JP2511221B2

JP2511221B2 - ポリメラ―ゼ活性測定方法

Info

Publication number: JP2511221B2
Application number: JP3509551A
Authority: JP
Inventors: エバーレ，ヨゼフ; ザイブル，ルドルフ; ケスラー，クリストフ; ケーニヒ，ベルンハルト
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1990-08-31
Filing date: 1991-05-31
Publication date: 1996-06-26
Anticipated expiration: 2011-06-26
Also published as: DE4027616A1; WO1992004467A1; EP0547056A1; JPH05505942A; DK0547056T3; ATE111961T1; US5413906A; EP0547056B1; DE59103063D1; US5635350A; ES2065038T3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ポリメラーゼ活性測定方法、該方法を行う
ための試薬および試薬キットならびにHIV検出のための
該方法の使用に関する。本発明は、また、物質のポリメ
ラーゼ活性への抑制効果を測定する方法、ポリメラーゼ
に対する抗体を検出する方法およびプロモーター配列を
検出する方法にも関する。

ポリメラーゼは生物にとって基本的に重要な酵素であ
る。それらは、例えば、核酸の合成およびそれらの蛋白
合成に必要なそれらの他の核酸への形質転換の原因とな
る。したがって、ポリメラーゼは、例えば細菌を含む全
ての種類の細胞にある。多くのウイルスでさえそれら自
身のポリメラーゼをコードする。１つの特定の代表例
は、リバーストランスクリプターゼ（RT）として知られ
ているポリメラーゼである。

最近10年間のヒト病原レトロウイルスの発見によって
（サイエンス（Science）（1983）、220:868−871、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA）（1980）、77:7415−7419およびバイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Comm.）（198
4）、121:126−133）、このウイルスのファミリーの典
型的なキー酵素であるリバーストランスクリプターゼ
（RT）の検出は、ますます重要性を増してきた。その
後、RT活性の測定方法の多くの改良が開示された（バイ
ロロジー（Virology）（1985）147:326−335）、RT試験
は以下の３つの状況下で一般に使用される。

1.レトロウイルスとして新規に単離されたウイルスを特
徴付け、異なるレトロウイルス間で区別する。

2.レトロウイルスに感染されることが知られている被検
体または感染され得る被検体の試験物質からのウイルス
単離の成功を測定する。

3.レトロウイルスに関して必須であるこれらの酵素的機
能に対する化学治療剤のイン・ビトロ効果を評価する。

前記適用分野の最初の２つに関しては、冗長な試料調
製（超遠心またはPEG沈澱、もしそうでなければ、感度
は非常に低くてもよい）を含む公知のRT試験は制限され
る；第２の適用分野に関しては、感度が良く、安価でか
つ簡単な抗原検出方法（ELISA）による競合；前記３つ
の適用分野の全てを制限するものは、慣用のRT試験が同
位体ヌクレオチドを使用し、かくして、研究室で特別な
要求（装置、許可、人員、廃棄物処理）がなされるとい
う事実である。

文献から知られている、リバーストランスクリプター
ゼ、特にHIVのリバーストランスクリプターゼの酵素活
性を検出する全ての方法は、鋳型の部分的な配列に相補
的なプライマーが標識ヌクレオチドを取り込むことによ
って伸長するアッセイに基づく。取り込まれないヌクレ
オチドは、一般に、トリクロロ酢酸またはエタノールの
助けによってポリマーを沈殿させ、次いで、濾過方法ま
たは正に荷電された面を有する膜フィルター（例えば、
ジャーナル・オブ・バイロロジカル・メソッズ（Journa
l of Virological Methods）19（1988）、161−168
の開示に従って、DEAE）へのポリマーの吸着によって；
あるいは負に荷電されたポリマーを負に荷電されたモノ
マーから分離するのに適当な別の方法を使用することに
よって、水素結合を介して鋳型に結合される伸長プライ
マーから分離される。これらの処置は、非常に冗長であ
り、さらなる処理工程を必要とする。

WO90/06373には、鋳型核酸として固体化核酸を使用する
方法が開示されている。この方法の欠点は、酵素へのア
クセスを妨害せずにこの鋳型核酸の有意に特異形な固定
化が不可能であるということである。故に、該方法は反
応性鋳型核酸の有効量によって制限され得る。さらに、
該方法は、異なるハイブリダイゼーション条件の結果と
して鋳型−DNAを介する固相への結合が非常に変化する
多数の種類の核酸を生じる。さらにまた、固相での反応
は、一般に、溶液中での反応を行うよりも乏しい速度論
を呈する。

さらにまた、HIV粒子の定量測定について、HIV抗原の
検出用イムノアッセイが確実ではないことが判明した
（ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディス
ン（New England Journal of Medicine）（1989）、第3
21巻、24、1673−1675）。

ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジ
ー（J.Clin.Microbiology）27（1989）、７、1453−145
5およびエイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レト
ロバイラシズ（AIDS Research and Human Retroviruse
s）５（1989）、535−540には、HIVに対する抗体の存在
下、ポリメラーゼ活性の測定に基づくHIV−RTに対する
抗体の検出方法が開示されている。ポリメラーゼによっ
て合成された放射性標識核酸は非特異的方法で膜に固定
化される。この方法もまた非常に冗長である。

故に、本発明の目的は、迅速で、簡単で、より確実で
かつ感度の良い、ポリメラーゼ活性に関する試験を提供
することであった。この目的は本発明によって達成され
る。

本発明の課題は、鋳型核酸および検出可能なモノヌクレオシド三リン酸
と一緒にポリメラーゼを含有試料をインキュベートし、該検出可能なモノヌクレオシド三リン酸から合成核酸を
分離し、核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出する工
程からなり、該インキュベーション混合物がさらに固定化可能なモノ
ヌクレオシド三リン酸を含有し、該インキュベーション混合物が固相に接触させられ、該
固相が固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および該
固定化可能なヌクレオチドを取り込む核酸を選択的かつ
実質的に完全に結合することを特徴とするポリメラーゼ活性の測定方法である。

また、本発明の課題は、該方法を行うための試薬、物
質のポリメラーゼ活性への抑制効果の測定方法、ポリメ
ラーゼに対する抗体の検出方法およびプロモーター配列
の検出方法を含む。

ポリメラーゼ活性は、鋳型核酸の助けによってモノヌ
クレオシド三リン酸をヌクレオチド配列に重合させるた
めのポリメラーゼの酵素的活性であると理解される。こ
の方法では、該モノヌクレオチドは核酸配列に付加さ
れ、核酸配列に相補的な核酸鎖に取り込まれる。ポリメ
ラーゼによって、得られる生成物は一本鎖核酸または二
本鎖核酸のいずれかである。

本発明の方法で測定され得るポリメラーゼが数種類あ
る。これらのポリメラーゼは、基質および／または重合
生成物に応じて区別される。例としては、T3−、T7−ま
たはイー・コリ（E.coli）−RNA−ポリメラーゼのよう
なDNA依存性RNAポリメラーゼ（Ｉ型）、クレノウ断片の
ようなDNA依存性DNAポリメラーゼ（II型）、リバースト
ランスクリプターゼのようなRNA依存性DNAポリメラーゼ
（III型）およびＱβ−およびピコルナウイルス−ポリ
メラーゼのようなRNA依存性RNAポリメラーゼ（IV型）が
挙げられる。本発明の方法では、例えば、ウイルスのリ
バーストランスクリプターゼ、特にHIV−リバーストラ
ンスクリプターゼが分析物として使用される。

本発明では、鋳型核酸なる語は、ポリメラーゼまたは
測定されるべき型のポリメラーゼの基質として機能する
核酸を表す。したがって、Ｉ型およびII型に関する基質
はデオキシリボ核酸であり、III型およびIV型に関する
基質はリボ核酸である。デオキシリボ核酸は、III型に
関する基質としても供し得る。しかしながら、II型と区
別を行うために、好ましい基質はリボ核酸である。

IIおよびIII型ポリメラーゼに関して、鋳型核酸とし
てヘテロポリマーおよびホモポリマー核酸を使用するこ
とができる。II型またはIII型ポリメラーゼのイン・ビ
トロ活性の測定は、一般に、プライマーの添加を必要と
する。

Ｉ型ポリメラーゼに関する試験には、イー・コリ（E.
coli）RNA−ポリメラーゼについてはイー・コリ由来のl
ac−プロモーターまたはT7−RNA−ポリメラーゼについ
てはT7−ファージ由来のポロモーターのような対応する
特異的なプロモーターを有する核酸の使用を必要とする
（チャンバーリン（Chamberlin）およびライアン（Rya
n）（1982）、ジ・エンザイム（The Enzyme）、第XV
巻、第87〜108頁）。逆に、特異的なプロモーターの検
出は特異的なポリメラーゼを必要とする。

IV型ポリメラーゼ測定用の鋳型核酸は、末端結合蛋白
を含む特異的な一次構造、ある二次構造などを有する。
これらの構造はポリメラーゼに依存しており、当業者に
知られている。

モノヌクレオシド三リン酸は、アデニン、グアニン、
シトシンおよびウラシルもしくはチミンのような天然塩
基、または、例えば７−デアザ−２′−デオキシグアノ
シン三リン酸の如き天然塩基のアザ−およびデアザ−ア
ナログのような人工塩基を含むヌクレオシドの三リン酸
エステルである。モノヌクレオシド三リン酸なる語は、
測定されるべきポリメラーゼ活性の型によってモノリボ
ヌクレオシド三リン酸またはモノデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸を表す。ＩおよびIV型はリボヌクレオチド
を必要とし、一方、IIおよびIII型はデオキシリボヌク
レオチドを必要とする。リバーストランスクリプターゼ
に関して、リボーおよびデオキシリボヌクレオチドの両
方を使用することができる。しかしながら、鋳型核酸と
してリボ核酸とデオキシリボヌクレオチドとの組合せが
III型ポリメラーゼに特異的であるので、デオキシリボ
ヌクレオチドが好ましい。

本発明によって定義された検出可能なモノヌクレオシ
ド三リン酸は、修飾された三リン酸エステルである。こ
の修飾は、例えば、光度測定的、蛍光測定的、放射線測
定的、酵素的もしくは免疫学的反応で、天然モノヌクレ
オチドの存在下、モノヌクレオチドを選択的に検出させ
る。好ましい方法では、モノヌクレオシド三リン酸は共
有結合した非放射線化学基を有する。これは、色素、蛍
光標識または抗原、抗体もしくはハプテンのような免疫
学的反応の成分である。ハプテンが好ましく、ジゴキシ
ゲニンがその高い感受性のために特に好ましい。これに
関連して、本発明者らは、EP−Ａ−0 324 474およびEP
−Ａ−0 254 090の内容を引用記載する。

検出可能なモノヌクレオシド三リン酸に加えて、本発
明は、固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸も使用す
る。これらのモノヌクレオチドの固定化は、例えば、固
相に対して特異的な親和性を有する共有結合した化学基
によって達成され得る。好ましい方法では、該化学基は
特異的な組合せの結合相手の一方である。このような組
合せは、例えば、抗原−抗体、ハプテン−抗体、抗体−
抗体、ビタミン−結合蛋白、補因子−酵素および糖−結
合蛋白（レクチン）である。特に好ましい組合せは、ビ
タミン−結合蛋白、特にビオチン−アビジンまたはビオ
チン−ストレプタビジンであり、ビオチンはリンカーを
介して結合されるモノヌクレオチドの化学基を表す。本
発明によって意図される結果を得るために、固定化可能
なモノヌクレオシド三リン酸は検出可能なモノヌクレオ
チドと異なっており、かつ区別可能であるべきである。
さらに、該方法は、モノヌクレオチドが同一である場合
と比較して、妨害に対して非常に感度が低くかつ取り込
まれたヌクレオチドの量にあまり左右されない。ビオチ
ン−およびジゴキシゲニン−ヌクレオチドに関して示さ
れたように、個々のポリメラーゼは基質として検出可能
および固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を受容し
なければならない。

ポリメラーゼの含量に関して試験されるべきいずれの
液体も本発明の方法に適している試料である。該方法
は、好ましい濃度10^-12〜10^-8mol/l、特に好ましい濃度
８×10^-11〜８×10^-10mol/l（RTに関して測定した）の
液体中のポリメラーゼを測定するのに適している。この
ような濃度の溶液は、例えば、ポリメラーゼを単離する
際に得られるが、ウイルスおよび最近の溶解物または細
胞培養物の上清中にもある。該溶解物は、組織および血
液のような体液由来の両溶解物であり得る。また、溶解
物からのポリメラーゼの単離は必要ではない。このよう
な試料の調製は、例えば、バイロロジー（Virology）
（1985）147:326;PNAS（1980）77、7415に開示されてい
る。その高い感度のために、ほとんどの場合、冗長な濃
縮工程がもはや必要ではないことが該方法の利点であ
る。

本発明の第１の工程では、鋳型核酸および少なくとも
１つの検出可能なモノヌクレオシド三リン酸および１つ
の固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を試料に添加
する。活性がプライマーの存在に左右されるポリメラー
ゼが検出されるべきである場合、この使用したプライマ
ーは、鋳型核酸よりも短く、鋳型核酸の一部分に相補的
であり、ポリメラーゼによって、鋳型核酸に相補的であ
る鎖断片によって伸長され得るオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチドである。効果的な条件は、ポリメラ
ーゼをその酵素活性を充分に展開させなければならな
い。これらの条件は、ポリメラーゼによって変化する
が、当業者には知られている。それらは、例えば、pH値
をポリメラーゼの最大活性付近に安定化させるpH緩衝液
の添加、または、例えば、個々のポリメラーゼ活性に必
要な陽イオンの存在を含む。トリトン（Triton）X100の
ような洗浄剤またはEDTAのような錯形成剤を添加するこ
ともできる。最適温度も、当業者に知られている。好熱
性ポリメラーゼ、例えばEP−Ａ−0 258 017のTaq−DNA
−ポリメラーゼの検出は、例えば、高温で行われ得る。
鋳型核酸がホモポリマーである場合、モノヌクレオシド
三リン酸は鋳型核酸のヌクレオチドに相補的なヌクレオ
チドからなっていなければならない。ポリアデニレート
が鋳型核酸として使用される場合、該三リン酸エステル
はチミンまたはウラシル残基を含有するのが好ましい。
というのは、後者は、ポリアデニレートに相補的な核酸
鎖を形成するために使用され得るからである。

さらにまた、インキュベーション溶液は、検出可能お
よび／または固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸の
ベースである検出不可能および／または固定化不可能な
モノヌクレオシド三リン酸も含有し得る。

鋳型核酸が全部で４種類のモノヌクレオチドからなる
コポリマーである場合、インキュベーション溶液は、検
出可能、固定化可能、または検出不可能もしくは固定化
不可能であるかその形態に関係なく、各々の対応する４
種類のモノヌクレオシド三リン酸を含有しなければなら
ない。好ましい場合は、４種類のモノヌクレオシド三リ
ン酸の濃度はほぼ同一であり、三リン酸エステルの一部
分は、その固定化可能な形態で存在し、同一の三リン酸
エステルまたは別の三リン酸エステルの他の部分は、そ
の検出可能な形態で存在する。各三リン酸エステルの好
ましい全濃度は0.0001〜10mmol/lであり、特に好ましい
濃度は0.001〜10mmol/lの範囲である。

約10^-11mol/lの濃度のリバーストランスクリプターゼ
の検出のためのインキュベーション時間は35℃で約90分
後に終わらせることができる。10^-12mol/lまでの少量
は、インキュベーション期間を24時間まで延長すると検
出され得る。

インキュベーションは、固定可能なモノヌクレオシド
三リン酸または該三リン酸エステルを含有する核酸が結
合できる固相にすでに接触している場合でも、例えば、
微量滴定プレートまたはチューブまたはバイアルのよう
ないずれの利用可能な予備インキュベーション容器中で
行われてもよい。好ましい場合は、予備インキュベーシ
ョン容器は、すでに、該固相を含有しており、故に、該
組成物を結合することができる。そこで、固相と一緒に
他のインキュベーション用容器への移送はもはや必要で
はない。

分離工程の間に、ポリメラーゼ活性によって生産され
得、少なくとも１つの取り込まれた固定化可能および少
なくとも１つの取り込まれた検出可能なモノヌクレオチ
ドを含有する核酸は、固相に結合され、液相は除去され
る。

固定化モノヌクレオシド三リン酸および該モノヌクレ
オシド三リン酸を取り込んだ核酸が結合される固相は、
他の結合相手を含有する。特に好ましい方法では、固相
をストレプタビジンで塗布する。固相は、容器の形態
で、またはビーズ状態で存在し得る。典型的かつ好まし
い容器はキュベットおよび微量滴定プレートである。ビ
ーズを使用する場合、固定化は、予備インキュベーショ
ン容器を使用しない限り、インキュベーション混合物を
収容するために分離容器を必要とする。

固相は、好ましくは、インキュベーション溶液中に含
有される固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および
該固定化可能なヌクレオチドを取り込んだ核酸の全量の
90％以上を結合し得るに違いない。このために、固相
は、少なくとも90％、好ましくは固定化可能なモノヌク
レオチドの初期有効量よりも多い結合部位を含有すべき
である。この量は既知であるので、当業者は、必要な面
を容易に測定することができるか、あるいは、逆に、種
々の量のモノヌクレオチドを含有する溶液に関する固相
の結合能を測定することによって、固相によって結合さ
れるモノヌクレオチドの最大可能量を測定することがで
きる。しかしながら、固相での結合部位の量がモノヌク
レオチドの量を超える場合、該測定を妨害しない。EP−
Ａ−0 344578に開示されているストレプタビジン被覆固
相は特に好ましい固相である。特異的な結合対の使用
は、非常に微量の、非特異的に結合され、標識されたモ
ノヌクレオシド三リン酸を確実に存在させる。前記結合
相手、特に、ビオチン／ストレプタビジンの親和性のた
めに、固定化可能なモノヌクレオチドはほとんど完全に
結合される。

ビオチン／ストレプタビジンの場合、35℃でのインキ
ュベーション混合物により固相のインキュベーション
は、２時間未満続く。次いで、例えばデカンテーショ
ン、ピペッティングまたは吸引除去によって、液体を固
相から分離する。取り込まれない検出可能なモノヌクレ
オシド三リン酸は、かくして、固定された検出可能モノ
ヌクレオチドから分離される。完全な分離を確実にする
ために、洗浄溶液による後処理が行われ得る。取り込ま
れた固定化可能なヌクレオチドを含有する核酸の固相へ
の堅固な結合によって、固定された核酸は有意には洗浄
されない。可能な洗浄溶液としては、例えば、緩衝化お
よび非緩衝化塩化ナトリウム溶液のような簡単な塩溶液
が挙げられる。かくして、従来技術では必要であった、
鋳型核酸の新しく形成される核酸へのハイブリダイゼー
ションを維持する洗浄溶液の使用は必要ない。

結果として、固相に結合した核酸は、取り込まれた検
出可能なヌクレオチドの助けをかりて測定される。測定
は使用した検出可能なヌクレオチドのタイプに左右され
る。好ましい場合、モノヌクレオチドの検出可能な基が
免疫学的反応の一成分である場合は、固相は該免疫学的
反応の他の成分と反応する。この第二成分は、例えば酵
素または蛍光標識で、標識されるのが好ましい。ホース
ラディッシュペルオキシダーゼ（POD）、アルカリホス
ファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼのような酵素で
標識するのが特に好ましい。好ましい場合は、第一成分
がハプテンであり、第二成分がこのハプテンに対する標
識抗体である。これに関連して、本発明者らは、WO89/0
6698およびEP−Ａ−0 209 875を引用記載する。該標識
が色素または蛍光色素のような直接標識である場合、検
出可能なモノヌクレオチドは可視的または自動分析によ
って直接測定され得る。後者の場合は、光度計または蛍
光光度計を用いる。酵素標識を使用すると、固相はこの
酵素に関する基質と反応し、該反応は光度測定的または
蛍光測定的にモニターされる。

本発明の方法では、ポリメラーゼの量もしくは存在ま
たはポリメラーゼのタイプは固相の検出可能なモノヌク
レオチドの量または存在から理解され得る。定量分析
は、ポリメラーゼの含量が既知である試料によって得ら
れた検量線に基づき得る。

個々のポリメラーゼおよび／または種々のポリメラー
ゼが検出可能および固定化可能なモノヌクレオチドを取
り込む条件が変化すると、個々のポリメラーゼ間および
種々のポリメラーゼ間で区別が可能である。故に、本発
明の方法は、１つのタイプのポリメラーゼの測定を他の
タイプのポリメラーゼの存在下で行う選択的方法であ
る。

標識核酸が非常に簡単かつ完全な方法で標識モノヌク
レオシド三リン酸から分離され得ることが本発明の方法
の利点である。さらにまた、この方法は１つの単一容器
で行われ得る。異なる容器への移送はもはや必要とされ
ない。非放射性アッセイ法の使用はさらに利点を有す
る：すなわち、該反応はあまり装置を必要とせず、自動
化が容易であり、例えば微量滴定プレートで、多くの試
料を平行測定できる。固定可能なヌクレオチドおよび該
ヌクレオチドを含有する核酸だけが固相に結合されるの
で、該方法は非常に特異的である。故に、最大よりも低
い純度を有する試料は本発明の方法に許容される。例え
ば、細菌の存在下での測定でさえ可能である。ジゴキシ
ゲニンのようなハプテンが検出可能なモノヌクレオチド
として使用される場合、鋳型核酸から新しく形成された
鎖を分離するのが必要ではない。本発明の方法は、ポリ
メラーゼ反応の生成物の長さが１つの修飾モノヌクレオ
チドだけを使用する場合よりも結果への影響が低いので
非常により信頼できる。種々の修飾モノヌクレオチドを
使用すると、固定化可能なモノヌクレオチドの量は固相
への定量的に特異的な結合のために低く維持され得る
が、一方、検出可能なモノヌクレオチドの量は、より高
い感度に関して比較的高く維持され得る。

リバーストランスクリプターゼを測定する方法の好ま
しい具体例では、該試料を、鋳型核酸としてのポリアデ
ニレート、固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸とし
てのビオチニル化dUTP（EP−Ａ−0 063 879）および検
出可能なモノヌクレオシド三リン酸としてのジゴキシゲ
ニン標識dUTP（WO89/06698）およびプライマーとしての
オリゴdTと反応させる。約35℃で90分間インキュベート
した後、該混合物をストレプタビジン被覆キュベットに
移す。約60分間インキュベートした後、液体を廃棄し、
キュベットを洗浄溶液で洗浄する。次いで、ジゴキシゲ
ニンに対するPOD標識抗体の溶液を添加する。約60分間
の後、液体を再度廃棄し、キュベットをもう１回洗浄す
る。次いで、ABTS^R溶液を添加し、着色を405nmで測定す
る。

本発明の他の課題は、本発明方法で使用するための試
薬および少なくとも１つの検出可能および少なくとも１
つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有する
鋳型核酸である。該試薬はポリメラーゼを含まないのが
好ましい。検出可能および固定可能なモノヌクレオシド
三リン酸は、例えばウリジンのような同一のモノヌクレ
オチドまたは例えばアデノシン（固定化可能）およびウ
リジン（検出可能）のような異なるモノヌクレオチドに
基づく種々の化合物である。鋳型核酸が例えばポリアデ
ニレートのようなホモポリマー核酸である場合、検出可
能および固定可能なモノヌクレオシド三リン酸について
１つのタイプのモノヌクレオチドだけが必要とされる。
すなわち、核酸のヌクレオチドに相補的な塩基（この例
ではウリジンまたはチミジン）を含有するものである。
鋳型核酸が全ての天然塩基を含有する場合、個々の相補
モノヌクレオチドは三リン酸エステルとして存在しなけ
ればならない。好ましい方法では、該試薬は、溶媒とし
ての水、pH緩衝剤、洗浄剤、安定化剤またはポリメラー
ゼに対する補因子を含む添加剤を含有する。pH緩衝剤
は、該試料に試薬を添加した後、検出されるべきポリメ
ラーゼが、存在する場合に、活性であると予想されるpH
を確実にするために含まれる。

水溶液の形態の試薬は前記成分を以下の濃度で含有す
る。

鋳型核酸 0.1〜2000μg/ml モノヌクレオシド三リン酸（合計） 0.0001〜10nmol/l 好ましくは 0.001〜10nmol/l 検出可能なモノヌクレオチド 0.0001〜10nmol/l 好ましくは 0.001〜1nmol/l 固定化可能なモノヌクレオチド0.0001μmol/l〜0.1mmol
/l プライマーは必要は場合は、10ng/ml〜10mg/mlの濃度
で、好ましくは10〜2000μg/mlの濃度で存在するべきで
ある。固定化可能なモノヌクレオチドとしてビオチン−
dUTPおよび検出可能なモノヌクレオチドとしてジゴキシ
ゲニン−dUTPを使用する場合、２つの物質は該反応にお
いて1:1〜1:50000のモル比で使用され、リバーストラン
スクリプターゼに関しては、好ましいモル比は1:5〜1:5
0、特に好ましくは1:10〜1:30（ビオチン：ジゴキシゲ
ニン）である。別の方法で修飾されるヌクレオチドを使
用する場合、当業者は、結果的に、値を最適化すること
ができる。ポリメラーゼ活性への依存性および壁の結合
部位の数の値も最適化することができる。さらに、該試
薬は、使用前に希釈しなければならない濃縮溶液の形態
で使用することができる。凍結乾燥物としての貯蔵も可
能である。後者の場合、該試薬は溶液の助けをかりて再
構成される。

本発明の他の課題は、ポリメラーゼ活性の検出用試薬
キットである。該キットは分離容器に以下の成分鋳型核酸、少なくとも１つの検出可能および少なくと
も１つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸、該固定化可能なモノヌクレオチドを選択的かつ実質的
に完全に結合するための容器、および洗浄溶液を含有する。

所望により、プライマーは（好ましくは、鋳型核酸と
の混合物状態で）試薬キットに含まれる。この試薬のほ
かに、該キットは、さらに、該方法を行うのに必要な容
器および洗浄溶液を含有する。さらにまた、該キットの
好ましい具体例は、検出可能なモノヌクレオチドの検出
用試薬を含有する。例えば、検出可能なモノヌクレオチ
ドに標識を結合するための免疫学的組合せを使用する
と、このキットは検出可能なモノヌクレオチドに結合さ
れる免疫学的組合せの成分の対応する標識相手を提供す
る。酵素標識を使用する場合、該キットは酵素基質およ
び所望により必要なpH緩衝剤と一緒になっている。全て
の試薬が安定であり、比較的小さい貯蔵空間を必要と
し、それらの使用および適用が従来技術の公知の試薬と
比較して非常に簡単であることが本発明の試薬キットの
利点である。

試薬キットの好ましい具体例は：ａ）鋳型核酸、ジゴキシゲニン標識モノヌクレオシド三
リン酸、ビオチン標識モノヌクレオシド三リン酸、pH緩
衝剤、洗浄剤、錯形成剤、補因子、塩および抗酸化剤を
含有する容器ｂ）ストレプタビジン被覆キュベット、チューブ、ペレ
ットまたは微量滴定プレート、ｃ）洗浄溶液、ｄ）ジゴキシゲニンに対するPOD標識抗体の溶液、ｅ）緩衝溶液中のPOD基質、例えば、2,2′−アジノ−ビ
ス−［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフェー
ト］（ABTS^R）を含有する。

II型またはIII型ポリメラーゼの検出については、好
ましい方法では、ａ）はプライマーも含有する。試薬キ
ットの全成分は安定であり、拡大された貯蔵安定性を有
し、それらの製造および処理は共に安価でありかつ簡単
である。

ポリメラーゼ活性の検出ための本発明の方法は、この
ようなポリメラーゼ活性が試料の組成物への情報を明ら
かにする如何なる分野においても使用され得る。これ
は、例えば、体液または処理された酵素単離体のような
試料中のポリメラーゼの検出、さらにポリメラーゼ含有
微生物、特に未知のポリメラーゼを特徴付けるためおよ
びそれらのポリメラーゼへの抑制効果を試験するための
細菌およびウイルスの検出における場合である。さら
に、物質の添加による既知のポリメラーゼ活性の低下
は、抑制の指標として供され、抗菌性物質または抗ウイ
ルス性物質としての該物質の可能な治療学的使用を示
す。

本発明の他の課題は、HIVを検出する方法であり、該
方法は、ポリメラーゼを検出する方法に基づいている。
次いで、HIVが存在すると予想される試料の溶解物を調
製する。

鋳型リボ核酸、少なくとも１つの検出可能および１つ
の固定化可能なモノデオキシヌクレオシド三リン酸およ
び添加剤をこの溶解物に添加し、インキュベーション後、該混合物を、固定化可能なモ
ノヌクレオチドおよび取り込まれた固定化可能なヌクレ
オチドを選択的および実質的に完全に結合する容器中に
移し、過剰の検出可能なモノヌクレオシド三リン酸を分離
し、結合された検出可能なモノヌクレオチドを検出する。

最初のインキュベーションは、HIV−RTがプライマー
依存性III型ポリメラーゼであるので、プライマーの存
在下で行うのが好ましい。混合物のインキュベーション
はそれ自体が結合可能である容器中で行うこともでき
る。

同様に、該方法はポリメラーゼに結合される他のウイ
ルスの検出に適用される。この場合、ウイルス単離体、
例えばペレットは試料として供し得る。

本発明の他の課題は鋳型核酸、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸およ
びポリメラーゼと一緒に検出されるべき抗体を含有する
試料をインキュベートし、合成された核酸を検出可能なモノヌクレオシド三リン
酸から分離し、核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出する
ことからなり、該インキュベーション混合物がさらなる固定化可能な
モノヌクレオシド三リン酸を含有し、該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌク
レオシド三リン酸および該固定化可能なモノヌクレオチ
ドを取り込む核酸を選択的および実質的に完全に結合す
ることができる固相に接触するかまたは接触させられることを特徴とする、ポリメラーゼに対する抗体を検出
する方法である。

この方法は、上記本発明のポリメラーゼ活性の検出に
基づいている。その反応混合物は、あるポリメラーゼ活
性を示す。該ポリメラーゼ活性を、このポリメラーゼに
対する抗体を含有すると予想される試料の添加後に存在
するものと比較する。このポリメラーゼに対して指向さ
れる抗体が存在する場合、活性は抗体が存在しない活性
と比較して低いであろう。使用した試料物質は血液、血
清、単離体、細胞培養物上清などであり得る。

したがって、使用される試薬の量およびタイプは、ポ
リメラーゼを検出する方法で使用されるものと実質的に
同一である。ポリメラーゼの濃度も、検出されるべき抗
体の量に左右される。しかし、当業者は、予めこの目的
のためのいくつかの試験を行うことによって適当な希釈
を見いだすことができる。本発明のポリメラーゼ検出方
法に関する検出範囲はこの場合に参照として供し得る。

さらに、ポリメラーゼを添加する前に抗体含有試料中
にもともと存在するポリメラーゼ活性を消去することが
有利であり得る。他の一般的な反応条件は、例えば、ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
（J.Clin.Microbiology）（1989）第27巻、７、第1453
〜1455頁およびエイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン
・レトロバイラシズ（AIDS Research and Human Retr
oviruses）（1989）第５巻、第535〜540頁から、当業者
に知られている。

II型およびIII型ポリメラーゼに対する抗体の検出は
別の対応するプライマーを必要とする。

HIV−RTに対する抗体を検出する方法の好ましい具体
例では、鋳型核酸、固定化可能なモノヌクレオシド三リ
ン酸としてのビオチニル化dUTP（EP−Ａ−0 063 879）
および検出可能なモノヌクレオシド三リン酸としてのジ
ゴキシゲニン−標識dUTP（WO89/06698）およびウイルス
溶解物からまたは遺伝子工学によって得られる所定量の
ポリメラーゼ、例えば、リバーストランスクリプターゼ
を、37℃で約60〜90分間、分析されるべき血清と一緒に
直接インキュベートする。インキュベーション後、該混
合物をストレプタビジン被覆キュベットに移す。約60分
間インキュベートした後、液体を廃棄し、キュベットを
洗浄溶液で洗浄する。次いで、ジゴキシゲニンに対する
POD標識抗体の溶液を添加する。約60分後に液体を再度
廃棄し、該キュベットを再度洗浄する。次いで、ABTS^R
溶液を添加し、着色を約405nmで測定する。

本発明の方法では、固相での検出可能なモノヌクレオ
チドの量または存在は、ポリメラーゼに対する抗体の量
または不在に従う。定量評価は、例えば、既知の量の抗
体を含有する試料で得られた検量線の助けをかりて可能
である。

個々のポリメラーゼまたは種々のポリメラーゼが検出
可能および固定化可能なモノヌクレオチドを取り込む条
件が変化すると個々のポリメラーゼに対する抗体間およ
び種々のポリメラーゼに対する抗体間で区別することが
できる。故に、本発明の方法は選択的方法である。例え
ば、１つのタイプのポリメラーゼに対する抗体を他のタ
イプのポリメラーゼに対する抗体の存在下で測定するこ
とができる。

本発明の方法は、例えば、HIVの如きウイルスのよう
な、ポリメラーゼを含有するかまたはポリメラーゼの生
産に関する情報を含有する微生物による感染の検出のた
めに使用され得る。該方法は、ポリメラーゼ活性を検出
する方法と同様に優れている。すなわち、それは公知の
方法よりも簡単で、迅速で、確実で、および感度がより
高い。冗長なIgG−調製物を必要としないことが該方法
のさらなる利点である。血清は試料として直接使用され
得る。

本発明の別の課題は、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸およびポリメラ
ーゼ反応を開始するためのプロモーター配列を必要とす
るポリメラーゼと一緒に検出されるべきプロモーター配
列を含有する試料をインキュベートし、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸から合成核酸を
分離し、核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出する
工程からなり、該インキュベーション混合物がさらなる固定化可能な
モノヌクレオシド三リン酸を含有し、該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌク
レオシド三リン酸および該固定化可能なモノヌクレオチ
ドを取り込む核酸を選択的におよび実質的に完全に結合
することができる固相に接触するかまたは接触させられ
ることを特徴とするプロモーター配列を検出する方法であ
る。

この方法は本発明のポリメラーゼ活性の測定に基づ
く。しかし、この方法は、所定量のポリメラーゼを添加
するが、一方、鋳型核酸を、検出されるべき試料に存在
し、かつプロモーター配列を含有し得る核酸に加えて添
加しない点で後者とは区別される。添加されたポリメラ
ーゼを開始することができるプロモーターが存在する
と、ポリメラーゼ反応が生じるであろうし、標識核酸が
検出され得る。検出され得るプロモーターとしてはSP
6、T7−およびT3−プロモーターが挙げられる。次い
で、個々のポリメラーゼ、すなわち、SP6−RNA−ポリメ
ラーゼ、T7−RNA−ポリメラーゼおよびT3−DNA−ポリメ
ラーゼを使用する。該試験は、個々のプロモーターに対
して特異的である。分子生物学では、このような試験
は、例えば、核酸構築物の検出において好都合に使用さ
れる。好ましい試料はDNA単離体である。

個々の試薬に関する濃度値および条件は、基本的に
は、本発明のポリメラーゼ測定方法で与えられた値に左
右される。

本発明の好ましい具体例では、試料を、固定化可能な
モノヌクレオシド三リン酸としてのビオチニル化dUTP
（EP−Ａ−0 063 879）および検出可能なモノヌクレオ
シド三リン酸としてのジゴキシゲニン標識dUTP（WO 89/
06698）と、ならびにプロモーターに対して特異的なポ
リメラーゼと反応させる。約35℃で90分間インキュベー
トした後、該混合物をストレプタビジン被覆キュベット
に移す。約60分間インキュベートした後、液体を廃棄
し、キュベットを洗浄溶液で洗浄する。次いで、ジゴキ
シゲニンに対するPOD標識抗体の溶液を添加する。約60
分後、液体を再度廃棄し、キュベットをもう１回洗浄す
る。次いで、ABTS^R溶液を添加し、着色を約405nmで測定
する。

本発明の方法では、ポリメラーゼに対するプロモータ
ーの長さもしくは存在またはポリメラーゼのタイプは固
相での検出可能なモノヌクレオチドの量または存在に従
う。

検出可能および固定化可能なモノヌクレオチドを取り
込むための条件が個々のポリメラーゼまたはポリメラー
ゼ・サブタイプについて異なる場合、個々のプロモータ
ー間で区別できる。故に、本発明の方法は、選択的方法
である。例えば、１つのポリメラーゼ・サブタイプのプ
ロモーターを別のポリメラーゼ・サブタイプのプロモー
ターの存在下で測定することができる。Ｉ型の真核ポリ
メラーゼは異なるプロモーター・タイプを認識する異な
るサブタイプ（RNA−polI、II、III）に存在する。そし
て、次に、各々個々のポリメラーゼ・サブタイプはさら
なる因子への依存性において異なるプロモーターを認識
する。

本発明の別の課題は、ポリメラーゼに対する抗体の検
出のための試薬キットである。該試薬キットは、鋳型核
酸、少なくとも１つの検出可能および少なくとも１つの
固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸および検出され
るべき抗体を指向するポリメラーゼを含有する。好まし
いさらなる成分は添加剤、および、所望により、固定化
可能なモノヌクレオシド三リン酸および該三リン酸エス
テルを含有する核酸を選択的にかつ実質的に完全に結合
する容器または他の固相である。好ましい方法では、少
なくともポリメラーゼは分離容器中で利用可能である。

第１図は２種類のウイルス溶解物濃度に関する抗HIV
陽性および抗HIV陰性血清（1:40）によるRT抑制のパー
セント（横座標）を示す。

第２図は組換えRT（約1:27000）に関する抗HIV陽性お
よび抗HIV陰性血清（1:40）によるRT抑制のパーセント
（横座標）を示す。

第１図および第２図におけるｎは血清の数を表す。

以下の実施例は非常に詳細に本発明を説明する。

実施例１ HIVの検出ａ）ペレット化HIVウイルスの調製 HIVウイルス培養物の細胞を含まない上清またはウイ
スル単離体溶液２〜3mlを得る。次いで、20000gで２時
間、超遠心して、細胞オルガネラおよび（陽性の場合）
ウイルス粒子のペレットを形成させる。

ｂ）ペレット化ウイルスの溶解ペレット化ウイルスの溶解緩衝液40μｌに溶解する。
溶解緩衝液： 1,4−ジチオエリトリトール（DTT、メルク（Merck）、
ダームスタット）2.5mM; EDTA（メルク、ダームスタット）0.75mM; KCl（メルク、ダームスタット）80mM; トリスHCl（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer
Mannheim））50mM; pH8.0（22℃）トリトン（Triton^R）Ｘ−100（シグマ（Sigma）、セ
ント・ルイス）0.5％別法としては、ウイルス含有上清35μｌに８倍に濃縮し
た溶解緩衝液５μｌを添加することもできる。

２℃で、このウイルス溶解物は活性を有意に低下させ
ずに約１週間貯蔵され得る（溶解物を乾燥から保護す
る）。

ｃ）インキュベーション／ポリメラーゼ反応以下の組成の溶液20μｌを前記溶解物に添加する。

DTT 10mM; KCl 290mM; MgCl₂ 30mM; dTTP 8.3μM; ビオチン−16−dUTP（ベーリンガー・マンハイム、Cat.
No.1 093 070）125nM; DIG−11−dUTP（ベーリンガー・マンハイム、Cat.No.
1 093 088） 2.5μM; ポリアデニル酸・ペンタデカチミジル酸（ポリＡ）・
(dT)₁₅（ベーリンガー・マンハイム、Cat.No.108 67
7）700U/l［35μg/ml］；トリス（Tris）x HCl 50mmol/lpH8.0（22℃）。

該混合物を35℃で90分〜24時間および所望の試験感度
に応じてさらに長くインキュベートする。

ｄ）反応生成物の単離インキュベーション後、該反応混合物をストレプタビ
ジン被覆96ウエルELISAプレート（EP−Ａ−0 344 578に
従って製造した、容量約20ngビオチン/ml、すなわち、6
0μｌ中ビオチン約1.2ng）のウエルに移し、次いで、35
℃で60分間インキュベートする。

ｅ）洗浄次いで、該ウエルを洗浄溶液（塩化ナトリウム0.85mo
l/l）で５回洗浄する。次いで、該ウエル中に残存する
溶液をプレート上でタッピングして除去する。

ｆ）POD標識抗ジゴキシゲニン抗体によるインキュベー
ション以下の組成のコンジュゲート溶液200μｌをウエルの
各々にピペットで移す：抗ジゴキシゲニン−POD（Fab断
片、Cat.No.1 207 733、ベーリンガー・マンハイム）20
0U/l; トゥイーン（Tween）20 0.5％塩化ナトリウム 0.85M 0.1mol/lリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5中。

該コンジュゲート溶液を60分後にデカントし、ウエル
を洗浄溶液（MaCl0.85M）で５回洗浄する。

ｇ）比色反応 ABTS^R緩衝液（Cat.No.1 112 597、ベーリンガー・マ
ンハイム）中 1g/l基質溶液（ABTS^R（2,2−アジノ−ジ−［３−エチル
ベンゾチアゾリンスルネート（６））］［sic］200μｌ
をウエルの各々にピペットで移す。35℃でさらに60分間
反応を生じさせた後、450nmに対して405nmで光度計で着
色を測定する。

ｈ）試験の感度本発明の方法の感度は、陽性対照（天然Ｔ細胞の連続
培養物を生産するウエルの上清約2mlからのペレット化H
IV−Ｉ−粒子の溶解物）の微量試料の連続希釈で試験し
た。

上記測定値は、異なる日に行った４つの実験の最小値
で得られる。試験の間で、使用する反応混合物を−20℃
で貯蔵した。異なる日に調製した少なくとも２つのバッ
チを使用した。最大シグナル（OD＞2.5）は、1:5の希釈
までで規則的に、1:25の希釈まででさえ幾つかの試験操
作で生じた。該シグナルの連続減少および希釈の同時増
加すると、リバーストランスクリプターゼの検出限界
は、90分間の反応時間後、約1:500の希釈で到達され
る。24時間の反応時間について、該制限は、1:3000〜1:
7500の希釈である（感度は６〜15倍高い）。異なる試験
操作におけるOD値間の偏差は典型的には２未満の因子に
おいてである。慣用の方法と比較して、反応時間90分を
有する新規試験は、少なくとも慣用の方法と同様に感度
が高く、より簡単な取り扱いによって区別される。さら
に、慣用の方法と比較して、本発明の方法のこの特異性
は、少なくとも24時間まで反応時間を延長し、故に、非
常により高い感度を得る。溶解された赤血球由来のヘモ
グロビンまたは細菌で塊状に汚染される試料でさえ、限
界を超えるブランクを示さない。種々のウイルス単離体
溶液（約3ml上清のペレット）の直接比較において、新
規な方法はその高い確実性で確信される。

実施例２リバーストランスクリプターゼの検出方法およびそれ
らのポリメラーゼへの可能な抑制効果について試料を試
験する方法実施例１と同様に、この試験はリバーストランスクリ
プターゼに関する試験に基づいている。

ａ）試料調製抑制剤の存在について試験されるべき試料は、一般
に、純粋なDMSO（ジメチルスルホキシド）中１〜10mg/l
の濃度で溶解される。これらの貯蔵溶液は、RT−緩衝液
（50mM Tris−HCl、pH7.9;50mM KCl;5mM MgCl₂;1mM DT
T）で希釈することによる希釈（通常、20〜200倍希釈）
に基づいている。

ｂ）インキュベーション該試験はストレプタビジン被覆96ウエル−ELISAプレ
ート（EP−Ａ−0 344 578に従って製造した）において
直接行われる。

プレートのウエル中に以下の溶液を連続してピペット
で添加する：陽性対照に関する希釈試料溶液またはRT−緩衝液 20
μｌ RT−緩衝液 20μｌ RNA−鋳型（HIV−LTR−５′−gag断片）１μｇおよび
以下の配列：配列番号１（５′−GTCCCTGTTCGGGCGCCA−
３′）の18−merDNA−プライマー21.3ngからなる鋳型／
プライマー錯体（水浴中、66.5℃で50倍濃縮形態で混合
物状態の両成分をインキュベートした後、該混合物を30
℃にゆっくりと冷却し、該混合物をRT緩衝液で10倍に希
釈する）20μｌ均質に精製されたイー・コリ（E.coli）においてクロ
ーン化および発現される公知の方法に従って製造され
（ヘテロダイマー、p66/p51、サイエンス（Science）
（1986）、231:1289−1291）、RT−緩衝液中１μg/mlの
濃度で溶解した、HIV−1RT 20μｌ以下の成分からなる反応開始溶液 20μl: RT−緩衝液（前記参照）５μＭ dATP ５μＭ dCTP ５μＭ dGTP ５μＭ Dig−11−dUTP 0.25μＭビオチン−16−dUTP 0.1％ノニデット（Nonidet^R）P40（ピアス（Pierc
e）、Cat.No.28324）。

T7−RNA−ポリメラーゼの助けをかりてイン・ビトロ
転写によって公知の方法に従って、鋳型として供される
1078塩基長さのHIV−LTR−５′−gagRNA断片を調製し
た。

次いで、該混合物を、37℃で１時間、水浴中、平坦な
底部を有する微量滴定プレート（結合ビオチンを結合す
るための許容量約20ng/ml、すなわち、100μｌ中ビオチ
ン約2ng）においてインキュベートする。この微量滴定
プレートはEP−Ａ−0 344 578に従って製造された。該
微量滴定プレートを接着ホイルで被覆する。

ｃ）該ウエルを５回、毎回、洗浄溶液（CaおよびMgを含
まないPBS（Cat.No.210 340、ベーリンガー・マンハイ
ム）、Tween20（Cat.No.170−6531、バイオ−ラッド（B
io−Rad）、0.05％（vol/vol））0.3mlで洗浄する。

ｄ）100mM Tris−HCl、pH7.9;150mM NaClの溶液中に含
有される抗ジゴキシゲニン−POD（Fab断片、Cat.No.1 2
07 733、ベーリンガー・マンハイム）100μｌを各ウエ
ルに添加する。室温で30分間インキュベーションを行
う。

ｅ）各ウエルを５回、各洗浄工程について洗浄溶液0.3m
lで洗浄する。

ｆ）以下の溶液100μｌを各ウエルに添加する： ABTS^R緩衝液中ABTS^R1g/1（Cat.No.1 114 497、ベー
リンガー・マンハイム）。

次いで、該溶液を室温で20〜30分間振盪しつつインキ
ュベートし、次いで、ELISA−光度計（MR5000 ダイナ
テック（Dynatech）、参照フィルター630nm）で405nmで
着色を測定する。405nmでの着色が遅延または消失する
場合にはポリメラーゼ抑制剤が存在する。

実施例３ DNA上の特異的なDNA依存性RNAポリメラーゼ活性およ
びRNA−ポリメラーゼに関する特異的なプロモーター配
列の検出 SP6−RNA−ポリメラーゼ T7−RNA−ポリメラーゼま
たはT3−RNA−ポリメラーゼに関するプロモーターを含
有する３つのDNA断片は、転写反応においてリボヌクレ
オチドの混合物と一緒にインキュベートされる。後者
は、Dig UTPおよびBio UTPならびにSP6−RNA−ポリメラ
ーゼまたはT7−RNA−ポリメラーゼも含有する。プロモ
ーターおよびポリメラーゼが特異的に適合する両アッセ
イでは、ヌクレオチドはDNAに相補的であり、RNA−鎖に
取り込まれる。インキュベーション後、該反応溶液をス
トレプタビジン被覆96ウエルELISAプレートのウエルに
移す。取り込まれたビオチン残基および取り込まれなか
ったビオチン残基はストレプタビジンに結合するであろ
う。RNA−ポリメラーゼ活性は、抗ジゴキシゲニン抗体
の助けをかりてビオチン−ヌクレオチドに共有結合され
るジゴキシゲニン−ヌクレオチドまたはジゴキシゲニン
−ハプテンを検出することによって検出され得る。した
がって、ポリメラーゼに対して特異的なプロモーターを
検出することができる。

ａ）転写反応鋳型−DNA（100ng/μｌ）１μｌ（100ng） Dig−Bio−ヌクレオチド−Mix 10×２μｌ RNAsin（50U/μｌ、Cat.No.799 017、ベーリンガー・マンハイム） 0.5μｌ（25U）転写緩衝液10× ２μｌファージーRNA−ポリメラーゼｘμｌ（20U） H₂O 全量20μｌまで 20μｌ鋳型−DNA: 適当なプロモーター配列を含有するプラスミドを制限
酵素によって切断し、アガロースゲル上で電気泳動によ
って分離した。プロモーターを含有するDNA断片を該ゲ
ルから溶離し、鋳型−DNAとして使用した。

ａ）SP6−プロモーターを有する鋳型 pSPT18プラスミド（Cat.No.909 793、ベーリンガー・
マンハイム）をEco RI＋SspIで消化し、951bpの断片を
単離した。転写物の長さ:58b。

ｂ）T7−プロモーターを有する鋳型 pSPT18プラスミド（Cat.No.909 793、ベーリンガー・
マンハイム）をHind III＋SspIで消化し、2204bpの断片
を単離した。転写物の長さ:61b。

ｃ）T3−プロモーターを有する鋳型（対照） pT3T7lacプラスミド（Cat.No.1 014 692、ベーリンガ
ー・マンハイム）をEco RI＋ScaIで消化し、1815bpの断
片を単離した。転写物の長さ:60b。

Dig−Bio−ヌクレオチド−Mix 10x: 100mM ATP 5μｌ（10mM） 100mM GTP 5μｌ（10mM） 100mM CTP 5μｌ（10mM） 100mM UTP 3.25μｌ（6.5mM） 1mM Bio−11−UTP 8.75μｌ（175nM） 10mM Dig−11−UTP 16.5μｌ（3.3mM） H₂O 6.5μｌ 50μｌ転写緩衝液 10x: 1M Tris/HCl（pH7.9） 400μｌ（400mM） 1M MgCl₂ 60μｌ（60mM） 1M DTT 100μｌ（100mM） 1Mスペルミジン 20μｌ（20mM） H₂O 420μｌ 1ml ファージ−RNA−ポリメラーゼ： SP6−RNA−ポリメラーゼ、Cat.No.810 266、ベーリン
ガー・マンハイム T7−RNA−ポリメラーゼ、Cat.No.881 767、ベーリン
ガー・マンハイム 4mMを超えるスペルミジン濃度を有するDNAが沈殿でき
るので、10x−転写緩衝液を、酵素の添加の直前に添加
した［クリーグ，ピー・エイ（Krieg,P.A.），メルト
ン，ディ・エイ（Melton,D.A.）（1987）、メソッズ・
オブ・エンザイモロジー（Meth.Enzym.）155］。H₂OをD
EPC（ジエチルピロカルボネート）で処理してRNAsesを
不活性化した。

30℃で２時間インキュベーション［クリーグ，ピー・エイ（1990）；ヌークリイック・
アシッズ・オブ・リサーチ（Nucl.Acids.Res.）、18、6
463の後］。

ｂ）微量滴定プレートにおける転写物のストレプタビジ
ンへの結合転写反応をTE（10nmol/lTrisHCl、1mmol EDTA、pH8.
0）で100μｌに充填した。希釈した転写反応20μｌの一
部分をストレプタビジン被覆96ウエルELISAプレート（E
P−Ａ−0 344 587に従って製造）の平底ウエルにピペッ
トで移し、0.05％（vol/vol）Tween20溶液180μｌを添
加した。全ての以下の結合および反応工程の間、該プレ
ートを蓋で覆った（ヌンク（Nunc）、Cat.No.26333
9）。

結合は、１時間、振盪しつつ37℃で行う。

未結合反応成分を、６回の洗浄工程で、各工程で0.9
％NaCl溶液300μｌを使用して、除去する。

ｃ）抗ジゴキシゲニン−抗体コンジュゲート体による検
出および着色反応実施例１の記載に従って、抗ジゴキシゲニン−POD（2
00U/l、Cat.No.1207733、ベーリンガー・マンハイム）2
00μｌを添加する。60分後、毎回0.9％NaCl溶液を使用
して６回の洗浄工程を行う。実施例１の記載に従って、
基質溶液（ABTS^R）200μｌを、37℃で、５〜60分間ウエ
ル中でインキュベートし、着色を405nmで光度計で測定
する。

実施例４患者の血清中でのHIV−RTに対する抗体の検出、該抗
体はRTの機能への抑制効果を有する。

この検出は、HIV感染に関する予後因子として供し、
異なる種類のHIV（HIV1およびHIV2）間での区別に供し
得る。

希釈血清（溶解緩衝液中1:10、実施例１を参照）10μ
ｌをポリメラーゼ（ウイルス溶解物または一般に処理さ
れたリバーストランスクリプターゼから得られる）30μ
ｌに添加し、1x濃縮溶解緩衝液中に希釈し、35℃で60〜
90分間インキュベートする。次いで、反応溶液（実施例
１のｃに記載された）20μｌを添加し、35℃で24時間イ
ンキュベートする。残りの方法は、実施例１の記載と同
様である。該試料はリバーストランスクリプターゼの機
能を抑制する抗体を含有する場合、シグナルは抑制され
るかまたは部分的に低下させられるであろう。RT抑制抗
体を含まない血清試料は、使用されるRTの量に相当する
シグナルを生成する。

ａ）予備試験：最適な血清およびウイルス濃度を測定するためにいく
つかの試験を行った。これらの試験では、各々、1:32お
よび1:64に希釈した６つのHIV−１−陽性およびHIV−陰
性血清を、1:250に希釈した標準的なウイルス溶解物（H
IV−１感染H9−細胞のウエル生産細胞培養物の上清約1m
lから溶解されたHIV−１）で試験した。別の試験では、
各々、1:32、1:64および1.128の濃度に希釈した３つの
さらなるHIV−１−陽性およびHIV−陰性血清および各
々、1:125、1:250および1:500の標準的ウイルス溶解物
希釈液を試験した。一般的に処理した（組換え）RT（ミ
クロゲン（Mikrogen）、ムニッヒ FRG）の調製物の異
なる希釈液によるさらなる試験も行った。最適なポリメ
ラーゼ希釈は、試験が開始される前にRT−抑制能が特徴
付けられた血清の助けで判明した。組換えRTの約1:2500
0の希釈が最も適していると証明された。

得られた値は全HIV−１陽性血清によるRT機能の有意
な抑制を示したが、一方、HIV陰性血清によるRT機能は
損なわれた。相対的なシグナル抑制は、1:32および1:64
の血清希釈液で最も明確である。本発明者らの標準的な
ウイルス溶解物の理想的な希釈は1:125〜1:250間の範囲
であることが判明した。

ｂ）患者の血清による試験原理の確認予備試験からの体験に基づいて、各々1:40に希釈した
34個のHIV−１−陽性血清および26個のHIV−陰性血清を
２つのバッチで試験した。１つのバッチは1:125に希釈
したウイルス溶解物を有しており、別のバッチは1:250
に希釈したウイルス溶解物を有する。結果を第１図に示
す。さらに試験原理を確認するために、多量の血清（98
個の抗−HIV−１−陽性血清および76個の抗−HIV−陰性
血清）を、組換えRT（希釈約1:27000）によって抗体を
抑制することについて試験した。組換えRTで得られた全
体的な結果を第２図に示す。

ｃ）RT抑制抗体の予後値を確立するための試験 132個の抗−HIV−１−陽性血清の幾つかから、本発明
者らは患者（無症候性LAS/ARC、AIDS）の臨床症状を知
り、幾つかから本発明者らは血清または血漿を用いてp2
4−抗原−ELISA（アボット・ラボラトリーズ（Abbott
Laboratories）、ノース・シカゴ、USA）で得られた試
験結果を知った。第３のグループでは、ウエスターン・
ブロット（WB）における反応パターンを使用して、異な
る症状間で区別することができる；すなわち、血清変換
（初期感染）後、有意でない抗体プロフィルを有する患
者は抗−p24レベルの増加および後期を開始する。RT−
抑制血清抗体の予後値を試験するために、血清の割合は
50％を超えるRT−抑制であり、平均RT−抑制は全てのグ
ループの比較で計算された（第２表を参照）。

実施例５ DNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性の検出任意にプライムされた標識化反応で、熱変性DNA断片
およびプライマーとして供し得る全ての可能な配列の六
量体からなる六量体の混合物と一緒にクレノウ−ポリメ
ラーゼをインキュベートする。非標識ヌクレオチドに加
えて、ポリメラーゼはまたDIGdUTPおよびBiodUTPを取り
込む。ポリメラーゼ活性によって生産された二重標識DN
Aは、次に、ストレプタビジン被覆ELISAプレートにおい
て定量的に測定され得る。

ａ）反応混合物：長さ356bpのDNA断片２μｇを、H₂O15μｌ中で95℃で1
0分間変性させ、次いで、直後に氷上に置く。これらの1
5μｌに以下の成分をピペット添加する。

10x反応緩衝液（ランダム・プライムド・ディ・エヌ・
エイ・ラベリング・キット（Random Primed DNA Labell
ing Kit）から、 Cat.No.1004760、ベーリンガー・マンハイム）２μｌ 10xヌクレオチド−Mix ２μｌクレノウ−酵素（ランダム・プライムド・ディ・エヌ・
エイ・ラベリング・キットから、Cat.No.1004760、ベー
リンガー・マンハイム）１μｌ 10xヌクレオチド−Mix: dATP 2mM dCTP 2mM dGTP 2mM dTTP 1.75mM DIGdUTP 0.25mM BiodUTP 125nM 反応混合物を37℃で３時間インキュベートし、次い
で、TE緩衝液（10mMTris、1mM EDTA）で1:10に希釈す
る。

対照反応は、混合物がBiodUTPを含有しないこと以外
は同一の方法を行う。

ｂ）微量滴定プレートにおける反応生成物のストレプタ
ビジンへの結合およびその検出 TE−緩衝液200μｌに含有される、標識反応に使用さ
れるDNA断片の、各々、20ngおよび60ngを含有する希釈
反応混合物２μｌおよび６μｌの一部分を、ストレプタ
ビジン被覆微量滴定プレートに移し、37℃で１時間イン
キュベートする。

次いで、該プレートを0.5％（vol/vol）Tween20を有
するPBS−緩衝液300μｌで３回洗浄する。

次いで、抗−ジゴキシゲニン−POD（150mU/ml、Cat.N
o.1207733、ベーリンガー・マンハイム）200μｌを添加
する。１時間後、各々、0.5％（vol/vol）Tween20を有
するPBS−緩衝液300μｌで、あと３回の洗浄工程を行
う。次いで、前記実施例に従って、ABTS^R−基質溶液200
μｌを添加し、30分のインキュベーション期間後、405n
mで着色を測定する。

配列プロトコル：配列番号1: 配列の長さ： 18塩基配列の型：ヌクレオチド鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状 GTCCCTGTTCGGGCGCCA

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ケスラー，クリストフドイツ連邦共和国デー―8021ドルフェン、シュロスベルクヴェーク11番 (72)発明者ケーニヒ，ベルンハルトドイツ連邦共和国デー―8137ベルク３、デューベルクシュトラーセ28番

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】鋳型核酸および検出可能なモノヌクレオシ
ド三リン酸と一緒にポリメラーゼを含有する試料をイン
キュベートし、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸から該核酸を分離
し、該核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出する
工程からなり、さらに、インキュベーション混合物が固定化可能なモノ
ヌクレオシド三リン酸を含有し、該インキュベーション混合物が、固定化可能なモノヌク
レオシド三リン酸および該固定化可能なモノヌクレオチ
ドを取り込む核酸を選択的および実質的に完全に結合す
る固相に接触するかまたは接触させられることを特徴と
する、ポリメラーゼ活性の測定方法。
【請求項２】鋳型核酸がDNAであり、それがポリメラー
ゼに対して特異的であるプロモーターを含有し、モノヌ
クレオシド三リン酸がリボヌクレオシド三リン酸である
請求項１記載の方法。
【請求項３】鋳型核酸がDNAであり、さらに、オリゴヌ
クレオチドがインキュベーション混合物に添加され、該
オリゴヌクレオチドが鋳型核酸の一部分に実質的に相補
的であり、モノヌクレオシド三リン酸がデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸である請求項１記載の方法。
【請求項４】鋳型核酸がRNAであり、モノヌクレオシド
三リン酸がデオキシリボヌクレオシド三リン酸である請
求項１記載の方法。
【請求項５】鋳型核酸がRNAであり、かつプライマー構
造を含み、モノヌクレオシド三リン酸がリボヌクレオシ
ド三リン酸である請求項１記載の方法。
【請求項６】ポリメラーゼがリバーストランスクリプタ
ーゼである請求項４記載の方法。
【請求項７】リバーストランスクリプターゼがHIV粒子
由来である請求項６記載の方法。
【請求項８】分離容器に、鋳型核酸、少なくとも１つの検出可能および少なくとも
１つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸、固定化可能なモノヌクレオチドが選択的かつ実質的に完
全に結合され得る容器、および洗浄溶液を含有するポリメラーゼ活性検出用試薬キット。
【請求項９】固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を
含有することを特徴とする、鋳型核酸および検出可能な
モノヌクレオシド三リン酸を含有するポリメラーゼ活性
検出用試薬。
【請求項１０】HIVが存在すると予測される試料から調
製された溶解物、この溶解物に、鋳型核酸、少なくとも１つの検出可能お
よび１つの固定化可能なモノデオキシリボヌクレオシド
三リン酸および添加剤が添加され、あるインキュベーション期間の後、該混合物が、固定化
可能なモノヌクレオチドおよび該モノヌクレオチドを含
有する核酸を選択的かつ実質的に完全に結合する容器に
移され、過剰量で存在する検出可能なモノヌクレオシド三リン酸
が分離され、結合された検出可能なモノヌクレオチドが検出されるこ
とを特徴とするHIV検出方法。
【請求項１１】溶液中、鋳型核酸およびモノヌクレオシ
ド三リン酸の存在下でポリメラーゼと一緒に物質をイン
キュベートし、得られた核酸の量を検出することからなり、インキュベーション溶液が１つの検出可能および１つの
固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸を含有し、過剰の、取り込まれない検出可能なモノヌクレオシド三
リン酸から分離された核酸であって、該核酸が固定化可
能なモノヌクレオシド三リン酸および該モノヌクレオシ
ド三リン酸が取り込まれる核酸を選択的かつ実質的に完
全に結合する固相に接触させられることを特徴とする、
物質のポリメラーゼ活性への抑制効果の測定方法。
【請求項１２】検出されるべき抗体を含有する試料を、
鋳型核酸、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸および
ポリメラーゼと一緒にインキュベートし、得られた核酸を検出可能なモノヌクレオシド三リン酸か
ら分離し、合成核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出す
ることからなり、該インキュベーション混合物がさらに固定化可能なモノ
ヌクレオシド三リン酸を含有し、該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌクレ
オシド三リン酸および該固定化可能なモノヌクレオチド
が取り込まれる核酸を選択的かつ実質的に完全に結合す
る固相に接触するかまたは接触させられることを特徴と
する、ポリメラーゼに対する抗体の検出方法。
【請求項１３】検出可能なモノヌクレオシド三リン酸お
よびポリメラーゼ反応を開始するためにプロモーター配
列を必要とするポリメラーゼと一緒に検出されるべきプ
ロモーター配列を含有する試料をインキュベートし、検出可能なモノヌクレオシド三リン酸から該核酸を分離
し、該核酸に含有される検出可能なヌクレオチドを検出する
工程からなり、該インキュベーション混合物がさらに固定化可能なモノ
ヌクレオシド三リン酸を含有し、該インキュベーション混合物が固定化可能なモノヌクレ
オシド三リン酸および該モノヌクレオチドが取り込まれ
る核酸を選択的かつ実質的に完全に結合する固相に接触
するかまたは接触させられることを特徴とする、プロモ
ーター配列の検出方法。
【請求項１４】分離容器中に鋳型核酸ならびに少なくとも１つの検出可能および少な
くとも１つの固定化可能なモノヌクレオシド三リン酸、検出されるべき抗体が指向されるポリメラーゼを含有するポリメラーゼに対する抗体の検出用試薬キッ
ト。