JPS63243875A - 核酸のアッセイ法ならびにそれに用いる試薬およびキット - Google Patents

核酸のアッセイ法ならびにそれに用いる試薬およびキット

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JPS63243875A JP63057310A JP5731088A JPS63243875A JP S63243875 A JPS63243875 A JP S63243875A JP 63057310 A JP63057310 A JP 63057310A JP 5731088 A JP5731088 A JP 5731088A JP S63243875 A JPS63243875 A JP S63243875A
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、核酸のアッセイ（ａｓｓａｙ）法ならびにそ
れに用いる試薬（ｒｅａｇｃｎｔ　ｃｏａ＋ｂｌｎａｔ
ｉｏｎ）およびキット（ｋｉｔ）に関する。さらに詳し
くは、検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｐｒｏｂｅ）
がハイブリダイゼーション（ｈｙｂ？１ｄｉｚａｔｌｏ
ｎ）反応の前に標的核酸（ｔａｒｇｅｔ　ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　ａｃｉｄ）のコピー（ｃｏｐｙ）に組み込まれる修
飾されたプライマー（ｍｏｄｉｆ’ｌｅｄｐｒｉｍｅｒ
）であるか、または捕捉プローブ（ｃａｐｔｕｒｌｎｇ
　ｐｒｏｂｅ）がハイブリダイゼーション反応の前に標
的核酸のコピーに組み込まれる修飾されたプライマーで
ある従来とは異なる反応様式のハイブリダイゼーション
法による、迅速および簡便で、かつ高感度な核酸のアッ
セイ法ならびにそれに用いる試薬およびキットに関する
。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題］ ハイブリダイゼーション反応において、標識（ｌａｂｅ
ｌ）されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
、すなわちプローブは標的核酸と塩基対を形成しうる。
核酸の検出に際しては、種々のハイブリダイゼーション
法が用いられてきた。直接的ハイブリダイゼーション法
では、検体（５ｐｅｃｌａ＋ｅｎ）は溶液中かまたは固
体担体に固定されている。同定されるべき核酸は、１つ
の標識されたプローブを用いて証明（ｄｅｍｏｎｓｔｒ
ａｔｅ）されている〇米国特許第４４８０５３９号明細
書に、サンドイッチハイブリダイゼーション法が記載さ
れている。
この方法では、２つの別個のプローブが用いられている
。１つは標識され検出に用いられる検出プローブであり
、他の１つは反応混合物から標的核酸を分離するために
固体担体に固定化された捕捉プローブである。
溶液中でのハイブリダイゼーション法は、英国特許出願
公開第２１８９４０３号明細書に記載されている。この
方法においては、同−液相中に共存する２つの異なるプ
ローブが用いられている。
検出プローブには検出されうる標識が標識されており、
捕捉プローブには他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）に対して親
和性を有する部分が付着されている。
ハイブリダイゼーション後、捕捉プローブ、標的核酸お
よび検出プローブの間で形成されたハイブリッド（ｈｙ
ｂｒＩｄ）は、親和性ペア（ｐａｉｒ）の他の部分によ
ってハイブリダイゼーション溶液から分離されうる。
あらかじめ存在している核酸鎖（ｓｔｒａｎｄ）のヌク
レオチド配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）　　（以下、鋳型（
Ｉｃｍｐｌａｔｅ）という）が正確に相補鎖（ｃｏｍｐ
ｌｅａｅｎｔａｒｙ　５ｔｒａｎｄ）にコピーされるＤ
ＮＡの酵素触媒化重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ
）は当業者によく知られた技術であり、たとえばコーン
ベルグ（Ｘｏｒｎｂｃｒｇ）　、ＤＮＡレブリケーショ
ン（ｒｅｐＨｃａｔｌｏｎ）、ダブリューΦエイチ争フ
リーマン・アンド会カンパニー（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａ
ｎ　＆Ｃｏ、）、サンフランシスコ、２２１〜２２５頁
および６７０〜６７９頁（１９８０）ならびにマニアチ
ス（Ｍａｎ　ｆａｔ　ｉｓ）ら、モレキュラー・クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、ア
争ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−（ｃｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、　１２２頁（１９８２
）に記載されている。
この生物学的増殖（ｍｕｌｔｉｐＨｃａｔｌｏｎ）は、
検出されるべき微生物が培養され、したがってテストに
供する前にＤＮＡが集９（ｅｎｒｌｃｈ）化しているハ
イブリダイゼーションアッセイ法において用いられてお
り、たとえばウー（Ｗｏｏ）、メソッズーインーエンザ
イモロジ−（ＭＧｔｌｌＯｄＳ　１ｎＥｎｚｙｍｏ１．
）、６Ｂ、３８９頁（１９７９）および米国特許第４３
５８５３５号明細書に記載されている。
特定のＤＮＡ配列は生細胞内で、たとえばフレウェル（
ｃｌｃｗｅｌｌ）およびヘリンスキ（ＩＩｅｌｌｎｓｋ
Ｉ）　、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、）　、１１０　、目３５頁（１９７
２）ならびにヨーロッパ特許出願第５５７４２号公開公
報に記載されているような適当な薬剤を用いることによ
っても増幅（ａｍｐＨｆ’ｙ）されうる。
より特定のＤＮＡ−集積化については、標的がプラスミ
ドのレプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）に結合後適当な細
胞に導入されることが、ヨーロッパ特許出願第１７５６
８９号公開公報に記載されている。
さらにまた別の方法、すなわちＤＮＡ合成のプライマー
依存性を用いた標的ＤＮＡの増幅に対する試験管内（Ｉ
ｎ　ｖｌｔｒｏ）反応について、ヨーロッパ特許出願第
２０１１８４号公開公報に記載されている。
ヨーロッパ特許出願ｍ２００３Ｂ２号公開公報には、増
幅した遺伝子（ｇｅｎｃ）の検出法が提案されている。
しかしながら、これら従来のハイブリダイゼーション法
による核酸のアッセイ法は、時間がかかり過ぎるかまた
は感度があまりにも低過ぎるという問題点を有していた
。
この感度の低さは、サンプル中の標的核酸の量が常に非
常に少ないばあい、たとえばサイトメガロウィルス（ｃ
ｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉ　ｒｕｓ、以下ＣＭＶという）
およびエイズ（ＡＩＤＳ）を生じさせるヒト免疫不全（
ｌｌｕｍａｎ　Ｉａ＋ｍｕｎｏｄｃｆ１ｃｉｏｎｃｙ　
ｓ以下旧という）ウィルスを伴なうばあいのアッセイ法
において、とくにこれらの検出が困難であるという問題
点を有していた。
したがフて、従来のアッセイ法の前記問題点を有するこ
となく、かつ長所は有している今までとは異なる反応様
式によるハイブリダイゼーション法を用いた核酸のアッ
セイ法が望まれていた。
本発明者らは、驚くべきことに、まず標的核酸を修飾さ
れたプライマーを用いて増殖したのち、適当なハイブリ
ダイゼーション反応を好ましくは溶液中で行ない、さら
にＩ＼イブリダイゼーション反応において、修飾された
プライマーが組み込まれている標的核酸のコピーの選択
的分離または検出を行ないうる選択的捕捉または検出プ
ローブを、修飾された捕捉または検出プライマーの選択
にもとづいて用いることにより、迅速かつ簡便であると
同時に改良された感度を有するハイブリダイゼーション
法による核酸のアッセイ法を見出し、本発明を完成する
に至った。
［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明は、捕捉プローブが標的核酸のコピー
に組み込まれる修飾されたプライマーとして作用し、つ
いで、該標的核酸の存在が少なくとも１つの選択的な検
出プローブによって検出されることを特徴とするハイブ
リダイゼーションによる核酸のアッセイ法に関する。具
体的には、くω標的核酸の少なくとも１つのプライマー
に親和性ペアの少なくとも１つの部分または親和性ペア
の少なくとも１つの部分が併行されうる少なくとも１つ
の特定部位（ｓｐａｃＩｆＩｃｓｌｔｅ）を与え； （ｂ）えられた捕捉プライマーまたはプライマー類と１
本鎖の標的核酸とを鋳型依存性重合（ｔｅｍｐｌａｔｃ
　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ
）反応に適した条件下で反応させ； （ｃ）該捕捉プライマーが組み込まれている標的核酸の
１本鎖のコピーと、該標的核酸と選択的にハイブリダイ
ズしうる検出プローブとをハイブリダイゼーション反応
に適した条件下でハイブリダイズさせ； 〈ｄ）該捕捉プライマーが組み込まれている標的核酸の
コピーを親和性ペアの他の部分によって分離し； （ｅ）該標的核酸のコピーとハイブリダイズしている選
択的検出プローブの存在を検出するのが好ましい。
本発明は、また、修飾されたプライマーが組み込まれて
いる標的核酸のコピーが少なくとも１つの選択的捕捉プ
ローブでハイブリダイズされ、ついで、ハイブリッド形
成物が該選択的捕捉プローブによって分離されたのち、
該ノーイブリッドの存在が検出されることを特徴とする
検出プローブが標的核酸のコピーに組み込まれる修飾さ
れたプライマーとして作用するハイブリダイゼーション
による核酸のアッセイ法に関する。具体的には、（ａ）
標的核酸の少なくとも１つのプライマーに少なくとも１
つの検出されうる標識または少なくとも１つの検出され
うる標識が付着されうる少なくとも１つの特定部位を与
え；（ｂ）えられた検出プライマーまたはプライマー類
と１本鎖の標的核酸とを鋳型依存性重合反応に適した条
件下で反応させ； （ｃ１該検出プライマーが組み込まれている標的核酸の
１本鎖のコピーと、該標的核酸と選択的にハイブリダイ
ズしうる捕捉プローブとをハイブリダイゼーション反応
に適した条件下でハイブリダイズさせ； （重鎮検出プライマーが組み込まれている標的核酸のコ
ピーを選択的捕捉プローブによって分離し； （ｅ＞該標的核酸のコピーの存在を検出するのが好まし
い。
本発明はさらに、試薬および本発明のアッセイ法の遂行
に必要な該試薬を有するマルチコンテナー（ｍｕｌｔｌ
ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）ユニット（ｕｎｉｔ）からなりパ
ッケージされた形態（ｐａｃｋａｇｅｄ　ｆｏｒｍ）に
あるキットに関する。
本発明のハイブリダイゼーション法を用いた核酸のアッ
セイ法によれば、ｌ＼イブリダイゼーション反応前に鋳
型依存性重合のプロセスにおいて、検出プローブまたは
捕捉プローブが標的核酸のコピーに組み込まれる修飾さ
れたプライマーとして作用する。
なお、前記検出プローブおよび捕捉プローブは、標的核
酸と充分に１０同（ｂｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、すなわち
同定されるべき標的核酸中のお互いに比較的接近した部
位に相同であることが好ましい。
また、これらプローブは標的核酸上でお互いに重複（ｏ
ｖｅｒｌａｐ）　Ｉ、てはならない。
本発明のアッセイ法によれば、少なくとも１つのプライ
マーが必要とされ、プライマー類は常に修飾されている
。重合反応において検出プローブがプライマーとして作
用するばあいには、プライマーには少なくとも１つの適
当な検出されうる積重または少なくとも１つの適当な検
出されうる標識が付着されうる少なくとも１つの特定部
位が備わっている。
一方、捕捉プローブが重合反応におけるプライマーとし
て用いられうる。このばあいには、プライマーには親和
性ペアの少なくとも１つの適当な部分かまたは親和性ペ
アの少なくとも１つの適当な部分が付着されうる少なく
とも１つの特定部位が備わっている。
これらの検出プローブまたは捕捉プローブを重合反応に
おけるプライマーとして用いることにより、標的核酸を
直接的に測定する方法と比較して、ハイブリダイゼーシ
ョン反応の感度を数オーダーのマグニチュード（ｍａｇ
ｕｎｉｔｕｄｅ）で増加しうる。
さらに、本発明のアッセイ法は溶液中においてハイブリ
ダイゼーション反応を行なう便利な方法を利用しつるの
で、このばあいには、ハイブリダイゼーション反応後に
ハイブリダイゼーション溶液からハイブリッド形成物が
容易にかつ迅速に分離されうる。
本発明のアッセイ法は、従来の方法では診断が非常に困
難であるようなある種の病気を診断するのに好都合であ
る。したがって、本発明のアッセイ法によれば、ＣＭ■
およびＨｌウィルスまたはＡＩＤＳウィルスの同定にと
くに役立つ。
［実施例］ （試料の調製） 本発明のアッセイ法で用いる核酸の試料は、通常方法に
したがって調製されうるが、該試料が二本鎖の核酸であ
るばあいには、あらかじめ変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）に
より一本鎖の核酸としておかなければならない。
（アッセイ用材料の調製） 本発明のアッセイ法において用いられるプローブとして
は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがあげ
られる。
プローブは、プローブ調製に好ましいモード（ｍｏｄｅ
）である合成的または半合成的な方法にしたがって調製
され、また該プローブはプライマーとしても作用する。
また、組み換え操作（ｒｃｃｏｆｆｌｂｉｎａｎｔ　ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅ）または天然物から直接的に単離した
核酸を用いてプローブを調製することもまったく可能で
ある。
プローブは適当なベクター（ｖｅｃｔｏｒ）と結合して
いてもよい。また、ベクタ一部分を含んでいるか、また
はベクタ一部分が完全に欠損していてもよい。事実、用
いられうる適当なプライマーおよびプローブの多くは、
市販のものである。
（修飾されたプライマーとしての検出プローブ）本発明
のアッセイ法の１つの方法における検出プローブとして
は、塩基対によって標的核酸に結合し、かつ鋳型依存性
核酸合成（重合）酵素に対するプライマーとして作用し
うるオリゴヌクレオチド類またはポリヌクレオチド類が
あげられる。
検出プライマーには、少なくとも１つの適当な検出され
うる標識または少なくとも１つの適当な検出されうる標
識が付着されうる少なくとも１つの特定部位が、備わっ
ている。
種々の放射性同位元素または放射性標識化合物を標識と
して用いてもよい。その他の標識物質としては、蛍光性
（Ｎｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）、冷光性（ｌｕｍｉｎｅｓｃ
ｅｎｔ）、発光性（ｌｉｇｈｔ　ｅｇ＋ｔｔｔｉｎｇ）
、酵素的または免疫学的に証明しうるちのなどがあげら
れる。さらに、ビオチンとアビジンまたはストレプトア
ビジンとの親和性、ランタニド・キレート（Ｉａｎｔｈ
ａｎｉｄｅ　ｃｈｅｉａｔｅ）類、フェリチン（ｆ’ｅ
ｒｒｉｔｉｎ）とヘム（ｈｅｍｅ）化合物ならびにアセ
トキシアセチルフルオレン誘導体たとえば、Ｎ−アセト
キシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）お
よび７−ヨード−Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルア
ミノフルオレン（ＡＡＩＦ）のような免疫学的に証明し
うるハブテン類などにもとづく標識も例としてあげられ
る。たとえば蛋白質のような媒介物質（ｍｅｄＩａｔｏ
ｒ）による同定もまた可能である。
本発明のアッセイ法は、検出プライマーに用いられる標
識のみに依存するものではない。核酸のハイブリダイゼ
ーションに適するすべての一般に知られた標識物質も本
発明の方法に自由に適用されうる。しかしながら、前記
標識は重合反応を妨害するものではなく、しかも、検出
プローブをプライマーとして作用せしめるばあいには、
プライマー機能を妨害しないような標識類よりなる群か
ら選ばれた標識を用いるのは必須である。
また、標識は、核酸重合酵素が検出プライマーをプライ
マーとして、今までどおりに認識しうるように検出プラ
イマーに付着されなければならない。
検出プローブを修飾されたプライマーとして用いるのに
好ましい条件としては、選択的捕捉プローブがハイブリ
ダイゼーションの間中、溶液中に存在しているばあいで
ある。
また、ハイブリダイゼーションの間中、固体担体に固定
化されている選択的捕捉プローブを用いてハイブリダイ
ゼーションを行なうことも可能である。しかしながら、
この方法は本発明のアッセイ法の実施態様としてはあま
り好ましくない（後記実施例５の検出モード２参照）。
（修飾されたプライマーとしての捕捉プローブ）本発明
のアッセイ法の別の方法における捕捉プローブとしては
、塩基対によって標的核酸に結合し、かつ鋳型依存性核
酸合成（重合）酵素に対するプライマーとして作用しう
るオリゴヌクレオチド類またはポリヌクレオチド類があ
げられる。
捕捉プライマーには、親和性ペアの少なくとも１つの適
当な部分または親和性ペアの少なくとも１つの適当な部
分が付着されうる少な（とも１つの特定部位が備わって
いることが必須である。また、捕捉プライマーが該捕捉
プライマーに対する媒介物質を通して親和性ペアの１つ
の部分または多くの部分に付着することも可能である。
親和性ペアの部分は、他の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）
に対する親和性を有する成分である。たとえば、ビオチ
ン−アビジンまたはストレプトアビジン、重金属誘導体
−チオ基ならびにポリｄＧ−ポリｄＣ。
ポリｄＡ−ポリｄＴおよびポリｄＡ−ポリＵのような種
々のホモポリヌクレオチド類がそのような親和性ペアと
してあげられる。
また、標的核酸のコピーに組み込まれている修飾された
捕捉プライマーの固体担体への特異的結合をさせるのに
充分に強い親和性を有しているかぎり、他の成分のペア
は用いられうる。
適当な親和性ペアは、免疫学的方法において用いられる
リガンド類および複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）類にお
いて見出される。
このように、いかなる種類の親和性ペアも捕捉プライマ
ーに対して用いられうるが、ただし、親和性ペアによる
ハイブリダイゼーション溶液からのハイブリッド形成物
の分離を可能ならしめ、重合反応を妨害せず、かつプラ
イマー機能を害さないことだけが該親和性ペアの条件と
してあげられる。
（選択的捕捉プローブ） 検出プローブが修飾されたプライマーとして作用する本
発明のアッセイ法の１つの方法においては、修飾された
プライマーが組み込まれている標的核酸のコピーの選択
的分離を行ないつるような選択的捕捉プローブが必要と
される。
選択的捕捉プローブは、標的核酸のコピーとの特異的な
ハイブリダイゼーションならびにそれに伴なう選択的な
分離および標的核酸のコピーに組み込まれている検出プ
ライマーによる検出をなしうるために、標的核酸と充分
に相同であることが必須となっている。
前記選択的捕捉プローブには、親和性ペアの少なくとも
１つの部分または親和性ペアの少なくとも１つの部分が
付着されうる少なくとも１つの特定部位が備わっている
。
（選択的検出プローブ） 捕捉プローブが修飾されたプライマーとして作用する本
発明のアッセイ法の別の方法においては、修飾されたプ
ライマーが組み込まれている標的核酸のコピーの選択的
検出を行ないうるような選択的検出プローブが必要とさ
れる。
選択的検出プローブは、修飾されたプライマーが組み込
まれている標的核酸のコピーと特異的にハイブリダイズ
し、それによって該標的核酸のコピーを選択的に同定す
るために標的核酸と充分に相同であることが必須となっ
ている。
検出プローブには、たとえばすでに述べたような何らか
の適当な検出されうる標識が与えられている。すなわち
、選択的検出プローブには、少なくとも１つの検出され
うる標識または少なくとも１つの検出されうる標識が付
着されうる少なくとも１つの特定部位が備わっている。
本発明の核酸のアッセイ法に用いうる２種の試薬をつぎ
に述べる。
（修飾されたプライマーとしての検出プローブを有する
試薬） 本発明は、（ａ）少なくとも１つの適当な検出されうる
標識または少なくとも１つの適当な検出されうる標識が
付着されうる少なくとも１つの特定部位を備えた、標的
核酸の少なくとも１つの修飾されたプライマーおよび（
１））親和性ペアの少なくとも１つの部分または親和性
ペアの少なくとも１つの部分が付着されうる少なくとも
１つの特定部位を備えた、少なくとも１つの選択的捕捉
プローブ、すなわち、標的核酸と選択的にハイブリダイ
ズしうる少なくとも１つの捕捉プローブからなる試薬に
関する。
（修飾されたプライマーとしての捕捉プローブを有する
試薬） 本発明はまた、（ａ）親和性ペアの少なくとも１つの適
当な部分または親和性ペアの少なくとも１つの適当な部
分が付着されうる少なくとも１つの特定部位を備えた、
標的核酸の少なくとも１つの修飾されたプライマーおよ
び（ｂ）少なくとも１つの適当な検出されうる標識また
は少なくとも１つの適当な検出されうる標識が付着され
うる少なくとも１つの特定部位を備えた、少なくとも１
つの選択的検出プローブ、すなわち標的核酸と選択的に
ハイブリダイズしうる少なくとも１つの検出プローブか
らなる試薬に関する。
（キラトン 本発明はまた、本発明の核酸のアッセイ法に用いうる便
利なキットに関する。
本発明のキットは、前記２種の試薬いずれが一方を有す
るか、または該２種の試薬のいずれか一方と、アッセイ
法において必要とされる以下に示すリアクタント（ｒｅ
ａｃｔａｎｔ）類またはファンリティー（ｆ’ａｃｆｌ
ｆｔｙ）類の少なくとも１つを有するマルチコンテナー
ユニットがらなりパッケージされた形態にある。リアク
タント類、およびファシリティ−類としては、少なくと
も１つの鋳型依存性重合剤を有するコンテナー（ｃｏｎ
ｔａｉｎｅｒ）　、４種のデオキシヌクレオシド三リン
酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｔｒｌｐｈＯ８
ｐｈａｔｅ）を有するコンテナー、重合およびハイブリ
ダイゼーションプロセスに用いる適当なファシリティ−
１標的核酸のコピーの分離に用いる適当なファシリティ
−があげられる。
好ましいファシリティ−類およびリアクタント類につい
ては、のちに詳しく述べる。
（アッセイ法） 本発明のアッセイ法の好ましい態様では、検出プライマ
ーまたは捕捉プライマーのいずれかである少なくとも２
つの修飾されたプライマーを、通常の方法にしたがって
変性せしめた標的核酸の試料溶液に加えることから開始
する。修飾されたプライマーは標的核酸の相補鎖、すな
わち鋳型にそれぞれアニール（ａｎｎｅａｌ）　Ｌ、、
さらに、鋳型依存性核酸合成（重合）酵素の添加により
該プライマーは伸長（ｅｌｏｎｇａｔｅ）される。
条件が適しているばあいには、前記プロセスにより、数
１０００塩基の長さを有する新しい核酸鎖の創作が試験
管内において効率よく進行する。
過剰の修飾されたプライマーを用いることにより、前記
プロセスは新しく合成された鎖に相補的なコピーを創作
することがくり返され、このようにしてえられたコピー
は最初の鋳型と同一である。さらに、このプロセスがく
り返されることにより、カスケード反応（ｃａｓｃａｄ
ｅｒｅａｃｔｉｏｎ）が開始され、これにより標的核酸
の増殖が行なわれる。
前記プロセスは、所望の検出感度かえられるまで望むか
ぎり何回でもくり返されうる。標的核酸の濃度が極度に
低いぼあい以外は、１回の増殖で充分に標的核酸が検出
されうる。
本発明のアッセイ法においては、修飾されたプライマー
の１つのみを用いることも可能である。しかしながら、
このばあいには、反応がカスケード型反応ではないため
、少なくとも２つのプライマーを用いるばあいほど標的
核酸の増殖は効率的には行なわれない。
本発明のアッセイ法によれば、標的核酸がＤＮＡまたは
ＲＮＡのいずれでも検出されうる。しかしながら、標的
核酸がＲＮＡのばあいには、まず最初にＲＮＡを対応す
るｃＤＮＡに逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅ　ｅｎｚｙｍｅ）を用いてコピーした
のちに、すでに述べたようなプロセスを続けるのが非常
に便利である。
本発明のアッセイ法では、まず最初に、修飾されたプラ
イマーが標的核酸のコピーに組み込まれたのち、標的核
酸の配列およびそのコピーを認識しつる適当な選択的プ
ローブが反応混合物に加えられ、選ばれたそれぞれのハ
イブリダイゼーションプロセスに適する条件下でハイブ
リダイゼーション反応が行なわれる。
前記ハイブリダイゼーション反応においては、修飾され
たプライマーの選択に応じて選択された選択的捕捉プロ
ーブまたは選択的検出プローブのいずれかが、もとの状
態における標的核酸の量と比べて、今や、何倍もの量で
存在している標的核酸のコピーとハイブリダイズされる
。
したがって、もとの試料が標的核酸の配列を含んでいる
ばあいには、加えられた選択的プローブは、標的核酸の
新しく合成されたコピーとハイブリダイズする。すなわ
ち、ハイブリッドは、修飾されたプライマーが組み込ま
れた標的核酸のコピー分子と選択的プローブとの間で形
成される。
つぎに、形成されたハイブリッドは、本発明のアッセイ
法にしたがって、捕捉プライマーまたは選択的捕捉プロ
ーブ上に付着している親和性ペアの部分によりハイブリ
ダイゼーション溶液から都合よく分離される。
分画の間、ハイブリッドに含まれたこれらの捕捉部分は
、親和性ペアの他の部分によって固体担体に接着（ａｄ
ｈｅｒｅ）　Ｌ、担体に接着したハイブリッド中の選択
的検出プローブまたは検出プライマーの量は、通常の方
法にしたがって該担体から直接的にまたは溶出後の溶出
液から測定されうる。
分画の前に、もし必要であれば、親和性ペアに有利な条
件となるように溶液を希釈する。そののち、溶液を固体
担体と接触させる。ここでいう担体としては、たとえば
アフィニティークロマトグラフィーカラム、フィルター
、プラスチック表面またはガラス表面があげられる。
分離を行なうのに都合のよいファシリティ−としては、
マイクロタイタープレート （ｍｆｃｒｏｔｆｔｓｒ　ｐｌａｔｅ）、ディツプステ
ィックシステム（ｄｌｐｓｔｉｃｋ　ｓｙｓｔｅｍ）ま
たは磁気粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）
などの種々のタイプがあるが、試験管内またはビーズ上
などで分離を行なうこともまったく可能である。
アフィニティーカラムの担体材料としては、たとえばセ
ルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、デキス
トランまたはアガロースのような天然または合成ポリマ
ーがあげられる。
これらの材料は試験管内に懸濁して用いることもできる
。内表面に親和性ペアの他の部分が固定化された試験管
を用いることも有益である。
前記担体材料の必要条件としては、捕捉プライマーまた
は選択的捕捉プローブに付着した親和性ペアの部分に対
して親和性を存する他の部分の成分が固定しうるちのか
ら選ばれた材料であることがあげられる。
重合開始時に、親和性ペアの１つの部分または多くの部
分を捕捉プライマーに付着することは必ずしも必要では
ない。また、重合前に、検出されうる標識を検出プライ
マーに付着することも必ずしも必要ではない。
したがって、重合プロセス後に、標的核酸のコピーに組
みこまれている修飾されたプライマーに前記親和性ペア
または標識を加えてもよい。
たとえば、検出されうる標識がハイブリダイゼーション
の条件に敏感であるばあいには、選択的捕捉プローブと
標的核酸のコピーとのハイブリダイゼーション後にはじ
めて該標識を加えてもよい。
検出プローブが標的核酸のコピー　に組み込まれる修飾
されたプライマーとして作用するばあいには、固体担体
上に固定化された選択的捕捉プローブにより反応混合物
からハイブリッドを分離してもよい。ヨーロッパ特許出
願第２３７３８２号公開公報にもすでに記載されている
この方法においては、検出プライマーが組み込まれてい
る標的核酸およびそのコピーと固体担体上に固定化され
た選択的捕捉プローブとのハイブリダイゼーションが、
速度律速段階（ｒａｔｅ　ｌｉｍｐｉｎｇ５ｔｅｐ）と
なっている。
したがって、溶液中でのハイブリダイゼーションが、前
記固体上でのハイブリダイゼーションよりも本発明にお
けるさらに好ましいハイブリダイゼーションの反応様式
となる。
なお、固定化捕捉プローブを用いて本発明のアッセイ法
を実施したばあいには、固体担体上に形成されたハイブ
リッドを洗浄したのち、該担体上の標識量を通常の方法
にしたがって測定する。
つぎに実施例にもとづいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はもとよりこれらに限定されるものではな
い。
実施例１ （検出プローブを修飾されたプライマーとして用いたＣ
ＭＶ−ＤＮＡ　）検出） この実施例において、標的核酸はサイトメガｏ　ｆｙ　
イルス（ｃＭＶ　、　ＡＤ　１６９、ＡＴＣＣＶＲ−５
３８）ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）の１２．３キロベース（
ｋｂ）断片を含む組み変えプラスミド（ｐＢＲ３２２／
ＣＭＶ　ｌ１１ｎｄＩＩＩＬ）であった。
用いた２つの検出プライマ＝（Ｐａ（塩基配列：５°−
ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＧＴＣＧＧＣＣＡＣＧＧ）お
よびＰｂ　（塩基配列：　５’−ＡＧＣＴＣＴ　ＴＴＣ
ＣＣＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＣＴ）、第１図参照）は、２０
ヌクレオチド長を有しており、オートメーション化され
た合成装置 （５ｙｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いた標準法により合成し
た。
なお、これら検出プライマーは１１１ヌクレオチド離れ
たＣＭＶ−特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔ）上の２つの領域
と一致する。
２つの選択的捕捉プローブ（Ｓｌ（塩基配列：５°−Ａ
ＣＧ　ＴＣＧ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＣＧＣＣＧ）
およびＳｌ（塩基配列：　５’−ＡＴＯＡＧＣＡＧＣＧ
ＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴ）、第１図参照）は、２本の鎖（
ＡおよびＢ１第１図参照）それぞれにおいて前記２つの
検出プライマー間にある領域を認識した。
ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｋｌｎａｓｅ）とガンマ（ｇａｆｆｌｍａ）−３２
Ｐ−ＡＴＰとを用いた既知の反応にしたがって、検出プ
ライマーＰａおよびｐｂの５°末端が４　ｘ　１０９　
ｃｐｍ／μｇの比活性（ｓｐｅｃｉｆ’１ｅ　ａｅｔｌ
ｖｉｔｙ）を有するまで３２ｐで標識した（マニアチス
ら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−φ
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−１（１９８２）参照）。
ビオチン化ヌクレオチドをリレイ（Ｒ１１ｅｙ　）ら、
ＤＮＡ　、　５（４）、　３３３〜３３７頁（１９８８
）の記載にしたがって、ビオ（ｂｉｏ）１１−ｄＵＴＰ
（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、以
下ＢＲＬという）社製およびターミナルトランスフェラ
ーゼ（ｔｅｒＩｌｌｉｎａｌｔｒａｎｓｆ’ｅｒａｓｅ
　ｓプロメガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｌｏ
ｔａｃｈ）社製）を用いて捕捉プローブの３°末端に加
えた。
標的プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲｌを用いた切断（ｃ
ｌｅａｖａｇｅ）により直線化した。
ＤＮＡポリメラーゼ、すなわちフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ
）断片はベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｌｎｇ
ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｌｍ）から、またストレプトアビジ
ン−アガロースはＢＲＬからそれぞれ入手した。
これらの試薬を用いて、下記の実験を行なった。
標的プラスミドをそれぞれＯ，１０４，１０Ｂおよび１
０６分子（それぞれ０，２ＸＩ０　　．２Ｘ１０−１８
および２　Ｘ　１Ｏ−１６ａ＋ｏｌと対応する）含む４
種の反応混合液を組み立てて用いた。加えて、これらす
べての４つの反応混合液に、総量５０μｇ中に２つのプ
ライマーをそれぞれ２ｐωｏ１ずつ、４種のデオキシヌ
クレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ
ＸｄＴＴＰ）をそれぞれ０．５ｍＭずつ、１０ｍＭ　）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１００ＩＭ１００Ｉ
　２．５０ｍＭＮａＣｌおよび１０ｍＭジチオスレイト
ール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｌｔｏｌ）を含有させた。
反応混合液を１００℃まで２分間加熱したのち、３７℃
で５分間インキュベーションし、さらにＤＮＡポリメラ
ーゼ１μΩ（１単位と等価）を加えた。ついで、反応混
合液を再び３７℃で１０分間インキュベーションした。
前記沸ｊｌｅに続く検出プライマーのア二一リングおよ
び添加したＤＮＡポリメラーゼとの３７℃でのインキュ
ベーションにより、ＤＮＡ合成サイクルが構成される。
この実験においては、前記サイクルを１回のみまたは５
回もしくは１５回行なった。
最終サイクル後、サンプルを再び１００℃まで加熱した
のち、選択的捕捉プローブ１０ｐｆｆｌｏｌを０．９Ｍ
　Ｎａ（Ｊ、　２０ｍＭＥＤＴＡ、　２０ａ＋Ｍリン酸
ナトリウム（ｐＨ７，５）および０．１％ドデシル硫酸
ナトリウム（以下、ＳＤＳという）とともに加え、容】
を１００μｇまで増量した（なお、前記濃度は最終濃度
を示す）。
そののち、反応混合液を５０℃で１時間インキュベーシ
ョンし、ハイブリダイゼーション反応を行なわせた。ハ
イブリダイゼーション反応後、ＩＭＮａ（Ｊ　、　２０
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）および１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡでの２５ｖ／ｖ％ストレプトアビジンーアガロー
ス懸濁液２００μｇを加えた。
回転ミキサー中に１５分間３７℃でビオチン化分子とス
トレプトアビジン−アガロースとが結合するように放置
した。アガロースを短時間の遠心分離により集め、上澄
液を吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）により除去した。つ
いで、アガロースを前記緩衝化Ｉ　ＭＮａ　Ｃ１中で１
度および１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、　１５＋ｎＭクエン酸
ナトリウム（ｐＨ８）および０．２％ＳＤＳを含む溶液
中で２度３７℃で洗浄した。
なお、ビオチン化マーカーを含むＤＮＡハイブリッドに
対するハーベスト（ｈａｒｖｅｓｔ）および洗浄方法は
、たとえば英国特許出願公開第２１８９４０３号明細書
に記載されているような以前より知られている方法を用
いた。
各標的プラスミドｆｆｉ（ｍｏｌ）について、アガロー
スに結合した１、５および１５回のＤＮＡ合成サイクル
後のハイブリッド形成物中の３２Ｐ放射活性（バックグ
ラウンド以上のｃｐｍ）を放射活性カウンターでそれぞ
れ２回測定し、その平均値を求めた。その結果を第１表
に示す。
第１表より、高い標的核酸量が存在してさえいれば、Ｄ
ＮＡ合成の１サイクルで検出に充分な放射活性が組み込
まれていることがわかる。また、１５サイクル後には、
非常に低い標的量でも検出されうるのがわかる。
したがって、高い標的量およびＤＮＡ合成の１５サイク
ルというもので、用いる検出プライマーの量が制限され
る。
また、検出プライマーＰａおよびｐｂならびに選択的検
出プローブＳ１およびＳ２の標的核酸ＣＭＶ−ＤＮＡの
２本鎖ＡおよびＢ上における相対部位をＰａ５Ｐｂ、　
　Ｓ＋およびＳ２のそれぞれの塩基配列とともに第１図
に示す。
［以下余白］ 実施例２ （捕捉プローブを修飾されたプライマーとして用いたＣ
ＭＶ−ＤＮＡ　ｆ７）測定） この実施例においては、捕捉プローブがプライマーとし
て作用する。用いた試薬は、下記の例外を除いては実施
例１と同じものであった。
捕捉プライマーＰａおよびＰｂ　（第１図参照）の５°
末端を３２Ｐで標識する代わりに、ビオチン残基で修飾
した。この化学的修飾法は、コレット（ｃｈｏｌ　１ｅ
ｔ）およびカワシマ、ヌクレイツク・アシツズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
、１３．１５２９〜１５４１頁（１９８５）に記載され
ている既知の方法にしたがって行なった。また、２つの
選択的プローブＳ１およびＳ２　　（第１図参照）を、
このばあいには検出プローブとして作用するように５°
末端において３２Ｐで標識した。比活性は、それぞれ約
２　Ｘ　１０９　ｃｐｍ／μｇおよび約２．５×１０９
　ｃｐｍ／μｇであった。
実施例１に記載の反応混合液を組み立てて用いた。ただ
し、ビオチン化捕捉プライマーの添加量は、１０倍二重
すなわち反応混合液あたり２゜ｐｍｏｌずつであった。
実施例１の方法にしたがってＤＮＡ合成を１．５または
１５サイクル行なったのち、反応混合液を１００℃まで
加熱し、３２ｐ漂識化プローブＳ１およびＳ２をそれぞ
れ０．５ｐｍｏｌずつ加えた。実施例１と同じ条件下で
ハイブリダイゼーションを実施した。
そののち、実施例１と同様にハイブリッドをストレプト
アビジン−アガロース上で集め、洗浄し、　Ｐ活性をカ
ウントした。えられた結果を第１表と同様の記載にした
がって第２表に示す。
第２表より、実施例１と同様に高い標的量が存在してさ
えいれば、ＤＮＡ合成の１サイクルで検出に充分な放射
活性が組み込まれ、また非常に低い標的量でも１５サイ
クル後には検出されうろことがわかる。
また、捕捉プライマーＰａおよびｐｂならびに選択的検
出プローブＳ１およびＳ２の標的核酸ＣＭＶ−ＤＮＡの
２本鎖ＡおよびＢの相対部位ならびにこれらのそれぞれ
の塩基配列については、第１図に示すとおりである。
［以下余白］ 実施例３ （捕捉プローグを修飾されたプライマーとして用いた臨
床サンプルからのＣＭＶ−ＤＮＡの検出）この実施例で
は、臨床サンプルの研究における本発明のアッセイ法の
適用性が、ＣＭＶ感染にかかっている幼児（ｔｒ＋ｒａ
ｎｔ）の尿からのＣＭＶ　検出によって証明される。健
康な子供からの尿を対照として用いた。
試材はともに尿１０ｍ１であり、該尿よりヴイルタネン
（Ｖｌｒｔａｎｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・ミクロバイオロジー（Ｊ、ＣｌＩｎ。
旧ｃｒｏｂｉｏ１．）　、２０［６）、１０８３〜１０
８８頁（１９８４）の記載にしたがって総ＤＮＡを単離
した。精製水２０μΩに溶解したＤＮＡを反応における
標的とした以外は、実施例２の方法にしたがって反応を
行なった。
ＤＮＡ合成を１０サイクル行なったのち、標識化選択的
プローブを反応混合液に加え、ハイブリダイズを行なわ
せ、ハイブリッド形成物を集めた。患者の尿由来のＤＮ
Ａでは、えられたハイブリッド形成物において明らかな
放射活性の」二昇がみられたが、一方、健康者の尿由来
のＤＮＡでは、バックグラウンドとしての放射活性を示
すのみであった。実際のａｐｍ値はそれぞれ２４００と
２４０であった。
なお、捕捉プライマーＰａおよびｐｂならびに選択的検
出プローブＳ１およびＳ２の標的核酸ＣＭＶ−ＤＮＡの
２水路ＡおよびＢのトｌ対部位およびこれらのそれぞれ
の塩基配列については、第１図に示すとおりである。
実施例４ （捕捉プローブを修飾されたプライマーとして用いたセ
ミリキ・フォレスト・ウィルス（Ｓｅｍｌｌｉｋｉ　Ｆ
ｏｒｅｓｔ　ｖｉｒｕｓ、以下ＳＰＶという）ＤＮＡの
検出） この実施例は、本発明のアッセイ法がＲＮＡの検出にも
用いられうろことを証明するためのものである。用いた
モデルは、ＳＦＶ由来のＲＮＡであった。
用いた試薬は、実施例２の方法にしたがって調製した２
つの５°末端ビオチン化捕捉プライマー（Ｐａ（塩基配
列：　５−ＴＧＣＴＣＴ　ＧＧＣＡＴＴ　ＴＧＣＡＴＧ
）およびＰｂ　（塩基配列：　５−ＧＡＧ　ＧＣＴ　Ｇ
ＡＣＡＧＯＣＣＡＴＴＣ）　、第２図参照）、実施例１
の方法にしたがって調製した１つの５゛末端３２ｐ−標
識化選択的検出プローブ（Ｓ（塩基配列：　５−ＣＡＴ
　ＴＴＣＣＧＴＣＧＴ　ＴＣＧ　ＡＧＧ　ＴＧＧ　ＡＧ
Ｔ　ＣＡＴ　ＴＧＣ）　、第２図参照）、逆転写酵素（
プロメガ・バイオチック社製）およびフレノウ断片であ
るＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム比製
）であった。
５ＦＶ−１？ＮＡ検出の第１段階はｃＤＮＡのコピーを
合成することであった。反応混合液２０μｇ中には、１
０ＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）、５０ｍＭ
　ＫＣＩ、　ｔ。
ＩＩＩＭＭｇＣＱ２．１０ＩＩＩＭジチオスレイトール
、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸をそれぞれＯ，
’５ａ＋Ｍずつ、ｔ−ＲＮＡ　　Ｏ，５μｇ　５ＳＦＶ
−ＲＮＡ　ｔｏｐｇ、捕捉プライマーＰａ　１０ｐｍｏ
ｌおよび逆転写酵素１００Ｕが含まれていた。この反応
混合液を３７°Ｃで１５分間インキュベーションした。
そののち、混合液を１００℃まで５分間加熱し、周囲の
７３度まで冷却した。
そののち、ｉｏ［ＩＩＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，
４）、５０ｍＭＮａＣｆｆ１、ｌ０ｍＭＭｇＣｆｆ　２
　、ｌＯ＋ｎＭジチオスレイトール、捕捉プローブＰｂ
　ｌｏｐｍｏｌおよび４種のデオキシヌクレオシド三リ
ン酸をそれぞれ０．５ｍＭずつ含む溶液５０μｇを加え
た。温度を３７℃まで上昇させ、５分後にＤＮＡポリメ
ラーゼｌυを加えた。
さらに１０分間インキユメーションしたのち、反応混合
液を１００°Ｃで５分間インキュベーションし、３７℃
まで冷却し、ＤＮＡ合成を５サイクル行なった。
最終変性段階後、選択的検出プローブ０．１ｐｍｏｌ　
（１，２ｘ　１０６ｃｐｔＡ）を１ＭＮａｃ１．５０ｍ
ＭＥＤＴＡ、　５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５
）および０．１％ＳＤＳを含む溶液８０μｇに加えた。
溶液を５５℃で２時間インキュベーションしたのち、実
施例１の方法にしたがってハイブリッドを集め洗浄した
。
反応の陰性コントロールとして、逆転写酵素を加えない
以外は同じ処理を行なった同一の試料を用いた。
逆転写酵素によりＲＮＡがｃＤＮＡに変換された試料が
捕捉されたハイブリッドにおいて４２０ｃｐｍの３２Ｐ
活性を示したのに対し、陰性コントロールでは５０ｃｐ
ｍを示した。
なお、捕捉プライマーＰａおよびｐｂならびに選択的検
出プローブＳの標的核酸５ＦＶ−ＲＮＡの２水路Ａおよ
びＢ上における相対部位をＰａ、　ＰｂおよびＳのそれ
ぞれの塩基配列とともに第２図に示す。
実施例５ （増殖したＤＮＡ検出の種々のモードでの比較）この実
施例においては、増殖したＤＮＡ検出の３つの種々のモ
ードを比較した。
選択的捕捉プローブまたは選択的検出プローブとして、
プライマー間の約１００ヌクレオチドを認識する旧３ク
ローンを用いた以外は、試薬および増殖プロセスを、実
施例１および２の記載および方法にしたがって行なった
。
標準操作を用いて、組み換えプラスミド、すなわちｐＢ
Ｒ３２２／ＣＭＶ　ＨｌｎｄＩＩＩ　Ｌのｔｌａｅ　ｍ
制限断片をファージベクター旧３ｍｐｌＯにサブクロー
ニングし、Ｍ１３クローンをえた。
選択的捕捉プローブとして加えたＭＬ３クローンの修飾
は、フォトプローブビオチン（商品名、ベクター・ラボ
ラド１ノーズ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）社製）のビオチンを用いて行なった。
選択的検出プローブとして用いた０１３クローンの標識
は、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断片）およびプ
ライマー伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）　　（ヒユー（Ｈ
ｕ）およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、ジーン（
Ｇｅｎｅ）、１７、２７１〜２７７頁（１９８２）参照
）により、”２Ｐ−ｄＣＴＰの比活性が２　ｘ　ｔｏ’
　ｃｐｍ／μｇとなるまで行なった。
直線化組み換えプラスミド３ＸＬＯ５分子（０，５Ｘ１
０”−１８［１１０１）の増殖をＩＯサイクル行なった
。
なお、モード１および２における検出のためには、３２
Ｐ標識化検出プライマーＰａおよびｐｂをそれぞれ２　
ｐｍｏｌずつ用いて実施例１の方法にしたがう増殖プロ
セスを行なった。モード３における検出のためには、ビ
オチン化捕捉プライマー２５ｐｍｏｌを用いて実施例２
記載の方法にしたがう増殖プロセスを行なった。
つぎに検出モード１〜３について詳しく説明する。
検出モード１−標的核酸のコピーとのハイブリッド形成
物を溶液中で集めるた めの選択的捕捉プローブ 検出のこのモードにおいては、ビオチン化選択的旧３捕
捉プローブを増殖したＤＮＡ断片の捕集に用いた。
最終増殖サイクル後、増殖サンプルの反応混合液を１０
０℃まで加熱し、Ｏ，［ｉＭ　ＮａＣｆ、　５　ｍＭＥ
ＤＴＡ　、　２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）
および０．１％ＳＤＳとともにそれぞれのビオチン化選
択的捕捉プローブを２Ｘ１０９分子ずつ加え、容量を１
００μｇまで増した（なお、前記濃度は最終濃度を示す
）。
混合液を６５℃で２時間インキュベーションした。　１
５ｍＭＮａ（Ｊ　、　　１．５ａ＋Ｍクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ４８）および０．２％ＳＤＳとともに５０℃で
さらに１分間２回洗浄した以外は、実施例１の方法にし
たがってストレプトアビジン−アガロース上で形成され
たハイブリッドを集めた。集めたハイブリッドの放射活
性（ｃｐｍ）を３回測定し、その平均値を求めた。
検出モード２−標的核酸のコピーとのハイブリダイゼー
ション前に固定化した 選択的捕捉プローブ このばあいには、増殖したＤＮＡを捕捉するために固定
化選択的Ｍ１３プローブを用いた。
増殖の最終サイクル後に、増殖サンプルの反応混合液を
１００℃まで加熱した。０．６Ｍ　ＮａＣｆ。
（ｉ０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ８）、０．０２％
フィコール（Ｐｉｃｏｌｌ、商品名、ファルマシア社製
）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血
清アルブミンおよび０．２ｍｇ／ｍｌ変性へリング精子
（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｈｅｒｒｌｎｇｓｐｅｒｍ）Ｄ
ＮＡ　（ベーリンガー・マンハイム社製など）を加え、
最終容量を１００μβとした（なお、前記濃度は最終濃
度を示す）。
すでに記載の方法（米国特許第４４８８５３９号明細書
参照）にしたがって、それぞれの選択的プローブが５ｘ
ｔｏｌｏ分子ずつ固定化しているニトロセルロースフィ
ルターディスクに、それぞれの試料を加えた。反応混合
液をフィルターとともに６５℃で２または１８時間イン
キュベーションし、ハイブリダイゼーションを行なわせ
た。
ハイブリダイゼーション反応後、フィルターを１５ｍＭ
Ｎａ（Ｊ　、　　１．５ａ＋Ｍクエン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ８）および０，２％ＳＤＳを含む溶液数ｍｌで２回５
０℃で２０分間洗浄し、フィルターと結合したハイブリ
ッドの放射活性（ｃｐｍ）を３回ｆｌｌ１１定し、その
平均値を求めた。
検出モード３−検出用選択的検出プローブここでは、３
２ｐ標識化選択的Ｍ１３検出プローブを増殖したＤＮＡ
の検出に用い、５′末端がビオチン化された捕捉プライ
マーを用いて実施例２の方法にしたがってハイブリッド
を集めた。
増殖サンプルの反応混合液を　１００°Ｃまで加熱し、
モード１記載の塩類とともにそれぞれの３２ｐ標識化選
択的プローブを２　Ｘ　１０８分子（２ｘ　１０’　ｃ
ｐＩＩＩ）ずつ加えた。
ハイブリダイゼーションおよびハイブリッド形成物の捕
集をモード１の方法にしたがって行なった。集めたハイ
ブリッドの放射活性（ｃｐｍ）を３回測定し、その平均
値を求めた。
前記検出の３つのモードによりえられた結果を第３表に
示す。
第３表より、モード２におけるフィルターハイブリダイ
ゼーションと比べて、モードｌおよび３における溶液中
でのハイブリダイゼーションの方がより速く行なわれる
という利点を有していることがわかる。
また、選択的検出プローブが１分子あたり多数の３２２
原子を含んでいるために、最も高い３２ｐ活性がモード
３よりえられることがわかる。
このように、検出プライマーよりも選択的検出プローブ
の方へより多くの標識が導入されうるため、モード３の
検出を用いるアッセイ法が本発明のアッセイ法における
最も好ましい実施態様であるといえる。
ｒ以下余白〕 実施例６　（ビオチン化検出プライマーにょるＣＭＶ−
ＤＮＡの増殖およびストレプトアビジー西洋ワサビ（ｈ
ｏｒｓｃｒａｄ　ｌ５ｈ）パーオキシダーゼを用いた間
接的検出） この実施例では、組み換えプラスミドであるＣＭＶ特異
的プラスミド（ＰＢＲ３２２／ＣＭＶ　ＨｆｎｄｍＬ）
の増殖を、検出プライマーとして実施例２記載のビオチ
ン化プライマーＰａおよびｐｂを用いて行なった。
スルホン基で修飾された実施例５記載の旧３クローンを
選択的捕捉プローブとして用いた。
形成されたハイブリッドを、スルホン修飾化Ｄ　Ｎ　Ａ
を認識する抗体でコートしたマイクロタイトレージョン
ウェル（ｍｉｃｒｏｔＨｒａｔｌｏｎ　ｗｅｌｌ）中で
集めた。
プライマーのビオチン部分を検出するストレプトアビジ
ン−西洋ワサビパーオキシダーゼ複合体（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ、アメルシャム（Ａｍｃｒｓｈａｍ）社製、英国
（ＵＫ））を用いて形成されたハイブリッドの最終検出
を行なった。
さらに詳しくは、まずオルゲニクス・リミテッド（Ｏｒ
ｇｃｎｌｃｓ　Ｌｔｄｓヤブネ（Ｙａｖｎｅ）、イスラ
エル国）から入手した試薬および推奨の方法を用いてス
ルホン化（５ｕｌｆ’ｏｎａｔｉｏｎ）反応によりＭ１
３クローンを修飾し７こ。
別に、ポリスチレンマイクロタイトレージョンウェル（
ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製、デンマーク）をスルホン修飾
化ＤＮＡ　　（オルゲニクス・リミテッド社製）に対す
るモノクローナル抗体がら精製したＩｇＧ　１０ｐｇ／
ｍｌを含むｉｏ［１１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９
，８）で４℃−晩かけてコートした。
つぎに直線化組み換えプラスミド３Ｘ１０５分子（０，
５Ｘ　１０”’　ｍｏ＋　）を含むかまたは対照として
該プラスミドを含まない反応混合液ならびにビオチン化
プライマーＰａおよびｐｂそれぞれを２５ｐｍＯ１ずつ
、実施例１記載の条件下でＤＮＡ合成の１０増殖サイク
ルに供した。増殖サンプルの反応混合液を１００℃まで
加熱したのち、実施例５において検出モード１用に特定
された試薬とともにスルホン化選択的捕捉プローブをそ
れぞれ２Ｘ１０９分子ずつ加えた。
反応混合液を６５°Ｃで２時間インキュベーションし、
ハイブリダイゼーションを行なった。そののち、０．２
％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０１００μｌ）で希釈し
、前記コートされたマイクロタイトレージョンウェルへ
、トランスファー（ｔ　ｒａｎｓ　ｆ’ｅｒ）した。ハ
イブリッドとウェルとの結合を３７°Ｃで２時間行なっ
た。
反応混合液を捨て、ウェルを０．１％Ｔνｅｅｎ２０を
含む０．１５ＭＮａＣ１＋　２０ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７，５）　（以下、ＰＢＳという）で３回洗浄し
た。
１％牛血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで２０００分の１に希釈したストレプトアビジン
−西洋ワサビパーオキシダーゼ複合体２００μｇを加え
、ウェルを３７℃で４５分間インキュベーションした。
前記と同様の洗浄を４回行なったのち、０−フェニレン
−ジアミン０．４６　ｍｇ　／　ｍｌおよび０．０１％
Ｈ２Ｏ２を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋
５．０）からなる基質溶液２００μｇを加えた。２２°
Ｃで１５分間インキュベーションしたのち、２ＮＨ２Ｓ
Ｏ４５０ｐｇで反応を停止し、色味を帯びた生成物の４
９２ｒ＋ｍにおける吸光度を吸光度計（ｓｐｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。
捕集および検出方法については、すでにシベーネン（Ｓ
ｙｖＭｎｅｎ）らにより記載されている（ヌクレイツク
・アシッズ・リサーチ、１４．５０３７〜５０４８頁（
１９８Ｂ）参照）。えられた結果を第４表に示す。
第４表より、標的プラスミド０．５Ｘ　１０””１８Ｉ
Ｉｌｏ１がＤＮＡ合成のＩＯプサイルの増殖後に明瞭に
検出されているのがイつかる。
第　　４　　表 ＊１：アッセイ（３回）の平均値 ［発明の効果］ 修飾された検出または捕捉プライマーおよび選択的捕捉
または検出プローブを用いたハイブリダイゼーションに
もとづいた本発明のアッセイ法によれば、サンプル中の
標的核酸を迅速かつ簡便に検出し、また、高感度である
ために、サンプル中の標的核酸量が非常に微量なばあい
でも、容易に該標的核酸を検出しうるという効果を奏す
る。
さらに、本発明の試薬およびキットは、核酸のアッセイ
法の実施を容易ならしめるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１．２および３で用いた修飾されたプラ
イマー（ＰａとＰｂ）および選択的プローブ（Ｓ＋　と
Ｓｚ　）の検出すべき標的核酸上における相対部位（上
段）ならびに該修飾されたプライマーおよび該選択的プ
ローブそれぞれの塩基配列（下段）である。ラインＡお
よびＢは両方向に続く２本の標的核酸鎖を示す。プライ
マー（ＰａとＰｂ）上の矢印は重合プロセスにおける伸
長方向を示す。 第２図は実施例４で用いた修飾されたプライマー（Ｐａ
とＰｂ）および選択的プローブ（Ｓ）の検出すべき標的
核酸上における相対部位（」二段）ならびに該修飾され
たプライマーおよび該選択的プローブそれぞれの塩基配
列（下段）である。 ラインＡはＩ？ＮＡまたはその同一のＤＮＡコピーを示
し、ラインＢは相補的ＤＮＡコピーを示す。プライマー
（ＰａとＰｂ）上の矢印は重合プロセスにおける伸長方
向を示す。 第１　図 Ｂ３・５・ 第２叢

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １　捕捉プローブが標的核酸のコピーに組み込まれる修
    飾されたプライマーとして作用し、ついで、該標的核酸
    の存在が少なくとも１つの選択的な検出プローブによっ
    て検出されることを特徴とするハイブリダイゼーション
    による核酸のアッセイ法。 ２　（ａ）標的核酸の少なくとも１つのプライマーに親
    和性ペアの少なくとも１つの部分または親和性ペアの少
    なくとも１つの部分が付着されうる少なくとも１つの特
    定部位を与え； （ｂ）えられた捕捉プライマーまたはプライマー類と１
    本鎖の標的核酸とを鋳型依存性重合反応に適した条件下
    で反応させ； （ｃ）該捕捉プライマーが組み込まれている標的核酸の
    １本鎖のコピーと、該標的核酸と選択的にハイブリダイ
    ズしうる検出プローブとをハイブリダイゼーション反応
    に適した条件下でハイブリダイズさせ； （ｄ）該捕捉プライマーが組み込まれている標的核酸の
    コピーを親和性ペアの他の部分によって分離し； （ｅ）該標的核酸のコピーとハイブリダイズしている選
    択的検出プローブの存在を検出することを特徴とする請
    求項１記載のアッセイ法。 ３　修飾されたプライマーが組み込まれている標的核酸
    のコピーが少なくとも１つの選択的捕捉プローブでハイ
    ブリダイズされ、ついで、ハイブリッド形成物が該選択
    的捕捉プローブによって分離されたのち、該ハイブリッ
    ドの存在が検出されることを特徴とする検出プローブが
    標的核酸のコピーに組み込まれる修飾されたプライマー
    として作用するハイブリダイゼーションによる核酸のア
    ッセイ法。 ４　（ａ）標的核酸の少なくとも１つのプライマーに少
    なくとも１つの検出されうる標識または少なくとも１つ
    の検出されうる標識が付着されうる少なくとも１つの特
    定部位を与え； （ｂ）えられた検出プライマーまたはプライマー類と１
    本鎖の標的核酸とを鋳型依存性重合反応に適した条件下
    で反応させ； （ｃ）該検出プライマーが組み込まれている標的核酸の
    １本鎖のコピーと、該標的核酸と選択的にハイブリダイ
    ズしうる捕捉プローブとをハイブリダイゼーション反応
    に適した条件下でハンブリダイズさせ； （ｄ）該検出プライマーが組み込まれている標的核酸の
    コピーを選択的捕捉プローブによって分離し； （ｅ）該標的核酸のコピーの存在を検出することを特徴
    とする請求項３記載のアッセイ法。 ５　選択的検出プローブに少なくとも１つの検出されう
    る標識または少なくとも１つの検出されうる標識が付着
    されうる少なくとも１つの特定部位が備わっていること
    を特徴とする請求項１または２記載のアッセイ法。 ６　選択的捕捉プローブに親和性ペアの少なくとも１つ
    の部分または親和性ペアの少なくとも１つの部分が付着
    されうる少なくとも１つの特定部位が備わっていること
    を特徴とする請求項３または４記載のアッセイ法。 ７　（ａ）少なくとも１つの検出されうる標識または少
    なくとも１つの検出されうる標識が付着されうる少なく
    とも１つの特定部位を備えた、標的核酸の少なくとも１
    つの修飾されたプライマー；および （ｂ）親和性ペアの少なくとも１つの部分または親和性
    ペアの少なくとも１つの部分が付着されうる少なくとも
    １つの特定部位を備えた、標的核酸と選択的にハイブリ
    ダイズしうる少なくとも１つの捕捉プローブからなるこ
    とを特徴とする核酸のアッセイに用いる試薬。 ８　（ａ）親和性ペアの少なくとも１つの部分または親
    和性ペアの少なくとも１つの部分が付着されうる少なく
    とも１つの特定部位を備えた、標的核酸の少なくとも１
    つの修飾されたプライマー；および （ｂ）少なくとも１つの検出されうる標識または少なく
    とも１つの検出されうる標識が付着されうる少なくとも
    １つの特定部位を備えた、標的核酸と選択的にハイブリ
    ダイズしうる少なくとも１つの検出プローブからなるこ
    とを特徴とする核酸のアッセイに用いる試薬。 ９　（ａ）少なくとも１つの検出されうる標識または少
    なくとも１つの検出されうる標識が付着されうる少なく
    とも１つの特定部位を備えた、標的核酸の少なくとも１
    つの修飾されたプライマー；および （ｂ）親和性ペアの少なくとも１つの部分または親和性
    ペアの少なくとも１つの部分が付着されうる少なくとも
    １つの特定部位を備えた、標的核酸と選択的にハイブリ
    ダイズしうる少なくとも１つの捕捉プローブを有するマ
    ルチコンテナーユニットからなりパッケージされた形態
    にあることを特徴とする核酸のアッセイに用いるキット
    。 １０　少なくとも１つの鋳型依存性重合剤を有するコン
    テナーを含んでなる請求項９記載のキット。 １１　４種のデオキシヌクレオシド三リン酸を有するコ
    ンテナーを含んでなる請求項９または１０記載のキット
    。 １２　重合およびハイブリダイゼーションプロセスに用
    いるファシリティーを含んでなる請求項９、１０または
    １１記載のキット。 １３　標的核酸のコピーの分離に用いるファシリティー
    を含んでなる請求項９、１０、１１または１２記載のキ
    ット。 １４　標識のアッセイに用いるファシリティーを含んで
    なる請求項９、１０、１１、１２または１３記載のキッ
    ト。 １５　（ａ）親和性ペアの少なくとも１つの部分または
    親和性ペアの少なくとも１つの部分が付着されうる少な
    くとも１つの特定部位を備えた、標的核酸の少なくとも
    １つの修飾されたプライマー；および （ｂ）少なくとも１つの検出されうる標識または少なく
    とも１つの検出されうる標識が付着されうる少なくとも
    １つの特定部位を備えた、標的核酸と選択的にハイブリ
    ダイズしうる少なくとも１つの検出プローブを有するマ
    ルチコンテナーユニットからなりパッケージされた形態
    にあることを特徴とする核酸のアッセイに用いるキット
    。 １６　少なくとも１つの鋳型依存性重合剤を有するコン
    テナーを含んでなる請求項１５記載のキット。 １７　４種のデオキシヌクレオシド三リン酸を有するコ
    ンテナーを含んでなる請求項１５または１６記載のキッ
    ト。 １８　重合およびハイブリダイゼーションプロセスに用
    いるファシリティーを含んでなる請求項１５、１６また
    は１７記載のキット。 １９　標的核酸のコピーの分離に用いるファシリティー
    を含んでなる請求項１５、１６、１７または１８記載の
    キット。 ２０　標識のアッセイに用いるファシリティーを含んで
    なる請求項１５、１６、１７、１８または１９記載のキ
    ット。
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