SE500262C2 - Ett förbättrat sätt för analys av nukleinsyror, en reagenskombination och en utrustning därför - Google Patents

Ett förbättrat sätt för analys av nukleinsyror, en reagenskombination och en utrustning därför

Info

Publication number
SE500262C2
SE500262C2 SE8800864A SE8800864A SE500262C2 SE 500262 C2 SE500262 C2 SE 500262C2 SE 8800864 A SE8800864 A SE 8800864A SE 8800864 A SE8800864 A SE 8800864A SE 500262 C2 SE500262 C2 SE 500262C2
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
primers
detector
copies
Prior art date
Application number
SE8800864A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8800864L (sv
SE8800864D0 (sv
Inventor
Hans Soederlund
Arja Weckman
Original Assignee
Orion Yhtymae Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Orion Yhtymae Oy filed Critical Orion Yhtymae Oy
Publication of SE8800864D0 publication Critical patent/SE8800864D0/sv
Publication of SE8800864L publication Critical patent/SE8800864L/sv
Publication of SE500262C2 publication Critical patent/SE500262C2/sv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

CD CD l\') (.1\ hö samma lösningsfas användes i denna metod. Detektorproben är märkt med en detekterbar markör och till infångningsproben är en del med affinitet till en annan komponent fästad.
Efter hybridiseringen kan den hybrid som bildats mellan in- fângningsproben, målnukleinsyran och detektorproben separeras från hybridiseringslösningen med hjälp av den andra delen av affinitetsparet.
Den enzymkatalyserade polymerisationen av DNA där nukleo- tidsekvensen av en tidigare existerande nukleinsyrasträng, dvs. mallen, exakt kopieras till dess komplementära sträng, är välkänd inom tekniken och har beskrivits t.ex. i Kornberg, DNA replication, W.H. Freeman & Co, San Francisco, p. 221- 225 och 670-679, 1980 och Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 122, 1982. Denna biologiska multiplikation användes vid hybridi- seringsana1yser,vari mikroben som skall detekteras odlas så att dess DNA berikas innan testet, och be- skrives t.ex. i Woo, Methods Enzymol. 68, p. 389, 1979 och i US-patentet nr. 4 358 535. Specifika DNA-sekvenser kan även amplifieras inuti levande celler, t.ex. genom använd- ning av lämpliga läkemedel såsom beskrivits av Clewall och Helinski i J. Bacteriol. 110, p. 1135, 1972 och i europeiska patentansökan nr. 55 742. En mera specifik DNA-berikning be- skrives i den europeiska patentansökan nr. 175 689, vari målet är förbundet till en plasmidreplikon och introduceras i en lämplig cell. Ännu en annan metod beskrives i europei- ska patentansökan nr. 201 184, vari primerberoendet av DNA- syntes användes för att skapa en in vitro-reaktion för amplifieringen av mål-DNAtt. I den europeiska patentansökan nr. 200 362 föreslås ett sätt för detektering av amplifierade gener.
Sammanställning av uppfinningen I hybridiseringsmetoden enligt föreliggande uppfinning agerar antingen detektorproberna eller infångningsproberna som modifierade primers,som införlivas i kopiorna av mâlnuklein- syran i ett mallberoende polymerisationsförfarande innan Qfi CD CD 7.67. hybridiseringsrekationen.
Vid metoden enligt uppfinningen erfordras minst en primer och primerna modifieras alltid. Om detektorproberna agerar som primers i polymerisationsreaktionen, förses primerna med minst en lämplig detekterbar markör och minst ett speci- fikt site till vilket minst en lämplig detekterbar markör kan fästas.
Alternativt kan infångningsproberna användas som primers vid polymerisationsreaktionen, varvid primerna förses med minst en lämplig del av ett affinitetspar eller minst ett site till vilket minst en lämplig del av ett affini- tetspar kan fästas.
Uppfinningen avser även en reagenskombination och en utrust- ning innefattande i förpackad form en multibehållarenhet innefattande den reagenskombination som erfordras för att genomföra testet.
Genom användning av detektor- eller infångningsproberna som primers i en polymerisationsreaktion, är det möjligt att öka hybridiseringsreaktionens sensitivitet i storleksord- ningen flera gånger jämfört med metoder som direkt mäter målet. Dessutom tillhandahåller uppfinningen ett lämpligt sätt att genomföra hybridiseringsreaktionen i lösning,så att hyb- riderna lätt och snabbt avskiljes från hybridiseringslös- ningen efter hybridiseringsreaktionen.
Sättet enligt uppfinningen är lämpligt för diagnos av vissa sjukdomar som är svåra att diagnostisera enligt konventionella metoder. Metoden är således speciellt användbar för identi- fiering av cytomegalovirus och HI- eller AIDS-virus.
Kort beskrivning av ritningarna Fig. l åskådliggör bassekvensen av modifierade primers, Pa och Pb, användes i exemplen l, 2 och 3, liksom de relativa sitena liksom de selektiva proberna, S1 och S2, som (Ü CÛ C: “Û Cm hl av modifierade primers, Pa och Pb, och de selektiva proberna, S1 och S2, och B, indikerar de två målsträngarna som fortsätter i båda på målnukleinsyran ifråga. De långa linjerna, A riktningarna. Pilhuvudena på primerna, Pa och Pb, indikerar den riktning i vilken de förlängs i polymerisationsprocessen.
Pig. 2 representerar bassekvensen av modifierade primers, Pa och Pb, liksom de relativa sitena av modifierade primers, Pa och Pb, och den selektiva proben S använd i exempel 4, och den selektiva proben S på målnukleinsyran ifråga. Linje A indikerar RNA och dess identiska DNA-kopior och linje B visar dekomplementära DNA-kopiorna. Pilhuvudena på primerna Pa och Pb indikerar den riktning i vilken de förlängs i polymerisationsförfarandet.
Detaljerad beskrivning av uppfinningen Framställning av analysmaterial Proberna använda i metoden är oligo- eller polynukleotider.
Proberna kan framställas syntetiskt eller halvsyntetiskt, vilket utgör de föredragna sätten att preparera prober, vilka även kommer att agera som primers. Det är även helt möjligt att framställa proberna genom rekombinant-tekniker, eller från nukleinsyror isolerade direkt från naturen. En prob kan bindas till en lämplig vektor. Den kan innehålla vektordelar eller vara fullständigt i avsaknad av vektordelar.
De facto är en mångfald lämpliga primers och prober, som kan användas, kommersiellt tillgängliga.
Detektorproberna som modifierade primers Enligt en metod enligt föreliggande uppfinning är detektor- proberna oligonukleotider eller polynukleotider, som kan bindas till målnukleinsyran genom basparning och som kan agera som primers för ett mallberoende nukleinsyrasynte- tiseringsenzym. Det är väsentligt att detektorprimers till- handahålles med minst en lämplig detekterbar markör eller minst ett specifikt site till vilket minst en lämplig detek- terbar markör kan fästas. 500 262 Olika radioaktiva isotoper eller radioaktivt märkta före- ningar kan användas som markörer. Markörsubstansen kan allt- så vara fluorescerande, luminescerande, ljusemitterande, enzymatiskt eller immunologiskt påvisbar, etc. Markörer base- rade på affiniteten av biotin och avidin eller streptavidin, lantanidkelater, ferritin och hemföreningar och immunologiskt demonstrerbara haptener såsom AAF och AIF (acetoxiacetyl- fluorenderivat) kan nämnas som exempel. Identifiering med hjälp av mediatorer, exempelvis proteiner, är även möjlig.
Metoden enligt uppfinningen är inte beroende av den använda markören. Alla för närvarande kända markörsubstanser lämp- liga för nukleinsyrahybridisering kan fritt appliceras på metoden. Det är emellertid essentiellt att om detektorprober- na agerar som primers väljes markören ur en grupp av markö- rer som inte stör funktionen av primern. Markören måste fästas till detektorprimern på så sätt att nukleinsyrapoly- merisationsenzymet fortfarande kan känna igen det som en primer.
Infångningsproberna som modifierade primers _ Enligt den andra metoden enligt föreliggande uppfinning är infångningsproberna oligonukleotider eller polynukleo- tider som kan bindas till mâlnukleinsyran genom basparning och som kan agera som primers för ett mallberoende nuklein- syrasyntetiseringsenzym. Det är väsentligt att infångnings- primers tillhandahålles med minst en lämplig del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site till vilket minst en lämplig del av ett affinitetspar kan fästas.
Det är även möjligt att _fästa delen eller delarna av affinitetsparet genom en mediator till infångningsprimern.
De enda betingelserna är att det ska vara möjligt att separera hybriden från hybridiseringslösningen med hjälp av affini- tetsparet och att primerfunktionen inte störes.
En del av ett affinitetspar är en komponent med affinitet till en annan komponent. Exempelvis biotin - avidin eller strept- avidin, ett tungmetallderivat - en tiogrupp, olika homopoly- (11 CD (I. f 'J O\ fx. nukleotider såsom poly dG - poly dC, poly dA - poly dT, och poly dA - poly U, är sådana affinitetspar. Men även andra komponentpar kan användas förutsatt att de har en tillräckligt stark affinitet för att tillåta specifik bindning av modifie- rade infångningsprimers som införlivas i kopior av målnuklein- syran till den fasta bäraren. Lämpliga affinitetspar finnes bland ligander aflxkonjugat använda i immunologiska metoder.
Den selektiva infångningsproben Enligt en av metoderna enligt föreliggande uppfinning,vari detektorproberna agerar som primers,erfordras en selektiv infångningsprob för att möjliggöra selektiv separation av kopiorna av målnukleinsyran vari modifierade primers har införlivats. Det är väsentligt att infångningsproberna är tillräckligt homologa till målnukleinsyran för att möjlig- göra att de specifikt hybridiserar med kopior av målnuklein- syran, varigenom selektiv separation och detektion av detek- torprimers införlivade i kopior av målnukleinsvran möjliguöres Den selektiva detektorproben Enligt den andra metoden enligt föreliggande uppfinning, vari infångningsproberna agerar som modifierade primers, erford- ras en selektiv detektorprob för att möjliggöra detektionen av kopiorna av målnukleinsyrorna vari modifierade primers har införlivats. Det är väsentligt att detektorproben är _tillräckligt homolog till mâlnukleinsyran för att specifikt hybridisera och därigenom selektivt identifiera mâlnuklein- syran. Detektorproberna kan tillhandahållas med vilka lämp- liga detekterbara markörer som helst, exempelvis de ovan- nämnda.
Reagenskombinationer Detektorproben som en modifierad primer Föreliggande uppfinning hänför sig till en reagenskombination innefattande minst en modifierad primer, försedd med minst en detekterbar markör eller minst ett specifikt site till vilket minst en lämplig detekterbar markör kan fästas och minst en selektiv infångningsprob försedd med minst en del (F 4D CD M3 Ib I av ett affinitetspar och minst ett specifikt site vartill minst en grupp av ett affinitetspar kan fä5;a5_r Infångningsproben som modifierad primer Föreliggande uppfinning hänför sig också till en reagens- kombination innefattande minst en modifierad primer försedd med minst en lämplig del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site till vilket minst en lämplig del av ett affinitetspar kan fästas och minst en selektiv detektor- prob försedd med minst en lämplig detekterbar markör eller minst ett specifikt site till vilket minst en lämplig detek- terbar markör kan fästas.
Utrustning Föreliggande uppfinning innefattar även en lämplig utrustning för analys av nukleinsyror. Utrustningen innefattar i för- packad form en multibehållarenhet i vilken en av de ovan- nämnda reagenskombinationerna kombineras med minst en av följande reaktanter eller hjälpmedel erfordrade i testet, ÖVS- eventuellt en behållare innefattande minst ett mall- beroende polymerisationsmedel, eventuellt en behållare med de fyra deoxinukleosidtrifosfaterna, eventuellt en lämplig hjälpanordning för polymerisations- och hybridiseringsför- farandet, eventuellt en lämplig hjälpanordning för separation av kopiorna av målnukleinsyrorna och eventuellt en lämplig hjälpanordning för analys av markören. De föredragna hjälp- anordningarna och reaktanterna beskrives mera detaljerat i följande beskrivningsdel.
Sättet enligt uppfinningen Det föredragna sättet enligt föreliggande uppfinning utgår från tillsats av minst två modifierade primers, varvid båda primerna antingen är detektor- eller infångningsprimers, till en denaturerad provlösning. Dessa modifierade primers binder till de komplementära strängarna av målnukleinsyran, dvs. mallen, och vid tillsats av ett mallberoende nukleinsyrasyntetiseringsenzym förlängs dessa primers. Förfarandet fortgår effektivt in vitro och skapar 07 CD CD 53 CA I\ nya nukleinsyrasträngar som kan vara flera tusen baser långa förutsatt att betingelserna är lämpliga. Med användning av ett överskott av modifierade primers kan förfarandet upprepas för att skapa komplementära kopior av de nysyntetiserade strängarna, vilka således är identiska kopior till den första mallen, Genom att upprepa detta förfarande initieras en kaskadreaktion varigenom mâlnukleinsyran multipliceras.
Förfarandet kan upprepas så många gånger som önskas för att få den önskade detektionssensitiviteten. I de fall där kon- centrationen av målnukelinsyran inte är extremt låg är en multiplikation tillräcklig för att göra mâlnukleinsyran detekterbar.
Det är även möjligt att använda endast en modifierad primer i metoden enligt uppfinningen. I detta fall är emellertid multiplikationen inte så effektiv som vid användning av minst två primers på grund av att reaktionen inte blir av kaskad- typ.
Både DNA och RNA kan bestämmas enligt metoden enligt före- liggande uppfinning. Om emellertid mâlnukleinsyran är RNA är det mest lämpligt att först kopiera RNA till motsvarande cDNA genom omvänt transkriptasenzym, varefter förfarandet fortsättes såsom beskrivits ovan.
När dessa modifierade primers har införlivats i kopiorna av målnukleinsyrorna känner en lämplig selektiv prob igen mâl- sekvensen och dess kopior sättes till reaktionsblandningen och hybridiseringsreaktionen sker under betingelser lämpliga för det Valda hybridiseringsförfarandet.
I hybridiseringsreaktionen får beroende på valet av modifie- rade primers, antingen en selektiv infångningsprob eller en selektiv detektorprob hybridisera med kopior av målnuklein- syran som nu är närvarande i mângfaldiga mängder jämfört med mängden av mâlnukleinsyran vid ursprungsläget.
Om det ursprungliga provet innehöll målsekvensen,kommer den tillsatta selektiva proben att hybridisera till ny- syntetiserade kopior av målnukleinsyran. En hybrid bildas mellan kopiemolekylen vari den modifierade primern har in- förlivats,och den selektiva proben. De bildade hybriderna separeras enligt föreliggande uppfinning lämpligen från hyb- ridiseringslösningen med hjälp av en del av affinitetsparet, vilket är fästat antingen på infångningsprimern eller på den selektiva infångningsproben. Under fraktionering fäster dessa infângningsdel-innehållande hybrider till en fast bärare med hjälp av den andra delen av affinitetsparet och mängden selektiv detektorprob eller detektorprimer som fäster till bäraren kan mätas enligt konventionella metoder direkt från bäraren, eller efter eluering från eluatet. Mängden markör är ett mått på mängden av målnukleinsyran.
Innan fraktionering utspädes lösningen, om så erfordras, för att göra betingelserna fördelaktiga för affinitetsparet_ Därefter bringas lösningen i kontakt med den fasta bäraren.
Ifrågavarande bärare kan exempelvis var en affinitetskromato- grafikolonn, ett filter, en plastyta eller en glasyta. Lämp- liga hjälpanordningar för att genomföra separationen är olika typer av mikrotiterplattor, doppsticksystem eller magnetiska partiklar, men det är även möjligt att genomföra separationen i PIOVIÖI och på kulor, etc.
Bärarmaterialet i affinitetskolonnen kanvara naturliga eller syntetiska polymerer, exempelvis cellulosa, polyakrylamid, poly- styren, dextran eller agaros. Dessa material kan även användas som suspensioner i ett provrör. Det är även fördelaktigt att använda provrör med den andra delen av ett affinitetspar fixerad till dess inre yta. Det är en förutsättning för det valda materialet att det skall kunna fixeras till en komponent med affinitet till gruppen av ett affinitetspar som är fästat till infångningsprimern eller den selektiva infångningsproben.
U 1 C.) CD IO O \ I\S 10 Det är inte nödvändigt att fästa delen eller delarna av affinitetsparet till infångningsprimern vid början av polymerisationen. Det är inte heller nödvändigt att fästa detektormarkören på detektorprimern före polymerisationen.
Dessa kan även tillsättas efter polymerisationsförfanandet till den modifierade primern, som har införlivats i kopiorna av målnukleinsyran. När exempelvis den detekterbara markören är känslig för hybridiseringsbetingelserna,kan den till- sättas först efter hybridiseringen av den selektiva infång- ningsproben med kopiorna av målnukleinsyran.
Om detektorproberna agerar som modifierade primers som in- förlivats i kopiorna av målnukleinsyran, kan hybriden sepa- reras från reaktionsblandningen med hjälp av selektiva in- fångningsprober immobiliserade på fasta bärare. Enligt denna metod, vilken även beskrivits i den europeiska patentansökan nr. 237362, i vilken det hastighetsbegränsande steget skapas när målnukelinsyran och dess kopior, vari detektorprimern har införlivats, måste hybridisera med den selektiva infång- ningsproben som immobiliserats på en fast bärare. Därför är hybridisering i lösning en mera föredragen metod enligt uppfinningen än denna. Emellertid genomföras metoden med använding av en immobiliserad infångningsprob, varvid hybriden bildad på den fasta bäraren tvättas och mängden av markören på bäraren mätes enligt konventionella metoder.
Principerna i testet demonstreras i följande exempel, Exempel l Detektion av cytomegalovirus DNA med användning av detektor- prober som modifierade primers.
I detta modellförsök var målet en rekombinantplasmid (pBR322/ CMV HindIII L) som härbärgerar ett 12,3 kb fragment av cyto- megalovirus (CMV, AD l69, ATCC VR-538) genomet. De två detek- torprimers (Pa, Pb, Fig. l) som användes var 20 nukleotider långa och syntetiserades genom standardmetoder på en automa- tiserad syntetiseringsanordning. De motsvarar två regioner 500 262 ll på den CMV-specifika insertionen, vilka var lll nukleotider ifrån varandra. Två selektiva infångningsprober (S1, S2, Figf 1) kände igen områden på var och en av de två strängarna mellan dessa två detektorprimers. Dessa detektorprimers Pa och Pb märktes med 32P vid deras 5'-ändar till en specifik aktivitet av 4 x 109 cpm¿ug med användning av den välkända reaktionen med polynukleotidkinas och gamma-32P-ATP (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Biotinylerade nukleotider sattes till 3'-ändarna av infång- ningsproberna med användning av bio ll-dUTP (BRL) och termi- nal transferas (Promega Biotech.) såsom beskrivits av Riley et al., DNA, 5 (4), p. 333-337, 1986. Målplasmiden gjordes linjär genom spjälkning med restriktionsenzymet EcoRI. DNA-polymeras, Klenow-fragment tillhandahölls från Boehringer-Mannheim och streptavidin-agaros från BRL.
Med användning av dessa reagens genomfördes följande försök.
Fyra olika reaktioner sammanställdes innehållande 0, 104,_l8 106 resp. 108 molekyler (motsvarande 0, 2 x 10-20, 2 x 10 , resp. 2 x 10-16 mol) av målplasmiden. Samtliga fyra reaktioner hade dessutom en total volym av 50Ipl: 2 pmol vardera av de två primerna,0,5 mM av vardera av de fyra deoxinukleosid- trifosfaterna (dvs. dATP, dCTP, dGTP och dTTP), 10 mm Tris- Cl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl och 10 mM ditiotreitol.
Blandningen upphettades till 100oC i 2 minuter, inkuberades därefter i 5 minuter vid 37°C varefter l,ul (motsvarande 1 enhet) DNA-polymeras tillsattes. Därefter inkuberades bland- ningen åter i 10 minuter vid 37OC. Kokning följt av bindning av detektorprimers och en inkubation av tillsatt DNA-polymeras vid 37OC utgör en DNA-syntetiserings- cykel.
I detta försök genomfördes cykeln antingen endast en gång eller upprepades 5 eller 15 gånger. Efter den sista cykeln upphettades provet åter till 100oC, varefter 10 pmol av den U » CD CD NJ C3\ RJ 12 selektiva infångningsproben tillsattes tillsammans med Nacl (0,9 M), EDTA (20 mm) , natriumfosfat (pH 7,5; 20 mm) och natriumdodecylsulfat (0,1 %). Volymen ökade till 100/ul och de givna koncentrationerna är slutkoncentrationerna.
Blandningen inkuberades därefter vid SOOC i en timme. Efter denna hybridiseringsreaktion tillsattes 200/ul av en 25%-ig suspension av streptavidin-agaros i l M NaCl, 20 mM natrium- fosfat (pH 7,5), l mM EDTA- Biotinylerade molekyler fick binda till streptavidin-agarosen i 15 minuter vid 37OC i en roterande blandare. Agarosen uppsamlades genom snabb centri- fugering och supernatanten avlägsnades genom sugning. Aga- rosen tvättades därefter en gång i buffrad lM NaCl och två gånger i en lösning innehållande 150 mM NaCl, 15 mM natrium- citrat och 0,2 % natriumdodecylsulfat (pH 8) vid 37oC. Radio- aktiviteten hos agarosen till vilken de bildade hybriderna var bundna, fastställdes därefter i en radioaktivitets- räknare. Skörde- och tvättningsförfarandena för DNA-hybrider innehållande en biotinylerad markörkär tidigare kända för- faranden beskrivna t.ex. i det brittiska patentet med pub- liceringsnummer 2 169 403.
Resultaten av försöket visas i tabell l. Det framgår att en cykel av DNA-syntesen införlivar tillräcklig radioaktivi- tet för detektion endast om höga målkoncentrationer är när- varande,men att även mycket låga målmängder är detekterbara efter 15 cykler. Med höga målmängder och 15 cykler blir mängden detektorprimer begränsande.
(N Z) <3 M3 0\ H3 13 Tabell 1 . _. 32 . _ _ . a) Malmangd P-aktivitet 1 samlade hybrider (mol) (CPM över bakgrundsvärdet) b) 1 5 15 '. Antal cykler . 0 0 0 0 -20 2 x 10 ND ND 650 2 x 10°l8 ND 300 11000 2 x 10°l6 700 13000 36000 a) Medelvärdet av två bestämningar b) ND - icke detekterbar (mindre radioaktivitet än 2 gånger medelbakgrundaktiviteten) Exempel 2 Bestämning av cytomegalovirus DNA med användning av infång- ningsprober som modifierade primers I detta exempel agerar infångningsproberna som primers.
De använda reagensen var samma som i exempel 1 med följande undantag: Ifrågavarande infångningsprimers (Pa, Pb, Fig. 1) var inte märkta med 32P utan deras 5'-ändar modifierades istället att innehålla en biotinrest. Denna kemiska modifika- tion gjordes med användning av kända metoder beskrivna av Chollet och Kawashima, Nucleic Acids Research, 13, p. 1529- 1541, 1985. De två selektiva proberna (S1 och S2, Fig. 1) var i detta fall märkta i sina 5'-ändar för att agera som detektorprober. Deras specifika aktiviteter var ungefär 2 x 109 resp. 2,5 x 109 cpmáug.
Reaktionsblandningarna sammanställdes såsom beskrivits i exempel l. Ifrågavarande biotinylerade infångningsprimers tillsattes emellertid i 10-faldiga mängder, dvs. 20 pmol vardera per reaktion. l, 5 eller 15 cykler genomfördes såsom beskrivits, varefter proven upphettades till 1000 C och 0,5 pmol vardera av de 32P-märkta probernä Sl och S2 ÉJÜÜ 262 14 tillsattes. Hybridiseringen genomfördes under samma betingel- ser som beskrivits i exempel l.
Hybriderna samlades därefter på streptavidin-agaros, tvätta- des och räknades för 32?-aktivitet, såsom i exempel l. Resul- taten visas i tabell 2.
Tabell 2 Målmängd 32P-aktivitet i upp-samlade hybrider-a) (mol) (CPM över bakgrundsvärdet) b) l 5 15 Antal cykler 0 0 0 0 -20 2 x l0 ND ND 800 2 x 1048 ND 400 13000 2 x 10"” 300 11000 54000 a) Medelvärdet av två bestämningar b) ND - icke detekterbar (jämför ex. l) Exempel 3 Detektion av cytomegalovirus DNA från kliniska prov med användning av infångningsprober som modifierade primers I detta exempel demonstreras metodens applicerbarhet vid studium av kliniska prov genom detektering av CMV från urinen av ett barn som lider av cytomegalovirusinfektion.
Urinen från ett friskt barn inkluderades som kontroll.
Båda proven utgjordes av 10 ml urin ur vilken den totala mängden DNA isolerats,såsom beskrivits i Virtanen et al,.
J. Clin. Microbiol., 20 (6), p. 1083-1088, 1984. DNA:t upplöst i 20/al H20 användes som mål i reaktionerna vilka annars genomfördes såsom beskrivits i exempel 2. Efter 10 cykler av DNA-syntes sattes den märkta selektiva proben till provet, fick hybridisera och hybriderna samlades. DNA från urinen av patienten visade en klart förhöjd hybridradio- aktivitet under det att den från den friska personen endast 15 visade bakgrundsaktivitet. De aktuella cpm-värdena var 2300 resp. 240.
Exempel 4 Detektion av Semiliki Forest virus RNA med användning av infångningsprober som modifierade primers Exempel 4 användes för att demonstrera att den beskrivna metoden även kan användas för detektion av RNA. Den modell som användes var RNA från Semliki Forest virus (SFV).
De använda reagensen var två 5'-biotinylerade infångnings- primers (Fig. 2) (framställda såsom beskrivits i exempel 2), en enkel 5' 32?-märkt selektiv detektorprob (framställd så- som beskrivits i exempel l), omvänt transkriptas (Promega Biotech) och DNA-polymeras, Klenow fragment (Boehringer Mannheim).
Det första steget i detektionen av SFV-RNA var att synteti- sera en CDNA-kopia. Reaktionsblandningen (20/ul) innehöll 10 mM Tris-Cl (pH 8,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl , 10 mM ditio- treitol 0,5 mM varderaav de fyra deoxinukleosidtrifosfaterna 0,5)pg t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pmol infångningsprimer Pa och 100U omvänt transkriptas. Denna blandning inkuberades vid 37OC i 15 minuter. Därefter upphettades blandningen till l00oC i 5 minuter och kyldes till rumstemperatur. Därefter tillsattes 50,ul av en lösning innehållande 10 mM Tris-Cl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 10 pmol av infångningsprimern Pb och 0,5 mM av var och en av de 4 deoxinukleosidtrifosfaterna. Temperaturen höjdes till 379C och efter 5 minuter tillsattes 1U DNA-polymeras. Efter ytterligare 10 minuters inkubationstid inkuberades reaktions- blandningen vid 1oo°c i 5 minuter. Biandningen kyides till 37OC och 5 cykler av DNA-syntesen genomfördes. Efter ett slutligt denatureringssteg tillsattes 0,1 pmol (1,2 x 106 cpm) av den selektiva detektorproben i 80 pl lM NaCl, 50 mM EDTA, 50 mM natriumfosfat (pH 7,5) och 0,1 % natriumdodecyl- sulfat. Lösningen inkuberades därefter i 2 timmar vid 55OC UI CD CJ ND CH R) 16 varefter hybriderna samlades och tvättades såsom beskrivits i exempel l.
Som en negativ kontroll för reaktionerna erhöll ett identiskt prov samma behandling förutom att inget omvänt transkriptas tillsattes. Provet vari RNA överfördes till cDNA med omvänt transkriptas gav 420 cpm 32P-aktivitet i infångade hybrider under det att den negativa kontrollen gav 50 cpm.
Exempel 5 Jämförelse av olika sätt för detektering av mångfaldigat DNA I detta exempel jämfördes tre olika sätt för detektering av mângfaldigat DNA. Reagensen och multiplikationsförfarandena var såsom beskrivits i exempel l och 2,förutom att de selek- tiva infångnings- eller detektorproberna var Ml3-kloner som känner igen ungefär 100 nukleotider mellan ifrågavarande primers.
Ml3-klonerna erhölls genom subkloning av'ett HaeIII-restriktions- fragment av rekombinantplasmiden pBR322/CMV HindIIIIi in i fagvektorn Ml3mpl0,med användning av standardtekniker. Ml3- klonerna som skall tillsättas som selektiva infångningsprober modifierades med biotin med användning av PhotoprobeTM biotin (Vector Laboratories). Ml3-klonerna som skall användas som selektiva detektorprober märktes med 32P-dCTP med använd- ning av DNA polymeras I (Klenow-fragment) och primerexten- sion (Hu och Messing, Gene 17, p. 271-277, 1982) till en specifik aktivitet av 2 x 108 cpmáng. 18 mol) av Multiplikationen av 3 x l05 molekyler (0,5 x 10- den linjäriserade pBR322/CMV HindIII L-plasmiden genomfördes med l0 cykler. För detektion enligt sätten 1 och 2, användes 2 pmol vardera av ifrågavarande 32P-märkta detektorprimers Pa och Pb och multiplikationsförfarandet genomfördes såsom beskrivits i exempel l. För detektering enligt sätt 3, användes 25 pmol av ifrågavarande biotinylerade infângnings- (__.
CD PO c' )'\ IMS) l7 primers i multiplikationsförfarandet och reaktionen genom- fördes såsom beskrivits i exempel 2.
Detektionssätt l - Selektiv infångningsprob använd för sam- ling av hybrider bildade i lösning med kopiorna av målnuklein- syran Vid detta sätt för detektion användes biotinylerade selektiva M13-infångningsprober för att samla de mångfaldigade DNA- fragmenten. Efter den sista multiplikationscykeln upphettades provblandningen till 100°C och 2 x 109 molekyler vardera av de biotinylerade selektiva infângningsproberna tillsattes tillsammans med NaCl (0,6 M), EDTA (5 mM), natriumfosfat (20 mM) och SDS (0,1 %). Volymen ökade till 100}pl och slutkoncentrationerna är givna. Blandningen inkuberades vid 65OC i 2 timmar. De bildade hybriderna samlades på strepta- vidin-agaros,såsom beskrivits i exempel l,förutom att två ytterligare 1 minuters-tvättar vid 50oC med 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitrat, 0,2 % SDS skedde. Radioaktiviteten för de samlade hybriderna mättes.
Detektionssätt 2 - Selektiv infångningsprob immobiliserades innan hybridiseringen med kopior av målnukleinsyran I detta fall användes immobiliserade selektiva Ml3-prober för att infånga det mångfaldigade DNA:t. Efter sista multi- piikationscykein upphettades proven till 1oo°c. Naci (0,6 M) , natriumcitrat (60 mM), Ficol1TM (0,02 %), polyvinylpyrroli- don (0,02 %), bovint serumalbumin (0,02 %) och denaturerad sillsperm-DNA (0,2 mg/ml) tillsattes för att ge de indikerade koncentrationerna i en slutvolym av 100fflfl En nitrocellulosa- fiiterskiva, till vilken 5 x 1010 selektiva proberna hade immobiliserats enligt ett tidigare beskrivet förfarande (US 4 486 539) sattes till varje prov.
Blandningen inkuberades med filtren vid 65OC i 2 timmar molekyler vardera av de eller 18 timmar. Efter hybridiseringsreaktionen tvättades o filtren två gånger i 20 minuter vid 50 C med 15 mM NaCl, 1,5 mM natriumcitrat och 0,2 % SDS och radioaktiviteten bunden 18 till filtren mättes.
Detektionssätt 3 - Selektiv detektorprob använd för detektion Här användes 32P-märkta selektiva Ml3-dektorprober för detektion av det mångfaldigade DNA:t och hybriderna samlades med hjälp av infångningsprimers biotinylerade vid 5'-ändarna såsom beskrivits i exempel 2. De mångfaldigade proven upp- hettades till l0o°c och 2 x 108 molekyler (2 X 105 cpm) vardera av de 32P-märkta selektiva proberna tillsattes till- sammans med salter såsom beskrivits i sätt l. Hybridisering och samling av de formade hybriderna skedde som i sätt l.
En jämförelse av resultaten erhållna genom de tre sätten för detektion framgår av tabell 3.
Sätten l och 3 har fördelen av en snabbare hybridiserings- hastighet i lösning jämfört med filterhybridiseringen i sätt 2. Den högsta 32P-aktiviteten erhålles enligt sätt 3 på grund av att den selektiva detekborproben innehåller multipla 3š~atomer per molekyl.
Tabell 3 Sätt Primers Selektiv Hybridi- 3%?-aktivitet Ml3-prob serings- i hybrider tid (h) (cpm) a) l 32 H _ .
P-markt blotlnylerad 2 870 detektor infångning 2 32P-märkt immobiliserad 2 43 detektor infångning 18 920 3 biotlnylerad 32P-märkt 2 7800 infångning detektor a) Medel av tre bestämningar (cpm över bakgrundvärdet) 500 262 19 Exempel 6 Mångfaldigande av cytomegalovirus DNA med användning av biotinylerade detektorprimers och indirekt detektering med streptavidin-pepparrotperoxidas I detta exempel skedde ett mångfaldigande av den CMV-specifika plasmiden (pBR322/CMV HindIII L) med användning av biotinyle- rade primers Pa och Pb beskrivna i exempel 2 som detektor- primers. Ml3-klonerna beskrivna i exempel 5 modifierade med sulfongrupper,användes som selektiva infångningsprober.
De bildade hybriderna samlades i mikrotitreringsbrunnar be- lagda med antikroppar igenkännande sulfonmodifierad DNA.
Slutdetektionen av de bildade hybriderna skedde med ett streptavidin-pepparrotperoxidas-konjugat, som detekterar biotindelarna av ifrågavarande primers.
Ml3-klonerna modifierades genom en sulfoneringsreaktion med användning av reagens från och de förfaranden som rekommen- derats av Orgenics Ltd (Yavne, Israel). Polystyrenmikro- titreringsbrunnar (Nunc, Danmark) belades med l0,ug/ml IgG renat från en monoklonal antikropp mot sulfonmodifierat DNA (Orgenics Ltd) i 10 mM natriumkarbonatbuffert (pH 9,6) över natten vid 4OC.
En reaktionsblandning innehållande 3 x 105 molekyler av linjäriserat pBR322/CMV HindIII L-plasmideg.eller kontroller utan plasmiden och 25 pmol vardera av ifrågavarande biotinyle- rade primers Pa och Pb,bearbetades för 10 multiplikations- cykler vid de betingelser som beskrivits i exempel l. Proven upphettades till l00OC, varefter 2 x 109 molekyler vardera av de sulfonerade selektiva infângningsproberna tillsattes tillsammans med reagensen som specificerats för sätt l för detektering i exempel 5.
Blandningen inkuberades vid 65oC i 2 timmar, späddes med 100 ffl. 0,2 % Tween 20 och överfördes till de belagda mikro- titreringsbrunnarna. Hybriderna fick binda till brunnarna i 2 timmar vid 37°C. Reaktionsblandningen kastades och brunnarna 20 tvättades tre gånger med 0,1 % Tween 20 i 0,15 M natrium- klorid, 20 mM natriumfosfat (pH 7,5) (PBS), 200,ml av ett strep- tavidin-pepparrotperoxidas-konjugat (Amersham, UK), utspätt l:2000 i en lösning av 1 % bovint serumalbumin, 0,1 % Tween 20 i PBS tillsattes och brunnarna inkuberades i 45 minuter vid 37OC. Efter fyra tvättningar som ovan, tillsattes 200 pd av en substratlösning bestående av 0,46 mg/ml O-fenylen- diamin, 0,01 % HZO2 i 0,1 M natriumacetatbuffert (pH 5,0).
Efter l5 minuter vid 22OC stannades reaktionen genom till- sats av 50Åpl 2N H2SO4 och absorbansen av den färgade produk- ten mättes med spektrofotometer vid 492 nm. Samling och detek- tionsförfarandena har vidare beskrivits av Syvänen et al.
(Nucleic Acids Res, 14, p. 5037-5048, 1986).
Resultaten av försöket framgår av tabell 4. 3 x 105 mole- kyler (0,5 x 10-18 mol) av målplasmiden detekterades klart efter 10 multiplikationscykler.
Tabell 4 Målmängd (mol) Absorbans vid 492 nm a) 0,5 x 10"” 0,348 0 0,120 a) Medel av tre analyser

Claims (9)

21 Un C-) Cl) [\ > I I I\"J PATENTKRAV
1. Sätt för analys av nukleinsyror genom hybridisering med såväl infångningsprober som detektorprober, k ä n n e -_ t e c k n a t av att infàngningsproberna agerar som modifie- rade Primers, infångningsprimers, vilka införlivas i kopior av màlnukleinsyran, vars närvaro därefter påvisas med minst en selektiv detektorprob, varvid nämnda infångningsprob är modi- fierad så att den innehåller minst en del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site till vilket minst en del av ett affinitetspar kan fästas.
2. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar: (a) framställandet av en kopia av màlnukleinsyran genom reak- tion mellan nämnda infångningsprimer eller -primers och den enkelsträngade màlnukleinsyran under betingelser lämpliga för en mallberoende polymerisationsreaktion; (b) hybridisering av de enkelsträngade kopiorna av målnuklein- syran, vari ifrågavarande infångningsprimers har införlivats, med en detektorprob med förmåga att selektivt hybridisera med màlnukleinsyran under betingelser lämpliga för en hybridi- seringsreaktion; _ (c) separation av kopiorna av màlnukleinsyran, vari ifrågava- rande infångningsprimers har införlivats, med hjälp av den andra delen av affinitetsparet; (d) detektering av närvaron av de selektiva detektorproberna som hybridiserats med kopiorna av màlnukleinsyran.
3. Sätt för analys av nukleinsyror genom hybridisering med såväl infångningsprober som detektorprober, vari detektorpro- ber agerar som modifierade primers, vilka införlivas i kopior- na av målnukleinsyrorna, k ä n'n e t e c k n a t av att kopiorna av målnukleinsyrorna, vari ifrågavarande modifierade primers har införlivats, först hybridiseras med minst en selektiv infángningsprob, och att den bildade hybriden där- efter separeras med hjälp av nämnda infângningsprob varefter närvaron av hybriden detekteras. 22
4. Sätt enligt patentkravet 3, k ä n n e t e c k n a t av att det innefattar: (a) tillhandahållande av minst en detektorprimer av málnuk- leinsyran med minst en detekterbar markör eller minst ett specifikt site vartill minst en detekterbar markör kan fästas; (b) framställande av en kopia av málnukleinsyran genom reak- tion mellan nämnda detektorprimer eller -primers och den enkelsträngade málnukleinsyran under betingelser lämpliga för en mallberoende polymerisationsreaktion; ' (c) hybridisering av de enkelsträngade kopiorna av málnuklein- syran, vari ifrågavarande detektorprimers har införlivats, med en infångningsprob med förmåga att selektivt hybridisera med málnukleinsyran under betingelser lämpliga för en hybridise- ringsreaktion; (d) separation av kopiorna av málnukleinsyran vari ifrågava- rande detektorprimers har införlivats med hjälp av den selek- tiva infångningsproben; (e) detektering av närvaron av kopiorna av màlnukleinsyrorna.
5. Sättet enligt patentkravet 3 eller 4, k ä n n e t e c k - n a t av att den selektiva infángningsproben är försedd med minst en del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site vartill minst en del av ett affinitetspar kan fästas.
6. En reagenskombination för analys av nukleinsyror, k ä n - n e t e c k n a d av att den innefattar: (a) minst en modifierad primer av málnukleinsyran försedd med minst en detekterbar markör eller minst ett specifikt site, vartill minst en detekterbar markör kan fästas; och (b) minst en infångningsprob med förmåga att selektivt hybri- disera med málnukleinsyran försedd med minst en del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site, vartill minst en del av ett affinitetspar kan fästas.
7. En reagenskombination för analys av nukleinsyror, k ä n - n e t e c k n a d av att den innefattar: 01 C- \ (__) hl O\ ha 23 (a) minst en modifierad primer av målnukleinsyran försedd med minst en del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site, vartill minst en del av ett affinitetspar kan fästas; och (b) minst en detektorprob med förmåga att selektivt hybridise- ra med målnukleinsyran försedd med minst en detekterbar markör eller minst ett specifikt site vartill minst en detekterbar markör kan fästas.
8. En utrustning för analys av nukleinsyror, k ä n n e - t e c k n a d av att den innefattar i förpackad form en multibehållarenhet med: (a) minst en modifierad primer av målnukleinsyran försedd med minst en detekterbar markör eller minst ett specifikt site, vartill minst en detekterbar markör kan fästas; (b) minst en infàngningsprob med förmåga att selektivt hybri- disera med målnukleinsyran, försedd med minst en del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site, vartill minst en del av ett affinitetspar kan fästas; (c) eventuellt en behållare innefattande minst ett mallbe- roende polymerisationsmedel; (d) eventuellt en behållare med de fyra deoxinukleosidtrifos- faterna; (e) eventeullt ett hjälpmedel för polymerisations- och hybri- diseringsförfarandet; (f) eventuellt ett hjälpmedel för separation av kopiorna av målnukleinsyran; och (g) eventuellt ett hjälpmedel för analys av.markören.
9. En utrustning för analys av nukleinsyror, k ä n n e - t e c k n a d av att den innefattar i förpackad form en multibehållarenhet med: (a) minst en modifierad primer av målnukleinsyran, försedd med minst en del av ett affinitetspar eller minst ett specifikt site, vartill minst en del av ett affinitetspar kan fästas; (b) minst en detektorprob med förmåga att selektivt hybridise- ra med målnukleinsyran, försedd med minst en detekterbar 01 CD CD RQ CN BJ 14 markör eller minst ett specifikt site, vartill minst en detek- terbar markör kan fästas; (c) eventuellt en behållare innefattande minst ett mallhe- roende polymerisationsmedel: (d) evetuellt en behållare med de fyra deoxinukleosidtrifos- faterna; (e) eventuellt ett hjälpmedel för polymerisations- och hybri- diseringsförfarandet; (f) eventuellt ett hjälpmedel för separation av kopiorna av målnukleinsyran; och (g) eventuellt ett hjälpmedel för analys av markören.
SE8800864A 1987-03-11 1988-03-10 Ett förbättrat sätt för analys av nukleinsyror, en reagenskombination och en utrustning därför SE500262C2 (sv)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2460487A 1987-03-11 1987-03-11

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE8800864D0 SE8800864D0 (sv) 1988-03-10
SE8800864L SE8800864L (sv) 1988-09-12
SE500262C2 true SE500262C2 (sv) 1994-05-24

Family

ID=21821443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8800864A SE500262C2 (sv) 1987-03-11 1988-03-10 Ett förbättrat sätt för analys av nukleinsyror, en reagenskombination och en utrustning därför

Country Status (25)

Country Link
US (2) US5476769A (sv)
JP (1) JP3244500B2 (sv)
AT (1) AT395434B (sv)
AU (1) AU622104B2 (sv)
BE (1) BE1003990A5 (sv)
CA (1) CA1338207C (sv)
CH (1) CH677285A5 (sv)
DD (1) DD272664A5 (sv)
DE (1) DE3807994C2 (sv)
DK (1) DK175384B1 (sv)
ES (1) ES2006377A6 (sv)
FI (1) FI94429C (sv)
FR (1) FR2613077A1 (sv)
GB (1) GB2202328B (sv)
GR (1) GR1000315B (sv)
HU (1) HU202583B (sv)
IE (1) IE61664B1 (sv)
IL (3) IL102154A (sv)
IT (1) IT1216048B (sv)
LU (1) LU87153A1 (sv)
NL (1) NL194922C (sv)
NO (1) NO172909C (sv)
NZ (1) NZ223700A (sv)
PT (1) PT86937B (sv)
SE (1) SE500262C2 (sv)

Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5753433A (en) * 1909-12-05 1998-05-19 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the sensitive detection of nucleic acids
DE4038804A1 (de) * 1990-10-09 1992-04-16 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit
US5714380A (en) 1986-10-23 1998-02-03 Amoco Corporation Closed vessel for isolating target molecules and for performing amplification
FI80476C (sv) * 1987-10-09 1990-06-11 Orion Yhtymae Oy Förbättrat hybridisationsförfarande, vid förfarandet använt redskap oc h reagensförpackning
JPH0775560B2 (ja) * 1987-12-25 1995-08-16 湧永製薬株式会社 検体中の目的核酸の検出法
CA1325761C (en) * 1987-12-25 1994-01-04 Takanori Oka Method of detecting an intended nucleic acid in a sample
WO1989009281A1 (en) * 1988-03-25 1989-10-05 Akzo N.V. Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid
US5817797A (en) * 1988-06-01 1998-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequencing DNA; a modification of the polymerase chain reaction
AU629845B2 (en) * 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
CA2002076A1 (en) * 1988-11-21 1990-05-21 Brent A. Burdick Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids
GB8827160D0 (en) * 1988-11-21 1988-12-29 Apothekernes Lab Detection & quantitative determination of rna & dna
DK175170B1 (da) * 1988-11-29 2004-06-21 Sangtec Molecular Diagnostics Fremgangsmåde og reagenskombination til bestemmmelse af nukleotidsekvenser
US5536648A (en) * 1988-12-09 1996-07-16 Amrad Corporation Limited Amplified DNA assay using a double stranded DNA binding protein
JP3068848B2 (ja) * 1988-12-09 2000-07-24 アムラド・コーポレイション・リミテッド 増幅ｄｎａ検定
CA2004326A1 (en) * 1988-12-23 1990-06-23 Nanibushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
ATE142272T1 (de) * 1989-01-19 1996-09-15 Behringwerke Ag Nukleinsäure-amplifikation unter verwendung eines einzelprimers
SG50434A1 (en) * 1989-02-13 1998-07-20 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
US5856092A (en) * 1989-02-13 1999-01-05 Geneco Pty Ltd Detection of a nucleic acid sequence or a change therein
CA2011818A1 (en) * 1989-03-17 1990-09-17 Fred T. Oakes Methods for purification, amplification and detection of a nucleic acid
CA2013317A1 (en) * 1989-04-17 1990-10-17 Fred T. Oakes Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
EP0478630B1 (fr) * 1989-06-12 1993-09-01 Cis Bio International Procede de detection de sequences specifiques d'acides nucleiques et ses applications
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
US5196305A (en) * 1989-09-12 1993-03-23 Eastman Kodak Company Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
IL97222A (en) * 1990-02-16 1995-08-31 Orion Yhtymae Oy Method and Responder for Determining Special Changes to Nucleotide
US5387505A (en) * 1990-05-04 1995-02-07 Eastman Kodak Company Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage
NZ240079A (en) * 1990-10-09 1993-07-27 Boehringer Mannheim Gmbh Method for the detection of a nucleic acid or part thereof
EP0566670A4 (en) * 1990-12-17 1993-12-08 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
DE4106251A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Boehringer Mannheim Gmbh Nachweis von bakterien mit hilfe einer nukleinsaeureamplifikation
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5888819A (en) * 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
CA2065719A1 (en) 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
US5387510A (en) * 1991-10-02 1995-02-07 Eastman Kodak Company Detection of amplified nucleic acid using secondary capture oligonucleotides and test kit
IT1252295B (it) * 1991-11-15 1995-06-08 Schiapparelli Diagnostici Ismu Metodo per rivelare acidi nucleici e relativo kit diagnostico
CA2124796A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Diagnostics Corporation Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
US5658729A (en) * 1994-10-11 1997-08-19 The University Of British Columbia Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis
DE4421901A1 (de) * 1994-06-23 1996-01-04 Bayer Ag Ein DNA-Schnelltest zum Nachweis von chinolonresistenten Staphylococcus aureus Erregern in klinischem Probenmaterial
US5705366A (en) * 1994-09-15 1998-01-06 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Coamplification of target nucleic acids using volume exclusion agent in reaction composition, test kit and test device useful therefor
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
US5856096A (en) * 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
AU2320597A (en) 1996-03-19 1997-10-10 Molecular Tool, Inc. Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
US6071493A (en) 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
IL122147A0 (en) * 1997-11-10 1998-04-05 Technion Res & Dev Foundation Method for labeling polynucleotides
BR9814294B1 (pt) 1997-12-18 2011-10-18 polipeptìdeo cry3bb de b, thuringiensis modificado, composição compreendendo o mesmo, processo para a produção da referida composição, polinucleotìdeo, vetor, vìrus, microorganismo transgênico e métodos para matar e controlar uma população de insetos coleópteros e para preparar uma planta transgênica resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a coleópteros e uma semente de planta resistente a ataque por insetos coleópteros.
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
DE19824900B4 (de) 1998-06-04 2006-05-04 Roche Diagnostics Gmbh DNA-Nachweis über einen Strangreassoziationskomplex
US6743906B1 (en) 1998-10-02 2004-06-01 Board Of Regents, The University Of Texas PPP2R1B is a tumor suppressor
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
CA2350911A1 (en) 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
US6432642B1 (en) 1999-01-15 2002-08-13 Pe Corporation (Ny) Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection
US6156515A (en) * 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
CA2368194A1 (en) 1999-04-30 2000-11-09 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
DK1471926T3 (da) 1999-06-01 2011-02-28 Baylor College Medicine Sammensætninger og fremgangsmåder til terapeutisk anvendelse af en atonal-associeret sekvens
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP1278855B1 (en) 2000-04-21 2008-03-12 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
WO2002000174A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20020164715A1 (en) 2000-07-10 2002-11-07 Lin Ji Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors
EP1988097A1 (en) 2001-05-09 2008-11-05 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
EP1399541A4 (en) 2001-05-22 2005-04-13 Univ Chicago RNA POLYMERASE DEPENDENT ON SINGLE VIBRATION N4 DNA
EP1908851A3 (en) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
EP2135960A1 (en) 2001-09-19 2009-12-23 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk by determining the allelic profile of the VDR-ApaI and CYP11B2 genes
ES2205998B1 (es) * 2001-12-14 2005-08-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas. Procedimiento para la deteccion del virus del amarilleo de las venas del pepino (cvyv).
WO2003053220A2 (en) 2001-12-17 2003-07-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
WO2003064625A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Sequitur, Inc. Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US6916474B2 (en) 2002-07-15 2005-07-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies with increased affinities for anthrax antigens
CN101912421A (zh) 2002-08-12 2010-12-15 杰能斯有限公司 涉及痘病毒和癌的方法及组合物
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
US8349276B2 (en) 2002-09-24 2013-01-08 Duke University Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board
HUE026376T2 (en) 2003-01-06 2016-05-30 Corixa Corp Certain aminoalkyl glucosamide phosphate compounds and their use
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
JP4773338B2 (ja) 2003-03-07 2011-09-14 ルビコン ゲノミクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ重合プロセスにより生成される全ゲノムおよび全トランスクリプトームライブラリーの増幅および分析
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
EP2295569A1 (en) 2003-07-25 2011-03-16 Ambion, Inc. Methods and compositions for preparing rna from a fixed sample
EP2270034A3 (en) 2004-06-03 2011-06-01 Athlomics Pty Ltd Agents and methods for diagnosing stress
WO2006017724A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-16 Becton, Dickinson And Company Sequences and methods for detection of cytomegalovirus
EP1802775B1 (en) 2004-09-14 2010-05-26 The Regents of the University of Colorado Method for treatment with bucindolol based on genetic targeting
ES2381279T3 (es) 2005-05-06 2012-05-24 Gen-Probe Incorporated Métodos y productos para la captura de ácido nucleico diana
EP1910565A4 (en) 2005-07-07 2009-10-28 Athlomics Pty Ltd POLYNUCLEOTIDE MARKER GENES AND THEIR EXPRESSION IN THE DIAGNOSIS OF ENDOTOXEMIA
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
WO2007048074A1 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Genenews Inc. Method and apparatus for correlating levels of biomarker products with disease
CA2637598A1 (en) 2006-01-18 2007-02-14 University Of Chicago Compositions and methods related to staphylococcal bacterium proteins
WO2007106579A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Micronics, Inc. Integrated nucleic acid assays
CA2663034C (en) 2006-09-15 2016-05-03 Ottawa Health Research Institute Oncolytic rhabdovirus
ATE555128T1 (de) 2006-11-30 2012-05-15 Res Dev Foundation Verbesserte immunglobulin-bibliotheken
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
HUE030719T2 (en) 2007-04-09 2017-05-29 Univ Florida RAAV vector formulations and methods comprising tyrosine-modified capsid proteins for their use
DK2155789T3 (da) 2007-05-01 2013-10-21 Res Dev Foundation Immunoglobulin-Fc-biblioteker
WO2010042481A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 University Of Chicago Compositions and methods related to bacterial eap, emp, and/or adsa proteins
KR20170102039A (ko) 2009-04-03 2017-09-06 유니버시티 오브 시카고 단백질 Ａ(ＳｐＡ) 변이체와 관련된 조성물 및 방법
CN102458446B (zh) 2009-04-22 2017-06-13 印第安那大学科技研究公司 用于治疗慢性阻塞性肺病和哮喘的组合物和方法
EP2789689B1 (en) 2009-06-29 2016-04-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
EP2272979A1 (en) 2009-06-30 2011-01-12 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method for testing a subject thought to be predisposed to having cancer
PL3042957T3 (pl) 2009-07-17 2018-03-30 Bioatla Llc Jednoczesna, zintegrowana selekcja i ewolucja wydajności ludzkiego białka i wyrażanie w gospodarzu do wytwarzania
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
US9512481B2 (en) 2009-09-11 2016-12-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Polymorphisms in the PDE3A gene
CA2774144C (en) 2009-09-14 2018-02-13 Jennerex, Inc. Oncolytic vaccinia virus combination cancer therapy
CN102858959B (zh) 2009-12-10 2016-02-24 渥太华医院研究院 溶瘤弹状病毒
CA2822747A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Arca Biopharma, Inc. Use of s-(6-nitro-oxi-hexahydro-furo[3,2-b]thioacetate in the treatment of cardiovascular disorders associated with oxide synthase dysfunction
CN102740976B (zh) 2010-01-29 2016-04-20 精密公司 取样-应答微流体盒
US8808699B2 (en) 2010-04-05 2014-08-19 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) antibodies as an enhancer of immune response
CN105821079B (zh) 2010-04-23 2021-10-26 佛罗里达大学研究基金公司 用于治疗莱伯氏先天性黑蒙-1(lca1)的raav-鸟苷酸环化酶组合物及方法
AU2011274367B2 (en) 2010-07-02 2015-04-23 The University Of Chicago Compositions and methods related to protein A (SpA) variants
SG10201902596TA (en) 2010-07-16 2019-04-29 Bioatla Llc Novel methods of protein evolution
WO2012034067A1 (en) 2010-09-09 2012-03-15 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens
EP2455485A1 (de) 2010-11-19 2012-05-23 Anagnostics Bioanalysis GmbH Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren
BR112013017096A2 (pt) 2011-01-04 2020-09-01 Jennerex Inc. composição e métodos de indução de resposta citotóxica dependente de complemento mediado por anticorpo específico de tumor em animal tendo tumor, de geração de anticorpos in vivo, de inibição do crescimento ou morte de célula de câncer, para tratar indivíduo com câncer, para adaptar de terapia de câncer para indivíduo com câncer e para identificar antígeno específico de tumor
CA2826467C (en) 2011-02-07 2019-11-12 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides
US20140057295A1 (en) 2011-02-28 2014-02-27 Barbara J. Stegmann Anti-mullerian hormone changes in pregnancy and prediction of adverse pregnancy outcomes and gender
AU2012226530B2 (en) 2011-03-08 2016-12-01 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
US9085631B2 (en) 2011-04-08 2015-07-21 Nov Vac APS Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting Staphylococcus aureus
US8945588B2 (en) 2011-05-06 2015-02-03 The University Of Chicago Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens, such as EBH polypeptides
WO2012167382A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
US20150030586A1 (en) 2011-06-21 2015-01-29 Sarah Ellen Warren Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer
US10040853B2 (en) 2011-09-09 2018-08-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving NKG2D inhibitors and cancer
EP2766388A1 (en) 2011-10-12 2014-08-20 Møller, Niels Iversen Peptides derived from campylobacter jejuni and their use in vaccination
ES2645418T3 (es) 2011-12-22 2017-12-05 Ibis Biosciences, Inc. Amplificación de una secuencia de un ácido ribonucleico
WO2013116698A2 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
NZ702285A (en) 2012-04-26 2016-07-29 Univ Chicago Staphylococcal coagulase antigens and methods of their use
CN104428424A (zh) * 2012-08-31 2015-03-18 东丽株式会社 目标核酸的检测方法
EP2740805B1 (en) 2012-12-07 2019-02-20 SuppreMol GmbH Stratification and treatment of patients suffering from idiopathic thrombocytopenic purpura
EP3549674B1 (en) 2012-12-21 2020-08-12 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Low elasticity films for microfluidic use
WO2014100732A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Micronics, Inc. Fluidic circuits and related manufacturing methods
KR20150097764A (ko) 2012-12-21 2015-08-26 마이크로닉스 인코포레이티드. 휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
RU2684211C2 (ru) 2013-02-21 2019-04-04 Тёрнстоун Лимитед Партнершип Композиция вакцины
WO2014182831A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
US10386377B2 (en) 2013-05-07 2019-08-20 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
WO2014182847A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Device for preparation and analysis of nucleic acids
BR112016007391A2 (pt) 2013-10-03 2017-08-01 Oklahoma Med Res Found biomarcadores da atividade, da intensidade e da fase aguda da doença lúpus eritematoso sistêmico
EP3077820A1 (en) 2013-12-03 2016-10-12 Evaxion Biotech ApS Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
AU2015204840B2 (en) 2014-01-07 2020-01-30 Bioatla, Llc Proteins targeting orthologs
WO2015191916A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Micronics, Inc. Microfluidic cartridges and apparatus with integrated assay controls for analysis of nucleic acids
EP3777883A1 (en) 2014-11-13 2021-02-17 Evaxion Biotech ApS Peptides derived from acinetobacter baumannii and their use in vaccination
SG10202012249YA (en) 2014-12-08 2021-01-28 Berg Llc Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
ES2957554T3 (es) 2015-01-12 2024-01-22 Evaxion Biotech Aps Tratamiento y profilaxis de infección por K. pneumoniae
CA2976236A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
EP3070178B1 (en) 2015-03-20 2020-02-12 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Method for diagnosing breast cancer
WO2017005670A1 (en) 2015-07-04 2017-01-12 Evaxion Biotech Aps Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
AU2016297510B2 (en) 2015-07-17 2021-09-09 President And Fellows Of Harvard College Methods of amplifying nucleic acid sequences
US10526408B2 (en) 2015-08-28 2020-01-07 Research Development Foundation Engineered antibody FC variants
EP3419654B1 (en) 2016-02-22 2022-04-27 Evaxion Biotech A/S Proteins and nucleic acids useful in vaccines targeting staphylococcus aureus
US20200185063A1 (en) 2016-06-05 2020-06-11 Berg Llc Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers
EP3565576A1 (en) 2017-01-05 2019-11-13 Evaxion Biotech ApS Vaccines targeting pseudomonas aeruginosa
US20190390278A1 (en) 2017-01-26 2019-12-26 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
CA3116539C (en) 2018-10-18 2023-10-03 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for a systemic lupus erythematosus (sle) disease activity immune index that characterizes disease activity
WO2020083904A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting m. catharrhalis
WO2020174044A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Evaxion Biotech Aps Vaccines targeting h. influenzae
EP3963099A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
ES2960366T3 (es) 2019-08-09 2024-03-04 Univ Freiburg Albert Ludwigs Método para diagnosticar cáncer de mama
US20230050225A1 (en) 2020-01-06 2023-02-16 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting Neisseria gonorrhoeae
US20230266325A1 (en) 2020-06-30 2023-08-24 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting lung cancer
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
CA3214833A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Bpgbio, Inc. Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
EP4320441A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 BPGbio, Inc. Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer
EP4320440A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 BPGbio, Inc. Protein markers for estrogen receptor (er)-positive luminal a(la)-like and luminal b1 (lb1)-like breast cancer
EP4366762A1 (en) 2021-07-05 2024-05-15 Evaxion Biotech A/S Vaccines targeting neisseria gonorrhoeae
WO2023196937A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin replacement therapy
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2422956A1 (fr) * 1978-04-13 1979-11-09 Pasteur Institut Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
BG36086A1 (en) * 1982-01-19 1984-09-14 Glbov Method for inducing interferon
CA1223831A (en) * 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
CA1256005A (en) * 1983-09-26 1989-06-20 W. Peter Hansen Sandwich hybridization method for nucleic acid detection
US4749647A (en) * 1984-06-22 1988-06-07 Genetic Systems Corporation Polymerization-induced separation assay using recognition pairs
US4743562A (en) * 1984-08-21 1988-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Purified human cytomegalovirus protein
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
FI72146C (sv) * 1985-01-02 1987-04-13 Orion Yhtymae Oy Förfarande för identifiering av nukleinsyror.
CA1272443A (en) * 1985-02-22 1990-08-07 Nanibhushan Dattagupta Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
CA1278755C (en) * 1985-03-15 1991-01-08 William J. Knowles Labelling of oligonucleotides
DK171161B1 (da) * 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8509367D0 (en) * 1985-04-12 1985-05-15 Amersham Int Plc Nucleic acid hybridisation
US4751177A (en) * 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
GB8515276D0 (en) * 1985-06-17 1985-07-17 Amersham Int Plc Nucleic acid sequencing
CA1284931C (en) * 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
AU7015287A (en) * 1986-03-19 1987-09-24 Cetus Corporation Detection of nucleic acid sequence using liquid hybridization method
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase

Also Published As

Publication number Publication date
AT395434B (de) 1992-12-28
BE1003990A5 (fr) 1992-07-28
SE8800864L (sv) 1988-09-12
NO172909C (no) 1993-09-22
FR2613077A1 (fr) 1988-09-30
NL194922C (nl) 2003-07-04
NO881064D0 (no) 1988-03-10
HU202583B (en) 1991-03-28
PT86937B (pt) 1995-03-01
CA1338207C (en) 1996-04-02
LU87153A1 (fr) 1988-08-23
FI880994A (sv) 1988-09-12
FR2613077B1 (sv) 1994-11-10
CH677285A5 (sv) 1991-04-30
DK175384B1 (da) 2004-09-20
IL102154A (en) 1994-04-12
IT8819722A0 (it) 1988-03-10
NO172909B (no) 1993-06-14
IE61664B1 (en) 1994-11-16
FI94429C (sv) 1995-09-11
GR880100139A (en) 1989-01-31
US5476769A (en) 1995-12-19
IT1216048B (it) 1990-02-22
DK129588D0 (da) 1988-03-10
AU1193788A (en) 1988-09-15
DE3807994A1 (de) 1988-09-22
US5989817A (en) 1999-11-23
FI94429B (sv) 1995-05-31
NL194922B (nl) 2003-03-03
FI880994A0 (sv) 1988-03-03
IL85480A0 (en) 1988-07-31
ATA64388A (de) 1992-05-15
GR1000315B (el) 1992-06-25
SE8800864D0 (sv) 1988-03-10
AU622104B2 (en) 1992-04-02
GB2202328A (en) 1988-09-21
DD272664A5 (de) 1989-10-18
IE880697L (en) 1988-09-11
GB2202328B (en) 1991-07-03
GB8805681D0 (en) 1988-04-07
PT86937A (pt) 1989-03-30
HUT50868A (en) 1990-03-28
IL102154A0 (en) 1993-01-14
ES2006377A6 (es) 1989-04-16
NZ223700A (en) 1990-04-26
NO881064L (no) 1988-09-12
DK129588A (da) 1988-09-12
DE3807994C2 (de) 1998-08-27
JPS63243875A (ja) 1988-10-11
JP3244500B2 (ja) 2002-01-07
NL8800594A (nl) 1988-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE500262C2 (sv) Ett förbättrat sätt för analys av nukleinsyror, en reagenskombination och en utrustning därför
EP0439222B1 (en) Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods
EP0128332B1 (en) Assay method utilizing polynucleotide sequences
JP2001521373A (ja) 核酸増幅法：ハイブリダイゼーションシグナル増幅法（ｈｓａｍ）
JP2005508599A (ja) 核酸の増幅方法
JPH10508741A (ja) 核酸−プローブ標的ハイブリッド検出の感度上昇のための増幅方法
JPH0398586A (ja) プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法
WO1991008308A1 (en) A new method for detecting a specific nucleic acid sequence in a sample of cells
Gudibande et al. Rapid, non-separation electrochemiluminescent DNA hybridization assays for PCR products, using 3′-labelled oligonucleotide probes
JPH07505533A (ja) 定量的ウイルスアッセイ
PT677589E (pt) Metodos elemento de teste e estojo de teste para a deteccao semiquantitativa de acido nucleico
WO1989009281A1 (en) Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid
EP1475387A2 (en) Method for preparing assay samples
EP0543222A1 (en) Method for detecting nucleic acids and relative diagnostic kit
CA1341365C (en) Analyte detecting composition utilizing polynucleotide sequences
JP3618168B2 (ja) 逆転写酵素活性阻止抗体の測定法
WO2000043546A2 (en) Detection of drug resistant organisms
Heesmans et al. Use of 65 kDa heat shock protein gene in a modified polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacteria in clinical practice

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed