んだものを必要としているためその段階ま
で持って行くまで操作が煩雑であり長時間を要する。し
かも、このキットにかかる時間だけでも２０〜２４時間
も必要とする。

一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡプ
ローブ法あるいはハイブリダイゼーション法が試みられ
るようになってきた。しかし、オリゴヌクレオチドを標
識修飾したプローブにより膜上、あるいは他の支持体上
でハイブリダイゼーションを行い、これを検出する場合
、細苗検査において十分な検出感度と選択性を得るのが
難しい。

［発明の目的］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応の１ライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術により病原大腸菌
由来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高感度な
病原大腸菌の検査法を提供することにある。

［問題点を解決するための手段および作用　］本発明は
、オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた遺伝子
増幅法で病原大腸菌を選択的に検出することを特徴とし
ている。遺伝子増幅は、５ａｉｋｉらが、開発したＰｏ
１ｙｖｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法（
以下、略してＰＣＲ法；　　５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．
１３５０（１９８５））をもとに行っている。この方法
は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の場合は
病原大腸菌のＬＴ遺伝子）を検出する場合、その領域の
両端の一方は土類を他方は一鎖をそれぞれ認識してハイ
ブリダイゼーションするようなオリゴヌクレオチドを用
意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に
対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとし
て機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１本鎖に分離し
、再び、同様な反応を起こさせる。この一連の操作を繰
り返すことで２つのプライマーにはさまれた領域は検出
できるまでにコピー数が増大してくる。検体としては、
臨床検査材料、例えば、糞便、尿、血液、組織ホモジェ
ネートなど、また、食品材料でもよい、これら材料をＰ
ＣＲ反応の試料として用いるには、材料中に存在する菌
体から核酸成分を遊離させる操作が前処理として必要と
なる。しかし、プライマーがハイブリダイズできる核酸
が数分子から数十分子以上存在すればＰＣＲ反応は進む
ので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で
短時間処理するだけでＰＣＲ反応を進行させるに十分な
核酸量を持った試料液が調製できる。

本発明で１ライマーとして用いられるオリゴヌクレオチ
ドは、選択性や検出感度および再現性から考えて、１０
塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持った核酸
フラグメントで、化学合成あるいは天然のどちらでもよ
い、また、プライマーは、特に検出用として標識されて
いなくてもよい。

プライマーが規定している病原大腸菌のＬＴ遺伝子にお
ける増幅領域は、５０塩基から２０００塩基となればよ
い、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いているが、この酵素の起源につい
ては９０〜９５℃の温度で活性を保持していれば、どの
生物種由来でもよい、熱変性温度は、９０〜９５℃、プ
ライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温
度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを
１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って
増幅させる。検出は酵素反応液をそのまま、アガロース
ゲル電気泳動にかけることで増幅された核酸断片の存在
およびその長さが確認できる。その結果から、検体中に
、プライマーが認識すべき配列を持った核酸が存在して
いるかどうか判定することができる。この判定は、その
まま病原大腸菌の有無を判定するものとなる。増幅され
た核酸断片の検出には、その他の電気泳動やクロマトグ
ラフィーも有効である。

［実施例］ （実施例１） １生立ＩＩ 病原大腸菌の検索には表１の縦の見出しに示した下痢症
患者から分離した大腸菌４０株を用いた。

これらの臨床分離株は大阪大学微生物病研究所よりアル
カリ固定された試料をもらい受けたもので、そこからＤ
ＮＡ抽出を行った。抽出法はアルカリ固定された菌体を
再度０．　ＩＮ水酸化ナトリウムに懸濁し、６０℃、１
５分で溶菌させた。溶菌液に前記Ｍ新液で飽和させたフ
ェノールを同容量を加え、よく攬はんした。遠心後、上
層液を回収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を
沈澱させ、その沈澱物を前記ＭｆＲ液、１ｍｌに溶かし
て、これを検体とした。

−マー　ム 病原大腸菌のＬＴ遺伝子の塩基配列（Ｙａｍａｓｏｔ。

、Ｔ、ａｎｄ　Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ　１５５，７２８−７３３　（１９８３））から
、特許請求範囲第１項に示した配列（（＆）、　　（ｂ
））を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチド
を化学合成した。化学合成は島津ＤＮＡ合成機ＭＳ−１
を用い、　トリエステル法により行った０合成したオリ
ゴヌクレオチド断片の精製はＣ１１３逆相カラムを用い
て行った。

Ｐ（、Ｒ 前記検体液を３μｍを用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
μｍ、１０×反応用バッファー３μｍ、ｄＮＴＰ溶Ｉｉ
、４．８μＩ、プライマー（１）１．５μ！、プライマ
ー（２）１．５μｍそして耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０
．１５μｍを加え、　３０μｍの反応液を調製した。　
　この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭ
Ａ社製）を５０μｍ加え反応液上に重層する。各添加さ
れた液の内容を下記に示す。

１０Ｘ反応用バッフ７−：　　５００ｍＭ　　ＫＣＩ。

１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）。

１５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン ｄＮＴＰ溶液：　　ｄＡＴＰ、　　ｄＣＴＰ、　　ｄＧ
ＴＰ。

ｄＴＴＰを混合させたもので、各終濃度が１．２ｍＭ プライマー（ａ）および（ｂ）：　　前述した化学合成
精製品の各水溶液（５０ＤＵ／　ａ＋１　）耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ：　　Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ（
Ｓ　ｕｎｉｔ／　ｍｌ；　　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ
　Ｃｅｔｕｓ社製） 反応条件は、次の通りである。

熱変性二　９４℃　１分 アニーリング：　３７℃　１分 重合反応二　６０℃　１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７分）とし、これを４２サイク
ル（総所要時間約４時間）行った。

これらの操作は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ
ｓ社製　ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上記反
応条件をプログラムすることにより行った。

権１ 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った。

アガロースゲルはゲル濃度２％（ｗ　／　ｖ　）とし、
臭化エチジウム（０，５μｇ／ｍ　Ｉ　）を含むものを
用いた。泳動の電気的条件は、定電圧１００ｖ、時間は
３０分行った。操作方法ならびに他の条件はＭａｎｉａ
ｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９
８２）に記載されている技法で行った０反応液の他に分
子量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較
により、ゲル中、紫外線光等で検出されたヌクレオチド
断片の長さを算出した。

前述したように、ＬＴ遺伝子は、すでに塩基配列が決定
されており５本発明のオリゴヌクレオチド、すなわち、
プライマーがＰＣＢより、増幅させてくるヌクレオチド
の大きさは推定できる。それによると、１ライマー　（
＆）と（ｂ）では推定値として２３３塩基の長さのヌク
レオチドが増幅されてくるはずである０表１は、上記方
法で増幅されてきたヌクレオチドの長さを測定した結果
で、推定された大きさと一致したものは＋、一致しない
ものはその大きさを示した。また、なにも検出されなか
ったものは−と示した。　　ＰＣＢと示したものが本発
明による結果で、Ｅｌｅｋと示したものはＬＴ検出のた
めの従来法で変法Ｅｌｅｋ法による結果を併せて示した
。同表かられかるように、ＰＣＲ反応を起こしたものに
ついては、各プライマーの組合せとも、推定されたヌク
レオチドの長さと一致したバンドが検出されており、ま
た、従来法との一致率は非常に高いものとなっている。

すなはち、これらが、 ＬＴ遺伝子の標的と している領域を正 しく増幅してきていることを示している。

表 菌株番号 Ｅｌｅｋ ＰＣＢ 菌株番号 Ｅｌｅｋ ＰＣＢ 先は大阪大字微生物病研究所。

（実施例２） 実施例１で得られた結果が、病原大Ｊｌｉ菌に対し選択
的なものか確かめるため、臨床検査において病原大腸菌
以外で検査対象となり得る菌種について比較検討した。

方法は、実施例１に示したものと同じであるが、Ｃａｍ
ｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ　ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
　ｆａｅｃａｌｊｓ。

Ｌａｃｔｏｂａｃｌｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ
については嫌気的条件下、３７℃で終夜培養を行い、Ｐ
ＣＢ法に適用しうる試料を調製した。検体の調製におい
て培養した菌は、表２の一縦の見出しに示した１７菌株
である。また、ヒト胎盤由来Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｈｕｍａｎ
　ｐｌａｃｅｎｔａ）は１μｓ／ｍｌの濃度のものを調
製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。　　結果を表２
に示す、ｎ内の数値の単位はキロ塩基対である。　　Ｙ
ｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｌｃａにおい
てＰＣＨの副次的産物とみられる、増幅されたヌクレオ
チド断片が検出されたが、ＬＴ遺伝子の塩基配列から一
推定されるヌクレオチド断片の長さとは異なっている。

病原大ＩＩＩＴ：Ｍと同じＬＴ遺伝子をこの菌種が持っ
ていれば実施例１の結果と同じ長さのヌクレオチド断片
が検出されるはずである。従って、この菌種由来の増幅
されたヌクレオチドはＬＴ遺伝子を認識して生成された
ものではないことが明かであり、病原大腸菌とは容易に
区別し検出できることがわかる。−方、本発明ではＶｉ
ｂｌｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅとは全く交差反応しないこ
とがわかった。前述したように免疫学的にはコレラ菌エ
ンテロトキシンとＬＴとは抗原共通性を持っていて免疫
学的手法によってもこれらを区別することができなかっ
た。しかし、本発明では、ＬＴのみ明確に反応すること
から従来法に比べ信頼性がより高くなったと考えられる
。なお、本発明の実施例にに用いているアガロース電気
泳動を前述の泳動条件行えば１００塩基対以下の範囲で
あれば５から１０塩基対、１００から５００塩基対の範
囲であれば１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの
違いを区別することがでる。さらに、アクリルアミドな
どをゲルに用いることでヌクレオチドの長さの測定の精
度を向上させれば、選択的検出における信頼度は、 さらに高まるもの と考えられる。

菌種基 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｒｅｕｓ 表 保存機関略号および株番号 ＪＣＭ２１５２ Ｖｉｂｒｉｏ　　ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｖｌｂｒｉｏ　　ｃｈｏｌｅｒａｅ ＶＩｂｌｌｏ　　ｃｈｏｌｅｒａｅ ＡＴＣＣ９４５８ ＡＴＣＣ９４５９ ＡＴＣＣ２５８７２ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｅｃａｌｉｓ　　　
　ｊｃＭ５８Ｑ３Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｃ
ｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　　ＪＣＭ１１３２Ｆｌｕｍａｎ　
　ｐｌａｃｅｎｔａ ［発明の効果　］ 本発明では、ＰＣＲ法を用いたことで、病原大腸菌の検
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つあるいは、それ以上のプライマーで反応が規定される
ことによる高い選択性を得ることができる。また、高い
検出感度のため多量の検体を必要とせず、検体の前処理
が簡便で済む。

しかも、反応時間が短く、検出も簡単な機材で済時間、
検出にかかる操作が３０分である。また、検出にアガロ
ースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染色法を
もちいることで、プライマー等に標識せずに検出が行え
、しかも、核酸の長さが確認できるので結果の信頼性が
高いものとなる。

食中毒原因菌としての病原大腸菌を同定する際、ＬＴを
産生じているかどうかの確認が重要となっている。ｆｌ
！！の生物種でＬＴ産生能を持つものは無いことから、
プライマーが標的とするヌクレオチド配列にＬＴ遺伝子
をもちいることで病原大腸菌の選択的的検出が可能とな
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中に存在する病原大腸菌を選択的に検出する
   ためのオリゴヌクレオチド、又は、病原大腸菌の易熱性
   毒素遺伝子（ＬＴ遺伝子）をコードするヌクレオチド配
   列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるよ
   うに化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、 合成ヌクレオチドが以下の配列群、 【遺伝子配列があります】 または対応する相補的配列から成ることを特徴とするオ
   リゴヌクレオチド。
2. （２）請求項第１項に記載された配列のうち、少なくと
   も１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライ
   マーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に
   増幅させることを特徴とする方法であって、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
   ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
   合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
   した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反
   応の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
   鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマー
   によるハイブリダイゼーションを繰り返すことにより特
   定のヌクレオチド配列が増幅され、電気泳動、クロマト
   グラフィーで増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
   在しているか否かを判定することで病原大腸菌の検出を
   行うことを含む方法。
3. （３）請求項第２項記載の方法における反応物を用いア
   ガロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色
   を行うことによる検出方法。