JPH07505533A - 定量的ウイルスアッセイ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 定量的ウィルスアッセイ 本発明は、血清サンプル中に含まれるウィルスの量を測定する、あるいは、野生 型、および、ウィルスのＤＮＡもしくはＲＮＡ中の単一の塩基における点突然変 異に起因する変異体のような、密接に関連するウィルス形態中におけるウィルス の相対的比率を決定するために使用することができる、新しいウィルスアッセイ に関する。 血清サンプル中に存在するウィルスの量を評価するための現存の方法は、組織培 養物における連続希釈、もしくは、ポリメラーゼ鎮連鎖反応（ＰＲＣ）系に頼っ ている。しかしながら、既知の系は困難極まりないものであり、かつ、時間の浪 費でもある。このようなことが、それらのアッセイを、臨床実験、および、ウィ ルスに感染しやすいもしくはウィルスに感染している患者の常習的なテストにお いて作成される多大な数の標本の調査には不適切なものにしてしまっているので ある。同様に、点突然変異の定量のための現存の方法は、それらの方法が、多大 な数のサンプルにおいては不都合でありかつ非実用的である全ＤＮＡ断片の配列 決定を伴うという点において、不都合かつ煩雑である。 そこで、これら応用法の両方のために使用することができる、簡便さおよび必要 とする時間に関して有意な利点を保持する、新しい定量的アッセイが考案された 。このことは、例えば、突然変異を起こしていない（野生型）ウィルスに対する 突然変異を起こしたウィルスの比率、および、患者から採取した血清中における ウィルスの量の両方を追及することにより、ウィルスが、ある薬剤に対する耐性 を発現させているかどうかを決定することのような、臨床実験における用途にと ってこのアッセイを適切なものとすることができる。 本発明に従えば、定量的ウィルスアッセイであって、（ａ）血清からウィルス粒 子を捕捉し、かつ、血清の残渣を除去し、（ｂ）ウィルス粒子からウィルスＲＮ ＡもしくはＤＮＡを放出させ、（Ｃ）゛必要に応じて、そのＲＮＡ配列の一部分 に対して相補的である配列を有する転写プライマーを使用する相補的ＤＮＡ　（ ｃＤＮＡ）に対してウィルスＲＮＡを逆転写させ、 （ｄ）第一段階において、最初のＰＣＲプテイマ一対を、そして、最終段階にお いては、最初のＰＣＲプライマー対に対して相補的であるＤＮＡ配列の一部分に より特定される領域内に存在するＤＮＡ配列の一部分に対して相補的である第二 のＰＣＲプライマー対を使用する繰り込み式多段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）によりウィルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡを増幅させるのであって、第二Ｐ ＣＲプライマー対の内の一つが、特異的な結合パートナ−に結合することができ る特異的結合試薬で標識されており、かつ、逆転写を使用して相補的なｃＤＮＡ を取得する場合には、最初のＰＣＲプライマ一対が、転写プライマーの配列に対 して相補的であるｃＤＮＡ配列の一部分が、その領域の外側に存在するというよ うなある領域を特定するｃＤＮＡの一部分に対して相補的な配列を有するもので あり、そして、 （ｅ）固定化されている特異的結合パートナ−を使用して、特異的結合試薬で標 識されているＰＣＲ産物を捕捉し、そして、捕捉したＰＣＲ産物を定量すること 、 を含んでなる定量的ウィルスアッセイが提供される。 このアッセイを、ヒトの免疫不全性ウィルス（ＨＩＶ）、および特に、ＨＩＶ− １のようなＲＮＡウィルスを定量するのに使用するのが好ましく、この場合、Ｐ ＣＲ段階（ｄ）の前に逆転写段階（Ｃ）を行って、相補的ＤＮＡを取得すること が必要である。 ウィルス分子は、例えば、ウィルス粒子に対して特異的な抗体のような結合性試 薬で被覆しである、例えばマイクロタイタープレートのウェルのような、ある表 面による親和性捕捉を使用する既知の方法により、血清から捕捉することができ る。 しかしながら、ウィルス分子は、そのウィルス粒子に対して特異的な結合試薬で 被覆した微細な粒子の懸濁液を使用して捕捉することが好ましい。これらの微細 粒子は、表面積が広く、かつ、血清中に含まれるウィルスからの行路長が短いと いう利点を有しており、そして、これらは、例えば、遠心処理により、血清残渣 から簡単に分離することができる。 本発明の最初の態様においては、このアッセイを使用して、サンプル中に存在す るウィルスの量を定量する。この態様においては、ＰＣＲの各段階をあらかじめ 決定されている周期数分を完全に実行し、従って、増幅させたＤＮＡの最終量と 、ＰＣＲを行う前のＤＮＡの量との間に既知の関連性が存在するのである。最終 段階のＰＣＲは、少なくとも一つのラベル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄ ＮＴＰ）の存在中において、あるいは、増幅されたＤＮＡがラベル化されるよう にラベル化プライマーを使用して実行するため、ラベル化物の量は、ＰＣＨにお いて産生されるＤＮＡの量に比例する。その後、反応混合物を、増幅させたＤＮ Ａ（もともとは、ＰＣＲの第二段階において、標識しであるブライマ−から生じ る）に対して付加しである特異的結合試薬に対して特異的な結合パートナ−を保 持する固体支持体と接触させ、増幅させて標識付加されているＤＮＡを特異的結 合パートナ−によって基質に対して結合させる。ラベル化プライマーを使用して ＰＣＲの最終段階を行う場合には、失敗結果を招く恐れがある、増幅されていな いラベル化プライマーの基質に対する結合を回避するために、ラベル化プライマ ーよりはむしろ、ラベル化していないプライマーを特異的結合試薬で標識付加す る。その後、増幅させたＤＮＡを、例えば洗浄などによって除去される未取り込 みのラベル化ｄＮＴＰもしくはプライマーの残存物がら分離することできる。そ の後、増幅させたＤＮＡにおけるラベルの量をアッセイし、これにより、ＰＣＲ ｌ、前に存在するウィルスＤＮＡもしくは相補的なりＮＡの量、および従って、 血清中に存在するウィルスの量を、既知のウィルスＲＮＡもしくはＤＮＡもしく はｃＤＮＡあるいはウィルスの量を使用して作成する標準曲線との比較により決 定する。 固体支持体に対して結合した増幅させたＤＮＡは、最初は二本鎖形態になってい る。増幅させたＤＮＡ中に取り込まれているラベルの量をアッセイする前に、随 意にそれを変性させ、鎖を分離させ、−末鎖の円の一つ、あるいは、支持体に対 して結合していない鎖、より好ましくは、変性後に支持体に対して結合した一本 鎖において取り込まれているラベルの量を測定する。 従って、本発明のある態様においては、定量的ウィルスアッセイであって、 ａｌ）ウィルス粒子に対して特異的な結合試薬で被覆しである微細な粒子の懸濁 液を使用して血清からＲＮＡウィルス粒子を捕捉し、ａ２）捕捉したウィルス粒 子を血清から分離し、ｂ）ウィルス粒子からウィルスＲＮＡを放出させ、Ｃ）そ のＲＮＡ配列の一部分に対して相補的な配列を有する転写プライマーを使用して ｃＤＮＡに対してウィルスＲＮＡを逆転写させ、ｄ）第一段階において、転写プ ライマーの配列に対して相補的なＣＤＮＡ配列の一部分がその領域の外側になる ようなｃＤＮＡの一定領域を特定するＣＤＮＡ配列の一部分に対して相補的な配 列を有する最初のＰＣＲブ・ライマ一対を使用し、かつ、第二段階において、最 初のＰＣＲプライマー対に対して相補的なＣＤＮＡ配列の一部分により特定され る領域内に存在するＣＤＮＡ配列の一部分に対して相補的な第二ＰＣＲプライマ ー対を使用する繰り込み式多段階ポリメシーゼ連鎮反応（ＰＣＲ）においてｃＤ ＮＡを増幅させるものであって、第二ＰＣＲプライマ一対の内の一つが特異的結 合パートナ−に対して結合することができる特異的結合試薬で標識されており、 ＰＣＲの各段階を、増幅させたＤＮＡの量がＰＣＲを行う以前のｃＤＮＡＯ量に 比例するようにあらかじめ決定された周期数分を完全に実行し、そして、最終段 階を、ラベル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下、もしくは 、ラベル化ＰＣＲプライマーを使用して実行し、 ｅ）増幅させたＤＮＡを、増幅させたＤＮＡに対して標識させた結合試薬に対し て特異的な結合パートナ−を保持している固体支持体と接触させることにより、 増幅させたＤＮＡが基質に対して結合するのを可能にさせ、かつ、未取り込みの ラベル化ｄＮＴＰもしくは未取り込みのラベル化プライマーを除去し、そして、 ｆ）増幅させたＤＮＡ中に含まれるラベルの量を測定し、そして、標準曲線との 比較により、血清中に含まれるウィルス粒子、あるいは、ウィルスＲＮＡもしく はｃＤＮＡの量を得ること、を含んでなる定量的ウィルスアッセイを提供する。 このような方法もやはり、ＤＮＡウィルスのアッセイに対して応用することがで きる。 第二の態様においては、このアッセイを使用して、野生型と突然変異体のｊうな 、ウィルスＲＮＡもしくはＤＮＡ内の少なくとも一つの既知の位置における突然 変異により変化したウイ／Ｖスの、二つもしくはそれを上回る数の、密接に関連 する形態の相対的比率を定量する。このような混合物は、例えば、点突然変異の 結果生じミーとがある。この混合物をウィルス捕捉に、必要に応じて逆転写に、 そして、多段階の繰り込み式（ｍｕｌｔｉ−ｓｔａｇｅ　ｎｅＳｔｉｄ）　Ｐ　 ＣＲに供するが、このＰＣＲにおいては、ラベル化ｄＮＴＰもしくはラベル化プ ライマーを使用する必要がない。その後、この反応物を、もともとはＰＣＲの第 二段階におけるプライマーの内の一つから得られる増幅させたＤＮＡに対して付 加させである特異的結合試薬に特異的な結合パートナ−を保持する固体支持体に 接触させ、そしてその後、この増幅させたＤＮＡを基質に対して結合させる。そ の後、未取り込みのｄＮＴＰを取り除き、基質に結合したＤＮＡを変性させて鎖 を分離させる。その後、このアッセイは、ラベル化ヌクレオチドの、結合した一 本鎖ＤＮＡ断片内に含まれる標的配列への添加を伴うが、この標的配列は、標的 部位のすぐ近くにある塩基、つまり、標的部位から一塩基分離れている塩基に５ ゛端を有する。このプローブの３°端は、従って、標的部位のすぐ近くにある標 的配列の塩基、および、プローブに対して添加された塩基に対して相補的であり 、従って、標的部位における塩基に相当する。プローブに対して添加されたヌク レオチドの種類をアッセイすることにより、突然変異部位におけるＤＮＡ断片内 のヌクレオチドを同定し、そして、いろいろなヌクレオチドの相対的比率を定量 することにより、もともとの混合物内に含まれるのウィルスの形態の比率を決定 することができる。 本処理法の用途は、点突然変異をアッセイすることに限定されるのではなく、こ の処理法を、他の方法においてＤＮＡ断片のアッセイに対して応用することがで きるということが明らかになるものと思われる。 従って、本発明の第二の態様においては、ウィルスＲＮＡもしくはＤＮＡ内に含 まれる少なくとも一つの突然変異により変化している負ＮＡウィルスの形態の混 合物中における相対的比率をアッセイする方法であって、 ａｌ）ウィルス粒子に特異的な結合試薬で被覆しである微細な粒子の懸濁液を使 用して、血清からＲＮＡウィルス粒子を捕捉し、ａ２）捕捉したウィルス粒子を 血清から分離し、ｂ）そのウィルス粒子からウィルスＲＮＡを放出させ、Ｃ）そ のＲＮＡ配列の一部分に対して相補的な配列を有する転写プライマーを使用して 、ウィルスＲＮＡをｅＤＮＡに対して逆転写させ、ｄ）最初の段階において、転 写プライマーの配列に対して相補的なＣＤＮＡ配列の一部分がその領域の外側に あるような、ｃＤＮＡの一定領域を特定するＣＤＮＡ配列の一部分に対して相補 的な配列を有する最初のＰＣＲプライマー対を、そして、第二段階においては、 最初のＰＣＲプライマー対に対して相補的なＣＤＮＡ配列の一部分により特定さ れる領域内に存在するＣＤＮＡ配列の一部分に対して相補的な第二ＰＣＲプライ マ一対を使用する繰り込み式多段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてｃ ＤＮＡを増幅させるものであって、第二ＰＣＲプライマー対の内の一つが、特異 的結合パートナ−に対して結合することができる特異的結合試薬で標識されてお り、 ｅ）増幅させたＤＮＡを、増幅させたＤＮＡに対して付加した結合試薬に対して 特異的な結合パートナ−を保持している固体支持体と接触させ、増幅させたＤＮ Ａが基質に対して結合するのを可能にさせ、未取り込みのｄＮＴＰを除去し、そ して、増幅させたＤＮＡを変性させてＤＮＡ鎖を分離し、 ｆ）増幅させたＤＮＡの鎖の内の一つに対して、そのＤＮＡ断片内に含まれる標 的配列に対して相補的な配列を有する一本鎖のＤＮＡオリゴマープローブをアニ ールさせるのであって、この標的配列は、分析する予定の塩基のすぐ近くの塩基 に５′端を有し、プローブ／標的鎖二重らせん鎖を形成し、 ｇｌ）プローブ／標的鎖二重らせん鎖の最初の分注を、ＤＮＡポリメラーゼ酵素 、および、その混合物中に含まれる最初のウィルス形態中に含まれる分析予定の 塩基に相当するラベル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）もしくはジ デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）と−緒にインキュベートし、 ｇ２）プローブ／標的鎖二重らせん鎖の第二の分注をＤＮＡポリメラーゼ酵素、 および、その混合物中に含まれる第二のウィルス形態中に含まれる分析予定の塩 基に相当するラベル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）もしくはジデ オキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）と−緒にインキュベートし、 ｈ）未取り込みのラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰを取り除き、そして、 ｉ）プローブ／標的鎖二重らせんの各分注に含まれる、あるいは、変性および標 的鎖からの分離後のプローブのＤＮＡ各分注に含まれる、プローブに対して結合 したラベルの相対的な量を決定すること、を含んでなる方法を提供する。 ｇｌ）およびｇ２）の二つの段階は、いろいろなラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄ ＮＴＰを使用して三回、およびに、随意に四回繰り返すことができる。他の可能 な突然変異部位における、ウィルス形態内のいろいろな変化を検出することに加 え、他の適切なＰＣＲプライマーおよびプローブを使用して本処理法を繰り返す ことができる。 図１は、実施例１において詳細を記載する実験の結果を示し、ＰＣＲ産物生物中 ２ｆｉｌラベルの量を（被検体：陰性対照比として表示しである）、（ａ）水中 に含まれるＨＩＶ−１ｃＤＮＡの希釈（・）、および、（ｂ）正常なヒト血清中 に含まれるウィルス含有血清の希釈（○および口）に対する相互関係を示しであ る。 図２は、混合物中に含まれるいろいろなウィルス形態の相対的比率ヲ決定するア ッセイにおいて関して、本発明の態様において使用される原理を説明している。 図３は、ＨＩＶ−１リバーストランスクリブターゼ（ＲＴ）内の点突然変異、お よび、実施例２において詳細を記載する実験において使用した互いに関連し合う プローブおよびプライマーの位置を示す。 図４は、実施例２において記載するプラスミドＤＮＡ内に含まれルＨＩＶ−１の ＲＴ遺遺伝山内コドン２１５におけるＴｈｒからＰｈｅへの突然変異の比率を基 に作成した検量線を示す。 図５は、突然変異に関連する薬剤耐性の発生時期を決定することにおＩＪる、本 発明の詳細な説明している。この図は、シトプシン（ｚｉｄ。 ｖｕｄｉｎｅ）処理の時間の長さに対する、患者の、血清中（血清ＲＮＡ　・） 、および、抹消面白血球（プロウィルスＤＮＡ　■）に含まれる、ＨＩＩ−１の リバーストランスクリブターゼ（ＲＴ）遺伝子のコドン７０ｊこおける耐性突然 変異に関連する、シトプシンを保持する総Ｔ（Ｉ■〜１ウィルスゲノムのＤＮＡ 比率を示している。 既に記載したように、血清中に含まれるウィルス粒子は、既知の技術を使用して 捕捉することができる。しかじな−から、ウィルス粒子は、ウィルス粒子に特異 的な抗体のような結合試薬で被覆した、ポリスチレン粒子のような微細な粒子の 懸濁液を使用して捕捉するのが好ましい。これらの粒子は、ＨＩＶ−１のＤＮＡ 包膜蛋白質ｇｐ１２０に対する抗体のような、ウィルス粒子の包膜蛋白質に対し て特異的な抗体で被覆しであることが好ましい。 このような方法を使用する場合、捕捉は、０．１から２０μｍ１好ましくは０． 　５から１μｍ、および最も好ましくは０．７から０．８μｍの直系を有するラ テックスビーズを使用して実行することが好ましい。 このビーズは、例えば、随意に、カルボキシル化により修飾しである、ポリスチ レンもしくはスチレンジビニルベンゼンから形成することができる。その上、こ のビーズは、分離を援助するために磁性物質を含むことができる。 ウィルス粒子の捕捉後、血清の残渣を、例えば、懸濁させた粒子の遠心処理およ び上清の除去により除去する。一般的には、例えば、リン酸緩衝化食塩水のよう な生理学的に容認される緩衝液中でウィルス粒子を洗浄して、すべての残存血清 を確実に除去することが必要である。例えば、ウィルスで被覆した微細な粒子を 緩衝液中に再懸濁させて、再度遠心処理を行うことができる。 その後、ウィルスＲＮＡもしくはＤＮＡを、ウィルス粒子から放出させる。これ は、例えば、Ｔｒｊｔｏｎ　Ｘ−１００のような洗剤を使用する常法において実 行することができる。ウィルスがＤＮＡウィルスである場合には、本アッセイに おける次の段階はＰＣＲ増幅である。しがしながら、ウィルスがＲＮＡウィルス である場合には、ＲＮＡを最初に、リバーストランスクリプターゼを使用して逆 転写させる。ＲＮＡはいったん放出されると簡単に分解されるため、ＲＮＡを放 出させる際にリバーストランスクリブターゼ酵素およびｄＮＴＰ基質が既に存在 するようにしておく、あるいは、ＲＮＡを放出させる試薬と一緒にそれらを添加 することが好ましい。そして、リバーストランスクリプターゼと共に、ＲＮＡア ーゼのインヒビターのような、ＲＮＡの分解を回避させる一つもしくは複数の試 薬を利用することも好ましい。このようにすれば、ＲＮＡが、逆転写が生じる以 前にＲＮＡの分解を引き起こすと思われる環境に露出されることはなくなる。 ｃＤＮＡを産生させる目的で逆転写を行う場合は、最初のＰＣＲプライマ一対に 対して相補的なｃＤＮＡの一部分により特定のｃＤＮＡの一定領域の外側にある ｃＤＮＡの一部分に対して相補的な配列を有することが好ましいプライマーを、 逆転写のために使用する。ＰＣＲプライマーにより特定される領域の外側にある 逆転写プライマーの利用により、転写プライマーがＰＣＲプライマーの内の一つ と同じである場合と比較して、より特異的かつ定量的なＰＣＲ産物が産生される 。転写プライマーが１５から３０までのヌクレオチドのオリゴマーであることが 好ましく、かつ、逆転写を２０から７０℃までの温度、より好ましくは約３７℃ の温度において、３０分間から１８時間まで、より好ましくは９０分間行う。　 別の方法においては、ランダムな配列を有する、六量体のようなオリゴマーの混 合物を、逆転写のためのプライマーとして使用するこのように取得されるウィル スＤＮＡもしくはｃＤＮＡを、例えば、［二重ＪＰＣ’Ｒのような［多重Ｊ　Ｐ ＣＲを使用して増幅させる。典型的には、出発用ＤＮＡもしくはｃＤＮＡの量は 、例えば約ｉ、ｏｏｏ分子のような、−分子から百方分子までであると思われる 。多段階ＰＣＲ処理法の利用により、このような非常に少量の物質がらの特異的 増幅処理法が提供される。ＰＣＲを行う目的においては、プライマーを設計する 目的において、増幅されるＤＮＡのフランク領域の配列を少なくとも部分的には 知っている必要がある。典型的には、ＤＮＡの各鎖内においては、ＰＣＲの各段 階のためのプライマーに対して相補的な各部分は、２０から１，０００の長さの 塩基対、例えば８０から１．０００の長さの塩基対により分離されている。 ＰＣＲは、既知の方法を使用して、ウィルスＤＮＡもしくはｃ　ＤＮＡについて 実行することができる。典型的には、ＰＣＲは、１５から３０までの核酸、より 好ましくは２０から２５までの核酸の、ＤＮＡ重合開始用オリゴマーを使用して 実行する。この反応は、典型的には、（ａ）二本鎖ＤＮＡを変性させるための、 ９２から９６℃までの温度、（ｂ）Ｄ　Ｎ　Ａ　鎖に対してプライマーをアニー ルさせるための、３７から７２°Ｃまでの温度、および、（ｃ）ＤＮＡプライマ ーを伸長させるための、６８から７４℃までの、三つの温度の間で循環させる。 しかしながら、第二段階および第三段階を同じ温度で処理する場合には、二つの 温度のみが必要である。この反応は、セーマス　アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕ ｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のもののような高熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを使用し て行い、反応中に追加的なりＮＡポリメラーゼを添加する必要性を回避すること が好ましい。これは例えば、１０から２００μｌまでの反応量、好ましくは２５ から１００μｌまでの反応量において行うこ本発明を、血清中に含まれるウィル スの量を定量するのに使用する場合には、ＰＣＲのすべての段階を、ＰＣＲ産物 の量が、出発用ＤＮＡ／ＲＮＡの量に対する既知の関連性を生じるような、あら かじめ決定された周期数について実行し、つまり、ＰＣＲは、産物の量が飽和に 達し、かつ、もはや増加しなくなる段階に至らせてはならず、この地点において は産物の量が出発用ＤＮＡの量に対してもはや対比しなくなる。出発用ウィルス ＤＮＡもしくはｃＤＮＡが、例えば、せいぜい約１．　０００分子であるような 少量である場合には、ＰＣＲの最初の一段階もしくは数段階を、２５から４０周 期、より好ましくは約３０がら３５周期行うことが好ましい。 ＰＣＲの最終段階は、少なくとも一つのラベル化ｄＮＴＰの存在下において行う ことができる。このようなｄＮＴＰのすべてをラベル化することができ、あるい は、ラベル化ｄＮＴＰと相関するラベル化していないｄＮＴＰとの混合物を、こ れらの比率が既知であるという前提の元に使用することができる。任意の種類の 因習的なラベル化法を使用することができ、それは、例えば、３２ｐ、３５Ｓ、 もしくは、＋２５Ｔを使用する放射性ラベル化法、あるいは、例えば、フルオレ セイン、ローダミンを使用する蛍光ラベル化法、あるいは、例えばユウロピウム を利用する増強蛍光ラベル化法などである。例えば、”Ｊ−ｄＣＴＰを使用する １２５■ラベル化法を使用することが特に好ましく、それは、この物質が、本ア ッセイに対して特に適するエネルギー範囲を有することが見いだされたためであ る。 ラベル化ｄＮＴＰを使用する以外の別の方法として、ＰＣＲを、ラベル化プライ マーを使用して行うことができる。−このようなプライマーは、因習的なラベル 化技術を使用してラベルすることができる。使用することができるラベルの具体 的な例には、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）およびＦＩＴＣラベル 、およびに、プライマー中に含まれるスルフォン化された塩基などがある。 ＰＣＲの最終段階は、３から２０までの周期、より好ましくは５から１５までの 周期を行うことが好ましい。特に好ましい態様においては、ＰＣＲの最終段階は 、確定している周期数を実行し、そして、標準曲線に対して比較する際、周期数 が至適になるように、例えば、数周期後に産物の一部分を除去することなどによ って、等間隔で中断させる。例えば、ＰＣＲを１５周期行い、そして、標準曲線 の内で最も感度がよく、好ましくは直線である領域において結果が得られるよう に、５周期および１０周期後にサンプルを除去するために中断させることができ る。 ＰＣＲｉ＆、増幅させたＤＮＡを、特異的結合相互作用の利用により、不必要な 成分から分離する。この目的のために、ＰＣＲの最終段階において使用したＰＣ Ｒプライマーの内の一つを、好ましくは５°　一端において、ビオチンのような 特異的結合試薬で標識する。ＰＣＲ後、増幅させたＤＮＡを、固体相への、標識 したプライマーを介する増幅させたＤＮＡの特異的結合を生じる、特異的結合試 薬のための特異的結合パートナ−（ストレプトアビジンのようなもの）を保持す る固体支持体と接触させる。増幅反応混合物の不必要な成分、および、特に、未 取り込みのラベル化ｄＮＰＴを、その後、洗浄して除去することができる。 増幅させたＤＮＡの一本の鎖のみが固体相に対して直接結合するように、ＰＣＲ プライマーの内の一つのみを特異的結合試薬で標識するのが好ましい。 適切な結合試薬／パートナ−の組み合わせには、抗原／抗体対、ビオチン／スト レプトアビジン、および、ビオチン／アビジンがある。これらの組み合わせの内 、どちらのものがＤＮＡに対して結合することができ、そしてもう一方のものが 支持体に結合することができるかということは明白であろう。特に有利な組み合 わせは、プライマーの５′端に結合させたビオチン、および、支持体上に結合さ せたストレプトアビジンもしくはアビジンの利用である。 適切な固体相には、マイクロウェル、ボリスチｌノン球（例えば、６ｍｍのポリ スチレン球）、磁性ラテックスビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、非磁性 ラテックスビーズ、ナイロン膜およびニトロセルロース膜がある。 ＰＣＲ内へのラベルの取り込みを、その後、例えば、放射活性の測定もしくは蛍 光定量法により測定する。ＰＣＲを、ジゴキンゲニン、１１ＴＣ，もしくは、ス ルフォン酸塩ラベル化物でラベル化したプライマーのようなラベル化プライマー を使用して実行した場合には、検出は、そのラベルに特異的なモノクローナル抗 体を使用する免疫アッセイにより行うことができる。 ラベルの測定を、固体相に結合させたＰＣＲ産物について行うことができる。別 の方法では、ＤＮＡ産物の鎖を、特異的結合相互作用により固体支持体に結合し ていない鎖を変性により分離し、それを単離し、そして、その鎖内に取り込まれ ているラベルを測定することができる。 標準曲線を作成して、血清サンプルをアッセイするのに使用したものと同じ条件 下においてウィルス粒子の既知の量を使用して、ＰＣＲ産物内に取り込まれてい るラベルの量を決定することができる。このような曲線と比較することにより、 血清中に存在するウィルス粒子の量を定量することができる。同様に、ウィルス ＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくは、ｃＤＮＡの既知の量を使用して作成した曲線と比較 することにより、サンプル中に存在するこれらの量を決定することができる。 混合物中に含まれるウィルス形態の相対的比率の定量本発明の方法を使用してこ のような比率を定量する場合には、分析予定の塩基（これはいろいろなウィルス 形態においてさまざまであり、従って、本明細書中においては今後、標的部位と する）のすぐ近くにある配列（本明細書中においては今後、標的配列とする）も やはり既知でありプローブを設計することができるということが必要である。ま た、その標的配列の両端を挟み込んでいる領域の配列が既知でありＰＣＲプライ マーを設計することができるということも必要である。 本態様において使用されるＰＣＲの両方の段階は、ラベル化されていないｄ　Ｎ 　Ｔ　Ｐを使用して実行するが、最終段階においては、特異的結合試薬で標識し たプライマーを利用する。これにより、特異的結合試薬により、一つの鎖が、好 ましくはその５°端が標識されている、二本鎖のＰＣＲ産物が産生される（図２ Ａを参照せよ）。ＰＣＲの各段階は、２５から４５周期、好ましくは３０から４ ０周期を行うことが好ましい。 ＰＣＲの後、増幅させたＤＮＡを、特異的結合相互作用の利用により、不必要な 成分から分離する（図２Ｂ）。これを行う前に、増幅させたＤＮＡを、各々異な るラベル化ｄ　Ｎ　Ｔ　ＰもしくはｄｄＮＴＰと一緒に別々にインキュベートさ せる目的で、一つを上回る分注、好ましくは４つの別々な分注に分配する。 特異的結合相互作用を提供するために、ＰＣＲの最終段階において使用するＰＣ Ｒプライマーの内の一つを、ビオチンのような特異的結合試薬で、好ましくは５ ゛端を標識する。ＰＣＨ後、増幅させたＤＮＡを、固体相に対する、標識したプ ライマーを介する増幅させたＤＮＡの特異的結合を生じる特異的結合試薬のため の特異的結合パートナ−（ストレプトアビジンのような）を保持する固体支持体 に接触させる。増幅用反応混合物の不必要な成分、および、特に、未取り込みの ｄＮＴＰを、その後洗浄して取り除くことができる。 増幅させたＤＮＡの内の一本の鎖のみが固体相に対して直接結合するように、Ｐ ＣＲプライマーの内の一つのみを特異的結合試薬で標識する。 ＤＮＡを変性させて鎖を分離させる場合には、その後、もう一方の鎖を洗浄によ り取り除くことができる。両方のプライマーを標識させる場合には、変性させた 増幅ＤＮＡが、変性条件を解除した際に再度アニールすることがあり、このこと により、後続の標的部位の検出が阻害されるものと思われる。 適切な結合試薬／パートナ−の組み合わせには、抗原／抗体対、ビオチン／スト レプトアビジン、および、ビオチン／アビジンがある。これらの組み合わせの内 、どちらのものがＤＮＡに対して結合することができ、そしてもう一方のものが 支持体に結合することができるかということは明白であろう。特に有利な組ろ合 わせは、プライマーの５′端に結もしくはアビジンの利用である。 適切な固体相には、マイクロウェル、ポリスチレン球（例えば、６ｍｍのポリス チレン球）、磁性ラテックスビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、非磁性ラ テックスビーズ、ナ・イロン膜およびニトロセルロース膜がある。 固体支持体に結合させたＤＮＡを、その後変性させて鎖を分離する（図２Ｃ）。 −例では、これは、例えば、水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムのような もので、例えば、少なくとも１０もしくはそれを上回るｐＩ］におけるアルカリ 性条件に））　ＣＲ産物を供することにより、あるいは、９４から１０００Ｃの 温度、好ましくは約９５℃の温度に増幅産物を加熱することにより行うことがで きる。特異的結合試薬およびパー　トナーを変性させること、およびに、それら の特異的結合を破壊することを回避させるように条件を選択するものと思われる 。 変性段階後、標的配列を含む、固体支持体に対しＣ結合している一本鎖の増幅産 物を、−末鎖のオリゴマーＤＮＡプローブに対してアニールさせて、プローブ／ 標的鎖二重らせんを形成させる（図２Ｄ）。 ブしフープは、典型的には、２０から３０塩基分の長さである。プローブの配列 は、５°方向における標的部位のすぐ近くにある標的配列に相当する。点突然変 異の分析の場合には、標的部位は突然変異の地点であり、他の場合においては、 それは単に分析予定の塩基である。 特定の場合においては、標的部位はＰＣＨにおいて使用するプライアーの内の一 つのものの３゛端の下流にある一つの塩基であり、この場合には、このプライマ ーをやはりプローブとしても使用することができる。 標的配列に対するプローブのアニールは、典型的には、過剰のプローブを使用し て、上昇させた温度において実行することができる。典型的には、この温度は５ ０から６０℃であり、そして、この温度を３０秒間から５分間保持し、そして、 その後、溶液をゆっくりと冷却させ名。 アニール後、プローブ／標的鎖の二重らせんを単一のラベル化ｄＮＴＰ１あるい は、好ましべはｄｄＮＴＰ、およびに、例えば、シークエナーゼ（Ｓ　ｅ　ｑ　 ｕ　ｅ　ｎ　ａ　ｓ　ｅ）のような、フレノウＤＮＡポリメラーゼもしくはＴ７ 　ＤＮＡポリメラーゼのようなりＮＡポリメラーゼ酵素と一緒にインキュベート する（図２Ｅ）。ラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰが標的部位の塩基に対し て相補的である場合には、そのラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰはプローブ に対して結合するが、そうでない場合には、そのラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄ ＮＴＰは、通常ではプローブ内に取り込まれない。従って、このことにより標的 部位の塩基を同定することができる。 ラベル化ｄＮＴＰよりはむしろラベル化ｄｄＮＴＰを使用することが好ましいが 、この場合には、このことにより、ラベル化された最初の塩基が結合した後に、 さらに別のラベル化ヌクレオチドがプライマーに対して結合するのを回避させる 。従って、プローブの３゛端の下流にある標的鎖の配列がラベル化されたヌクレ オチドに相当する反復する塩基を含む場合には、ｄＮＴＰでは複数のラベル化塩 基が結合してしまうが、ｄｄＮＴＰでは、蛍独のラベル化塩基のみが取り込まれ る。 例えば、３２ｐもしくは３５Ｓのような放射活性ラベル、あるいは、フルオレセ インもしくはローダミンのような蛍光ラベルのような、任意の因習的なラベルを ラベル化ｄＮＴＰもしくはｃｌｄＮＴＰにおいて使用することができる。 プローブ／標的鎖二重らせんの分離サンプルを、同じラベルを保持するいろいろ なラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰで処理して、いろいろなヌクレオチドを 取り込んでいるサンプルの相対的比率を評定することができることが好ましい。 幾つかの事例においては、いろいろなラベルをいろいろなｄＮＴＰと共に使用す ることができ、−例では、いろいろな比色定量用ラベルを使用することができる 。 ラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰと一緒にインキュベートした後、未取り込 みのラベル化ｄＮＴＰもしくはｄｄＮＴＰを、プローブ／標的二重らせんから分 離する。プローブ／標的二重らせんは固体用に結合するため、これは洗浄により 行うことができる。 最終的に、プローブ内へのラベルの取り込みの程度を、例えば、放射活性の測定 もしくは蛍光定量法により測定する。この検出もしくは測定は、プローブ／標的 鎮の二重らせんにおいて、好ましくは、例えば、アルカリ性条件のような条件下 における変性により標的の鎖から分離することができるプローブ単独について行 うことができる。検出は、例えば、マイクロタイターウェル中に含まれるサンプ ルに関して、シンチレーションカウンターを使用して行うことができる。 プローブ／標的二重らせんの変性後、標的鎖を緩衝液中での洗浄により再生処理 し、その後、先に記載した方法を使用して、第二標的部位における塩基の分析の ための第ニブローブに対してアニールさせる。標的鎖を、このようなさらに進ん だアッセイを行う前に、数日間までは緩衝液中に保存することができる。この処 理法は、さらに別の標的部位におけるアッセイのためにさらに反復することがで きる。 本発明の方法を使用して、点突然変異のためのアッセイを行い、さらに、混合物 中に含まれるウィルス形態の相対的比率、つまり、いろいろラベル化ｄＮＴＰも しくはｄｄＮＴＰの取り込みの程度の比較による、突然変異集団／非突然変異集 団の混合物中に含まれる突然変異の程度を決定することが可能である。複数のウ ィルス形態の内の一つのものにおいて、標的部位における塩基が、一つもしくは 複数のすぐ後続する塩基において反復している場合には、これにより、一つを上 回る塩基のプローブ内への取り込みが生じ、従って、ラベルの取り込みが増大す る。このようなラベルの取り込みの増大を、混合物中に含まれるいろいろなウィ ルス形態の相対的比率を決定する際に考慮に入れる。 混合物中に含まれるウィルスの量および相対的比率の定量化を組み合わせて使用 して、血清サンプルのより詳細な分析を行うことができるということは評価に値 するところであろう。従って、ＰＣＲ段階以前に、サンプルを二つの分注に分配 し、一つのものについてウィルスの量のためのアッセイを行い、もう一方のもの をウィルス形態の相対的比率のためのアッセイを行うことができる。 本発明は以下に示される実施例を参考にすることによりより良く説明されるもの と思われる。 実施例１ ６人の未感染患者、およびに、６人のＣＤＣグループＩＩ患者、９人のＣＤＣグ ループＩ　Ｉ　Ｉ　患者、オヨヒ、１４人のＣＤＣグループＩＶ患者を含む、Ｃ ｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　（ＣＤＣ）の分類法に より定義された、ＨＩＶ−１疾患の様々な段階にある２９人の感染患者を代表的 な研究対象としてサンプル抽出した。 凝固させ、分離し、そして、この研究を行う前に最高４年までの間−７０℃に血 清を保存した。 ラテックスペレットの調製 血清／血漿ＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡのアッセイのために、ラテックス微粒子を、抗− ＨＩＶ−１抗体で被覆した。１０パーセントのラテックス溶液（Ｓｉｇｍａ　Ｌ ｉｍ１ｔｅｄ、−等量）を、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，６， ５０等量）で３回洗浄し、そして、遠心処理（１０，０００ｇで１０分間）によ りペレット状にさせた。このラテ・ソクスペレノトを、その後、ＨＩＶ−１の組 換え表面包膜糖蛋白質（抗−ｇｐ−１６０／１２０）に対して作成した一つのモ ノクローナル抗体および４つのポリクローナル抗体（各８０μｇ／ｍｌ）を含む Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（５０等ｌｌ）内に再懸濁させ、そして、室温において 緩和に農産させながらインキュベートした（２４時間）。被覆したラテックスを 、先のようにペレット状にさせて３回洗浄しく７．０００ｇで６分間）、そ［） で、最後に、アシ化ナトリウム（０，１％）を含む０．ＬＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩 衝液（ｐＨ７，６，３５等量）内に再懸蘭させた。 ウィルスを捕捉し、かつ、ＨＩＶ−１のｃＤＮＡを産生させるために、最初は血 清に遠心処理を施して任意の細胞性断片を取り除いた（１５゜０００ｇで１５分 間）。その後、血清（１００Ｉｌｉりを取り出し、抗−ＨＩＶ−１で被覆したラ テックス溶液（２０μ／）と−緒に、室温において１時間、緩和に振盪させなが らインキュベートした。その後、ラテックス／ウィルス複合体をペレット状にさ せ（７，０００ｇで４分間）、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ、１００μｌ）中に おいて洗浄し、そして、ペレット状にさせた（７，０００ｇで４分間）。洗浄し たペレットを、Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ　−Ｘ−１００（０，１％）、リバーストラン スクリプターゼ　プライマー　ＣＰＩ　（５’ＧＧＡＧＧＧＧＴＡＴＴＧＡＣＡ Ａ３’）（０，１Ｍモル／ｌ’）　、Ｈｅｐｅｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ６，９，５ｍ モル／ｌ）、ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０，０，１ｍモル／ｌ’）、Ｔｒｉｓ−ＨＣ Ｉ　（ｐＨ７，５，５０ｍモル／ｌ）　、ＫＣ１（７５ｍ−Ｅル／Ａ’）　、Ｍ ｇ　Ｃ］　２　（３ｍモル／Ａり　、ＤＴＴ　（１０ｍモル／ｌ）、各ｄＮＴＰ 　（各０．５ｍモル／ｌ）、ＲＮアーゼ　インヒビター（２２単位）（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａＬｔｄ）、および、組換えＭｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのリ バーストランスクリブターゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ）（１５単位）を含 む溶液（２０μｌ）中に再懸濁させた。この混合物を、３７℃において９０分間 インキュベートした。 ＣＲによりｃＤＮＡを増幅させ、そして定員を行った。１０マイクロリツトルの 患者由来のｃＤＮＡを、外部プライマー、ＭＨ５５’ＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧ ＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＴ３’ＮＨ６５’ＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＣＡ ＧＧＴＧＧＣ３′ を使用して、５０μｌの反応混合物中における初回のＰＣＲにおいて増幅させた 。 ２マイクロリツトルの初回産物を、内部プライマー、ＰＯＬ　１　ビオチニル化 させた（５’ＣＡＧＧＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＴＧＡＧＧ３’） ＰＯＬ２　（５’ＣＣＣＡＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＴＡＴＧＧＧＴ３′） を使用して、第二ＰＣＲにより増幅させた。 両方の反応は、Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ　（ｐＨ８，３，１０ｍモル／ｌ）、ＫＣＩ　 （５０ｍモル／ｌ）、ＭｇＣ＋２　（１，５ｍモル／ｌ）、ゼラチン（００１％ 　Ｗ／ｖ）、工ａｑ　ポリメラーゼ（”Ａｍｐｌｉｔａｑ”Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌ ｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、１．２５単位）、および、プライマー（各０１μモル／ｌ ）を含む、反応混合物全体（５０μｌ）において行った。 最初のＰＣＲは、反応混合物中に含まれる２００μＭの濃度の各ｄＮＴＰを使用 して行った。熱周期は、９４℃で４分間の１周期、９４℃で１分間、６０℃で１ 分間、および、７２℃で１分間の３５周期、そして、最後に７２℃で７分間の１ 周期で構成されていた。 第二ＰＣＲを、ｄＧＴＰ　（２０Ｉモル／ｌ’）　、ｄＡＴＰ　（２０Ｉモル／ Ｖ）　、ｄＴＴＰ　（２０Ｉモル／ｌ）　、１２５１　ｄＣＴＰ　（ＮＥＮ　Ｄ ｕｐｏｎｔ　（Ｉｏｎモル／ｌ）、および、ブライ７−　（Ｂ　ｉ　ｏ　ＰＯＬ 　１およびＰＯＬ２）（各０．１μモル／Ａ’）を使用して行った。熱周期は、 ９４℃で１分間、５０℃で１分間、そして、７２℃で１分間、の総計１５周期で 構成されていた。 ＰＣＲ産物（１０，１’）　を、５周期、１０周期、オヨヒ、１５周期１に第二 ＰＣＲ反応物から取り出し、そして、別々に、ＰＢＳ　（９０μｌ）中に含まれ るＴｗｅｅｎ−２０（０，５％）を含んでいる、ストレプトアビジン被覆済みの ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌｓ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌｔｄ）に添加した。室温におけ るインキュベーション（３０分間）の後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−２０（０，０ ５％）を含むＴｒｊｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６，０，ＯＩＭ）で完全に洗浄し、そ して、；２５Ｉでラベル化ＤＮＡの結合をガンマ−カウンターにより計測した。 糀！ ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる沈殿 法により測定し、そして、ｃＤＮＡを、既に記載されているＰＣＨにおける終点 滴定により定量した（Ｓｅｍｐｌｅ　Ｍ、Ｌｏｖｅｄａｙ　Ｃ５Ｗｅｌｌｅｒ　 Ｉ　ａｎｄ　Ｔｅｄｄｅｒ　Ｒ（１９９１）免疫親和性アッセイを、すべての標 本に関する１２５Ｉ結合についての被検体：陰性対照比（Ｔ　：　Ｎ）を得るこ とにより標準化させた。抗−ＨＩＶ−１抗体についてのスクリーニングを行っで ある、血液提供者からのプールした正常ヒト血清（ＮＨ３）を、陰性の血清対照 として各アッセイにおいて用いた。ＨＩＶ−１感染中者がらの血清ｒＭＪを分注 し、陽性の血清対照として各アッセイにおいて用いた。後の方のアッセイにおい ては、血清ｒＭＪおよび血清ｒＫＪの両方ともが検出可能な無細胞）ＴＴＶ−Ｉ 　ＲＮＡの既知の力価を含んでおり、これを使用して回帰線を作成し、既知のコ ピー数／ｍｌのプロウィルスＨＩＶ−Ｉ　ＣＢＬ−Ｉ　ＤＮＡの一連の希釈系列 をすべての繰り込み式ＰＣＲ反応に使用した。この系列中の各濃度におけるＨＩ Ｖ−Ｉ　ＤＮＡの既知のコピー数についてのＴＡＮ比を、第二回目のＰＣＲの５ 周期、１０周期、および、１５周期後のサンプル抽出に基づいてプロットして標 準曲線を作成した。 実験標本の逆転写により作成されるＨＩＶ−１ＣＤＮＡ濃度のコピー数を、その 標準ＤＮＡ曲線との比較により評定した。一つのＲＮＡゲノムが単一のｃＤＮＡ コピーを作成すると仮定して、被検体に含まれるＩ］ＩＶ’−Ｉ　ＲＮＡについ ての最小コピー数を、ｍ１当たりのｃＤＮＡのコピー値から取得した。 被覆しであるラテックスに対して非特異的に吸着することがあるプロウィルスＤ ＮＡの増幅の可能性に対する対照をとるため、２０人の）（ＩＶ−１感染患者か らの血清サンプルを、記載のように、ラテックス溶液（抗体で被覆していない） と−緒にインキコベートした。ラテックスをベレッ（・状にさせ、洗浄し、そし て、Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ−Ｘ−１００（０１％）を含むＰＣＲ緩ｉｔｉ液中に再懸 濁させ、そして、先の定量的ＰＣＲ計画に供した。 アッセイ内の再現性を評価するために、血清ｒＭＪを一回のアッセイにおいて９ 回測定し、その値を比較した（平均値、レンジ、および、標準偏差）。アッセイ 間における可変性を評価するために、同じ血清を１１回の連続するアッセイにお いて測定し、結果を比較した（平均値、Ｌノシン、および、標準偏差）。 血清は、既知の方法によりウィルス感染の標識についてテストした。 ＨＩＶ−１感染患者からの、アッセイを行った２０本の血清サンプルの内の任意 のものにおいてはプロウィルスＤＮＡは検出されなかった。ＣＤＮＡ濃度の定量 については、１２５Ｉ濃度の結合がＤＮＡコピー数／ｍｌに相関する場合に直線 の用量反応曲線が見い出され、図１ａは、水中に含まれるＨＩＶ−１プロウイル スＤＮＡの希釈に対する被検体、陰性対照比として表される１２５Ｉ結合を示し ている。その上、１２５Ｉ結合もやはり、分析を行った被検体血清中に含まれる ＨＴＶ−Ｉ　ＲＮＡの力価に対して直線関係を示しており、図１ｂは、正常ヒト 血清中に含まれる血清「Ｋ」　（ロ）および「Ｍ」　（○）の希釈に対するＨＩ Ｖ−１プロウイルスＤＮＡの希釈についての、被検体・陰性対照被検体として表 される１２５）結合を示している。良好なアッセイ内再現性が、血清ｒＭＪにつ いて得られた反復結果により証明された。４４，９０４ｃ／ｍｌの平均力価（血 清のｍ１当たりのＨＩＶ−Ｉ　ＲＮＡの最小コピーとして表される：ｃ／’ｒｒ ＋１）が、ｌｏｇ＋ａの１／３の範囲に関して取得され（２８゜０６０ｃ／ｍＡ ’から５２．　２８０　ｃ／ｍｌ）、そして、７．８３７ｃ／ｍｌという標準偏 差が得られた。それと比較して、アッセイ間の可変性はより大きいものであった 。１１回の連続するアッセイにおいて試験した同一の陽性対照が、ｌｏｇ＋ｏの ３／４の範囲内に関して３］、、１．５３Ｃ／ｍｌという平均コピー数を生じ（ １２，０４０ｃ／ｒｒ＋１から６４．２００Ｃ／ｍｌ）、そして、１８．８８６ ｃ／ｍｌという標準偏差が得られた。 免疫親和性アッセイおよびＰＥＧアッセイにより測定した、患者の代表的なグル ープからの血清中に含まれる血漿１−（ＴＶ−Ｉ　ＲＮＡ濃度を比較した。ＨＩ Ｖ−Ｉ　ＲＮＡは、感染固体からのすべての血清中において検出された。ＰＥＧ 法により測定されたサンプル中に含まれるＨＴＶ−Ｉ　ＲＮＡの幾何学上の平均 力価は、６８１　ｃ／ｍｌ　（ＣＤＣＩ！、ｎ−６）　、７７４ｃ／ｍＡ’　（ ＣＤＣＩ　Ｉ　Ｉ、ｎ＝９）　、および、８４８２ｃ／ｍ１（ＣＤＣＩＶ、ｎ＝ １４）であった。新しい免疫親和性定量的ＰＣＲ法により測定した場合、力価は 、各々、２４１ｃ／ｍ！、３７４　ｃ／ｍｌ、および、２５．５２３ｃ／ｍＡ’ であった。免疫親和性法およびＰＥＧ法により評定されたウィルスのレベル間に は良好な相関が存在したく相関係数　ｒ＝０．９４、Ｐ＞０．００１）、ｐ２４ 抗原は、感染固体からの２９本の血清の内の１４本のみにおいて検出され、さら に、これら１４本の内の３本のみが、ＣＤＣグループＩＩおよびＩＩＩに含まれ る患者に由来するものであった。 実施例２ サンプルを、ＨＩＶ−１のリバーストランスクリブターゼ（ＲＴ）遺、　伝子ト おける点突然変異について分析した。４つの点突然変異を、）（Ｉｖ−１のＲＴ 遺伝子のコドン６７．７０．２１５、および、２１９におけるそれらの存在につ いてアッセイし、それを図３に示した。 個々のアッセイにおいて使用したプライマーおよびプローブを以下に列挙し、そ して、ＲＴ遺伝子内におけるそれらの相対的な位置を、図３において示した。 プライマー５ＰＰ１（２１Ｍ体）５′＾ＧＧＡαゴＡＣ＾αゴロＴ：　ＡＡＣＡ Ｔ　３’　（センス）プライマーＭＨ６Ａ　（２１Ｍ体）　５′Ａ　ＣＴＣＡＧ Ｇ　ＡＡＴα：Ａ　ＧＧＴ　ＧＧＣＴｒ　３’　（アンチセンス）ブライ？−３ ＰＰ２　（２４量体＋　５’ＧＴＴＧＡσＣＡＧ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＴＧＣＡＣ ｒ　７７３’　（セ＞Ｘ）ビオチン化されており、プローブＡＲＰ１、ＡＲＰ３ 、ＡＲＰ４Ｃと共に使用するためのものブライ？−５ＰＰ６　（２３Ｍ体）　５ ’ＴＧ　ＧＡＧ　ＴｒＣＡＴ＾ＡＣＣＣＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　３’　（７ン＋ センＸ）ビオチン化されており、プローブＡＲＰ２Ｂと共に使用するためのもの プローブＡＲＰＩ　（２０Ｍ体）５′ηＴ　ＴＣＴ　ＱＩＪ　ＴＴＴ　ＡＧＴ　 ＡＣＴ　ＧＴ　３’　（７ン＋センス）野生型はＣを添加し、変異体はＴＸＴを 添加するコドン６７のためのものブＣ１−ブＡＲＰ３　（２０Ｍ体’）　５’Ａ ＡＧＴＴＣｍＣＴＧＡＴＧｍＴＴ３′（アンチセンス）野生型はＴを添加し、変 異体はＧＸ２を添加するコドン２１９の！こめのちのプローブＡＲＰ４Ｃ（２２ Ｍ体）　５’ＣＴＧＡπ１了η了ＧＴＣＴＧＧ　面Ｇ　３′（７ン＋センス）野 生型はＧを添加し、変異体はＡＸ２　（Ｐｈｅ）もしくはＴｃＴｙｒ）を添加す るコドン２１５のためのもの分析のためのサンプル ＤＮＡ配列を、プロテイナーゼ　Ｋ、Ｔｗｅｅｎ　２０、および、ＮＰ４０を含 む抽出緩衝液中において、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅで分離したＰＢＭＣから抽 出したＤＮＡから増幅させた（Ｈｉｇｕｃｈｉ　１９８９）、対照配列は、Ｂｒ ｅｎｄａｎ　Ｌａｒｄｅｒ、Ｗｅｌｌｃ。 ｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅｃｋｅｎｈａｍ、Ｕ 、に、　、より供給されたプラスミドＤＮＡ　（ＲＴＩ／Ｈ）およびＲＴＭＣ， あるいは、慢性的に感染しているＭＴ−２細胞株（ＭＲＣＡＩＤＳ　Ｒｅａｇｅ ｎｔｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔにより供給されたＡ０１２ＢおよびＡＯ１２Ｄ）から抽 出したＤＮＡから増幅させた。 ＲＮＡは、実施例１において記載のように、ウィルスに特異的な抗体で被覆しで あるラテックスビーズ上におけるウィルス粒子の捕捉、ウィルス粒子の溶菌、お よび、ｃＤＮＡを産生させるための逆転写により分析することができる。 ＰＣＲ増幅 各配列を、繰り込み式のプライマーセットを使用する二重ＰＣＲにおいて増幅さ せた。初回のＰＣＲのための熱周期は、９４℃で４分間の１周期、９４℃で１分 間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の３５周期、および、７２℃で７分間の１ 周期で構成されていた。第二回目の（「繰り込み式Ｊ）ＰＣＲは、９４℃で１分 間、５５℃で１分間、７２℃で１分間１．７２℃で１分間の３５周期、およびに 、７２℃で７分間の１周期で構成されていた。反応は、Ｔｒ　ｉ　ｓ／ＨＣＩ（ １０ｍＭ、ｐＨ８，３）、ＫＣｌ　（５０ｍＭ）　、ＭｇＣｌ２　（１，５ｍＭ ’）１ゼラヂン（０，０１％　ｗ／′ｖ、　５０１ｔｌ）　、工ａｑポリメラー ゼ（“Ａｍｐ　Ｉ　ｉ　ｔａｑ”：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＣｅｔｕＳ；１ 単位）、各ｄＮＴＰ（各２００μＭ）、および、各プライマー（各０．１μＭ） を含む反応混合物（５０μｌ）中で行った。 マイクロタイタ一点突然変異アッセイ ＰＣＲ産物（１０μｌ分注）を、Ｔｗｅｅｎ　２０　（０，０５％）を含むＴ　 ｒ　ｉ　ｓ／ＨＣＩ緩衝液（１０℃Ｍ、ｐＨ７，６）（ＴＴＢ）で希釈した２Ｆ Ｈｔｌに）、ストレプトアビジン（２５ｕ　ｇ／ｍＡ、　２５　ｕＩ／ウェル） で被覆しである４つのマイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ、Ｕ−ウェル）の各々 に加え、そして、室温でインキュベートして（１５分間）、ビオチニル化させで あるＰＣＲ産物を捕捉した。 このウェルをＴＴＢで洗浄して（３回）ＰＣＲ反応成分を取り除き、その後、Ｎ ａＯＨ（４０１’、ｏ、１５Ｍ）を、各ウェルに対して室温で５分間添加して、 捕捉したＰＣＲ産物を変性させた。それらのウェルをＴＴＢで洗浄して（４回） 、放出された二番目の鎖を取り除き、そして、アニール用ミックス（２０ｍＭの Ｍ　ｇ　Ｃ１ｔ、５０ｍＭのＮａＣｌ。 および、２．５μＭのオリゴヌクレオチドプローブを含む４０ｍＭのＴｒｉｓ／ ＨＣＩ、ｐＨ７，６の２５μＡ’）を各ウェルに添加した。これらのウェルを温 水浴槽中で加熱しく６５℃）、その温度に３分間維持し、そして、室温にゆっ（ りと冷却させて（３０分）、プローブをアニールさせた。ラベル化用ミックス（ １６，６μＭのジチオスレイトール、０゜０１６％のＢＳＡ、０，１５単位のフ レノウＤＮＡポリメラーゼ、および、０．１６℃Ｍの一種類の３５　［３］ラベ ル化ｄＮＴＰ−１２００Ｃｉ／ｍモルを含む４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐＨ ７，６）の分注（６μｌ）を、各ウェルに添加するが、それぞれ異なるラベル化 ｄＮＴＰを４つのウェルの各々に対して添加してゆき、そして、これを室温にお いてインキュベートした（２分）。その後、これらのウェルをＴＴＢで洗浄する が（５回）、４度目の洗浄後は浸透させて洗浄しく１分）、未取り込みのラベル を除去した。その後、ＮａＯＨ（４０μｌ、領　１５Ｍ）を各ウェルに添加して 、プローブを変性させると共に、標的鎖から未取り込みのラベル化ヌクレオチド を取り除いた。このＮａＯＨ溶液を除去し、そして、５ｍｌのシンチレーション カクテル（ＯｐｔｉｐｈａｓｅＨｉｓａｆｅ−３、ＬＫＢ）と混合させた。サン プルを、ＬＫＢ　Ｍｉｎｉｂｅｔａにおいて１分間計測した。 別の方法として、本処理法において使用した緩衝液は、追加的に、細菌の混入を 阻害するための０．１％のアジ化ナトリウムを含むことができる（このような緩 衝液をＴＴＡと表示する）。 野生型配列および変異体配列のパーセント率を、分析予定の地点において見いだ されなかったある塩基もしくは複数の塩基（つまり、コドン６７におけるＡおよ びＧ１コドン７０におけるＣおよびＴ、コドン２１５におけるＣ１コドン２１９ におけるＡおよびＣ）から得られる非特異的なバックグラウンド測定値を差し引 いた後に計算した。コドン６７における変異体のＴ添加についての放射性ラベル の取り込みは７塩基であり、従って、この場合においてはＴシグナルを７で割っ た。同様に、コドン７０における野生型配列は二つのＡ残基を取り込み、そして 、コドン２１５におけるＰｈｅ突然変異は２つのＡ残基を取り込み、そして、こ れらのシグナルの各々を先に従って調整した。 コドン２１５におけるＴｈｒからＰｈｅへの突然変異についての標準曲線は、野 生型（Ｒ”［／Ｈ）プラスミドおよび変異体（ＲＴＭＣ）プラスミドの既知のＤ ＮＡコピー数を混合することにより取得した。プラスミドサンプル配列は、Ｓｉ ｍｍｏｎｄｓ　ｅｔ　ａｌ、（Ｓｉｍｍ。 ｎｄｓ、Ｐ、　、Ｂａ１ｆｅ、Ｐ　５Ｐｅｕｔｈｅｒｅｒ、Ｊ、Ｆ、　、Ｌｕｄ ｌａｍ、Ｃ，Ａ、、Ｂ１５ｈｏｐ、Ｊ、Ｏ，ａｎｄ　Ｌｅｉｇｈ−Ｂｒｏｗｎ、 Ａ、Ｊ、　（１９９０）：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６４．８ ６４−８７２）の方法に従う、ＰＣＲ内における終点希釈により定量し、そして 、点突然変異アッセイによる分析のためのＰＣＲ反応物に添加したＤＮＡコピー の総数は１０３であった。結果を表１および図４に示す。図４は、添加した変異 体プラスミドのパーセント率に対する、検出された変異体プラスミドのパーセン ト率としての、コドン２１５における突然変異の検出のための検量線を示す。 対照サンプルにより得られる組織培養物の分析を表ＩＩにおいて示す。 これらのサンプルは、シトプシン（ｚ　ｉ　ｄｏｖｕｄ　１ｎｅ）療法の開始後 ２力月目（Ａ０１２Ｂ）および２６力月目（ＡＯ１２Ｄ）において作成した単離 物から取得した。サンプルＡ０１２Ｂは４つのコドンすべてにおいて約１００％ の野生型配列を示すのに対して、ＡＯ１２Ｄは、コドン６７．２１５、および、 ２１９においては約１００％の変異体配列を、そして、コドン７０においては２ ３．２％・７４．８％の野生型：この方法をうまく使用して、ウィルス集団中に おける２％程の低い突然変異の発生率を検出することができる。 表２ ａ、ａ、６７において、野生型二０１変異体＝Ｔａ、ａ、７０において、野生型 ＝Ａ、変異体＝Ｇａ、ａ、２１．５において、野生型＝Ｇ、変異体＝Ａ（ｐｈｅ ）もしくはＴ（ｔｙｒ） ａ、ａ、２１５において、野生型＝Ｔ、変異体＝ＧＡ０１２Ｂ＝２カ月間シトプ シンで治療した患者からのＭＴ２細胞培養物中に含まれる単離物（ＭＲＣＡＩＤ Ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｐｒｏｊｅｃｔ） ＡＯ１２Ｄ＝２６カ月間ジドブンンで治療した患者からのＭＴ２細胞培養物中に 含まれる単離物（ＭＲＣＡＩＤＳ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｐｒ。 ＴｈｒからＴｙｒへのコドン２１５の突然変異についての、実施例２において記 載の点突然変異アッセイの再現性を５回の反復実験において、４つノサンプル、 ａ、ｂ、ｃ、および、ｄについて調査した。無細胞ウィルスＲＮＡおよびプロウ ィルスＤＮＡのアッセイについて、各々、表３および４において示されるこれら の実験の結果は、作業毎にはほとんど変化を示していない。 飢 コドーン２１５におけるＴｙｒへの突然変異についての無細胞ウィルスＲＮＡア ッセイ コドン２１５におけるＴｙｒへの突然変異についてのプロウィルスＤＮＡアッセ イ 実施例２の方法を使用して、プローブとしてＡＲＰ４Ｃを使用して、コドン２１ ５における突然変異についてのアッセイを行った。吸引後、サンプルをＴＴＢ緩 衝液で４回洗浄し、さらに、吸引した。その後、サンプルを第ニブローブＡＲＰ １に対してアニールさせて、同じ処理法を使用して、コドン６７における突然変 異についてのアッセイを行った。 単一のプローブについてのこの反復アッセイの結果を、２つのサンプルについて 、以下に示した。 コドン２１５における突然変異についてＡＲＰ４Ｃを使用して探索をＧ＝２２８ ６０　ｃｐｍ　）　野生型＝９９％Ａ＝６８　ｃｐｍ　）　ｐｈｅへの突然変異 ＝０％Ｔ−１７９ｃｐｍ　）　ｔｒｙへの突然変異＝１％Ｃ＝２７　ｃｐｍ　） コドン６７における突然変異についてＡＲＰｌを使用して再探索を行った。 Ｃ＝１９００９　ｃｐｍ　）　野生型＝９８％Ｔ＝３５００　ｃｐｍ　） Ａ＝３８４　ｃｐｍ　）　変異体＝２％Ｇ＝７９　ｃｐｍ　） サンプル２ コドン２１５における突然変異についてＡＲＰ４Ｃを使用して探索を行った。 Ｇ＝１０４２６　ｃｐｒｒｒ　）　野生型＝７０％Ａ＝５９７　ｃｐｍ　）　変 異体（ｐｈｅ）＝２％Ｔ＝４１３２　ｃｐｍ　）　変異体（ｔｙｒ）＝２８％Ｃ ＝４３　ｃｐｍ　） コドン６７における突然変異についてＡＲＰｌを使用して再探索を行った。 Ｃ＝２０６０　ｃｐｍ　）　野生型＝５３％Ｔ＝１２８２５　ｃｐｍ　） Ａ＝５１　ｃｐｍ　）　変異体＝４７％Ｇ＝６３　ｃｐｍ　） リバーストランスクリプターゼ酵素の三次元構造が同定されたことにより、その 酵素の様々な活性部位の同定、および、薬剤耐性に関連するアミノ酸の位置の同 定が行われた。コドン１８３−１８６　（チロシン、メチオニン、アスパラギン 酸、アスパラギン酸）によりコードされるアミノ酸の配列は酵素活性にとって必 要不可欠であるようであり、かつ、この配列の調製は、数々の非ヌクレオシドＲ Ｔインヒビターにおける耐性に関係する。実施例２の方法に類似した方法を使用 して、プローブとして、 （アンチセンス） 野生型はＴを添加しく×１）、変異体はＣを添加する（×］）を使用して、コド ン１８４（メチオニンからバリンまで）における突然変異のためのアッセイを行 った。 既知の比率の野生型ウィルスおよび変異体ウィルスの混合物における一連のアッ セイの結果を、以下の表５において示す。これらのサンプルは、１０３コピー／ サンプルに希釈したＰＣＲ産物の混合物であった。 コドン１８４において、１００％野生型である、あるいは、１００％バリン変異 体であることが知られている患者からのサンプルにおいて、使用するＰＣＲ産物 をウィルスＲＮＡから増幅させ、ｃＤＮＡに対して逆転写させた。これらのサン プルを、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ　ｅｔ　ａｌ。 （既述−英語原文ベージ２９）により記載される終点希釈により定量した。 ＡおよびＧの取り込みについてアッセイしたサンプルにおける平均レベルとして バックグラウンドを測定した。 調整後の測定値は、サンプルのウィルスバックグラウンドについての測定された レベルである。 国際調査報告 −ＰＣ丁／Ｇ８　９３１００７４５ Ｔｈ！Ｉ＋−ミー一一一一一叩・−−ｍ−−ｍ　−−ｓ＋ｗｍ−′ｎ１１７１１ １１１１　Ｍｌ−ミー一＝　ｍ　Ｈｈ−−ｏ鵬−ＥＤＰ　ａｌｅ　Ｍ紬−一（ｌ １６ｍｌＩＩｗａｗ−ｉ−一−１−−ｗｍｐｗｐｗｍｊ−−２２１０７／９３フ ロントページの続き （７２）発明者　ラブディ、クライブ イギリス国ロンドン　ダブリュー１ピー７エルピー・クリーブランドストリート ４６・ウインデャービルディング・ユニバーシティカレッジロンドンメディカル スクール・デパートメントオブメディカルマイクロバイオロジー・デイビジョン オブバイロロジー （７２）発明者　ケイ、　ステイーブンイギリス国ロンドン　ダブリュー１ピー ７エルピー・クリーブランドストリート４６・ウインデャービルディング・ユニ バーシティカレッジロンドンメディカルスクール・デパートメントオブメディカ ルマイクロバイオロジー・デイビジョンオブバイロロジー （７２）発明者　センプル、　マルコム・グラシーイギリス国ロンドン　ダブリ ュー１ピー７エルピー・クリーブランドストリート４６・ウインデャービルディ ング・ユニバーシティカレッジロンドンメディカルスクール・デパートメントオ ブメディカルマイクロバイオロジー・デイビジョンオブバイ口ロジ−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．定量的ウイルスアッセイであって、（ａ）血清からウイルス粒子を捕捉し、 かつ、血清の残渣を除去し、（ｂ）ウイルス粒子からウイルスＲＮＡもしくはＤ ＮＡを放出させ、（ｃ）必要に応じて、そのＲＮＡ配列の一部分に対して相補的 である配列を有する転写プライマーを使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対し てウイルスＲＮＡを逆転写させ、 （ｄ）第一段階において、最初のＰＣＲプライマー対を、そして、最終段階にお いては、最初のＰＣＲプライマー対に対して相補的であるＤＮＡ配列の一部分に より特定されるある領域内に存在するＤＮＡ配列の一部分に対して相補的である 第二のＰＣＲプライマー対を使用する繰り込み式多段階ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）によりウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡを増幅させるのであって、第 二ＰＣＲプライマー対の内の一つが、特異的な結合パートナーに結合することが できる特異的結合試薬で標識されており、かつ、逆転写を使用して相補的なｃＤ ＮＡを取得する場合には、最初のＰＣＲプライマー対が、転写プライマーの配列 に対して相補的であるｃＤＮＡ配列の一部分が、その領域の外側に存在するとい うような一定領域を特定するｃＤＮＡの一部分に対して相補的な配列を有し、そ して、 （ｅ）固定化されている特異的結合パートナーを使用して、特異的結合試薬で標 識付加されているＰＣＲ産物を捕捉し、そして、捕捉したＰＣＲ産物を定量する こと、 を含んでなる、上記定量的ウイルスアッセイ。
2. ２．ウイルスがＲＮＡウイルスであり、かつ、段階（ｃ）においては、ウイルス ＲＮＡを逆転写させてｃＤＮＡを提供する、請求の範囲１に記載のアッセイ。
3. ３．逆転写プライマーが、最初のＰＣＲプライマー対に対して相補的なｃＤＮＡ の一部分により特定されるｃＤＮＡの領域の外側にあるＲＮＡ配列の一部分に対 して相補的である配列を有する、請求の範囲２に記載のアッセイ。
4. ４．ウイルス粒子を、ウイルス粒子に特異的な結合試薬で被覆した微細な粒子の 懸濁液を使用して捕捉する、前述の請求の範囲のいずれかに記載のアッセイ。
5. ５．前述の請求の範囲のいずれかに記載のアッセイであって、段階（ｄ）におい て、第一段階において、転写プライマーの配列に対して相補的なｃＤＮＡもしく はウイルスＤＮＡ配列の一部分がその領域の外側になるようなｃＤＮＡもしくは ウイルスＤＮＡの一定領域を特定するｃＤＮＡもしくはウイルスＤＮＡ配列の一 部分に対して相補的な配列を有する最初のＰＣＲプライマー対を使用し、かつ、 第二段階において、最初のＰＣＲプライマー対に対して相補的なｃＤＮＡもしく はウィルスＤＮＡ配列の一部分により特定される領域内に存在するｃＤＮＡもし くはウイルスＤＮＡ配列の一部分に対して相補的な第二ＰＣＲプライマー対を使 用する繰り込み式多段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてｃＤＮＡもし くはウイルスＤＮＡを増幅させるのであって、第二ＰＣＲプライマー対の内の一 つが特異的結合パートナーに対して結合することができる特異的結合試薬で標識 されており、ＰＣＲの各段階を、増幅させたＤＮＡの量がＰＣＲ以前のｃＤＮＡ もしくはウイルスＤＮＡの量に比例するように、あらかじめ決定された周期数分 を完全に実行し、そして、最終段階を、ラベル化デオキシヌクレオチド三リン酸 （ｄＮＴＰ）の存在下、もしくは、ラベル化ＰＣＲプライマーを使用して実行し 、段階（ｅ）において、増幅させたＤＮＡを、増幅させたＤＮＡに対して標識さ せた結合試薬に対して特異的な結合パートナーを保持する固体支持体と接触させ ることにより、増幅させたＤＮＡが基質に対して結合するのを可能にさせ、かつ 、未取り込みのラベル化ｄＮＴＰもしくは未取り込みのラベル化プライマーを除 去し、そして、段階（ｆ）において、増幅させたＤＮＡ中に含まれるラベルの量 を決定し、かつ、標準曲線との比較により、血清中に含まれるウイルス粒子、あ るいは、ウイルスＲＮＡもしくはｃＤＮＡの量を取得すること、を含んでなる、 上記アッセイ。
6. ６．請求の範囲１から４のいずれかに記載のアッセイであって、段階（ｄ）にお いて、最初の段階において、転写プライナーの配列に対して相補的であるｃＤＮ ＡもしくはウイルスＤＮＡ配列の一部分がその領域の外側にあるような、ｃＤＮ ＡもしくはウイルスＤＮＡの一定領域を特定するｃＤＮＡもしくはウイルスＤＮ Ａ配列の一部分に対して相補的な配列を有する最初のＰＣＲプライマー対を、そ して、第二段階においては、最初のＰＣＲプライマー対に対して相補的なｃＤＮ ＡもしくはウイルスＤＮＡ配列の一部分により特定される領域内に存在するｃＤ ＮＡ配列の一部分に対して相補的な第二ＰＣＲプライマー対を使用する繰り込み 式多段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、ｃＤＮＡもしくはウイルス ＤＮＡを増幅させるのであって、第二ＰＣＲプライマー対の内の一つが、特異的 結合パートナーに対して結合することができる特異的結合試薬で標識してあり、 段階（ｅ）において、増幅させたＤＮＡを、増幅させたＤＮＡに対して付加させ た結合試薬に対して特異的な結合パートナーを保持している固体支持体と接触さ せ、増幅させたＤＮＡが基質に対して結合するのを可能にさせ、未取り込みのｄ ＮＴＰを除去し、そして、増幅させたＤＮＡを変性させてＤＮＡ鎖を分離し、 段階（ｆ）において、増幅させたＤＮＡの鎖の内の一つに対して、そのＤＮＡ断 片内に含まれる標的配列に対して相補的な配列を有する一本鎖のＤＮＡオリゴマ ープローブをアニールさせるのであって、この標的配列は、分析予定の塩基のす ぐ近くの塩基に５′端を有し、プローブ／標的二重らせん鎖を形成し、 段階（ｇ１）において、プローブ／標的鎖二重らせん鎖の最初の分注をＤＮＡポ リメラーゼ酸素、および、その混合物中に含まれる最初のウイルス形態中に含ま れる分析予定の塩基に相当するラベル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴ Ｐ）もしくはジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）と一緒にインキュ ベートし、段階（ｇ２）において、プローブ／標的鎖二重らせん鎖の第二の分注 をＤＮＡポリメラーゼ酵素、および、その混合物中に含まれる第二のウイルス形 態内に含まれる分析予定の塩基に相当するラベル化デオキシヌクレオチド三リン 酸（ｄＮＴＰ）もしくはジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）と一緒 にインキュベートし、段階（ｈ）において、未取り込みのラベル化ｄＮＴＰもし くはｄｄＮＴＰを取り除き、そして、 段階（ｉ）において、プローブ／標的鎖二重らせんの各分注に含まれる、あるい は、変性および標的鎖からの分離後のプローブのＤＮＡ各分注に含まれる、プロ ーブに対して結合したラベルの相対的な量を決定すること、 を含んでなる、上記アッセイ。
7. ７．段階（ｆ）において、分析予定の塩基が点突然変異の部位であり、そして、 段階（ｉ）において、その点突然変異部位においていろいろな塩基を示すＤＮＡ の相対的な量を決定する、請求の範囲６に記載のアッセイ。
8. ８．増幅段階（ｄ）の前に、サンプルを２つの分注に分配し、一つを請求の範囲 ５に従ってアッセイし、そして、もう一方を請求の範囲６もしくは７に従ってア ッセイする、前述の請求の範囲のいずれかに記載のアッセイ。
9. ９．ヒトもしくは動物の患者から採取したサンプル内に存在する薬剤耐性の発現 を決定することにおける、前述の請求の範囲のいずれかに特許請求されているア ッセイの用途。