JPH0349696A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［　産業上の利用分野　］ 本発明は、臨床検査あるいは食品検査でのセレウス菌の
検出に関するものである． ［　従来の技術と問題点］ 検査材料が磨．者の嘔吐物、糞便，食品または拭き取り
材料の場合、セレウス菌と同定するまでには、増菌培餐
，分離培養を経て純培養、確認培簑に至る操作を行わな
ければならない．各培養段階に要する時間は，　１８〜
２４時間であり総所要時間にすると約４日間となり、長
時間を要する，［Ｘ２培養にｐける生化学的試験では，
卵黄反応、■Ｐ反応、ゼラチン液化性，デンプン分解性
、硝酸塩道元性及びＮ還元性を調べる必要があり、操作
的にも煩雑である．また．それに伴い，時間や工？以下
今、ら 用がかかる． 一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡグ
ロープ法あるいはハイブリダイゼーシヨン法が試みられ
るようになってきた．しかし、オリゴヌクレオチドを標
識修飾したブローブにより膜上，あるいは他の支持体上
でパイプリダイゼイションを行い．これを検出する場合
、細菌検査において十分な検出感度と選択性を得るのが
迂しい．【　発明の目的　］ 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応の１ライ
マーとして機能させた遺伝子増幅ｒｉ術によりセレウス
菌由来の核酸を検出するもので、簡便、迅速かつ高感度
なセレウス菌の検査法を提供することにある． Ｅ　問題点を解決するための手段および作用　］本発明
は、オリゴヌクレオチドを１ライマーとして用いた遺伝
子増幅法でセレウス菌を選択的に検出することを特徴と
している．３＋！伝子増幅は、Ｓａｉｋｌらが、開発し
たＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ法《以下，略してＰＣＲ法；　　Ｓｃｉｅｎｃｅ．２
３０．１３５０（１９８５））をもとに行っている．こ
の方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明の
場合はセレウス菌のβ−１ａｃｔａ＋ｎａｓｅ遺伝子）
を検出する場合、その領域の両端の一方は十鎖を他方は
一鎮をそれぞれｚｚ議してパイプリダイゼーシミンする
ようなオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性によ
り１本鎖状態にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオ
チド重合反応の１ライマーとして機能させ、生成した２
本ｉｉ￥核酸を再び１本鎖に分離し、再び、同様な反応
を起こさせる．この一連の操作を繰り返すことで２つの
１ライマーにはさまれた領域は検出できるまでにコピー
数が増大してくる．検体としては、臨床検査材料、例え
ば，糞便，尿、血液、ｍ織ホモジェネートなど、また、
食品材料でもよい．これら材料をＰＣＲ反応の試料とし
て用いるには、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊
離させる操作が前処理として必要となる．しかし、プラ
イマーがハイプリダイズできる核酸が数分子から数十分
子以上存在すればＰＣＲ反応は進むので、検査材科を溶
菌酵素，界面活性剤、アル力ソ等で短時間処理ずるだけ
でＰＣＲ反応を進行させるに十分な核酸量を持った試料
液が調製できる．本発明で１ライマーとして用いられる
オリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性
から考えて，　　１０塩基以上、望ましくはｌ５塩基以
上の長さを持った核酸フラグメントで、化学合成あるい
は天然のどちらでもよい．また、プライマーは、持に検
出用として標識されていなくてもよい．　　プライマー
が規定しているセレウス苗のβ−Ｉａｃｔａｍａｓｅ遺
伝子における増幅領域は、５　０　１ｘ基から２０００
塩基，望ましくは、　ｌｏ　ｏ　＋＝基から１０００塩
基となればよい．鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には
、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素
の起源については９０〜９５℃の温度で活性を保持して
いれば、どの生物種由来でもよい．熱変性温度は，９０
〜９５゜Ｃ，ブライマーをハイブリダイズさせるアニー
リング操作の温度は３７〜６５゜Ｃ，重合反応は５０〜
７５’Ｃで、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から
４２サイクル行って増幅させる．検出は酵素反応液をそ
のまま、アガロースゲル電気泳動にかけることで増幅さ
れた核酸断・片の存在およびその長さがＷ１認できる．
その結果から、検体中に、１ライマーがＸ２識すべき配
列を持った核酸が存在しているかどうか判定することが
できる．この判定は、そのままセレウス菌の有無を判定
するものとなる．増幅されたｔ′！Ａ酸断片の検出には
、その他の電気泳動やクロマトグラフィーも有効である
．［　実施例　〕 （実施例ｌ〉 駈朱立且玉 セレウス菌は表ｌの縦の見出しに示した６株を用いてそ
れぞれを適当な増菌培地に接種し、３７℃、好気的条件
下で一晩培養を行い、その培地、１．５ｍｌから遠心操
作により菌体を回収した．１０ｍＭ｝リスー塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを
ｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉとなるように溶かした液、０．
５ｍｌで懸濁させ、ェ・人　下臀、色 ３７℃，　１０分で溶菌させた．溶菌液に前記緩衝液で
飽和させたフェノールを同容量を加え、よく攪はんした
．遠心後、上層液を回収し、エタノル沈澱処理を行って
核酸成分を沈渭させ、その沈澱物を前記桜街液、　ｌｍ
ｌに熔かして，これを検体とした． 一　マーのム セレウス菌のβ−１ａｃｔａｍａｓｅ　Ｉ　　型および
■型遺伝子の塩基配列（　Ｗａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ　ａｌ
．；　　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１６３，４８７−４９
２（１９８５）：　　Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ　ａ
ｔ．；　　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．１６４．２２３−
２２９＜１９８５））から、特許請求範囲第２項、第４
項、第６項に示した配列（（ａ）、＜ｂ＞、（Ｃ）はβ
−１ａｃｔａｍａｓｅ　Ｉ型遺伝子、　（ｄ）、　（ｅ
）はβｃｔａａａｓｅ　！Ｉ型ｙＡ伝子より、　）を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した．化学合成は島津ＤＮＡ合成ｉＮｓ−１を用い、
トリエステル法により行った．合成したオリゴヌクレオ
チド断片の精製はＣＩ＋３逆相カラムを用いて行った． 旦３Σ旦 前記検＃液を３μ１を用いそれに減ｉ蒸留水ｌ６．０５
μ１、　ＩＯＸ反応用バッファ−３μ！、ｄＮＴＰ溶液
４．８μ１，プライマ−（１）１．５μＬ　プライマー
（２＞１．５μｌそしてｉ７［％性ＤＮＡポリメラーゼ
０．１５μｌを加え、３０μ１の反応液を調製した，　
　この反応液の入った容器にミネラルオイル（　！ｌｉ
ｌＧＭＡ社製）を５０μＩ加え反応液上に重層する．各
添加された液の内容を下記に示す． ｔＯＸ反応用バ７フＴ−：　　５００ｍＭ　　ＫＣＩ．
１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．　　３）．
１　５ｍＭ　　ＭｇＣ　Ｉ２，　　Ｏ．　　１％（　ｗ
／　Ｖ　）ゼラナン ｄ　　Ｎ　Ｔ　Ｐ溶液：　　ｄＡＴＰ，　　　ｄＣＴＰ
．　　　ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを混合させたもので、各終
濃度がｌ２５ｍＭ １ライマ−（１）および（２）：　前述した化学金成清
製品の各水溶Ｋｌ　（　５　０Ｄ［＋／費１）１ライマ
ーの組合せは、持ｚ′ｆ請求範囲第２項、第４項、第６
項に示した配列（（ａ）〜（ｅ））より、次の紐合せを
用いた． マー　　　＋　−　マー　９ （ａ）　　　　　　＋　　　　（ｂ） （ａ）　　　　　＋　　　　（Ｃ） （ｄ）　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　　　（
ｅ）ｒｒ！熱性ＤＮＡポリメラーゼ：ＴａｑＤＮＡボリ
メラーゼ（　５　ｕｎｉｔ／ｍｌ：　　Ｐｅｒｋｉｎ　
Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製） 反応条件は、次の通りである． 熱変性：９４”Ｃ　　ｌ分 アニーり冫グ；　３７℃　１分 重合反応＝　６０℃　１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程をｌ
サイクル（所要時間５．７分）とし．これを４２サイク
ル（総所要時間約４時Ｅ＞行った．これらの操作は．　
　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌ＋ｓｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製　Ｄ？
ｌＡＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上記反応条件をフ
゛ログラムすることにより行った． 腹ｌ 反応液から、ｔＦＪ幅されたヌクレオチド断片を検出す
るため、アガロース電気泳動を以下の様に行った． アガロースゲルはゲル酒度２％（　ｗ　／　ｖ　）とし
、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を含むものを用
いた．泳動の電気的条件は、定電圧ｔ　ｏｏｖ、時間は
３０分行った．操作方法ならびに他の条件はＭａｎｉａ
ｔｉｓ等、！４ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎｇ（１
９８２）に３己載されている技法で行った，反応液の他
に分子量マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の
比較により、ゲル中，紫外線光等で検出されたヌクレオ
チド断片の長さを算出した． 謀遣 前述したように、β−１ａｃｔａｍａｓｅ遺伝子の１型
、■型とも、すでに１二基配列が決定されており、本発
明のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがＰＣ
Ｈにより、１１１ｇさせてくるヌクレオチドの大きさは
推定できる．それによると、プライマ（ユ）と（ｂ）で
は，　ｌ５６塩基、　（λ〉と＜ｃ＞では、３　１　３
　ｔ＝基，（ｄ）と（ｅ）では，　２３２塩基の長さの
ヌクレオチドが増幅されてくるはずである．表ｌに示し
た数値は．上記方法で増幅されてきたヌクレオチドの長
さを測定した結果で、単位はキロ塩基対である．同表か
らわかるように、各１ライマーの組合せとも，推定され
たヌクレオチドの長さと一致しており、これらが、　β
−１ａｃｔａｍａｓｅ遺伝子の標的としている領域を正
しく増幅してきていることを示している． 表　　１ 実施例ｌで得られた結果が、セレウス閑に対し選択的な
ものか確かめるため、臨床検査においてセレウス閑以外
で検査対象となり得る閏種について比較検討した． 方法は，実施例１に示したものと同じであるが、（３）
と（７）の株については嫌気的条件下、　３７℃で終夜
培蓑を行い，ＰＣＲ法に適用しうる試料を調製した．検
体の調製において培養した菌は、表２の縦の見出しに示
した７菌株である．また、ヒト胎盤由来ＤＮＡは１μｇ
　／　ｍ　ｌの濃度のものを調製し、これも同様にＰＣ
Ｒを行わせた．　　結果を表２に示す．ａ１と同様、欄
内の数値の単位はキロ塩基対である．一部の菌種におい
てＰＣＲの副次的産物とみられる、増幅されたヌクレオ
チド断片が検出されたが、どれもβ−１ユｃ　ｔａｍａ
ｓｅ遺伝子の塩基配列から推定されるヌクレオチド断片
の長さとは異なっている．セレウス菌と同じβ−Ｉａｃ
ｔａｍａｓｅ遺伝子をこれらの菌種が持っていれば実斃
例ｌの結果と同じ長さのヌクレオチド断片が検出される
はずである．従って、これら′ｇｌｆｉ由来の増幅され
たヌクレオチドはβ−１ａｃｔａｍａｓｅｙ１（云子を
１２識して生成されたものではないことが明かであり、
セレウス閏とは容易に区別し検出できることがわかる．
なお、本発明の実施例にに用いているアガロース電気泳
動を前述の泳動条件行えば１００塩基対以下の範囲であ
れば５から１０塩基対、１００から５００塩基対の範囲
であれば１０から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違
いそ区別することがでる．さらに，アクリルアミドなど
をゲルに用いることでヌクレオチドの長さの測定の精度
を向上させれば、選択的検出における信頼度は、さらに
高まるものと考えられる． 表　　２ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓ（ＪＣＭ２１５２）
　　０．１５　　０ｉＩ　　　Ｏ．２３Ｈｕｍ五〇 ｐｌａｃｅｎｔａ（８） Ｏ ２８ （実施例３〉 本発明による方法で検体中のセレウス菌がどこまで微量
検出できたかを以下に示す． 友羞 セレウス′Ｇｉ（　ＪＣＭ２１５２株）を１００ｍｌの
増田用培地に接種し、好気的条件下、３７℃で終夜培養
を行った．この培養液から遠心操作により菌体を回収し
、　１０ｍＭＴｒ　ｉ　ｓ−ＨＣ　ｌ　（ｐＨ７、　５
〉緩衝液で１回洗浄し，同Ｍ街液に溶かしたりゾチーム
溶液（ｌｍｇ／ｍ！）．２０ｍｌに懸濁させ、３７℃、
ｌＯ分で溶菌させた．この溶田液に２０％（ｗｖ）ＳＤ
Ｓ水溶液１ｍｌを加え、同温度で１０分、そしてブロテ
ィナーゼＫを終濃度７５０μｇ／となるように加え、さ
らに３０分加温した．そして、同容量の飽和フェノール
（上記Ｍｌ　ｍ液に飽和させた、）を加え、よく攪はん
した後、遠心して上層液を回収した．この溶液に豚杯ｘ
ａリボヌクレアーゼをｅ’ｉ　ａ度５０μｇ／ｍｌとな
るように加え，３７℃、６０分加温した． この液に前記フェノールを同容量加え、よく攬はんした
後，遠心して上層を回収した．エタノール沈澱を行うた
めに、回収液の１／１０ｇ量の３Ｍ酢酸ナトリウムＭ衝
液（ｐＨ５．２）を加え、混ぜた後、回収液の２倍容Ｉ
のエタノールを加え攬はんした．析出した糸状のＤＮＡ
を遠心操作により、回収したｆ＆．１０ｍｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７．　　５）Ｊ４ｆｆｒＦ
ｉ．に再溶解させ、清製ＤＮＡ標品を得た．そして，こ
の標品中のＤＮＡ量を波長２６０ｎｍの吸光度より算定
した．セレウス菌の染色体ＤＮＡ　１μｇは３×１０一
個のセレウス菌に相当することから、ＰＣＲ系に持ち込
むＤＮＡ量で何個のセレウス菌が存在すれば検出できる
か算定した，ＰＣＲ、その他の手順は実施例１に示した
通りである．１ライマーの組合せは（ａ）＋（Ｃ）を用
いた．増幅されたヌクレオチド断片の検出は，泳動した
ゲルをトランスイルミネーター上で写真撮影し．フイル
ム上でバンドのｒｉｉ認を行った．カメラは、Ｈａ■ｉ
ｙａ　ＲＢ６７、フィルムは，Ｐｏｌａｒｏｉｄ　ｔｙ
ｐｅ６６７．　ＪＲ影条件は、絞り：５．６、シャッタ
ースピード：　１秒で、Ｋｅｎｋｏ　Ｒｌフィルターを
使用した． ：Ｉ１（よ．山（りごぐ） レーン番号 ＤＮＡ量（ｇ） 分子数 レーン番号（５）でも目的とするバンドが確認できた．
これは、セレウスｒＭ染色体ＤＮＡの３０分子相当のＤ
ＮＡｔを検出しており、埋２＾的には，セレウス苗、　
３０個が検体中に存在していれば検出できることになる
． 本発明による方法の検出感度はＰＣＨにおけるサイクル
数を増加させることで、さらに高められる可能性がある
．しかし，これ以上検出感度を高めて，数分子，あるい
は１分子の検出が可能となってもｉｉ率論的要素が加わ
り、再現性が悪くなると考えられるので、本発明の目的
から考えて、意味の無いものであろう． この方法をさらに改善するための条件は、ＰＣＲ系に、
いかに多くの漂的ヌクレオチドを持ち込むことができる
かにある．これは、検体をＰＣＲに用いることができる
までに処理する過程に３いて、標的ヌクレオチドをでき
るだけ効率よく清製し、濃縮することである．実施ＰＡ
１、　２，あるいは３の方法におけるＩＩの調製過程を
さらに効率化することで、材料中に低密度で存在するセ
レウス菌を容易に検出できると名えられる．［　発明の
効果　］

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）検体中におけるセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
   ｃｅｒｅｕｓ）を選択的に検出するためのオリゴヌクレ
   オチド、または、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅ
   ｒｅｕｓ）のβ−ｌａｃｔａｍａｓｅ遺伝子をコードす
   るヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列
   と相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチ
   ドであって、合成ヌクレオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ＿１−ＧＧＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＡＣＡＡＧ
   ＣＣ（３’）…（ａ） （５’）ｄ−ＧＣＡＴＡＴＡＣＡＣＣＴＡＡＴＣＧＡＧ
   Ｃ（３’）…（ｂ） （５’）ｄ−ＣＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＣＧ（
   ３’）…（ｃ） （５’）ｄ−ＴＴＣＴＧＴＡＴＧＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴ
   Ｇ（３’）…（ｄ） （５’）ｄ−ＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＧＣＧＴＡＡＣＧ
   Ｇ（３’）…（ｅ） または、対応する相補的配列から成ることを特徴とする
   オリゴヌクレオチド。
2. （２）請求項第１項に記載された各オリゴヌクレオチド
   の配列のうち、少なくとも連続した１０塩基以上を含む
   オリゴヌクレオチド。
3. （３）検体中におけるセレウス菌のβ−ｌａｃｔａｍａ
   ｓｅ I 型遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド
   であつて該オリゴヌクレオチド配列が （５’）ｄ−ＧＧＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＡＣＡＡＧＣＣ
   （３’）…（ａ） （５’）ｄ−ＧＣＡＴＡＴＡＣＡＣＣＴＡＡＴＣＧＡＧ
   Ｃ（３’）…（ｂ） （５’）ｄ−ＣＣＡＣＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＴＣＧ（
   ３’）…（ｃ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とする請
   求項第１項記載のオリゴヌクレオチド。
4. （４）検体中におけるセレウス菌のβ−ｌａｃｔａｍａ
   ｓｅII型遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドで
   あつて該オリゴヌクレオチド配列が （５’）ｄ−ＴＴＣＴＧＴＡＴＧＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴ
   Ｇ（３’）…（ｄ） （５’）ｄ−ＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＧＣＧＴＡＡＣＧ
   Ｇ（３’）…（ｅ） または対応する相補的配列から成ることを特徴とする請
   求項第１項記載のオリゴヌクレオチド。
5. （５）請求項第１項の配列の少なくとも１つを有するオ
   リゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマーとして機能さ
   せ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させることを
   特徴とする方法であつて、 （ａ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
   ライマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重
   合反応により鎖長反応を行わせ、 （ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
   した場合その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応
   の鋳型として機能し、 （ｃ）これら２種のプライマーによる同時の鎖長反応、
   鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマー
   によるハイブリダイゼーシヨンを繰り返すことにより特
   定のヌクレオチド配列を増幅させ、それを電気泳動、ク
   ロマトグラフィーで検出し、 （ｄ）その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存
   在しているか否かを判定し、セレウス菌の検出を行うこ
   とを含む方法。
6. （６）請求項第５項記載の方法における反応物から電気
   泳動、ないしクロマトグラフィーにより、増幅されたヌ
   クレオチド配列を分離し、この塩基対数を決定すること
   により、セレウス菌の検出を行うことを含む方法。
7. （７）請求項第５項記載の方法における反応物からアガ
   ロース電気泳動および臭化エチジウムによる核酸染色を
   行うことによる請求項第６項の方法。
8. （８）請求項第１項記載の配列の１つを有するオリゴヌ
   クレオチドをプローブとして機能させ、膜上あるいはそ
   の他支持体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出す
   る方法。
9. （９）請求項第１項記載の配列の１つを有するオリゴヌ
   クレオチドが標識物で修飾されていることを特徴とする
   請求項第８項記載の方法。