FI103808B - Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoittamiseen - Google Patents
Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoittamiseen Download PDFInfo
- Publication number
- FI103808B FI103808B FI931586A FI931586A FI103808B FI 103808 B FI103808 B FI 103808B FI 931586 A FI931586 A FI 931586A FI 931586 A FI931586 A FI 931586A FI 103808 B FI103808 B FI 103808B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- reaction
- primer
- labeled
- process according
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Control Of El Displays (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
103808
Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoittamiseen - Förfarande för känsligt pävisande av nukleinsyror 5 Patenttihakemus koskee menetelmää nukleiinihapon tai sen osa osoittamiseksi spesifisesti.
Nukleiinihappojen osoittaminen kliinisessä diagnostiikassa ja molekyylibiologiassa on viime aikoina saavuttanut yhä enemmän merkitystä verrattuna klassisiin immuu-10 nitesteihin. Tämä liittyy siihen, että on edistytty eri alkulähteistä olevien nukleiinihappojen nukleotidi-sekvenssien tutkimuksessa.
Koska nukleotidisekvenssistä saatavat tiedot ovat erittäin eriytyneitä, voidaan nuk-leiinihappodiagnostiikkaa käyttää erittäin edullisesti erottamaan pieniäkin tunnus-15 merkkejä. Tämä on esimerkiksi tärkeää osoitettaessa mutaatioita ja eroja keinotekoisesti luoduissa sekvensseissä. Amplifikaatiomenetelmän kehittämisen kautta voitiin nukleiinihapon osoittamisen herkkyyttä kohottaa melkoisesti.
Eräs sellainen menetelmä on esimerkiksi EP-A-0 200 362:ssa kuvattu. Amplifikaa-20 tioefekti saadaan aikaan pääosiltaan siten, että niin kutsutusta kohdenukleiinihaposta templaattina muodostetaan alukkeen ja mononukleosiditrifosfaatin avulla alukkeen pidennystuote, joka joko voidaan osoittaa tai käyttää jälleen itse templaattinukleiini-happona. Tällöin voidaan pidennystuotteeseen myös viedä osoitettavissa oleva nukleotidi. Syntynyt pidennystuote voidaan osoittaa myös elektroforeettisesti.
25 Tämä osoitusmenetelmä on kuitenkin perinpohjaisen ja aikaa vievän elektroforeesi-vaiheen takia epäedullinen.
Leimaamaton pidennystuote voidaan kuitenkin EP-A-0 201 184:n mukaan osoittaa 30 myös hybridisoimalla se osoitettavissa olevan leimatun nukleiinihappokoettimen kanssa. Hybridin erottaminen pidennystuotteesta ja reagoimattomasta koettimesta on kuitenkin siinä kuvatulla menetelmällä joko tehotonta epäspesifisten vuorovaikutusten takia tai sidottu moniin pesuvaiheisiin, jotka vähentävät herkkyyttä.
35 WO 89/11546:ssa ehdotetaan menetelmää, jossa amplifioidut, kiinteään faasiin sidotut nukleiinihapot reagoitetaan alukkeen ja leimatun mononukleotidin kanssa, jolloin täten muodostuneet leimatut nukleiinihapot voidaan osoittaa. Tämän menetelmän 2 103808 haittana on, että kaikki ratkaisevat reaktiot tapahtuvat kiinteässä faasissa, minkä johdosta reaktionopeus hidastuu. Myös EP-A-0 324 474:ssä ehdotetaan sellaista menetelmää, jossa leimattuja mononukleotidejä viedään sekvenssiin ja nämä leimatut nukleiinihapot kiinnitetään immobilisoiduilla nukleiinihapoilla, jotka ovat komp-5 lementaarisia osoitettavien nukleiinihappojen kanssa. Amplifioitavien nukleiinihappojen denaturaatiomenetelmistä ja hybridisaatio-olosuhteista ei sanota mitään. Vielä eräs tämän menetelmän haittapuoli on, että tehokkaan kiinteään faasiin sidotun nukleiinihapon tuottaminen on hankalaa.
10 EP-A-0 357 01 l:ssä kuvataan menetelmä, jossa pidennysreaktiossa käytetään kahta aluketta, joista toinen on osoitettavissa olevasti leimattu ja toinen on sopiva kiinteään faasiin sitoutumiseen. Tämän menetelmän haittana on, että on hankalaa erottaa osoitettavissa olevia oligonukleotidejä näitä oligonukleotidejä sisältävistä pidennys-tuotteista. Jos erottamista ei tehdä, on kilpailureaktioiden takia odotettavissa vähen-15 tynyt herkkyys.
EP-A-0 297 379:ssä ja EP-A-0 348 529:ssä on kuvattu menetelmä, jossa immobili-soitu tai immobilisoituva aluke kohdenukleiinihappo templaattina pidennetään osoitettavalla mononukleotidillä immobilisoiduksi ja samanaikaisesti osoitettavissa ole-20 vaksi leimatuksi nukleiinihapoksi. Tällä menetelmällä on haittana mm. että osoittamisen spesifisyys ei ole kovin korkea. Samoin EP-A-0 297 379:ssä kuvatulla menetelmällä, jossa käytetään vain yhtä immobilisoitavaa tai immobilisoitavissa olevaa aluketta, minkä jälkeen pidennystuotteet saatetaan reagoimaan leimatun oligonu-kleotidin kanssa, on EP-A-0357 011 :ssä kuvattu haitta, että oligonukleotidi on vai-25 kea erottaa.
WO 89/0928 l:ssä on kuvattu menetelmä, jossa molemmissa alukkeissa on sama kemiallinen ryhmä, jota toisaalta käytetään immobilisointiin ja toisaalta osoittamiseen. Tämä vahvistaa vielä edellä mainitun haittapuolen huonosta erotettavuudesta. 30
Julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi. 86, s. 6230-6234, kuvataan samoin menetelmä, jossa pidennetään osoitettavissa oleva leimattu aluke. Osoittaminen tapahtuu sen jälkeen, kun pidennystuote on sidottu pyydysnäytteeseen. Myöskään tässä ei osoitettavissa olevan leimatun alukkeen erottaminen ole mahdollista ilman li-35 sävaihetta ja se häiritsee tämän vuoksi osoitusreaktiota.
3 103808
Siksi keksinnön tehtävänä oli välttää tekniikan tason menetelmien haittapuolet ja erityisesti saada käyttöön nukleiinihapon osoitusreaktio, jossa yhdistyy suuri spesifisyys tai selektiivisyys vähäiseen taustasignaaliin.
5 Keksintö koskee menetelmää nukleiinihapon spesifiseksi osoittamiseksi näytteessä, johon menetelmään sisältyvät seuraavat vaiheet: a) näytteen reagoittaminen yhden tai useamman osoitettavalla leimalla merkityn mononukleosiditrifosfaatin ja yhden tai useamman entsyymin kanssa, joka katalysoi 10 leimatun nukleiinihappo B:n tuottamista, jossa tätä nukleotidiä on, b) reaktioseoksen ei-terminen denaturointi, c) nukleiinihappo B:n hybridisointi nukleiinihappokoettimen C kanssa, jossa on vähintään yksi immobilisoitava tyhmä ja joka on riittävän komplementaarinen nukleiinihappo B:n kanssa, ja samanaikaisesti nukleiinihappokoettimen C immobili- 15 sointi kiinteään faasiin, joka voi sitoa spesifisesti immobilisoitavan nukleiinihappokoettimen C, d) nestemäisen faasin erottaminen kiinteästä faasista, ja e) leimatusta nukleiinihaposta B ja nukleiinihappokoettimesta C muodostuneen nukleiinihappohybridin D osoittaminen osoittamalla kiinteään faasiin sitoutunut 20 osoitettavissa oleva leima.
Keksinnön muut oleelliset tunnusmeikit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Keksinnön mukainen menetelmä koskee niin sanottujen hybridisointitestien erityistä 25 suoritusmuotoa, joka on nukleiinihappodiagnostiikan alueen ammattimiehelle tuttua. Mikäli kokeellisia yksityiskohtia ei seuraavissa huomioida, viitataan julkaisuihin "Nucleic acid hybridisation", julkaisija B.D. Hames ja S.J. Higgins, IRL Press, 1986, luvuissa 1 (Hybridisation Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) ja 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular 30 Biology, toim. F.M. Ausubel et ai., J. Wiley and Son, 1987, 2.9.1.-2.9.10 ja Molecular Cloning, toim. J. Sambrook et ai., CSH, 1989, 9.4.7. - 9.5.8. Näihin kuuluvat erityisesti tunnetut menetelmät leimattujen nukleosiditrifosfaattien valmistamiseksi, kuten on kuvattu myös EP-A-0 324 474:ssä, modifioitujen ja modifioimattomien oligonukleotidien kemiallinen synteesi, nukleiinihappojen pilkkominen restriktioent-35 syymien avulla, hybridisointiolosuhteiden valinta, joilla saavutetaan spesifisyys, joka riippuu hybridisoitavien nukleiinihappojen välisen homologian kattavuudesta, niiden GC-sisällöstä ja niiden pituudesta, samoin kuin nukleiinihappojen muodos- 4 103808 taminen nukleosiditrifosfaateista polymeraasien avulla, mahdollisesti niin sanottujen alukkeiden avulla.
Leimaaminen tämän keksinnön yhteydessä tarkoittaa suoraa tai epäsuoraa osoitet-5 tavissa olevaa ryhmää L. Suoraan osoitettavissa olevia ryhmiä ovat esimerkiksi ra-dioaktiiviset ( P), värilliset tai fluoresoivat ryhmät tai metalliatomit. Epäsuoraan osoitettavissa olevia ryhmiä ovat esimerkiksi immunologisesti tai entsymaattisesti vaikuttavat yhdisteet, kuten vasta-aineet, antigeenit, hapteenit tai entsyymit tai entsymaattisesti aktiiviset osaentsyymit. Nämä osoitetaan seuraavissa reaktioissa tai 10 reaktiosekvensseissä. Erityisen edullisia ovat hapteenit, koska niillä leimatut nu-kleosiditrifosfaatit ovat yleensä erityisen hyviä polymeraasin substraattina, ja sen jälkeen tapahtuva reaktio leimatun vasta-aineen kanssa hapteenia tai haptenisoitua nukleosidia vastaan voidaan suorittaa helposti. Sellaisia nukelosiditrifosfaatteja ovat esimerkiksi bromi-nukleosiditrifosfaatit tai digoksigeniini-, digoksiini- tai fluoreseii-15 ni-kytketyt nukleosiditrifosfaatit. Erityisen sopiviksi ovat osoittautuneet EP-A-0 324 474:ssä mainitut steroidit ja niiden osoitus. Niiden liittämiseksi nukleiinihappoihin viitataan täten EP-A-0 342 474:ään.
Nukleosiditrifosfaatit (NTP) ovat ribo (rNTP)- tai desoksiribonukleosiditrifosfaatte-20 ja (dNTP).
Kohdenukleiinihapolla tarkoitetaan nukleiinihappoa, joka on keksinnön mukaisen menetelmän osoittamisen kohde ja lähtömateriaali.
25 Templaattinukleiinihappo A on nukleiinihappo, jonka perusteella olennaisesti uusi komplemetaarinen nukleiinihappojuoste muodostetaan. Mitä tulee sekvenssi-informaatioon, toimii templaattinukleiinihappo matriisina ja sisältää sekvenssi-informaation, joka reaktiossa a) uudelleenkirjoitetaan nukleiinihapoksi B. Nukleiinihappo A on joko kohdenukleiinihappo tai siitä johdettu nukleiinihappo. Se voi olla esimer-30 kiksi osa kohdenukleiinihappoa tai sisältää osan kohdenukleiinihappoa toisten osien vieressä, esimerkiksi erittäin kompleksiset nukleiinihapot. Siinä voi olla myös osa kohdenukleiinihapon kanssa komplementaarista juostetta.
Nukleiinihappojen denaturaatio tarkoittaa nukleiinihapon kaksoisjuosteen erottumis-35 ta yksijuosteiseksi. Ammattimiehellä on käytössään lukuisia muunnelmia.
5 103808
Spesifisellä osoittamisella tarkoitetaan menetelmää, jolla haluttaessa voidaan osoittaa myös selektiivisesti määrättyjä nukleiinihappoja toisten nukleiinihappojen läsnäollessa. On kuitenkin mahdollista, että osoitetaan useampia nukleiinihappoja tai ryhmä nukleiinihappoja, joilla on osittain yhteensopiva tai samanlainen nukleotidi-5 sekvenssi, tai useampi jakso nukleiinihaposta muiden nukleiinihappojen läsnäollessa. Kaksoisjuosteisen nukleiinihapon osoittamiseksi voidaan käyttää kumpaakin komplementaarista juostetta.
Olennaisesti komplementaarisella nukleiinihapolla tai nukleiinihapposekvenssillä 10 tarkoitetaan nukleiinihappoja tai sekvenssejä, jotka voidaan hybridisoida vastaavan nukleiinihapon kanssa, jonka nukleotidisekvenssi on hybridisoitavalla alueella joko tarkalleen komplementaarinen toisen nukleiinihapon kanssa tai erottuu muutaman emäksen suhteen tarkasti komplementaarisesta nukleiinihaposta. Spesifisyys mukautuu sekä komplementaarisuuden asteen että hybridisointiolosuhteiden mukaan.
15
Nestefaaseina käytetään nukleiinihapon osoittamisessa tavallisesti vesipitoisia faaseja, joissa on liuenneita orgaanisia tai epäorgaanisia ainesosia, esim. hybridisointi-puskuria, ylimääränukleotideja, muita ei-osoitettavia nukleiinihappoja, proteiineja jne.
20
Keksinnön mukainen menetelmä toimii nukleiinihapon osoittamiseksi. Nukleiinihapoilla tarkoitetaan tällöin mitä tahansa alkuperää esimerkiksi viroidi-, virus-, bakteeri- tai solualkuperää olevia nukleiinihappoja. Ne voivat esiintyä liuoksessa, suspensiossa, mutta ne voivat olla myös kiinnittyneinä kiinteisiin kappaleisiin tai olla 25 solupitoisissa alustoissa, solunäytteissä, kiinnitetyissä soluissa, kudosleikkeissä tai kiinnitetyissä organismeissa. Nukleiinihapot ovat edullisesti liuoksessa. Reaktiovai-heet aloitetaan useimmiten saattamalla tutkittava nukleiinihappo yhteyteen vastaavan reagenssin kanssa. Tällöin voivat osaltaan auttaa sekä pH:n muunnokset (emäksinen), lämpö, äärilämpötilamuunnoksien toistaminen (jäädyttäminen/sulatta-30 minen), fysiologisten kasvuolosuhteiden muuttaminen (osmoottinen paine), deter-genttien vaikutus, kaotrooppiset suolat tai entsyymit (esim. proteaasit, lipaasit), yksin tai yhdessä, nukleiinihapon vapauttamiseen. Koska keksinnön mukainen menetelmä on erittäin herkkä ja selektiivinen, voidaan myös pienet nukleiinihappomäärät osoittaa muiden aineiden läsnäollessa, esimerkiksi proteiinien, solujen, solufrag-35 menttien, mutta myös ei-osoitettavien nukleiinihappojen. Näytteen puhdistaminen voidaan täten jättää pois, kun on varmistettu, että osoitettavissa olevat nukleiinihapot ovat riittävän saavutettavissa käytetyille reagensseille.
6 103808
Nukleiinihappoja voidaan myös esikäsitellä. Tunnettuihin esikäsittelyihin kuuluvat erityisesti fragmentointi, esimerkiksi restriktioentsyymien avulla tai cDNA-synteesi RNA:sta. Jotta keksinnön mukainen menetelmä voisi osoittaa etunsa täydellisesti, on osoittaunut tarkoituksenmukaiseksi, että nukleiinihapon koko on vähintään 40 bp. 5
Lisäksi nukleiinihappo on edullisesti aikaisemman spesifisen tai epäspesifisen nukleiinihappoamplifikaation tuote. Sellaisia nukleiinihappoamplifikaatiomenetel-miä tunnetaan esimerkiksi seuraavista EP-A-0 201 184, EP-A-0 272 098, EP-A-37 26 934, EP-A-0 237 362, WO 88/10315, WO 90/01069, WO 87/06270, EP-A-0 300 10 796, EP-A-0 310 229, WO 89/09835, EP-A-0 370 694, EP-A-0 356 021, EP-A-0 373 960, EP-A-0 379 369, WO 89/12696 tai EP-A-0 361 983.
Nukleiinihapot voivat kuitenkin olla myös kloonauksella ja in vivo lisäämisellä tuotettuja nukleiinihappoja.
15
Osoitettavia (kohde)nukleiinihappoja voidaan käyttää suoraan templaattinukleiini-happona A reaktiossa a), kun se täyttää valitulle entsyymisysteemille tarpeelliset ehdot. Tähän kuuluu, että monien entsyymien suhteen kyse on yksijuosteisista nukleiinihapoista, kun taas toisille vaaditaan, että niillä on entsyymisysteemin tunnista-20 miskohta tai promoottori.
Jos näin ei ole, niin kohdenukleiinihapot täytyy muuttaa aikaisemmassa vaiheessa (reaktio a) tällaiseksi templaattinukleiinihappo A:ksi.
25 A:ssa voi olla kysymys ribonukleiinihaposta tai desoksiribonukleiinihaposta. Erityisen edullisia nukleiinihappo A:na ovat desoksiribonukleiinihapot.
Entsyymi E keksinnön mielessä on entsyymi tai entsyymisysteemi, joka katalysoi nukleiinihappojen templaattiriippuvaiset synteesit mononukleosiditrifosfaateista. 30 Edullisia entsyymejä ovat polymeraasit ja transkriptaasit, jotka aikaansaavat mono-nukleotidien yhteenliittämisen. Tällaiset entsyymit ovat ammattimiehelle tuttuja.
Ensimmäisessä vaiheessa valmistetaan templaattinukleiinihaposta A leimattu nukleiinihappo B. Tämä voi periaatteessa tapahtua millä lailla tahansa, niin kauan kuin 35 nukleiinihapon A tai sen osan nukleotidisekvenssin spesifinen informaatio säilyy olennaisesti.
7 103808
Eräs menetelmä on esimerkiksi nukleiinihappo A:n yksittäisten nukleotidien vaihto leimattuihin nukleotideihin, esimerkiksi nick-koijauksella (J. Mol. Biol. 113, 237 (1977)). Tässä reaktiossa entsyymi E on E. coli DNA polymeraasi tai Komberg-entsyymi. Tämä menetelmä ei kuitenkaan ole täysin edullinen, koska leimaus vie-5 dään sisään suhteellisen epäspesifisestä tämä tarkoittaa että nukleiihappo A.n lisäksi kaikki muut näytteessä olevat nukleiinihapot leimautuvat. Siksi se sopii erityisesti reaktioon a) silloin kun, kuten edellä kuvattiin, osoitettavat nukleiinihapot on ampli-fioitu spesifisesti edeltävässä amplifikaatiovaiheessa.
10 Eräässä toisessa menetelmässä, jolla samoin on mainittu haittapuoli, pidennetään nukleiinihappoa A leimattujen nukleotidien sekvenssiinviennillä (hännitys). Muita tämän tapaisia menetelmiä ovat fotoleimaus ja satunnainen alukkeen käyttö.
Tähän mennessä kuvatuissa vaiheissa nukleiinihappo B:n tuottamiseksi käytetään 15 reaktiossa a) suoraan kohdenukleiinihappoa. Tämä voi olla yksi- tai kaksijuosteista.
Seuraavissa esitetyissä edullisissa suoritusmuodoissa täytyy kohdenukleiinihapot tehdä reaktion a) aikana tai ennen sitä yksijuosteisiksi. Mahdollisesti välttämätön juosteen erottaminen voi tapahtua emäskäsittelyllä, mutta myös termisesti, entsy-20 maattisesti tai kaotrooppisten suolojen avulla.
Reaktion a), joka on riippuvainen spesifisen käynnistimen läsnäolosta, käyttäminen on kohonneen spesifisyyden takia erityisen edullista. Tällaiset spesifiset käynnistimet saavat aikaan sen, että entsyymi vaikuttaa vain nukleiinihappoihin, jotka ovat 25 sitoneet tämän käynnistimen. Käynnistin on edullisesti niin kutsuttu spesifmen aluke Pl, promoottori tai replikaation aloitusalue.
Spesifiset alukkeet Pl ovat erityisesti oligonukleotidejä tai modifioituja oligonuk-leotidejä, joilla on olennaisesti nukleiinihapon A kanssa komplementaarinen nukleo-30 tidisekvenssi. Modifioidut oligonukleotidit ovat esimerkiksi oligonukleotidejä, joilla on 3'-päässä dideoksinukleotidi. Tällaisia oligonukleotidejä voidaan valmistaa entsymaattisesti. Kohdenukleiinihappoa voidaan käyttää suoraan kuten templaattinukle-iinihappo A:ta.
35 Tällaisten alukkeiden Pl käyttö edellyttää siis, että vähintään osa nukleiinihapon sekvenssistä on tunnettu. Alukkeen sekvenssi valitaan lisäksi siten, että se on toises- 8 103808 ta päästään, edullisesti 3-pää, lyhyempi kuin nukleiinihappo. Tällä on siksi ylimääräinen yksittäisjuosteosa alukkeen 3'-pään toisella puolen.
Reaktiovaiheissa voidaan jokaista osoitettavissa olevaa yksittäisjuosteista nukle-5 iinihappoa kohti käyttää yksi tai useampi spesifinen aluke. Useamman alukkeen tapauksessa eivät mene päällekkäin ne nukleiinihapossa olevat alueet, joiden kanssa aluke voi hybridisoitua, ja erityisen edullisesti on näiden alueiden välissä nukleiinihapon A yksijuosteisia alueita. Alukkeessa voi templaattinukleiinihappo A:n kanssa olennaisesti komplementaarisen osan, edullisesti 5-päässä, vieressä olla vielä 10 nukleotidi sekvenssi SI, joka ei hybridisoidu nukleiinihapon kanssa, erityisesti komplementaariseen alueeseen liittyvällä alueella.
Tämä sekvenssi SI voi olla esimerkiksi yksi- tai kaksijuosteinen ja siinä voi olla myös entsyymin tunnistussekvenssi. Tämä voi olla esim. restriktiopilkkomiskohta. 15 Alukkeessa voi myös olla tehokas alukkeen käyttö huomioon ottaen, esimerkiksi proteiini sitoutuneena, jonka entsyymi E, ensisijassa polymeraasi, tunnistaa.
Jotta reaktio a) voisi tapahtua, täytyy nukleiinihappo A ja aluke P1 ensin erottaa mahdollisesti komplementaarisella alueella läsnäolevista komplementaarisista juos-20 teista. Tämä erottaminen voi tapahtua tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi termisesti tai ei-termisesti. Ei-terminen denaturointi on edullinen. Reaktio a) aloitetaan sitten olosuhteissa, joissa A ja P1 voivat hybridisoitua.
Käytettäessä aluketta käynnistimenä lisätään näytteeseen lisäksi entsyymiä E, joka 25 voi syntetisoida alukkeesta riippuvassa reaktiossa A:lle komplementaarisen nukleiinihapon. Näihin kuuluvat erityisesti polymeraasit.
Niiden substraattispesifisyys mukautuu nukleiinihappo A:n mukaan. Jos A on RNA, niin tulevat kysymykseen erityisesti RNA-riippuvaiset DNA-polymeraasit, kuten 30 käänteistranskriptaasi (esim. AMV:stä tai MuLV:stä). Jos A on DNA, niin ovat DNA-riippuvaiset DNA-polymeraasit, kuten Taq-DNA-polymeraasin Klenow-entsyymi, edullisia.
Näytteeseen lisätään myös desoksiribonukleosiditrifosfaatteja (dNTP), joista vähin-35 tään yksi on leimattu.
9 103808
Polymeraasireaktion tuote on leimattu desoksiribonukleiinihappo B, jossa on aluke PI samoin kuin leimattu desoksiribonukleosiditrifosfaatti sekvenssissä. Tämä nukleiinihappo B on yhtä suuri tai pienempi kuin templaatti, mutta sisältää kuitenkin alueen, joka on vähintään osittain olennaisesti komplementaarinen templaatin kans-5 sa.
Tätä nukleiinihappoa B voidaan nyt suoraan käyttää vaiheessa b). Se altistetaan edullisesti kuitenkin vielä kerran templaattinukleiinihapoksi reaktiossa, joka on analoginen vaiheen a) kanssa. Tämfin lisäksi lisätään näytteeseen aluke P2, joka on 10 olennaisesti komplementaarinen nukleiinihappo B:n erään osan kanssa, edullisesti osan siitä alueesta kanssa, joka on juuri muodostettu dNTPistä. Alukepari P1 ja P2 täyttävät edullisesti EP-A-0 201 184:ssä kuvatut ehdot. P1 ja P2 lisätään edullisesti yhtä aikaa templaattiin A.
15 Korkeamman herkkyyden saavuttamiseksi on mahdollista suorittaa reaktio a) vielä useamman kerran, edullisesti 1-60, erityisen edullisesti 20-60 kertaa, jolloin kulloinkin saadut reaktion tuotteet viedään uudestaan reaktioon a). Tällä tavoin saadaan aikaan teoreettisesti lähes eksponentiaalinen leimattujen nukleiinihappojen lisääntyminen. Tällöin muodostetaan molempia nukleiinihappojuosteita, jolloin pituus 20 määräytyy alukkeiden P1 ja P2 ei-pidennettävien päiden kautta.Yhdenmukaisesti EP-A-0 201 184:n kanssa on mahdollista käyttää myöhemmissä reaktion a) toistoissa myös niin kutsuttua sisäkkäin asetettua aluketta, jonka sekvenssi valitaan siten, että muodostuneet nukleiinihapot ovat pienempiä kuin edellä muodostuneet. Ennen jokaista reaktion a) toistoa on taikoituksenmukaista erottaa reaktiossa a) muodos-25 tuneet A:n ja B:n kaksoisjuosteet Tämä voi tapahtua termisesti tai ei-termisesti. Kulloinkin täytyy olla läsnä uudestaan aluketta P1 ja P2.
Käynnistin voi olla myös promoottori. Promoottori on nukleotidisekvenssi, jonka RNA-polymeraasi tunnistaa ja saa tämän syntetisoimaan nukleiinihappojuostetta B, 30 joka on komplementaarinen promoottoria seuraavalle nukleotidisekvenssille. Tällöin viedään myös ei-leimatun NTP:n lisäksi leimattua NTP:tä muodostuneeseen nukleii-nihappojuosteeseen.
Sopivat promoottorit ovat tunnettuja, esimerkiksi RNA-polymeraasin sitomiskohta 35 bakteriofageista, kuten T3, T7 tai SP6 (Melton et ai.: NAR 12, 1984, 7035-56; Pfeiffer & Gilbert: Protein Sequences and DNA-Analysis I, 1988, 269-280; Uhlen-beck et ai.: Nature 328, 1987, 596-600).
10 103808
Promoottori on spesifisen alukkeen osan osoitusmenetelmän edullisessa suoritusmuodossa templaattinukleiinihappo A:n valmistamiseksi kohdenukleiinihaposta. Tällä alukkeella on nukleotidisekvenssi SI, joka on olennaisesti komplementaarinen kohdenukleiinihapon osan kanssa, ja nukleotidisekvenssi S2, jonka RNA-polyme-5 raasi tunnistaa ja jossa on vähintään promoottorisekvenssi. Ensimmäisessä reaktiossa muodostetaan alukkeen ja kohdenukleiinihapon laadusta riippuvan DNA-polymeraasin ja dNTP:n kanssa kohdenukleiinihapon kanssa ainakin osittain komplementaarinen nukleiinihappojuoste AI, jossa on aluke promoottorin kanssa. Siinä tapauksessa että se ei jo ole sitoutunut alukkeen kanssa, kytketään juuri muo-10 dostunut nukleiinihappopala kovalenttisesti alukkeen kanssa lisäämällä uutta entsyymiä, edullisesti ligaasia, esim. E. coli DNA-ligaasia. Ligaasi voi olla myös termisesti stabiilia. AI on edullisesti lyhyempi kuin kohdenukleiinihappo.
Tähän transkriptioreaktioon käytetään edullisesti toista kohdenukleiinihappojuos-15 teen kanssa komplementaarista aluketta P3 ja aukko molempien alukkeiden välillä suljetaan, esimerkiksi aukontäyttöreaktiolla. Leimatun dNTP:n käyttö tässä ei ole tarpeellista, koska tämä toimenpide antaa vain vähäisen mittaussignaalin vahvistumisen keksinnön mukaisessa menetelmässä, mutta on toki mahdollista.
20 Jos kohdenukleiinihappo on RNA, niin tämä hajotetaan edullisesti selektiivisesti seuraavassa vaiheessa. Tätä varten ovat tunnetut menetelmät sopivia, esimerkiksi käsittely emäksellä tai RNAasilla. Sen jälkeen muodostetaan Al:n kanssa komplementaarinen nukleiinihappojuoste A2. Tätä varten laitetaan reaktioseokseen aluketta P2, joka on osan, edullisesti juuri muodostuneen juosteen AI osan kanssa komple-25 mentaalinen. Alukkeella P2 on edullisesti myös promoottorisekvenssi S2. Tämä pidennetään A2:ksi, kuten edellä Alille on kuvattu. Tällaisia menetelmävaiheita on kuvattu esim. EP-A-0 329 822:ssa, DE-A-37 26 934:ssa, WO 88/10315:ssä, WO 87/06270:ssa, EP-A-0 310 229:ssä ja EP-A-0 373960:ssa, minkä takia tässä viitataan näihin julkaisuihin. Erityisesti niiden yksityiskohtien osalta, jotka ovat avuksi 30 ja tarpeelliset RNA:n käänteistranskriptiossa tai DNA:n transkriptiossa, viitataan näihin julkaisuihin.
Erityisen edullisesti on näytteessä tässä suoritusmuodossa lisäksi kohdenukleiinihapon kanssa komplementaarinen juoste, jolloin P1 ja P2 pidennetään samanaikaisesti. 35
Mainitussa suoritusmuodossa lisätään täten esikäsiteltyyn näytteeseen sen jälkeen keksinnön mukaisesti promoottorispesifisesti ohjattu DNA-riippuvainen RNA-poly- ,1 103808 meraasi. Sellaisia polymeerejä ovat esim. T3, T7 tai SP6 RNA-polymeraasit. Niiden avulla muodostetaan NTP:stä ja leimatusta NTP:stä leimattua nukleiinihappo B:tä. Kaksijuosteinen nukleiinihappo A1/A2 toimii templaattinukleiinihappona, edullisesti useamman kerran.
5
Edullisia NTP:itä ovat ribonukleosiditrifosfaatit. Koska tässä reaktion a) muunnelmassa muodostetaan yksijuosteista nukleiinihappo B:tä, ei denaturointi ole välttämättä tarpeellinen juosteen erottamiseen, mutta mahdollista.
10 Eräs edullinen suoritusmuoto on DE-A-4 010 465 :n mukainen menettelytapa, kuitenkin käyttämällä osoitettavissa olevaa leimattua ribonukleosiditrifosfaattia. Käynnistin on edullisesti replikaation aloitusalue (RIR). Replikaation aloitusalue on esimerkiksi nukleotidisekvenssi, jonka replikaatioentsyymi tai -entsyymikompleksi, esimerkiksi DNA-riippuvainen DNA-polymeraasi, kuten 0 29:stä (P2, P3), tunnis-15 taa. Erityisen edullinen on tapaus, jossa RIR on osa spesifistä aluketta. Tällä aluk-keella on nukleotidisekvenssi SI, joka on olennaisesti komplementaarinen kohde-nukleiinihapon osan kanssa, ja siihen liittyneenä on sekvenssi S2, jolla on replikaa-tiokompleksin tunnistamiskohta, edullisesti proteiini. Sellaista aluketta nimitetään seuraavassa adapteri Ad:ksi. Reaktio aloitetaan saattamalla kohdenukleiinihappo, 20 joka on varsinainen osoitettava laji, reagoimaan Ad:n kanssa hybridisointiolosuh-teissa. Erityisen edullinen on kahden adapterin Adl ja Ad2 käyttö yksijuosteista kohdenukleiinihappoa kohden, jolloin kohdespesifiset sekvenssit voivat hybridisoi-tua toisistaan tilavuusulotteisesti erotettujen yksijuosteisten kohdenukleiinihapon sekvenssien kanssa ja adapterin kohdespesifiset sekvenssit kohdenukleiinihapossa 25 ovat suunnatut toisiaan kohti.
Yksijuosteiset aukot adapterien välillä täytetään aukontäyttämisreaktiolla (Maniatis et ai., Molecular Cloning, 1982, CSH). Leimatun NTP:n lisäys ei ole tarpeellista, mutta mahdollista. Siten muodostuu kaksijuosteinen nukleiinihappo, jossa on yksi 30 juoste kohdenukleiinihaposta ja yksi juoste juuri muodostetusta nukleiinihappo A:sta. Tämä sisältää vähintään yhden, edullisesti 2 replikaation aloitusaluetta, jotka ovat erityisen edullisesti jäijestäytyneet vastakkaisiin replikaatiosuuntiin.
Tästä kaksoisjuosteesta voi nyt keksinnön mukaisella tavalla valmistaa leimattu 35 nukleiinihappo B replikaatiolla ilman adapterien lisäkäyttöä käyttämällä leimattua ja leimaamatonta nukleosiditrifosfaattia reaktiossa a). Tämä sisältää jälleen ainakin yhden, edullisesti kaksi, replikaation aloitusaluetta ja voidaan siksi käyttää uudes- ,2 103808 taan reaktiossa a) templaattinukleiinihappona. Täten saavutetaan melkoinen B:n lisääntyminen. Siinä tapauksessa, että molemmilla adaptereilla kummallakin on RIR tai reaktiossa a) käytetään kahta toistensa kanssa komplementaarista nukleiinihappo A:ta, voi muodostua kaksi toistensa kanssa komplementaarista nukleiinihappo B:tä. 5 Nämä täytyy erottaa toisistaan ennen vaihetta b) denaturoimalla.
Vaiheen a) jälkeen keksinnön mukaisessa menetelmässä tehdään reaktioseokselle ei-terminen denaturointi (reaktio b)). Myös siinä tapauksessa, että vaihe a) suoritetaan useamman kerran, tapahtuu myös ei-terminen denaturointi suoraan ennen vaihetta 10 c). Erityisesti erotetaan tällöin nukleiinihapon kaksoisjuosteita toisistaan. Ei-termi- nen denaturointi tarkoittaa, että denaturoinnin lämpötila ei ole yli 50 °C, edullisesti ei yli 37 °C, ja tapahtuu edullisesti alueella 22-37 °C. Denaturoinnissa erotetaan mahdolliset olemassa olevat nukleiinihappokaksoisjuosteet toisistaan, siten että nukleiinihappo B esiintyy yksijuosteisena. Tämä tapahtuu esimerkiksi tiukentamalla 15 olosuhteita, mutta myös entsyymeillä, esimerkiksi helikaasi, recA-proteiini, E. coli ssb-proteiini, geeni-32-proteiini, ja emäksellä tai lisäämällä kaksoisjuostetta destabi-loivia kemikaaleja, kuten esim. orgaanisia aineita, kuten virtsa-aine, formamidi (konsentraatio > 70 %, NAR 1977, voi. 4,5 1539-1553) tai kaotrooppisia suoloja. Kaotrooppisia suoloja on kuvattu julkaisussa J. Biol. Chem. 1966, 241/17, 4030-20 4042 J. Amer. Chem. Soc. USA 1962, 84/8, 1329-1338 tai Anal. Biochem. 129, 357-364 >(1983). Erityisen edullisia keksinnön mielessä ovat NaJ, guanidiniumtio-syanaatti tai NaC104. Denaturaatiota varten tarpeellinen konsentraatio näitä suoloja voidaan saada selville yksinkertaisilla kokeilla. Se nousee kuitenkin esim. NaJ:lle edullisesti n. 12,2 mol/l:aan, guanidiniumsuoloille n. 4 mol/l:aan ja NaC104:lle n. 25 7 mol/l:aan.
Erityisen edulliseksi on osoittautunut tässä emäksinen denaturointi. Tätä varten asetetaan reaktioseos reaktiosta a) pH-alueelle 10-14, edullisesti 12-14. Tämä tapahtuu esimerkiksi lisäämällä NaOH- tai KOH-liuosta vedessä.
: 30
Seoksen lämpötila 1-30 min, edullisesti 5-10 min inkubaation aikana on alueella 17-50 °C, edullisesti 22-37 °C.
Seuraavassa reaktiovaiheessa c) saatetaan nukleiinihappo B reagoimaan koettimen C 35 kanssa siten, että ne yhdessä muodostavat nukleiinihappohybridin D.
,3 103808
Nukleiinihappokoettimena C tulevat erityisesti oligo- tai polynukleotidit pituudeltaan 6-5000, edullisesti 15-2000, kysymykseen. Koetin C voi olla plasmidi, nukle-iinihappofragmentti tai oligonukleotidi. Voi olla kysymys RNA:sta tai DNA:sta. Nukleiinihappokoetinta C laitetaan reaktioseokseen ylimäärin suhteessa odotettuun 5 määrään nukleiinihappoa B, edullisesti vesipitoisen liuoksen muodossa. Koettimessa C on nukleotidisekvenssi, joka on olennaisesti komplementaarinen B:n kanssa ja on spesifinen B:lle, eli ei hybridisoidu lainkaan tai vain hyvin vähäisessä määrin näytteessä läsnäolevien tai muodostuneiden nukleiinihappojen kanssa, jota ei pidä olla läsnä. Yhdistämällä spesifisen alukkeen käyttö ja hybridisointi spesifisen koettimen 10 kanssa, tulee keksinnön mukaisesta menetelmästä erityisen selektiivinen.
C voi olla kaksijuosteinen nukleiinihappo, jonka toinen juoste C1 on komplementaarinen B:n osan kanssa. Nukleiinihappokoettimen toinen juoste C2 on edullisesti komplementaarinen toisten nukleiinihappojen B kanssa, erityisesti sellaisten kanssa, 15 joita syntyy suoritettaessa reaktiota a) käytettäessä B:tä templaatti-nukleiinihappona. C:n denaturointi voidaan täten suorittaa erillään B:stä. On kuitenkin edullista denaturoida C yhdessä B:n kanssa. Tämä koskee erityisesti emäksistä denaturointia. Tätä varten lisätään C:tä edullisesti ennen a):sta saadun reaktioseoksen emäksiseksi tekemistä. Inkubaatioajan jälkeen saatetaan seos pH:hon 5,0-8,5, edullisesti 7-8, minkä 20 jälkeen nukleiinihappohybridi D muodostuu B:stä ja Cl:stä tai C2:sta.
Sellainen tapaus on edullinen, että C:ssä on kyse yksijuosteisesta nukleiinihappo-koettimesta Cl ja Cl:n kanssa komplementaarista juostetta C2 ei käytetä. Tosin silloin on myös mahdollista lisätä Cl ennen B:n denaturointia. Erityisen edullista on 25 sitten kuitenkin B:n emäksisen denaturoinnin tapauksessa, ensin vain inkuboida B:tä emäksisesti ja sen jälkeen lisätä koettimeen Cl:n hapanta liuosta. Cl:n happaman liuoksen pH on alueella 3,0-6,5, edullisesti 4,5-6,0, ilman että todetaan huomattavaa koettimen epästabiiliutta. Heikosti happamen liuoksen pitäisi riittää hybridisointi-liuokseen lisäämisen jälkeen säätämään pH 5,0-8,0. Liuos voi olla myös puskuroitu 30 tällä alueella ja siinä voi olla muita hybridisointia auttavia reagensseja, kuten esim. SSC, formamidi tai estoreagensseja ei-osoitettaville nukleiinihapoille. Seoksen pH:n pitäisi olla myös tässä Cl:n lisäyksen jälkeen alueella 5,0-8,5. pH:n hienosäätö voidaan suorittaa hybridisointiliuoksen määrällä, samoin kuin sen pH:lla.
35 Hapot, joita voidaan käyttää neutralisointiin tai hybridisointiliuoksen ainesosina, ovat esimerkiksi suolahappo tai muurahaishappo; edullisia ovat kuitenkin etikka-happo tai fosforihappo. Hybridisointiliuoksen pH on ennen näytteeseen lisäämistä 14 103808 3,0:n ja 6,5:n välillä. Esimerkiksi etikkahapon konsentraatio on edullisesti 0,05-0,5 mol/1, erityisen edullisesti 0,1-0,2 mol/1.
Yksijuosteisia nukleiinihappokoettimia Cl voidaan valmistaa esimerkiksi kemialli-5 sella nukleiinihapposynteesillä DE-A- 39 16 871:n tai myös EP-B-0 184 056:n mukaan.
Tällä suoritusmuodolla on se etu, että säästetään yksi pipetointivaihe käyttämällä koetinliuosta näyteliuoksen neutralointiin. Lisäksi on osoittautunut, että konsent-10 roidun hapon lisäys emäksellä käsiteltyyn näytteeseen, jossa on korkea proteiinisi-sältö, johtaa paakkuuntumiseen, minkä takia ehdotettu menettelytapa on erityisen edullinen.
Siinä tapauksessa, että ennen vaihetta c) suoritettiin denaturointi kaksoisjuostetta 15 destabiloivalla aineella, voidaan hybridi sointiolosuhteita säätää koettimella C, laimentamalla seosta.
Koettimessa C on nukleiinihappojuostetta kohti yksi tai useampi immobilisointiin kykenevä (immobilisoituva) ryhmä I.
20
Immobilisointiin kykeneviä ryhmiä I on esimerkiksi kemialliset ryhmät, jotka voidaan sitoa kovalenttisesti, esimerkiksi kemiallisella tai fotoreaktiolla kiinteään faasiin, tai ryhmät tai molekyylin osat, jotka toinen molekyyli tai molekyylin osa tunnistaa ja voi sitoa ryhmäspesifisen vuorovaikutuksen kautta. Tällaisia ryhmiä ovat 25 siten esim. hapteenit, antigeenit ja vasta-aineet, nukleotidisekvenssit, reseptorit, säätelysekvenssit, glykoproteiinit, esimerkiksi lektiinit, tai myös sitoutumisproteii-nin sitoutumispartnerit, kuten biotiini tai iminobiotiini. Vitamiinit ja hapteeni ovat edullisia, erityisen edullisia ovat biotiini, fluoreseiini tai steroidit, kuten digoksi-geniini tai digoksiini. Keksinnölle on tärkeätä, että jokaisessa hybridi D:ssä koetti-30 men immobilisoitava ryhmä erottuu nukleiinihappo B:n osoitettavissa olevasta ryhmästä.
Seos saatetaan tämän jälkeen kosketuksiin kiinteän faasin F kanssa, joka voi spesifisesti sitoa hybridin D nukleiinihappokoettimen C immobilisoituvan ryhmän kautta. 35
Kiinteän faasin tyyppi valitaan immobilisoitavan ryhmän I mukaan. Edullisesti siinä on immobilisoitava ryhmä R, jolla voi olla sitovassa vuorovaikutuksessa I:n kanssa.
15 103808
Jos immobilisoitva ryhmä on esimerkiksi hapteeni, voidaan käyttää kiinteätä faasia, jolla on ulkopinnallaan vasta-aineita tätä hapteenia vastaan. Jos immobilisoitava ryhmä on vitamiini, kuten esim. biotiini, silloin voi kiinteässä faasissa olla immobi-lisoiva sitova proteiini, kuten avidiini tai streptavidiini. Erityisen edullisia jäännök-5 siä I ja R ovat biotiini ja streptavidiini. bnmobilisointi modifioidussa nukleiinihapossa olevan ryhmän kautta on erityisen edullista, koska se tapahtuu lievemmissä olosuhteissa kuin esimerkiksi hybridisointireaktiot.
Muodostuneiden nukleiinihappojen immobilisoimiseksi kaadetaan reaktioseos edul-10 lisesti nukleiinihappohybridin D muodostumisen jälkeen astiaan, joka voi reagoida pinnallaan immobilisoitavan ryhmän kanssa. Hybridisointireaktio koettimen kanssa tapahtuu edullisesti samanaikaisesti immobilisoinnin kanssa. Astia voi olla esimerkiksi kyvetti, koeputki tai mikrotiitterimalja. On kuitenkin mahdollista käyttää kiinteätä faasia huokoisen materiaalin muodossa, kuten membraani, kudos tai materi-15 aaliliuska, jolle reaktioseos laitetaan. Samoin on mahdollista käyttää helmiä, niin sanottuja lasihelmiä, tai lateksipartikkeleita. Kiinteällä faasilla pitäisi olla läsnä vähintään niin paljon sitomiskohtia koettimen immobilisoitaville ryhmille kuin nukleiini-happohybridi D:llä ja siten nukleiinihappo B:llä.
20 Edullisen kiinteän faasin valmistammen on kuvattu EP-A-0 344 578:ssa, jonka sisältöön viitataan kokonaisuudessaan.
Inkubaatioajan jälkeen, jona aikana immobilisointireaktio tapahtuu, poistetaan nestefaasi astiasta, huokoisesta materiaalista tai pelletoiduista helmistä. Kiinteä faasi 25 voidaan sen jälkeen pestä sopivalla puskurilla, koska hybridin D sitoutuminen kiinteään faasiin on erittäin tehokasta. Keksinnön mukainen menetelmä sallii täten erityisen vähien pesuvaiheiden käytön, koska vaikeasti erotettaviaa koettimia, päinvastoin kuin tekniikan tasossa käytettyt havaittavissa olevat koettimet, ei välttämättä tarvitse poistaa täydellisesti, tai ne johtavat verrattain vähäisiin taustasignaaleihin.
30
Kiinteään faasiin sidotun modifioidun nukleiinihapon määrä voidaan periaatteessa määrittää tunnetulla tavalla, jolloin suoritettavat vaiheet sovitetaan osoitettavan ryhmän ominaisuuksiin. Suoraan osoitettavissa olevilla ryhmillä, esimerkiksi fluore-senssileima, määritetään leiman määrä fluorometrisesti. Jos osoitettavissa oleva 35 ryhmä on hapteeni, niin saatetaan modifioitu nukleiinihappo edullisesti reagoimaan hapteenin leimatun vasta-aineen kanssa, kuten on kuvattu EP-A-0324747:ssä. Leimaus voi olla esimerkiksi entsyyntileimaus, kuten β-galaktosidaasi, emäksinen fos- >« 103808 fataasi tai peroksidaasi jne. Entsyymileimauksen tapauksessa mitataan nukleiinihapon määrä tavallisimmin fotometrisellä, kemoluminometrisellä tai fluorometrisellä entsyymin reaktion seuraamisella kromogeenisen, kemoluminogeenisen tai fluoro-geenisen substraatin kanssa. On myös mahdollista seurata reaktiota elektrokemialli-5 sesti, kun käytetään leimauksena pelkistys-hapetus-entsyymiä, tai seurataan pH-arvon muunnosta pH-elektrodin avulla. Mittaussignaali on mitta alunperin saatavilla olevalle kohdenukleiinihapolle.
Nukleiinihapon osoittaminen voidaan suorittaa sekä kvalitatiivisesti että myös 10 kvantitatiivisesti. Kvantitatiivisen arvioinin tapauksessa on osoittautunut tarkoituksenmukaiseksi suorittaa vähintään yksi vertailukoe näytteellä, jossa oli tunnettu nukleiinihapposisältö. Kalibrointikäyrän aikaansaaminen on mahdollista ja suositeltavaa.
15 Eräässä menetelmän suoritusmuodossa käytettäessä PCR:ää lisätään näytteeseen oligonukleotidit alukkeina P1 ja P2. P1 on tällöin komplementaarinen yksijuosteisen nukleiinihapon A osan kanssa, joka esittää kohde- ja samanaikaisesti templaatti-nukleiinihappoa. P2 on homologinen siitä poistetun A:n osan kanssa. Tätä seosta käsitellään nyt, kuten EP-A-0 210 184:ssä kuvataan, jolloin kuitenkin käytetään ei-20 modifioidun desoksimononukleotiditrifosfaattien rinnalla myös digoksigeniini-leimattua tai fluoreseiinileimattua desoksimononukleotiditrifosfaattia. Suoritetaan edullisesti 20-30 amplifikaatiosykliä. Tämän jälkeen lisätään kaksijuosteista biotii-nilla leimattua koetinta C ja natriumhydroksidia pH:hon 10-14. Seosta inkuboidaan noin 37 °C:ssa ja sen jälkeen sekoitetaan hybridisointiapuaineliuoksen, noin pH 5, 25 kanssa, niin että saadaan pH n. 7-8,5. Seos dekantoidaan streptavidiini-päällystet-tyyn astiaan ja inkuboidaan uudestaan. Liuos poistetaan ja astia pestään. Lisätään konjugaatti, joka koostuu vasta-aineista digoksigeniiniä vastaan ja entsyymistä, ja inkuboidaan uudestaan. Liuoksen poistamisen ja astian pesun jälkeen tapahtuu reaktio entsyymin kromogeenisen substraatin kanssa ja tarkkaillaan värinmuodostusta. 30
Eräs edullinen suoritusmuoto on DE-A-39 29 030:ssa kuvatun menetelmän muunnos. Tässä viitataan julkaisuun DE-A-39 29 030 kokonaisuudessaan. Menetelmän suorittamiseksi näytteeseen, jossa on yksijuosteista kohdenukleiinihappoa, sekoitetaan kaksi adaptoria, jotka ovat komplementaarisia saman juosteen kanssa ja joiden 35 A:n kanssa hybridisoituvat päät ovat suunnatut toisiaan vasten ja joiden ei-hybri-disoituvissa päissä on replikaation aloitussekvenssi 029-polymeraasille. Hybridi-sointiolosuhteissa suljetaan kahden adaptorin välillä oleva aukko aukontäyttämisellä 17 103808 DNA-polymeraasin tai käänteistranskriptaasin (entsyyminä El) ja ligaasireaktion avulla. Tässä käytetyt desoksimononukleosiditrifosfaatit voivat olla ei-modifioituja, mutta edullisesti on kuitenkin toinen niistä digoksigeniinileimattu monodesoksiribo-nukleosiditrifosfaatti. Replikaation suorittamiseksi lisätään replikaatiosysteemiin 5 029 (P2, P3 ja ATP) samoin ei-modifioitujen mononukleosiditrifosfaattien rinnalla, ellei niitä jo käytetty aukontäyttämisreaktiossa, digoksigeniini- tai fluoreseiini-leimattua monodesoksiribonukleosiditrifosfaattia. Replikaatiossa muodostunut osoitettavissa oleva leimattu nukleiinihappo B toimii ilman adaptorilisäystä uudestaan templaattinukleiinihappona uusien nukleiinihapojen B muodostamiseksi. Näin saa-10 daan ajan mittaan osoitettavissa olevan leimatun nukleiinihappo B:n eksponentiaalinen lisääntyminen. Niin pian kuin on muodostunut tarpeeksi nukleiinihappoa, suoritetaan seokselle ei-terminen denaturomtivaihe ja sekoitetaan edullisesti yksijuostei-sen biotiinilla leimatun koettimen Cl sisältävä liuos hybridisointireagenssien kanssa pH :ssa 3,0-6,5, pH:hon 5,0-8,5, edulhsesti 7,0-8,0. Suorittamalla ei-terminen dena-15 turointivaihe tulee mahdolliseksi suorittaa koko osoitusmenetelmä lämpötila-alueella 17-50 °C ja edullisesti yhdessä ainossa lämpötilassa. Seos dekantoidaan streptavi-diinipäällystettyyn astiaan ja inkuboidaan. Sen jälkeen, kun neste on imetty pois ja astia pesty, lisätään konjugaatin liuosta, joka koostuu entsyymileimatusta vasta-aineesta digoksigeniiniä tai fluoreseiinia vastaan ja inkuboidaan uudestaan. Liuok-20 sen imemisen ja astian pesun jälkeen tapahtuu sekoittaminen kromogeenisen substraatin kanssa ja tarkkaillaan värinmuodostusta.
Tekniikan tason menetelmissä on aina tähän asti käytetty osoitettavaa leimattua koetinta. Ei-hybridisoituvan koettimen täydellinen erottaminen oli mittaustuloksen 25 tarkkuudelle tarpeellista, kuitenkin suhteellisen kallista.
Keksinnön mukaisella menetelmällä kierretään tämä haittapuoli siten, että leimatun koettimen hybridisoinnin ja niiden määrityksen sijasta mitataan sekvenssissä olevien leimattujen mononukleotidien läsnäolo, jota käytetään mittana osoitettavan nukleii-30 nihapon läsnäolosta tai määrästä. Niiden leimattujen mononukleotidien, jotka eivät sisälly sekvenssiin, erottaminen on tämän menetelmän mukaisesti erityisen yksinkertaista ja täydellisesti saavutettavissa, koska ne eivät ole sitoutuneet nukleiinihappoihin eivätkä pintaan. Immobilisoitavan koetin C:n ylimäärä sitä vastoin ei häiritse määritystä, koska koettimen C immobilisoitavia ryhmiä ei käytetä leimauksessa ja 35 siten eivät vaikuta mittaustulokseen. Erityisesti kiinteän faasin sitomiskapasiteetti on paremmin laskettavissa kuin immobilisoitavan NTP:n sekvenssiin vienti.
is 103808
Keksinnön mukainen menetelmä on siksi erittäin sensitiivinen ja selektiivinen, lisäksi se voidaan suorittaa lyhyessä ajassa.
Keksinnön mukainen menetelmä sopii nukleiinihappojen osoittamiseen sellaisina 5 kuin ne ovat nukleiinihappopitoisista organismeista, esim. bakteereista, viruksista ja soluista, ja nukleiinihappomuutosten osoittamiseen, kuten mutaatiot tai kromosomin translokaatiot, ja geenien paikallistamiseen ja ekspressioasteen osoittamiseen. Voidaan osoittaa sekä ribonukleiinihappoja että myös desoksiribonukleiinihappoja. Myös pisteittäisten erojen tunnistaminen nukleiinihapoissa on mahdollista, kun koe-10 tuloksia vertaillaan, joissa reaktiossa a) käytetään toisaalta aluketta, joka on 3-pääs-tä komplementaarinen nukleiinihapon A kanssa, ja toisaalta käytetään aluketta, joka ei 3'-päästään ole täysin komplementaarinen nukleiinihapon A kanssa, mutta hybridi soituu kuitenkin sen kanssa. Alukkeen pidentäminen ja täten nukleiinihappo B:n muodostuminen on nyt ensimmäistä kertaa mahdollista. Sellaisten alukkeiden valin-15 ta on kuvattu esimerkiksi julkaisussa PNAS 86, 2757 (1980).
Kuvio 1 esittää kaavamaisesti erään suoritusmuodon kulun käytettäessä alukkeen pidennystä (vain yhden alukkeen P1 käyttäminen).
20 Kuvio 2 esittää kaavamaisesti erään suoritusmuodon kulun käytettäessä PCR-periaatetta kahdella alukkeella, jolloin ensin muodostettua nukleiinihappoa B käytetään uudestaan templaattinukleiinihappona.
Kuvio 3 esittää kaavamaisesti edullisen suoritusmuodon kulun käytettäessä repli-25 kaatioamplifikaatiota.
Kuvio 4 esittää käyrällä I erään kokeen tuloksen kuvion 1 mukaisesti. Kuvataan liuoksessa mitatun ekstinktion funktiota osoitettavan nukleiinihappo A:n määrän suhteen; käyrä II antaa tuloksen uudestaan ilman osoitettavan nukleiinihapon läsnäoloa.
30 i
Kuvio 5 esittää kalibrointikäyrän 1 HBV-DNA-määritykselle PCR:n avulla ja yksi-juosteisen biotiinilla leimatun oligonukleotidin esimerkin 2 mukaisesti avulla. Käyrä 2 osoittaa sokkoarvot (ilman Bio-Oli 25 -lisäystä).
35 Kuvio 6 esittää stabilointikäyrän 3 HBV-määritykselle esimerkin 3 mukaisella menetelmällä. Käyrä 4 osoittaa sokkoarvot (ilman Bio-Oli 25 -lisäystä).
19 103808
Viitemerkit A templaattinukleiinihappo AI A:n vastajuoste 5 P1 A :n kanssa komplementaarinen aluke E entsyymi/entsyymikompleksi El DNA-polymeraasi tai käänteistranskriptaasi L osoitettavissa oleva ryhmä (leimaus) B reaktion a) tuote 10 C nukleiinihappokoetin I immobilisoituva ryhmä D nukleiinihappohybridi B:stä ja C:stä R immobilisoiva ryhmä F kiinteä faasi 15 SI A:n kanssa komplementaarinen sekvenssi S1' toinen A:n kanssa komplementaarinen sekvenssi S2 promoottori tai ensimmäinen replikaaation aloitussekvenssi (replikaation alkuperä) S2' promoottori tai toinen replikaation aloitussekvenssi (replikaation alkuperä) 20 Adl adaptori 1, kohde-nukleiinihapon kanssa komplementaarinen Ad2 adaptori 2, kohde-nukleiinihapon kanssa komplementaarinen
Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavilla esimerkeillä: 25 Esimerkki 1
Kohde-DNA:n amplifikaatio käyttämällä osoitettavissa olevaa desoksiribonuk-leosiditrifosfaattia (vaihe a))
Polymeraasiketjureaktio suoritetaan kloonatulla HBV-spesifisellä sekvenssillä. 30 Käytetyt alukkeet sitoutuvat asemiin 1937-1960 ja 2434-2460 HBV-genomissa, so. sekvenssi, jossa on 523 nukleotidiä, amplifioidaan (R. Sumazaki et ai., 1989, J. Med. Virol, 27, 304-308). Amplifioidun DNA:n konsentraatio plasmidissa vastaa tässä käytettyä laimennussaijaa 100 ag - 100 pg. 30 PCR-sykliä (2' 92°C; 2' 50°C; 2' 70°C) suoritetaan 100 plrssa alukkeiden kanssa, kutakin 200 nM; KC1, 50 mM; Tris 35 HC1 pH 8,5, 10 mM; MgC^, 1,5 mM; gelatiini 100 pg/ml; dATP, 100 pm; dCTP, 200 pm, dGTP, 200 pm; dTTP, 150 pM; digoksigeniini-ll-2'-desoksi-uridiini-5'- 20 103808 dUTP (DIG-[ll]-dUTP, Boehringer Mannheim), 50 μιη; 2,5 U Thermus aquaticus (Tag) DNA-polymeraasi.
Ei-terminen denaturaatio 5 20 μΐ tätä seosta PCR:n jälkeen ja 40 ng biotiinilla leimattua näyte-DNA:ta (satunnaisesti aluketta käytetty, kloonattu HBV-DNA asemissa 27-2604, kaksijuos-teinen) denaturoidaan 44 μ1:η kokonaistilavuudessa 0,5:ssa NaOH:ssa 10' 37 °C:ssa.
10 Hybridisointi koettimen C kanssa (vaihe c)) ja kiinteän faasin sitominen (vaihe c)).
Sen jälkeen neutraloidaan lisäämällä 156 μΐ hybridisointiliuosta, pH 5 ja pipetoi-daan streptavidiinillä peitettyyn mikrotiitterimaljaan (hybridisointiliuos = 62,5 mM natriumfosfaatti, 6,25 x SSC [1 x SSC = NaCl, 0,15 M; natriumsitraatti, 0,015 M] ja 15 formamidi 62,5 %). Hybridisointi-/seinäänsitoutumisreaktiota suoritetaan 18 h 37 °C kevyesti ravistellen.
Hybridin D (vaihe e)) havaitseminen 20 Sen jälkeen, kun oli poistettu neste ja 5 x pesty 0,025 %:lla NaCl.lla ja 1 oo/o ku-parisulfaatilla, lisätään 200 mU/ml anti-digoksigeniini-piparjuuri-peroksidaasi-konjugaattia ja 60' 37 °C Tris HCl:ssä, pH 7,5/10 mM; NaCl 0,9 %; BSA, 1 %; Plu-ronic T68 0,5 % inkuboidaan. 5 x pesun jälkeen (samat olosuhteet kuin edellä) in-kuboidaan 0,1 % 2,2-atsino-di-[3-etyylibentstiatsoli]-(ABTS):n kanssa 60' 37 °C ja 25 ekstinktio mitataan 405 nm.ssä.
Kuviossa 4 on näytetty ekstinktiot tälle reaktiolle ja kontrollireaktiolle bioleimatun näytteen kanssa.
30 Esimerkki 2
Amplifikaatioreaktio (polymeraasiketjureaktio) suoritetaan kontrolliseerumilla (HBV-DNA-negatiivinen), joka on rikastettu HBV-spesifisellä DNA:lla. Valitun PCR-alukkeen sijainnin perusteella muodostetaan amplifikaatiossa 523 bp suuruinen 35 DNA-ffagmentti (PCR-aluke 1: asema 1937-1960, PCR-aluke 2: asema 2434-2460 HBV-genomissa, kirjallisuus katso esimerkiksi 1). Valmistetaan laimennussarja plasmidista alueella 10 pg/ml-1,25 pg/ml kontrolliseerumissa. Tämä vastaa, sovellet- 21 103808 tuna plasmidin amplifioituvaan DNA-alueeseen, määriä alueella 40 ag - 320 ag DNA, jotka käytettiin amplifikaatioreaktioon. Alkalilyysia varten 10 μΐ plasmidi-DNA:ta sisältävää kontrolliseemmia laimennetaan 50 piillä 10 mM Tris HC1 (pH 8,3) ja 20 piillä 0,5 N NaOHita ja inkuboidaan 1 h 37 °C:ssa. Sen jälkeen kun on 5 neutraloitu 20 piillä 0,5 N HCliää, laitetaan 10 μΐ lyysierästä amplifikaatioreaktioon. Reaktio tapahtuu 100 μ1:η kokonaistilavuudessa, jossa on kutakin 200 nM PCR-aluketta, kutakin 200 μΜ dATP:tä, dCTP:t ja dGTPitä, 175 μΜ dTTP, 25 μΜ digoksigeniini-ll-2'-dUTP (Boehringer Mannheim), 2,5 U Thermus aquaticus DNA-polymeraasi, 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 0,01 % 10 gelatiinia. Sen jälkeen, kun liuos on peitetty 100 piillä mineraaliöljyä, seuraa inku-baatio termosyklerissa (Perkin Elmer): 30 s 92 °C, 30 s 50 °C, 60 s 70 °C, yhteensä 30 sykliä. Sen jälkeen, kun amplifikaatio on lopetettu, laimennetaan 40 μΐ erästä 10 piillä 0,5 N NaOH:ta ja inkuboidaan 10 min huoneenlämpötilassa. Neutralisointi tapahtuu lisäämällä 450 pilaan hybridisointiliuosta (50 mM Na-fosfaattipuskuri, 15 0,75 M NaCl. 0,075 M Na-sitraatti, 0,05 N HC1, 0,05 % RS A, pH 5,4) 220 ng/ml:ssa biotiinilla leimattuun oligonukleotidia (Bio-Oli 25, biotiini-leimattua, Applied Biosystems mukaan, käyttäjän tiedotuslehtinen, DNA-Synthesizer Nr. 49, 1988, asema 2327-2356 HBV-genomissa), joka on komplementaarinen amplifioidun DNA-alueen erään alueen kanssa. 200 μΐ hybridisointierää inkuboidaan eräässä 20 streptavidiinilla peitetyn mikrotiitterimaljan syvennyksessä 3 h 37 °C. Sen jälkeen, kun liuos on imetty pois, pestään seuraavaksi 2x10 min 37 °C 0,3 Milla NaClilla, 0,03 M Na-sitraatilla, 0,2 %:lla SDSillä ja 1 x lyhyesti huoneenlämpötilassa 0,9 %:lla NaClilla. Lisätään 200 mU/ml anti-digoksigeniini-piparjuuri-peroksidaasi-konjugaattia 100 mM Tris HClissä (pH 7,5), 0,9 % NaCl, 1 % RSA ja inkuboidaan 25 30 min 37 °C. Sen jälkeen, kun on pesty 3 kertaa 0,9 %:lla NaClilla, lisätään substraattiliuos (1,9 mM ABTSR) ja ekstinktio mitataan 405 nmissa.
Kuviossa 5 ovat reaktion tulokset esitetty graafisesti.
30 Esimerkki 3 HBe-positiivista ihmisen plasmaa, jonka virustiitteri on 1 x 1010 Hepatitis B-virusta/mol laimennetaan normaaliseerumiin niin, että viruspitoisuus laimennuksessa on 0,25 x 105/ml - 2 x 105/ml. Viruslyysia laimennetaan 10 piillä seerumilaimen-35 nusta, jossa on 10 μΐ 0,2 N NaOHita ja inkuboidaan 1 h 37°C. Sen jälkeen tapahtuva neutralointi tapahtuu lisäämällä 30 μΐ neutralointiliuosta (100 mM KC1, 20 mM Tris-HCl (pH 8,3)), 3 mM MgCl2, 0,02 % gelatiini, joka on laimennettu 10 piillä 22 103808 käytettyä lysaattierää. Reaktio tapahtuu 100 μΐ kokonaistilavuudessa kutakin 200 nM molempia PCR-alukkeita; kutakin 200 pm dATP, dCTP ja dGTP, 175 μΜ dTTP, 25 μΜ digoksigemini-ll-2'-desoksi-uridiini-5'-dUTP (Boehringer Mannheim), 50 pm KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCh, 0,01 % gelatiini 2,5 5 U Thermus aquaticus DNA-polymeraasi. Reaktioerä peitetään 100 piillä mineraaliöljyä ja inkuboidaan termosyklerissa (Perkin Elmer) 30 sykliä: 30 s 92 °C, 30 s 50 °C, 1 min 70 °C.
Amplifikaatiovaiheen kautta syntyy 523 bp suuruinen DNA-fragmentti (HBV-PCR-10 aluke 1: asema 1937-1969, HBV-PCR-aluke 2: asema 2434-2460 HBV-genomissa). PCR-tuotteen spesifinen osoittaminen tapahtuu kaksikomponenttitestisysteemissä kiinteässä faasissa. Seuraavaksi laimennetaan 20 μΐ amplifikaatioerästä 20 piillä TE-puskuria (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA) ja 10 pl 0,5 N NaOHita ja inkuboidaan 10 min huoneenlämpötilassa. Neutralointi tapahtuu lisäämällä 450 pl 15 happamaksi tehtyä hybridisointiliuosta (50 mM Na-fosfaattipuskuri, 0,05 N HC1, 0,75 M NaCl, 0,075 M Na-sitraatti, 0,05 % RSA, pH 5,4), johon on lisätty 100 ng/ml:ssa biotiinilla leimattua oligonukleotidia, joka vastaa amplifioidun DNA-alueen erästä aluetta (HBV-biotiini-oligonukleotidi, 30meeri, 2-kertaisesti biotiinilla leimattu, asema 2327-2356 HBV-genomissa, Bio-Oli 25, valmistettu kiinteän faasin 20 synteesillä, biotiini-leimattu kuten esimerkissä 2 on kuvattu). 200 pl tätä hybri-disointierää inkuboidaan ravistellen eräässä streptavidiinilla peitetyn mikrotiitteri-maljan syvennyksessä 3 h 37 °C. Hybridisointi- ja seinään sitomisreaktion jälkeen liuos imetään pois ja pestään 2x10 min 0,3 Milla NaClilla, 0,03 M Na-sitraatilla, 0,2 %:lla SDSillä 37 °C ja 1 x lyhyesti 0,9 %:lla NaClilla huoneenlämpötilassa. Li-25 sätään 200 mU/ml anti-digoksigeniini-vasta-aine-piparjuuri-peroksidaasi-konju-gaattia 100 mM Tris HClissä (pH 7,5), 0,9 % NaCl, 1 % RSA ja inkuboidaan ravistellen 30 min 37 °C. Sitoutumaton konjugaatti poistetaan 3-kertaisella pesulla 0,9 %:lla NaClilla huoneenlämpötilassa.
30 Sen jälkeen kun oli inkuboitu 1,9 mM ABTSR:n kanssa (2,2'-atsino-di-[3-etyyli-bentstiatsoliinisulfonihappo (6)]-diammoniumsuola) 37 °C, mitataan ekstinktio 405 nmissa ELISA-lukijan avulla. Tulokset on esitetty kuviossa 6.
Claims (23)
1. Menetelmä nukleiinihapon spesifiseksi osoittamiseksi näytteessä, mihin sisältyvät seuraavat vaiheet: 5 a) näytteen reaktio yhden tai useamman osoitettavalla leimalla merkityn mono-nukleosiditrifosfaatin ja yhden tai useamman entsyymin kanssa, joka katalysoi leimatun nukleiinihappo B:n tuottamista, jossa tätä nukleotidiä on, b) reaktioseoksen ei-terminen denaturointi, 10 c) nukleiinihappo B:n hybridisointi nukleiinihappokoettimella C, jossa on vähintään yksi immobilisoitava ryhmä ja joka on riittävän komplementaarinen nukleiinihapon B kanssa ja samanaikaisesti nukleiinihappokoettimen C immobilisointi kiinteään faasiin, joka voi sitoa spesifisesti immobilisoitavan nukleiinihappokoettimen C, 15 d) nestemäisen faasin erottaminen kiinteästä, ja e) leimatusta nukleiinihaposta B ja nukleiinihappokoettimesta C muodostuneen nukleiinihappohybridin D osoittaminen osoittamalla kiinteään faasiin sitoutunut osoitettavissa oleva leima.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio a) ta pahtuu spesifisen käynnistimen läsnäollessa.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi tai entsyymikompleksi katalysoi nukleosiditrifosfaatin polymerisaation nukleotidiksi
25 B, joka on oleellisesti komplementaarinen nukleiinihappo A:n kanssa.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleosiditri-fosfaatti sisältää ribonukleosiditrifosfaatin.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiossa a) käytetään käynnistimenä aluketta Pl, joka on oleellisesti komplementaarinen nukleiinihapon A osan kanssa ja jota entsyymi pidentää lisättäessä mononukleosiditri-fosfaatti nukleiinihappo A:n kanssa olennaisesti komplementaariseksi nukleiinihapoksi B. 35 24 103808
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi käytetään aluketta P2, joka on nukleiinihappo B:n osan kanssa olennaisesti komplementaarinen.
7. Patenttivaatimuksen 3 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleo- siditrifosfaatti sisältää desoksiribonukleosiditrifosfaatin.
8. Jonkin patenttivaatimusista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osoitettavissa oleva nukleiinihappo on yksijuosteinen tai tehdään sellaiseksi, näyt- 10 teeseen lisätään sitten vähintään yksi adapteri osoitettavissa olevaa yksittäisjuostetta kohden, jossa on yksi osoitettavissa olevan nukleiinihapon yhden osan kanssa olennaisesti komplementaarinen nukleotidisekvenssi ja yksi replikaation aloituskohta, jolloin adapteri pidennetään nukleiinihapon kanssa komplementaariseksi sekvenssiksi, ja siten muodostunutta nukleiinihappoa käytetään templaattinukleiinihappona 15 reaktiossa a).
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osoitettavissa oleva nukleiinihappo on yksijuosteinen tai tehdään sellaiseksi, näytteeseen lisätään sitten vähintään yksi aluke osoitettavissa olevaa yksittäisjuostetta 20 kohden, jossa on yksi osoitettavissa olevan nukleiinihapon yhden osan kanssa olennaisesti komplementaarinen nukleotidisekvenssi ja yksi transkription aloituskohta, jolloin aluke pidennetään osoitettavan nukleiinihapon kanssa komplementaariseksi nukleotidisekvenssiksi, ja siten muodostunutta nukleiinihappoa käytetään templaattinukleiinihappona reaktiossa a). 25
10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa a) muodostunutta nukleiinihappo B:tä käytetään templaatti-nukle-iinihappona uudestaan reaktiossa a).
11. Jonkin edellä olleiden patenttivaatimuksien mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiota a) suoritetaan useamman kerran toinen toisensa jälkeen, jolloin kulloinkin reaktion tuote palvelee jälleen uuden reaktion lähtömateriaalina.
12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reakti-35 ossa a) muodostuu nukleiinihappohybridi nukleiinihaposta Aja nukleiinihaposta B. 25 103808
13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että denaturointi tapahtuu emäksisessä pH.ssa.
14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 denaturointi suoritetaan lisäämällä kaotrooppista suolaa.
15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että denaturointi tapahtuu lämpötila-alueella 17-50 °C.
16. Jonkin patenttivaatimuksista 13, 14 tai 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kokonaisosoitusmenetelmä tapahtuu lämpötila-alueella 17-50 °C.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että osoitusmene-telmä tapahtuu yhdessä ainoassa lämpötilassa. 15
18. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiini-happokoetin laitetaan liuokseen, jonka pH on 3,0-6,5.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksessa on 20 lisäksi kaikki hybridisoinnin läpiviemiseksi tarvittavat reagenssit.
20. Patenttivaatimuksen 18 tai 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukle-iinihappokoetin C on yksijuosteinen nukleiinihappo Cl, jonka vastajuostetta ei ole liuoksessa saatavilla.
21. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiini-happokoetin laitetaan liuokseen, jonka pH on 10-14 ja sen jälkeen seokseen säädetään hybridisointiliuoksella pH 5,0-8,5.
22. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seuraavaksi koettimen liuos yhdistyy näytteen kanssa, sitten säädetään pH 10-14 ja sen jälkeen seokseen säädetään pH 5,0-8,5.
23. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alukkeen P1 ja 35 P2 pidennyksellä muodostettu nukleiinihappo saatetaan reagoimaan uudestaan Pl:n ja P2:n kanssa, jolloin yhdellä alukkeella uudestaan muodostetut juosteet toimivat kulloinkin templaattisäikeenä toisen alukkeen pidennykselle. 26 103808
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4032024 | 1990-10-09 | ||
DE4032024 | 1990-10-09 | ||
DE4038804A DE4038804A1 (de) | 1990-10-09 | 1990-12-05 | Verfahren zur genus- oder/und spezies-spezifischen detektion von bakterien in einer probenfluessigkeit |
DE4038804 | 1990-12-05 | ||
DE4041608A DE4041608A1 (de) | 1990-12-22 | 1990-12-22 | Verfahren zum empfindlichen nachweis von nukleinsaeuren |
DE4041608 | 1990-12-22 | ||
EP9101898 | 1991-10-04 | ||
PCT/EP1991/001898 WO1992006216A1 (de) | 1990-10-09 | 1991-10-04 | Verfahren zum empfindlichen nachweis von nukleinsäuren |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI931586A FI931586A (fi) | 1993-04-07 |
FI931586A0 FI931586A0 (fi) | 1993-04-07 |
FI103808B true FI103808B (fi) | 1999-09-30 |
FI103808B1 FI103808B1 (fi) | 1999-09-30 |
Family
ID=27201764
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI931586A FI103808B1 (fi) | 1990-10-09 | 1993-04-07 | Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoittamiseen |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0552203B1 (fi) |
JP (1) | JP2673162B2 (fi) |
AT (1) | ATE122104T1 (fi) |
AU (1) | AU655781B2 (fi) |
CA (1) | CA2093647C (fi) |
DE (1) | DE59105402D1 (fi) |
DK (1) | DK0552203T3 (fi) |
ES (1) | ES2073771T3 (fi) |
FI (1) | FI103808B1 (fi) |
IE (1) | IE68525B1 (fi) |
IL (1) | IL99663A (fi) |
NO (1) | NO305995B1 (fi) |
NZ (1) | NZ240079A (fi) |
PT (1) | PT99177B (fi) |
WO (1) | WO1992006216A1 (fi) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4344742A1 (de) * | 1993-06-09 | 1994-12-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren |
ES2114692T3 (es) * | 1993-06-09 | 1998-06-01 | Gamera Bioscience Corp | Reaccion en ciclos magneticos. |
WO1997038131A1 (fr) * | 1996-04-11 | 1997-10-16 | Valentina Filippovna Kulikova | Procede de detection d'une chaine d'acides nucleiques devant etre analysee |
DE60024464T2 (de) * | 1999-05-07 | 2006-08-03 | Roche Diagnostics Gmbh | Hohe dichte markierung von dns mit modifizierte oder chromophore tragende nukleotide und benutzte dns polymerasen |
DE60321961D1 (de) * | 2002-11-07 | 2008-08-14 | Yoichi Matsubara | Verfahren zum genmutationsnachweis |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU622104B2 (en) * | 1987-03-11 | 1992-04-02 | Sangtec Molecular Diagnostics Ab | Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore |
CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
AT390080B (de) * | 1988-07-29 | 1990-03-12 | Lion Thomas Dr | Schnell-blot verfahren zum nachweis viraler sequenzen sowie amplifizierter gensequenzen in menschlichen zellen |
CA2004326A1 (en) * | 1988-12-23 | 1990-06-23 | Nanibushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
KR920700360A (ko) * | 1989-03-22 | 1992-02-19 | 하리크 프리드리히 | 미끄럼 베어링 |
CA2012982A1 (en) * | 1989-03-27 | 1990-09-27 | Frank W. Hobbs | Process for rapid nucleic acid detection by incorporating a reporter moiety into amplified target nucleic acid |
US5043272A (en) * | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
-
1991
- 1991-10-03 NZ NZ240079A patent/NZ240079A/xx unknown
- 1991-10-04 DK DK91917451.6T patent/DK0552203T3/da active
- 1991-10-04 EP EP91917451A patent/EP0552203B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-04 AU AU86275/91A patent/AU655781B2/en not_active Expired
- 1991-10-04 JP JP3515944A patent/JP2673162B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-04 CA CA002093647A patent/CA2093647C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-04 ES ES91917451T patent/ES2073771T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-04 WO PCT/EP1991/001898 patent/WO1992006216A1/de active IP Right Grant
- 1991-10-04 AT AT91917451T patent/ATE122104T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-04 DE DE59105402T patent/DE59105402D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-07 IL IL9966391A patent/IL99663A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-08 PT PT99177A patent/PT99177B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 IE IE355291A patent/IE68525B1/en not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-04-06 NO NO931309A patent/NO305995B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-04-07 FI FI931586A patent/FI103808B1/fi active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IE913552A1 (en) | 1992-04-22 |
DE59105402D1 (de) | 1995-06-08 |
NO931309D0 (no) | 1993-04-06 |
FI931586A (fi) | 1993-04-07 |
NO931309L (no) | 1993-04-06 |
FI931586A0 (fi) | 1993-04-07 |
NO305995B1 (no) | 1999-08-30 |
IL99663A (en) | 1995-12-31 |
EP0552203A1 (de) | 1993-07-28 |
ATE122104T1 (de) | 1995-05-15 |
CA2093647C (en) | 2000-09-19 |
DK0552203T3 (da) | 1995-10-02 |
AU655781B2 (en) | 1995-01-12 |
IE68525B1 (en) | 1996-06-26 |
EP0552203B1 (de) | 1995-05-03 |
CA2093647A1 (en) | 1992-04-10 |
JPH06501157A (ja) | 1994-02-10 |
WO1992006216A1 (de) | 1992-04-16 |
ES2073771T3 (es) | 1995-08-16 |
AU8627591A (en) | 1992-04-28 |
IL99663A0 (en) | 1992-08-18 |
JP2673162B2 (ja) | 1997-11-05 |
PT99177B (pt) | 1999-04-30 |
NZ240079A (en) | 1993-07-27 |
PT99177A (pt) | 1992-09-30 |
FI103808B1 (fi) | 1999-09-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU624601B2 (en) | Amplification and detection of nucleic acid sequences | |
EP0792376B1 (en) | Continuous amplification reaction | |
JP2843147B2 (ja) | インビトロにおける増幅を用いたポリヌクレオチド捕捉アッセイ | |
JP3887786B2 (ja) | スルホクマリン−含有ヌクレオチド及び核酸検出法におけるそれらの利用 | |
JP2005511030A (ja) | 核酸の増幅方法 | |
WO1997023647A1 (en) | Homogeneous amplification and detection of nucleic acids | |
JP2003510012A (ja) | 電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上の係留鎖置換増幅 | |
US7105318B2 (en) | Specific and sensitive nucleic acid detection method | |
JP2511221B2 (ja) | ポリメラ―ゼ活性測定方法 | |
IL95537A (en) | A process for replicating nucleic acids using at least two adapters | |
JPH10201476A (ja) | 核酸配列分析方法 | |
US6136535A (en) | Continuous amplification reaction | |
FI102084B (fi) | Menetelmä muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi ja menetelmä n iiden osoittamiseksi sekä reagenssipakkaus | |
JP2644419B2 (ja) | 核酸の固定化 | |
JP2638421B2 (ja) | 核酸の検出方法 | |
FI103808B (fi) | Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoittamiseen | |
US5753433A (en) | Method for the sensitive detection of nucleic acids | |
AU641085B2 (en) | Detection of bacteria using a nucleic acid amplification | |
Nicolas et al. | Phosphate Dehydrogenase by Bioluminescence |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HC | Name/ company changed in application |
Owner name: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH |