JPH0343099A - 増幅した遺伝子を使用する配列のアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特定の配列の検出のための遺伝子の増幅に関
する。さらに詳しくは、本発明は、固定化されているか
、あるいは固定化可能なオリゴヌクレオチドを使用して
、特定の核酸配列を検出する方法に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：試料中の特定
の標的核酸配列を増幅する方法であって、（ａ）ハイブ
リダイゼーション条件下に、（ｉ）第１プライマー核酸
および第２ブライマー核酸を（ｉｉ）標的核酸配列を含
有する試験試料と接触させ、前記第１または第２のプラ
イマー核酸の一方は、好ましくは固体の物質に、固定化
されているか、あるいは固定化可能であり、他方は固定
化されているか、あるいは固定化可能であるか、あるい
は標識されており、 （ｂ）　工程（ａ）の得られた産生物をエキステンダー
酵素および少なくとも１つのヌクレオチド残基、好まし
くはヌクレオチドトリホスフェートと、伸長のため、生
ずるハイブリダイゼーションしたプライマー核酸を、好
ましくは前記固体の物質と反対方向に、伸長する条件下
に、接触させ、（ｃ）工程（ｂ）の産生物を変性して、
固定化された標的核酸配列を産生し、そして （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のサイクルを少
なくとも１回反復し、前のサイクルの工程（ｃ）の産生
物を（ａ）（ｉｉ）の代わりに使用する、 ことを特徴とする方法。前述の方法を使用して、標的核
酸配列を含有することが疑われる試験試料を使用するこ
とによって、特定の標的核酸配列を検出することができ
る。

核酸配列の大規模な産生は、通常、特異的ベクター中で
特定の配列をクローニングことによって実施される。ク
ローニングすべき配列を分離し、同定し、−末鎖または
二本鎖のベクターに共有結合させ、次いでクローニング
する。余分のＤＮＡをもつベクターを宿主細胞から分離
しそして、要件に依存して、ＤＮＡのクローニングした
片は制限し、そしてＤＮＡの残部から分離しなくてはな
らない。−末鎖ＤＮＡを必要とする場合、それを−末鎖
のベクター中で仔ウシするか、あるいは鎖の分離を必要
とする。すべてのこれらの技術は、熟練した生化学的ま
たは生物学的系の操作を包含する。

アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１４０．９５−１０３（１９８４
）は、−末鎖ＤＮＡの鋳型をセルロースへ非特異的に固
定化することによってＤＮＡハイブリダイゼーションプ
ローブを産生ずる方法を記載している。この方法は有用
であるが、新しく合皮した産生物のＤＮＡの長さの分布
は所望のように均一ではない。今、これはセルロースへ
の鋳型ＤＮＡの多数のに組み込みのためであるように思
われる。

２つのグローブを含む均質な系は、欧州特許出！！第１
９２．１６８号に記載された。この方法は２つのオーバ
ーラツプしないプライマーを使用し、その一方は検出の
ために標識されており、そして他方は雑種の分離のため
に標識されている。アッセイは均質な溶液中で実施し、
そして雑種は引き続いて固体の支持体を使用するにおい
て固定化反応および分離プローブにより分離する。

プライマーとして固定化されたポリヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチドを使用することによって精製したポ
リヌクレオチド配列を増幅することは、米国特許第４．
７３４，３６３号およびアナリティカル・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、５ｕｐｒ
ａに記載されている。米国特許第４，７３４，３６３号
において末端カップリングおよびアシュレイ（Ａｓｈｌ
ｅｙ）らにおいて非特異的なランダムな力・７プリング
反応が、ポリヌクレオチドの固定化のために使用された
。

サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）　、２３０，１３５０　（１９８５）は、オリゴヌク
レオチドとのハイブリダイゼーションにより点突然変異
を検出するために、ヒト成長培地試料中でベーターグロ
ビン核酸配列を増幅する方法を記載している。この産生
物の配列は溶液中で形成される。ハイブリダイゼーショ
ンのために、ＤＮＡを増幅後に固定化しなくてはならな
いか、あるいは制限消化および分離を配列の分析のため
に実施しなくてはならない。

サイキ（Ｓａｉｋｉ）らにより記載される増幅の方法は
、また、米国特許第４．６８３．１９５号および米国特
許第４．６８３．２０２号［以後、ムリス（Ｍｕｌｌｉ
ｓ）に記載されている。−この方法の有意の制限は、生
ずる増幅された配列が混合から容易に分離されないか、
あるいは容易に操作できず、こうして熱サイクルの停止
時に増幅された配列を分析または検出するためにかなり
の努力をさらに必要とすることである。

本発明は、特定の配列の検出のために遺伝子を増幅する
ことに関する。増幅された配列は、固定化されているか
、あるいは固定化可能であるか、あるいは非アイソトー
プ的に標識されたプライマー配列を使用して産生される
ので、産生物は検出のために固定化することができる。

プライマーとして働く配列を、また、伸長反応の間に標
識することができる。

さらに詳しくは、本発明は、試料、例えば、二本鎖ＤＮ
Ａからなる試料中の特定の標的核酸配列を増幅する方法
であって、 （、）ハイブリダイゼーション条件下に、（ｉ）第１プ
ライマー核酸および第２プライマー核酸を（ｉ　ｉ）標
的核酸配列を含有する試験試料と接触させ、前記第１ま
たは第２のプライマー核酸の一方は、好ましくは固体の
物質に、固定化されているか、あるいは固定化可能であ
り、他方は固定化されているか、あるいは固定化可能で
あるか、あるいは標識されており、 （ｂ）工程（ａ）の得られた産生物をエキステンダー酵
素および少なくとも１つのヌクレオチド残基、好ましく
はヌクレオチドトリホスフェートと、伸長のため、生ず
るハイブリダイゼーションしたプライマー核酸を、好ま
しくは前記固体の物質と反対方向に、伸長する条件下に
、接触させ、（ｃ）工程（ｂ）の産生物を変性して、固
定化された標的核酸配列を産生じ、そして （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のサイクルを少
なくとも１回反復し、前のサイクルの工程（ｃ）の産生
物を（ａ）（ｉ　ｉ）の代わりに使用する、 ことを特徴とする方法に関する。

本発明は、また、試料、例えば、二本鎖ＤＮＡからなる
試料中の特定の標的核酸配列を増幅する方法であって、 （ａ）ハイブリダイゼーション条件下に、（ｉ）第１プ
ライマー核酸および第２グライマー核酸ヲ（ｉｉ）標的
核酸配列を含有することが疑われる試験試料と接触させ
、前記ｖｇｌまたは第２のプライマー核酸の一方は、好
ましくは固体の物質に、固定化されているか、あるいは
固定化可能であり、他方は固定化されているか、あるい
は固定化可能であるか、あるいは標識されており、 （ｂ）工程（ａ）の得られた産生物をエキステンダー酵
素および少なくとも１つのヌクレオチド残基、好ましく
は標識されたヌクレオチドトリホスフェートと、伸長の
ため、生ずるハイブリダイゼーションしたブライマー核
酸を、好ましくは前記固体の物質と反対方向に、伸長す
る条件下に、接触させ、 （ｃ）工程（ｂ）の産生物を変性して、固定化された標
的核酸配列を産生し、 （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のサイクルを少
なくとも１回反復し、前のサイクルの工程（ｃ）の産生
物を（、）（ｉｉ）の代わりに使用し、そして （ｅ）増幅された配列が存在するかどうかを決定する、 ことを特徴とする方法に関する。

本発明は、さらに、特定の標的核酸配列を増幅するため
のキットに関し、このキットは１または２以上の容器か
らなり、前記容器は、（ａ）固定化されているか、ある
いは固定化可能であるプライマーの核酸、（ｂ）固定化
されているか、あるいは固定化可能であるか、あるいは
標識されている核酸、（ｃ）エキステンダー酵素、およ
び（ｄ）伸長のための少なくとも１つのヌクレオチド残
基を含有する。

本発明は、また、特定の標的核酸配列を増幅するための
キットに関し、このキットは１または２以上の容器から
なり、前記容器は、（ａ）固定化されているか、あるい
は固定化可能であるプライマーの核酸、（ｂ）固定化さ
れているか、あるいは固定化可能であるか、あるいは標
識されている核酸、（ｃ）エキステンダー酵素、（ｄ）
伸長のだめの少なくとも１つのヌクレオチド残基および
（ｅ）増幅された配列の検出のために特異的な標識され
たハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチドを
含有する。

本発明は、固定化されているか、あるいは固定化可能な
オリゴヌクレオチドを多数の他の配列を含有する粗製混
合物中の特定の配列の増幅に使用することができること
において、先行技術を越えた有意の改良を提供する。そ
のうえ、この方法の終わりに産生された所望の分析物は
、固定化された形態であり、そして異質相のアッセイに
準備される。本発明は、固定化され増幅された配列を産
生し、そして完全な分析のために自動化された系として
処理することができる。

本発明の１つの実施態様は、ムリス（Ｍｕｌｌｉ３）の
特許、米国特許第４．６８３．１９５号および米国特許
第４，６８３．２０２号（これらの開示をここに引用に
よって加える）より改良されている。この改良において
、プライマーの少なくとも１つは固定化されているか、
あるいは固定化可能である。

本発明のいくつかの好ましい実施態様は、要約すると、
次のとおりである： 表１ プライマーの　　　　プライマーの　　　　増幅された
性質　核酸１　　　　性質　核酸１ （１）固定化された　固定化された （２）固定化された 固定化可能 （３）固定化された 標識された （４）固定化可能 標識された （５）固定化可能 固定化された （６）標識された 固定化された （７）標識された 固定化可能 産生物の検出 凝集、ハイブリダ ゼーション、比色 測定または蛍光側 定 凝集、ハイブリダ イゼーション、比 色測定または蛍光 測定 標識またはハイブ リダイゼーション ｌ！ｌＩ識またはハイブ リダイゼーション 凝集、ハイブリダ イゼーション、比 色測定または蛍光 測定 標識またはハイブ リダイゼーシヲン 標識またはハイブ リダイゼーション （８）固定化された　　　　　　　　　　　凝集、ハイ
ブリダ／標識された　　　　　　　　　　　　　　イゼ
ーション、比色測定または蛍光 測定 （９）固定化可能　　　　　　　　　　　　凝集、ハイ
ブリダ／標識された　　　　　　　　　　　　　　イゼ
ーション、比色測定または蛍光 測定 （１０）　　　　　　　固定化された　　　　凝集、ハ
イブリダ／標識された　　　　イゼーション、比色測定
または蛍光 測定 （１１）　　　　　　固定化可能　　　　　凝集、ハイ
プリダ／Ｈ識された　　　　イゼーシ５ン、比色測定ま
たは蛍光 測定 表１において、増幅された産生物の検出の他の方法、例
えば、産生物の制限エンドヌクレアーゼ消イＩ／　封　
Ｆｒに／ｒ”　＋１−雪４「ル重ｈ　九ｎ１１）十　ヱ
　ｔ　し　ム；っ咋　冬　ヱアッセイのための試験核酸
配列の増幅に関する、上の表１中の特定の実施態様（３
）および（６）の詳細な説明は、試験核酸配列の１つの
鎖に対して相補的な固体の支持体に取り付けられた核酸
および検出可能な標識に取り付けられた他の核酸をハイ
ブリダイゼーション条件下に接触させ、前記核酸は試験
試料の核酸の他の鎖に対して相補的であり、ハイブリダ
イゼーションした核酸を酵素で伸長して、試験試料に対
して相補的な配列を産生し、産生物を変性し、モして再
アニーリングして、より伸長可能な構造体を産生し、そ
してこの方法を反復して、出発濃度より大きい量で固体
の支持体固定化試験配列を産生ずることを包含する。次
いで、産生物は、例えば、次のようにしてアッセイする
： （ａ）標識されたオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て使用し、そして第２ブライマーが固定化された形態で
ある場合、支持体上の標識の検出は試験の増幅された核
酸の存在を検出するであろ（ｂ）特異的プローブとハイ
ブリダイゼーションさせることによって； （ｃ）伸長反応の間、標識された核酸残基が組み込まれ
る場合、このような残基の組み込みの程度は特定の配列
の存在を決定するか、あるいは（ａ）後伸長凝集反応。

アッセイのための核酸配列の増幅に関する他の実施態様
（４）および（７）の詳細な説明は、試験核酸配列の１
つの鎖に対して相補的な固体の支持体に固定化可能な核
酸および検出可能な標識に取り付けられた他の核酸をハ
イブリダイゼーション条件下に接触させ、前記核酸は試
験試料の核酸の他の鎖に対して相補的であり、ハイブリ
ダイゼーションした核酸を酵素で伸長して、試験試料に
対して相補的な配列を産生し、産生物を変性し、再アニ
ーリングして、より伸長可能な構造体を産生し、この方
法を反復して、出発濃度より大きい量で試験配列を産生
じ、そして増幅された産生物を固体の支持体と接触させ
て検出のための固定化を実施することを包含する。次い
で、固定化された産生物は、例えば、次のようにしてア
ッセイする： （ａ）固体の支持体上の標識を検出し：そして（ｂ）特
異的プローブとハイブリダイゼーションする。

前述したように、サイキらおよびムリスは試験試料の増
幅のポリメラーゼ鎖反応（Ｐ　ＣＲ）を記載している。

サイキらおよびムリスは２つの異なるオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用した。試験試料の核酸はプラ
イマー伸長反応のための鋳型として働く。オリゴヌクレ
オチドは二本鎖の試料ＤＮＡの２本の鎖の端に対して相
補的であった。サイキらおよびムリスにおいて、一方の
オリゴヌクレオチドは一方の鎖に対して特異的であり、
そして他方のオリゴヌクレオチドは相補的鎖に対して特
異的である。両者のオリゴヌクレオチドは分析すべき突
然変異配列の領域を７ランキングする。オリゴヌクレオ
チドを試験試料の核酸とアニーリング条件下に混合する
とき、オリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチドの
３′　ヒドロキシルが伸長のために利用できるような方
式でハイブリダイゼーションするであろう。オリゴヌク
レオチドを鋳型依存性プライマー伸長酵素、例えば、Ｄ
ＮＡ、ポリメラーゼ、逆転写酵素などで伸長され、オリ
ゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび伸長を
反復する。このような増幅の欠点は、最終産生物の分析
が困難な試料取り扱い工程、例えば、固定化を必要とす
ることである。

ＰＣＲ法は固定化されているか、あるいは固定化可能な
核酸プライマーの使用により有意に改良される。本発明
の最後の増幅された産生物は、既に固定化されているか
、あるいは増幅の効率を有意に損失しないで特異的に固
定化可能である。

第１図において、増幅の最初のサイクルのだめの鋳型と
して働く、試験試料の核酸を、ハイブリダイゼーション
条件下に、固定化されているか、あるいは固定化可能な
プライマーの核酸と接触させる。プライマーはお互いに
対して相補的でない。

プライマー鋳型の雑種が形成した後、それらを酵素によ
り伸長する。次いで、増幅された配列をそれ以上の増幅
のために再循環させる。

好ましい実施態様において、プライマーの核酸はオリゴ
ヌクレオチドであり、そしてそれらは試料のＤＮＡの３
′末末端列に対して相補的である。

核酸のプライマーは３〜１０キロ塩基以上、好ましくは
５〜１００塩基の長さを有することができる。３′　ヒ
ドロキシをもつ相補的な（試料に対して）核酸は、鋳型
仲介伸長反応のためのプライマーとして働くことができ
る。

２つのプライマーを使用する目的は、両者の鎖を増幅す
るためである。プライマーは試料配列に対して相補的（
それら全体が）あってはならない。

それらは配列の特異的な、鋳型仲介伸長反応を開始する
ために十分に相補的でなくてはならない。

鋳型仲介プライマー伸長反応の信頼性を維持するために
、開始は完全に合致した塩基対領域から起こるべきであ
る。最小配列は３塩基対を含む。通常、５〜７塩基対の
二本鎖領域は、２５°Ｃ以下においてプライマー伸長反
応を行うために十分に強い。それが５ｂｐより少ない場
合、低温の伸長反応が実施された。

本発明は先行技術に記載されている増幅方法の改良であ
る。欧州特許（ＥＰ）０１９２．１６８号は、ポリヌク
レオチド配列を固定化および検出する方法を開示してお
り、そしてその開示をここに引用によって加える。本発
明は試験試料の核酸の増幅の方法を記載し、ここで増幅
された配列は固定化された形態で産生される。このよう
な方法に関連する主要な利点は、産生物が特異的に固定
化可能であるか、あるいは固定化された状態で形成され
るということである。これは増幅されない配列（時には
試験配列の１０’〜１０’倍）の分離を容易にする。そ
れは特異的に固定化可能であるか、あるいは固定化され
た形態であるので、分析は一層容易である。

核酸、ことにオリゴヌクレオチドの固定化は、親和クロ
マトグラフ（−（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　　Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ）、ＨｅｒｂｅｒＳｃｈｏｔｔ、ＩＭａ
ｒｃｅｌ　　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、１５−２１ペー
ジ（１９８４）に記載されている。その中に記載されて
いる固定化法の大部分は、スペーサーまたはリンカ−残
基を経て実施することができる。例えば、「セファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｊまたはセルロース粒子を使
用する代わりに、直接、ポリアミンまたはセルロース結
合「セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｊを使用する
ことおよびオリゴヌクレオチドのカップリング部位ａＳ
タンパク質またはポリアミン残基を使用することが可能
である。

例えば、臭化シアン活性化「セファデックス（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ）Ｊをまず大過剰のポリアミン、例えば、スペ
ルミンと反応させ、次いでオリゴヌクレオチドへ酸化的
反応によりカップリングすることができる。欧州特許（
ＥＰ）１６４，５８６号に記載されているように、アミ
ノ標識オリゴヌクレオチドを可変りンカー長さで調製す
ることができる。アミノ標識したオリゴヌクレオチドを
調製する他の方法は、また、この分野において記載され
ている。

本発明の固定化マトリックス（固体の支持体）として、
反応性または活性化セルロース、「セファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）Ｊ、「セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）」、「セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）」、
ポリスチレンラテックス、ポリアクリレート、ポリビニ
ルアルコールあるいは化学反応を行うように活性化する
ことができる他の合成または自然に産出するマトリック
スを使用することができる。

伸長反応のための基質は、ｌまたは２以上の核酸残基、
例えば、ヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）であ
る。

配列の忠実度のために必要なプライマーまたは伸長反応
へのヌクレオシド残基の付加は特異的であるので、酵素
、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーのクレノー
断片または逆転写酵素、ｔａｑポリメラーゼは好ましい
。これらの酵素は特異的プライマー伸長反応を触媒する
。このような酵素は、固定化されたとき、効率を有意に
損失しないで、オリゴヌクレオチドプライマーに作用す
るであろうことは、予覇さハず力１つ予測不可能↑あっ
た。

本発明は分析のために固定化された配列を産生ずる。１
つの実施態様において、このような配列の存在は伸長の
ために標識されたヌクレオチド残基を使用することによ
って検出することができる。

例えば　１２ｐ標識またはフルオレセイン標識されたヌ
クレオシドトリホスフェートを酵１ＤＮＡポリメラーゼ
を使用する伸長のための基質として使用するとき、伸長
された産生物は標識されるであろう。このような標識（
３２Ｐについて放射性およびフルオレセインについて蛍
光性を検出することによって、試験配列の核酸の存在を
確証することができる。

増幅されたシグナルは、また、特異的グローブとのハイ
ブリダイゼーションにより検出することかできる。

固定化されているか、あるいは固定化可能なオリゴヌク
レオチドプローブは、増幅すべき配列の３′末端または
５′末端に対して相補的である少なくと≠１１つの一太
輔世其が別力）へｆｒスアもスろグローブは、酵素伸長
反応を実施する前に、全体の配列に対して相補的であっ
てはならない。プローブの末端の相同性は、３ヌクレオ
チド程度に短く、そして２００ヌクレオチド程度に長く
あることができるが、ｌＯ〜３０ヌクレオチドの残基は
好ましい。

オリゴヌクレオチドは、固体の基質にその１ｍで結合す
るオリゴヌクレオチドにより固定化することができ、こ
こで伸長は固体の基質に対しては反対方向に起こる。

試料は二本鎖ＤＮＡからなることができ、そして各オリ
ゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡの鎖に対して相補的であ
ることができる。

増幅された配列の存在の検出は、次の方法を包含する多
くの方法で実施することができる：（１）核酸残基、例
えば、標識、例えば、放射性部分、染料、蛍光性部分ま
たは酵素で標識し、次いで分析を実施してこのような標
識の存在を決定する； （２）特定の標的核酸配列を検出する前述の方法の工程
（ｄ）の産生物を、試験する配列とハイブリダイゼーシ
ョン可能な標識されたプローブ（このような標識は前述
のものであることができる）とハイブリダイゼーション
させ、そして実際にハイブリダイゼーションが起こった
かどうかを決定する； （３）物理的性質の変化または差の決定、例えば、電気
泳動、遠心、ゲル透過クロマトグラフィーを実施するか
、あるいは顕微鏡検査（大きさの差を検出するための視
的決定）を使用して分子量または密度を検出する。

プライマー プライマーは、この分野において、適切な向きに余分の
一本！１１（これは存在するか、あるいは反応において
つくることができる）の配列をもつ相補的核酸とらせん
を形成する、酵素的に伸長することができる核酸分子量
として知られている。核酸伸長酵素の大部分は存在する
ヌクレオチド残基の３′側に残基を付加するので、コピ
ー配列はプライマーの３′側に向かって相補的形態の一
本鎖であるべきである。プライマーは通常オリゴヌクレ
オチドであるが、任意のハイブリダイゼーション可能な
りＮＡ１ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドを包含する。

より高い分子量の一本鎖核酸は、また、プライマーとし
て働くことができる。トリヌクレオチド程度に短い核酸
および１０ｋｂ程度に長い核酸はプライマーとして働く
ことができる。

好ましい大きさは、コピーまたは増幅すべき配列の特異
的性質により決定される。プライマーの最も好ましい大
きさはへキサヌクレオチドとサーティマーとの間である
。この出願における実施例は、２０マー〜３０マーの長
さのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するが、他の
長さを利用することができる。固定化可能な核酸は欧州
特許（Ｅ　Ｐ）１９２．１６８号に詳細に記載されてい
る。伸長したプライマーは同様な方式で使用することが
できる。

固定化法 オリゴヌクレオチドの化学的固定化は、この分野におい
てよく知られている。例えば、親和クロマトグラフィー
（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
）、Ｈｅｒｂｅｒ　　　Ｓｃｈ。

ｉｔ、Ｍａｒｃｅｌ　　　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ−１１
５−２１ベージ（１９８４）は、オリゴヌクレオチドお
よび核酸の固定化の異なる方法を記載している。この本
に記載されていない他の方法は、また、この分野におい
て知られている。クロロメチルおよびスチレンのコポリ
マーは、第一アミン含有オリゴヌクレオチドの固定化に
使用することができる。異なるタイプのラテックスを、
タンパク質の固定化において使用するのと同様な化学に
従って固定化に使用することができる。原理的には、固
体の支持体、例えば、セルロースおよびその誘導体「セ
ファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｊ、「セファローズ
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）Ｊおよび同様な物質、紙のラテ
ックス粒子、ガラスに基づく物質、ポリウレタン、「テ
フロン（ＴＥＦＬＯＮ）Ｊに基づく粒子またはシート、
「イモピロン（ＩＭＭＯＢ　Ｉ　ＬＯＮ）Ｊなどを固定
化のための図化の古椿体ンして使用することができるが
、これらに限定されない。

磁気粒子を使用する場合、蛍光性結合プライマーからの
非結合蛍光性プライマーの分離は磁場を使用して実施す
ることができる。増幅手順後、反応室を磁場に密接させ
て保持する。固定化された粒子は固定され、そして上澄
み液をデカンテーションまたは吸引することができる。

固定化された粒子を反復して洗浄して、過剰の非結合蛍
光性標識プライマーを反応混合物から除去する。洗浄後
、磁気粒子を再懸濁し、そして粒子上の蛍光性シグナル
を定性的または定量的に決定することができる。他の標
識つけ方法を磁気粒子と組み合わせて利用することがで
きる。

ハイブリダイゼーシタンを使用しない標識つけおよび検
出 プライマーの１つが固定化されているか、あるいは固定
化可能であるとき、検出は固体の支持体上で標識された
プローブとの／％イブリダイゼーションにより実施する
ことができるか、あるいは産生物は検出可能な標識で誘
導化した他のプライマーを使用して直接検出することが
できる。検出可能な標識、例えば、蛍光団によるオリゴ
ヌクレオチドの標識つけはこの分野において知られてい
る。

すべての検出技術は当業者により実施されることができ
る。

ビオチンはよく知られたビオチン−アビジン技術を使用
して固定化されているか、あるいは固定化可能なプライ
マーのための標識として利用することができる。固定化
された／標識された系において、ビオチンは１つのプラ
イマー上に存在し、そして固定化された基質は第２プラ
イマー上に存在するであろう。固定化可能な／標識され
た糸において、ビオチンは１つのプライマー上に存在し
、熱サイクルによる増幅後、ビオチン含有産生物を固定
化することができる。

標識されたプライマー 分離され固定化された分画または残りの反応溶液中の標
識され伸長されたプライマーの存在を決定して、アッセ
イを実施する、多数の方法を本発明において使用するこ
とができる。増幅された試料中の標識の存在を検出する
普通の手段から１つを選択することができる。

標識は標識または検出可能な物理的、化学的または電気
的性質を有する物質中に組み込まれたプライマーのオリ
ゴヌクレオチドに固有の特性であろう。検出可能な標識
つけ物質を導入するとき、それは直接、例えば、共有結
合によりプローブへ結合することができるか、あるいは
間接的に、例えば、マイクロカプセルまたはリポソーム
中に究極的に検出可能な物質を組み込み、次いでそれを
検出可能なプローブに結合することによって結合するこ
とができる。

標識つけ物質はイムノアッセイの分野においてよく開発
されており、そしてこのような方法において一般にほと
んどの任意の標識を本発明に適用することができる。と
くに次のものは、有用である：酵素的に活性な群、例え
ば、酵素［参照、クリニカル−ケミストリー（ｃＩｉｎ
、Ｃｈｅｍ、）、（１９７６、）２２　：１２３２、米
国再発行特許第３１．００６号および英国特許第２．０
１９．４０８号］、酵素基質（参照、米国特許第４，４
９２゜７５１号）、補酵素（米国特許第４．２３０．７
９７号および米国特許第４．２３８，５６５号）、およ
び酵素阻害因子（参照、米国特許第４，１３４．７９２
号）：蛍光体［参照、クリニカル・ケミストリー（ｃＩ
　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、）、（１９７９）２５　：　３５３
］　　；発色団：発光体、例えば、化学発光体および生
物発光体（米国特許第４，３８０．５８０号）；特異的
結合可能な配位子、例えば、ビオチン（参照、欧州特許
明細書６３，８７９号）またはハゲテン（参照、ＰＣＴ
発行８３−２２８６号）；放射性同位元素、例えば、３
Ｈ１３５Ｓ、３２ｐ１１ハ１１および１Ｃにのような標
識はそれら自身の物理的性質（例えば、蛍光体、発色団
および放射性同位元素）またはそれらの反応性または結
合性質（例えば、配位子、酵素、基質、補酵素および阻
害因子）に基づいて検出される。例えば、コファクター
標識種は、標識がコファクターである酵素（またはサイ
クル系を使用する場合酵素）および前記酵素の１または
２以上の基質の添加により検出することができる。ハブ
テンまたは配位子（例えば、ビオチン）配位子種は、検
出可能な分子で標識した配位子に結合するハプテンまた
はタンパク質（例えば、アビジン）に対する抗体の添加
により検出することができる。このような検出可能な分
子は、測定可能な物理的性質（例えば、蛍光性または吸
収）をもつ分子または酵素反応に参加する物質（例えば
、上を参照）であることができる。例えば、基質へ作用
して、測定可能な物理的性質を発生する酵素を使用する
ことができる。後者の例は、次のものを包含するが、こ
れらに限定されない：ベーターガラクトシダーゼ、アル
カリ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼ。

本発明の好ましい実施態様において使用する標識を調製
する方法は、先行技術から容易に入手可能である。標識
するとき、ハイブリダイゼーションおよび伸長に参加す
る標識されたプライマーの能力を実質的に妨害しないで
、核酸の修飾に有効である合皮アプローチ、および伸長
および引き統く検出に使用すべき条件下に十分に安定で
ある標識を選択する。凝集検出についての方法は、次の
文献を参照：グリエコ（Ｇｒｊｅｃｏ）８よびメリ不イ
（Ｍｅｒｉｎｅｙ）、臨床医のための免疫診断（Ｉｍｍ
ｕｎｏｄａｇｎｏｓｉｓ　　Ｃ１１ｎｉｃｉａｎｓ）（
１９８３）、第２章。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例１ ヒトベーターグロブリンの配列を、本発明のためのモデ
ルの系として使用する。任意の既知の配列を固定化され
たプライマーの適切な選択により増幅することができる
。

配列ＷＰまたはそれより短い ＷＰ　　５’ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧ
　　３’ および配列ＣＰまたはそれより短い ＣＰ　　３’ＣＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡ
Ｃ５’ これらのオリゴヌクレオチドおよび標的グロブリン配列
に対するそれらの関係は、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３０．１３５０　（１
９８５）に発表された。

オリゴヌクレオチドプライマーを、アミン末端をもつ炭
素鎖りンカーを各オリゴヌクレオチドの５′末端上に、
アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｓｕｐｒａから入手可能な試薬お
よびプロトコルを使用して配置して修飾する。次いで、
修飾されたプライマーは３次元の表面に共有結合するこ
とができる。

固定化された固体の支持体のために、プライマーの局所
的濃度は溶液中の平均濃度より大きい。修飾されＩ；オ
リゴヌクレオチドプライマーを固体の基質に共有結合す
る前に、修飾されたプライマーを熱サイクルにかけて、
プライマーの修飾が増幅に悪影響を及ぼすかどうかを決
定した。第３図に示すように、プライマーにより規定さ
れた１００塩基対の配列の形成はプライマーの５′末端
におけるＮＨ２の存在により悪影響を受けなかった。

別のリンカ−１例えば、アルキル、例えば、Ｃ２まＩ：
はＣＩ９を利用するこ、Ｌ−がでＩＬすＩ−同一または
異なるリンカ−を利用してプライマーを固定化および／
または標識することができる。リンカ−の選択は、ヌク
レオチド配列の増幅の妨害の不存在に基づく。例えば、
転写が固体の基質から離れているとき、より短いリンカ
−を使用することができる。ある固体の基質のだめのよ
り長いリンカ−は、転写が固体の基質の方向にあるとき
、必要である。

修飾されたオリゴヌクレオチドを、ホウ酸塩の存在下に
クロロメチルスチレン（ｃＭＳ）のビーズに共有結合し
た。ビーズを洗浄し、そしてペレットにして結合しない
オリゴヌクレオチドを除去した。

固定化されたＷＰ８よびＣＰを含有するほぼ２０μαの
水性懸濁液中のビーズを、１０ミリモルのトリス−ＨＣ
ｌ　　ｐＨ７，５，５０ミリモルのＮａＣ］、ｌＯミリ
モルのＭ　ｇ　ＣＩ　、、１．５ミリモルのデオキシヌ
クレオシドトリホスフェート（すべて４）を含有する溶
液（１ｍＱ）に添加する。それらを３７℃に１０分間加
熱し、そして２Ｏ単位のＥ、ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメ
ラーゼのタレ／−断片（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　
Ｉ）を添加する。反応を５分間進行させる。次いで、こ
の溶液をマイクロフーグ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）内で放
射性基質としてデオキシヌクレオシドトリホスフェート
の１つを使用して遠心し、そしてシンチレーションカウ
ンターでビーズの放射能を計数することによって推定す
る。

この反応は、（０，ｌｐｇ）の１０μＱの水性熱変性し
た（１００℃）水冷試料ＤＮＡ　（ヒト）の添加後、反
復する。このサイクルは、全混合物を沸騰する水浴中で
加熱し、そして３７℃に急速に冷却することによって反
復する。サイクル毎に、新鮮な酵素（２単位）のアリコ
ートを添加する。

反復した加熱および冷却はビーズを凝集させ、伸長およ
びアニーリングのために最適よりよくない状態にビーズ
を残すことがある。この問題を最小にするためにこの分
野において知られている方法は、「ライ−７８０」、グ
リシン、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような
物質の使用を包含する。オリゴヌクレオチドの修飾した
共有結合後、添加されるこのような物質の１つまたは組
み合わせは、この問題を解決することができる。

最終産生物は、マイクロ７−グ内の遠心により、固定化
され増幅された配列として集められる。次いで、固定化
された産生物の核酸は、３つの異なる方法、すなわち、
次のようにしてアッセイされる： （１）＊識された１９マーとのハイブリダイゼーション
； （２）２つの酵素を使用する消化（Ｓｉｅｎｃｅ、２３
０．１３５０　（１９８５）；（３）制限消化を使用す
るか、あるいは使用しない直接の検出。

アガロースゲル上の電気泳動により分析した増幅の結果
を、第２図に示す。

実施例２ ビーズ上へ固定化された増幅された産生物は、沸騰する
水浴上で加熱い、次いで水中で冷却することによって変
性する。後述するように、次いでビーズを３２ｐ標識さ
れたオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨンさせ
る。

分子ハイブリダイゼーションのために、次の混合物を調
製する： ４５０μＣの２ＱＸＮＥｂ ７５０μｇの２０％の硫酸デキストラン１５０μＱの脱
イオン水 ７５μａの１ｏｏｘデンハルト溶液 ７５μＱ１０％のＮＰ−４Ｑ洗浄剤（Ｓｉｇｍ　ａ　） この混合物に、次の文献に記載されているようにして調
製したオリゴヌクレオチドグローブのＩ／１０の部分を
添加する二Ｎ、ダッタグプタ（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ）
、Ｄ、ラビン（Ｒａｂｉｎ）、Ｇ、ミチャウド（Ｍｉｃ
ｈａｕｄ）およびＰ、Ｍ。

Ｍ、　ラエ（Ｒａｅ）、ｒ高い特異的活性のオリゴヌク
レオチドプローブの発生の簡単な方法（Ｓｉｍｐｌｅ　
　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
　　ｏｆ　　Ｈｉｇｈ　　５ｐｅｃｉｆｉｃＡｃｔｉｖ
ｉｔｙ　　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　Ｐｒｏ
ｂｅｓ）Ｊ、ＢｉｏＴｅｃｈｉｑｕｅｓｓ　Ｖｏｌ、５
、Ｎｏ、Ｌ　３８−４３、（１９８７）。最終の１９マ
ーのプローブの濃度はほぼ１ナノモルである。これより
多くのプローブの添加はバックグラウンドを増加するこ
とが発見された。単一のまたはわずかの反応のための標
識されたプローブを調製するために、上に詳細に説明し
た標識つけプロトコルの規模を、比例的に少ないプライ
マー、鋳型、ｄＧＴＰｌおよびｄＡＴＰを使用して小さ
くする。０．１×反応は１０１Ｊ４で実施することがで
き、０．２×反応は２０μａで実施することができる、
など。体積が許すとき、［アル７γ３２ｐ−アルファー
ＡＴＰは蒸発乾固丁る必要はない。

増幅されたほぼ０．５ｍｆｆの配列を含有するビーズを
、１端の左が開いＩ；プラスチックの袋（例えば、ｒＳ
ＥＡＬ−Ａ−ＭＥＡＬＪ、ｒＳＥＡＬＡＮＤ　　５ＡＶ
ＥＪなど）に入れる。放射性ハイブリダイゼーション混
合物を、バスツールビベ・ットまたは２１ゲージの針を
もつ注射器で添加し、そして袋の残りの端を密封する。

ハイブリダイゼーションは５０℃において１時間実施す
る。

ハイブリダイゼーション後、ビーズを試験管内で遠心に
より分離し、そしておだやかに農産しながら６ＸＳＳＣ
（生理的塩類溶液のクエン酸ナトリウム）で洗浄する。

厳格な洗浄のために、ビーズを予備加温したｌ。

６ｍＱの５ｘＳＳＣを含有する１、５ｍｄの培養管に移
す。試験管を５７℃の循環する水浴中に１０分間再び入
れる。液体を急速に遠心し、さらに１．５ｒｒｌの予備
加温した５ｘＳＳＣを添加し、次いで試験管を水浴中に
再びさらに１０分間入れ、液体を再び遠心し、次いで上
澄み液を廃棄する。

試験管中の放射能をシンチレーションカウンターで計数
する。ビーズに関連する放射能はハイブリダイゼーショ
ンの測度であり、それゆえもとの試料中の試験遺伝子の
存在の指示である。

実施例３ ２つの酵素を使用する消化 サイキ（Ｓ　ｉ　ｋ　ｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、２３０．１３５０　（１９８５）に記載されて
いるように、実施例１の増幅された産生物をハイブリダ
イゼーションによりアッセイし、次いで制限消化し、そ
してゲル電気泳動または薄層クロマドグ２フイーにより
分離する。

実施例４ 直接の検出 増幅された産生物は、増＃ｉ／伸長反応のための基質と
してヌクレオシドトリホスフェートを使用することによ
って、直接アッセイすることができる。例えば、３２Ｐ
標識されたまたはフルオレセイン標識されたまたはビオ
チン標識されたヌクレオシドトリホスフェートを基質と
して使用する場合、伸長された核酸中への標識の組み込
みは特異的プロセス、それゆえ特異的試験配列の存在の
直接の指示である。増幅後、増幅された核酸はビーズ中
に存在し、そしてビーズ上の標識の存在は試験配列の存
在を示す。フルオレセイン、ビオチンまたは３２ｐにつ
いてのアッセイは、この分野においてよく知られている
。他の普通の標識を、また、この目的に使用することが
できる。

ビーズの物理的性質の差は、また、検出のために使用す
ることができる。電気泳動の移動度、遠心の場における
密度およびクロマトグラフィーの性質を、また、検出の
目的に使用することができる。

ドの固定化 スチレンおよびクロロメチルスチレンの乳濁重合により
調製された、７５％のクロロメチル基を含有するポリス
チレンラテックスを洗浄し、そして次のようにして混合
床上で脱イオン化した：２ｇのＡＧ５０１−ｘ８混合床
の樹脂（Ｂｉｏｒａｄ１米国カリフォルニア州リッチモ
ンドすを３０ｍ１２のコレックスガラスの試験管に取っ
た。この試験管に、２０ｍｇの脱イオン水および１ｍＱ
の樹脂の１０％の懸濁液を添加した。この混合物を室温
において１時間震盪した。次いで、懸濁液を焼結ガラス
の漏斗で濾過して、濾液としてビーズを集めた。次いで
、樹脂床を１ｍＱの脱イオン水で洗浄した。混合床上の
洗浄および脱イオン化をもう一度反復した。最後に洗浄
した材料を４℃においてガラス管中に貯蔵した。この手
順を日常的に使用してラテックス粒子を脱イオン化およ
び洗浄する。

オリゴヌクレオチドを含有する第一アミンの固定化は、
次のようにして実施した：４００ｐａの１０ミリモルの
ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，３）をマイクロフーグ管（
１，５ｍ（２）中に取り、そして１０μＱの洗浄したラ
テックス粒子（はぼ２ｍｇ）を添加し、次いで同一緩衝
液中の１０μＱのオリゴヌクレオチドをｌμｇ／μＱで
添加した。

この混合物を室温において４時間農産した。非反応のク
ロロメチル基を５００ｐＱの１００ミリ七°ルののグリ
シン、０．１％の「ツイーン８０」を室温において１０
時間添加して遮断した。次いで、懸濁液を遠心して非反
応物質を除去し、そして１００ミリモルのグリシン、「
ツイーン２０Ｊおよび１％のウシ血清アルブミンで洗浄
した。次いで、ラテックス粒子を洗浄緩衝液中に４°Ｃ
において貯蔵した。

同様な方法を使用してアミノリンク（−ＮＨ。

含有）オリゴヌクレオチドを、アミノ反応性固体の支持
体にカップリングすることができる。

物の検出 この実施例を実施して、増幅のために固定化されたオリ
ゴヌクレオチドプライマーを使用する容易性を実証した
。典型的な１ＯＯｐαの反応混合物は、次の成分を含有
する： １μａのすべての４つの各ミリモルのヌクレオシドのデ
オキシヌクレオシドトリホスフェート混合物、 ２μαのゼラチン、１０ｐｇ／μａ ２μＱの可溶性オリゴプライマー　１μｇ／μα、 １０μαの固定化されたプライマー ｘｐＱの鋳型（濃度はｌピコグラム程度に低くあること
ができる）、 ２．５単位の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ［ｌｐａのｔ
ａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉ
ｏｌａｂ）］および （１００−（ｘ＋１６））ｐＱの５０ミリモルのＫＣＩ
％　１０２９モルのトリス　ｐＨ８，４，２，５ミリモ
ルのＭｇＣｌ、を含有する緩衝液。

次いで、この混合物を３０〜３５反復の次ぎの加熱−冷
却サイクルで処理した：この混合物を９５℃に加熱し、
次いで４０℃にアニーリングのために冷却し、次いで伸
長のために７０℃に加熱した。最後のサイクルの終わり
に、この混合物を７０℃に１０分間維持して最後のサイ
クルを完結した。次いで、試料をアガロースゲル上で分
析した。

結果を表２に示す。

試料としてｐｓｓ７３７を使用する左から右への増幅の
産生物［ゲーバー（Ｇｅｅｖｅｒ）ａｔａｌ、（１９８
１）、プロシーデインダス・オフ・ナシ２ナル・アカデ
ミ−・オフ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｅｔ、）ＵＳＡ、７８，５０８１−５０８５）
は、次のとおりである： Ｓ＊／ｐｓｓ：両者溶液中のプライマー６．７＊：溶液
中のローダミンで標識された；６固定化された ６＊、ヱ：６＊ローダミンで標識されたおよび溶液中；
７固定化された Ｓ＊／ＡＡ　：　ＤＮＡ試験試料の核酸を含有する正常
のベーターグロブリン遺伝子、両者は溶液中および標識
された ６、７＊／ＡＡ：６は固定化された；７＊標識されたお
よび溶液中およびＤＮＡを含有する正常ベーターグロブ
リン遺伝子 ６＊、７／ＡＡニアは固定化された：６＊は標識されか
つ溶液中およびＤＮＡを含有する正常ベーターグロブリ
ン遺伝子 Ｓ＊／ｓｓ、６．７木／　ｓ　ｓおよび６本、ヱ／ＳＳ
は最後の３つと同一であるが、ただし試験試料は鎌状赤
血球貧血をもつ患者から得た。

Ｘ１７４−ＨａａｌｌＩはマーカー核酸である。

デオキシＮＴＰの１つを使用する場合、例えば、制限消
化の前後における放射能のＳ！Ｐの直接の計数は配列に
ついての情報を与えるであろう。

固定化されたオリゴヌクレオチドの配列は、５′末端に
おける１０のアデニンの付加をもつ実施例１のＷＰプラ
イマーと同一であった。

他のプライマーの配列、７、は５′末端におけるｌＯの
アデニンの付加をもつ実施例１のＣＰグライマーと同一
であった。

使用した鋳型の量は約１ピコグラムであった。

実施例７ 増幅の特異性 増幅は、実施例５に記載されているようにして、実施し
、固定化されたプライマーを使用するｐｓｓ７３７のみ
を使用は第３図に示されている。第２図に適用したのと
同一の表示を再び使用する。

Ｄは制限エンドヌクレアーゼＤｄｅｌを使用する消化を
意味する。レーンの表示１．２／Ｄ；６゜７／Ｄ　；　
６．２／Ｄおよび６＊、７＊／Ｄで示す、゛非固定化１
１０−１３０ｂｐの断片の消化は、Ｄｄｅｌ制限部位が
中央に位置するので、等しい長さの２つの断片を生ずる
。レーンの表示旦、７＊／Ｄで示す、固定化された１１
０−１３０ｂｐの消化は、単一の可溶性断片およびより
遅い移動度の第２のビーズに取り付けられた断片を生ず
る。

実施例８ 増幅のための蛍光性で標識されたオリゴプライマーの使
用 手順は実施例６に記載する手順と同一であったが、ただ
しローダミン標識されたオリゴプライマーを非修飾の可
溶性オリゴヌクレオチドプライマーの代わりに使用した
。標識されたオリゴヌクレオチドは合成装置（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓ　ｔｅｍ３％　３８０）で合或
し、そしてアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　　Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍｓ）により供給されたプロトコルに従い供
給された化学物質を使用して誘導化した。

プライマーの配列および使用した鋳型は、実施例６にお
けるのと同一であった。

実施例９ 修飾されたオリゴヌクレオチドを特異的配列の分析のた
めに、試料の増幅により首尾よく使用することができる
という、前の実施例に記載されている方法を使用して、
本発明の実施態様の１つを性的に伝達した（ｓｅｘｕａ
ｌｌｙ　　ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ）有機体の分析のた
めに使用した。

オリゴヌクレオチドプライマーは、クラミジア・トラコ
ミチスの共通のタンパク質の保存された領域に相当する
ように選択して、すべての血清型を包含するようにし、
そして増幅された配列は特異的血清型についての情報を
提供するために十分な変動性を有するべきである。この
実施例のために選択した配列は、有機体の主要な外膜の
解読配列のヌクレオチド配列に相当する。配列は１つの
プライマーについて残基１２９３〜１５４７に相当し、
そして他のプライマーについて残基１５２７〜１５４７
に対して相補的である［Ｒ，Ｓ、ステ７エンス（Ｓｔｅ
ｐｈｅｎｓ）、ジャーナル・オフ・バクテリオロジー（
Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ。

ｇｙ）、１６９．３８７９　（１９８７）］　。これは
増幅された産生物としてＤＮＡの２５５ｂｐの断片を産
生するであろう。増幅のために使用した条件は実施例６
において使用したものと同一であり、そしてゲル電気泳
動分析は期待した産生物の形成を示した。

２１７−の配列は、次のとおりである：５′アミノーＣ
ＡＡ　　ＧＣＡ　　ＡＧＴ　　ＴＴＡＧＣＴ　　ＣＴＣ
ＴＣＴ　　および ５″アミノ−ＡＧＡ　　ＴＴＴ　　ＴＣＴ　　ＡＧＡＴ
ＴＴ　　ＣＡＴ　　ＣＴＴ プライマーを前述したように修飾し、そしてローダミン
で標識した。プライマーは、完全な成長培地クラミジア
ＤＮＡを含有する試料に添加した。

増幅後、未反応の標識されたオリゴヌクレオチドをアガ
ロースゲル上で電気泳動により分離した。

クラミジアは宿主マウス細胞中で増殖しないので、マウ
スＤＮＡを対照として使用した。着色したバンドおよび
対応する対照を切断し、そして第４図に示すように撮影
した。

簡単な遠心および濾過を、また、組み込まれなかった着
色した（標識された）オリゴヌクレオチドプライマーの
分離のために使用した。

固定化され標識されたプライマーは、完全に自動化され
た、感受性の、特異的な、容易に分析可能なアッセイを
提供する。固定化されているか、あるいは固定化可能の
標識されたプライマーを添加し、黙サイクルにかけられ
た、患者の試料は、迅速な臨床的診断のためのアッセイ
を提供する。

この明細書および特許請求の範囲は例示を目的としかつ
限定的ではなく、そして変更および変化は本発明の精神
および範囲を逸脱しないでなすことができる。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、試料中の特定の標的核酸配列、好ましくはオリゴヌ
クレオチドを増幅する方法であって、（ａ）ハイブリダ
イゼーション条件下に、（ｉ）第１プライマー核酸およ
び第２プライマー核酸を（ｉｉ）標的核酸配列を含有す
る試験試料と接触させ、前記第１または第２のプライマ
ー核酸の一方は、好ましくは固体の基質に、固定化され
ているか、あるいは固定化可能であり、他方は固定化さ
れているか、あるいは固定化可能であるか、あるいは標
識されており、 （ｂ）工程（ａ）の得られた産生物をエキステンダー酵
素および少なくとも１つのヌクレオチド残基、好ましく
はヌクレオチドトリホスフェートと、伸長のため、生ず
るハイブリダイゼーションしたプライマー核酸を、好ま
しくは前記固体の基質と反対方向に、伸長する条件下に
、接触させ、（ｃ）工程（ｂ）の産生物を変性して、固
定化された標的核酸配列を産生し、そして （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のサイクルを少
なくとも１回反復し、前のサイクルの工程（ｃ）の産生
物を（ａ）（ｉｒ）の代わりに使用する、 ことを特徴とする方法。

２、試料中の特定の標的核酸配列、好ましくはオリゴヌ
クレオチドを増幅する方法であって、（ａ）ハイブリダ
イゼーション条件下に、（ｉ）第１プライマー核酸およ
び第２プライマー核酸を（ｉｉ）標的核酸配列を含有す
ることが疑われる試験試料と接触させ、前記第１または
第２のプライマー核酸の一方は、好ましくは固体の基質
に、固定化されているか、あるいは固定化可能であり、
他方は固定化されているか、あるいは固定化可能である
か、あるいは標識されており、 （ｂ）工程（ａ）の得られた産生物をエキステンダー酵
素および少なくとも１つのヌクレオチド残基、好ましく
は標識されたヌクレオシドトリホスフェートと、伸長の
ため、生ずるハイブリダイゼーションしたプライマー核
酸を、好ましくは前記固体の基質と反対方向に、伸長す
る条件下に、接触させ、 （ｃ）工程（ｂ）の産生物を変性して、固定化された標
的核酸配列を産生じ、 （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のサイクルを少
なくとも１回反復し、前のサイクルの工程（ｃ）の産生
物を（ａ）（ｉｉ）の代わりに使用し、そして （ｅ）増幅された配列が存在するかどうかを決定する、 ことを特徴とする方法。

３、工程（ｅ）は上記第２項の工程（ｄ）の産生物をハ
イブリダイゼーション条件にかけ、試験する物質とハイ
ブリダイゼーション可能な標識されたプローブを使用し
、そして実際に７１イブリダイゼーシヨンが起こったか
どうかを決定することを特徴とする、上記第２項記載の
方法。

４、特定の標的核酸配列について物理的性質の差が存在
するかどうかを決定することによって検出を実施し、前
記物理的性質の差は電気泳動、遠心、ゲル透過クロマト
グラフィーまたはｌｌｌｌｌ検鏡検査り決定する、上記
第２項記載の方法。

５、核酸または核酸の組み合わせを含有する試料中の少
なくとも１つの特定の核酸配列の存在または不存在を検
出するか、あるいは前記試料中の２つの配列を区別する
方法であって、前記試料は混合物中に前記ｌまたは２以
上の配列を含有することが疑われ、前記方法は、 （ａ）前記試料混合物を、ハイブリダイゼーション条件
下に、多異なる特定の配列の各鎖の少なくとも１つのた
めの少なくとも１つのための固定化されたオリゴヌクレ
オチドプライマーで処理して、プライマーがハイブリダ
イゼーションする多異なる配列の各鎖について、各核酸
鎖に対して相補的である各ブライマーの伸長産生物を合
皮し、ここで前記ｌまたは２以上のブライマーをそれと
ハイブリダイゼーションする各特定の配列の各鎖に対し
て十分に相補的であるように選択し、こうして一方のプ
ライマーから合皮された伸長産生物は、その相補体から
分離したとき、他方のプライマーの伸長産生物の合成の
ための鋳型として働くことができ、そして好ましくは前
記オリゴプライマーの少なくとも１つは標識されたオリ
ゴヌクレオチドであり、 （ｂ）工程（ａ）の産生物を変性条件下に処理して、プ
ライマーの伸長産生物をそれらの鋳型から分離し、 （ｃ）工程（ｂ）の産生物を使用して工程（ａ）を反復
して、固定化された最終産生物であるｌまたは２以上の
特定の核酸配列を増幅させ、ここで固定化された最終産
生物は分析される、ことを特徴とする方法。

６、ｌまたは２以上の容器は、 （ａ）固定化されているか、あるいは固定化可能である
プライマーの核酸、 （ｂ）固定化されているか、あるいは固定化可能である
か、あるいは標識されている核酸、（ｃ）エキステンダ
ー酵素、 （ｄ）伸長のための少なくとも１つのヌクレオチド残基
および好ましくは （ｅ）増幅された配列の検出のために特異的な標識され
たハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチド、 を含有することを特徴とする、上記第１％または上記第
２項記載の方法を実施するためのキット。

７、（ｉ）試料混合物からの最終産生物の分離の前また
は後に、固定化された最終産生物を標識し、そして （ｉｉ）標識された最終産生物を分析する、ことによっ
て、固定化された最終産生物を分析することをさらに特
徴とする、上記第２り記載の方法。

８、核酸または核酸の組み合わせを含有する試料中の少
なくとも１つの特定の核酸配列の存在または不存在を検
出するか、あるいは前記試料中の２つの配列を区別する
方法であって、前記試料は混合物中に前記ｌまたは２以
上の配列を含有することが疑われ、前記方法は、 （ａ）前記試料混合物を、ハイブリダイゼーション条件
下に、各員なる特定の配列の各鎖の少なくとも１つのた
めの少なくとも１つのための固定化されたオリゴヌクレ
オチドプライマー、好ましくは標識されたオリゴヌクレ
オチドで処理して、プライマーがハイブリダイゼーショ
ンする各員なる配列の各鎖について、各核酸鎖に対して
相補的である各プライマーの伸長度生物を合成し、ここ
で前記ｌまたは２以上のプライマーをそれとハイブリダ
イゼーションする各特定の配列の各鎖に対して十分に相
補的であるように選択し、こうして一方のプライマーか
ら合成された伸長産生物は、その相補体から分離したと
き、他方のプライマーの伸長産生物の合成のための鋳型
として働くことができ、 （ｂ）工程（ａ）の産生物を変性条件下に処理して、プ
ライマーの伸長産生物をそれらの鋳型から分離し、 （ｃ）工程（ｂ）の産生物を使用して工程（ａ）を反復
して、固定化可能な最終産生物である１または２以上の
特定の核酸配列を増幅させ、そして（ｄ）固定化可能な
最終産生物を分析する、ことを特徴とする方法。

９、固定化可能な最終産生物を分析することをさらに特
徴とし、前記分析は、 （ｉ）固定化された最終産生物を試料混合物から分離し
、 （ｉ　ｉ）最終産生物を固定化し、 （ｉ　ｉ　ｉ）工程（ｉｉ）の産生物に、固定化された
最終産生物への結合のために、標識を添加し、そして （ｉｖ）標識された最終産生物を分析する、ことによっ
て実施する、上記第８項記載の方法。

１０、固定化可能な最終産生物を分析することをさらに
特徴とし、前記分析は、 （ｉ）工程（ｃ）の産生物に、固定化された最終産生物
への結合のために、＃ｌ識を添加し、（ｉ　ｉ）標識さ
れた最終産生物を固定化し、（ｉ　ｉ　ｉ）標識された
最終産生物を試料混合物から分離し、そして （ｉｖ）標識された最終産生物を分析する、ことによっ
て実施する、上記第８項記載の方法。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明の実施態様による増幅を実施するため
の工程を示す路線図である。 第２図は、ゲル電気泳動により分析された、本発明によ
る核酸の増幅の結果の写真である。 第３図は、本発明による増幅の産生物の制限エンドヌク
レアーゼの消化の写真である。第３図は、本発明の方法
が溶液中で実施した場合のように特異的である結果を生
成することを示す。 第４図は、特定の増幅された（ｃＬ−クラミジア）産生
物および対照（マウス）を含有する２本の試験管の写真
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の特定の標的核酸配列、好ましくはオリゴヌ
   クレオチドを増幅する方法であって、（ａ）ハイブリダ
   イゼーション条件下に、（ｉ）第１プライマー核酸およ
   び第２プライマー核酸を（ｉｉ）標的核酸配列を含有す
   る試験試料と接触させ、前記第１または第２のプライマ
   ー核酸の一方は、好ましくは固体の基質に、固定化され
   ているか、あるいは固定化可能であり、他方は固定化さ
   れているか、あるいは固定化可能であるか、あるいは標
   識されており、 （ｂ）工程（ａ）の得られた産生物をエキステンダー酵
   素および少なくとも１つのヌクレオチド残基、好ましく
   はヌクレオチドトリホスフェートと、伸長のため、生ず
   るハイブリダイゼーションしたプライマー核酸を、好ま
   しくは前記固体の基質と反対方向に、伸長する条件下に
   、接触させ、（ｃ）工程（ｂ）の産生物を変性して、固
   定化された標的核酸配列を産生し、そして （ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のサイクルを少
   なくとも１回反復し、前のサイクルの工程（ｃ）の産生
   物を（ａ）（ｉｉ）の代わりに使用する、 ことを特徴とする方法。