JP2843147B2 - インビトロにおける増幅を用いたポリヌクレオチド捕捉アッセイ - Google Patents
インビトロにおける増幅を用いたポリヌクレオチド捕捉アッセイInfo
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- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Description
【発明の詳細な説明】 説明 技術分野 本発明は、核酸化学および生化学アッセイの分野に関
する。より詳細には、本発明は、新規なポリヌクレオチ
ド増幅、検出方法および試薬に関する。
する。より詳細には、本発明は、新規なポリヌクレオチ
ド増幅、検出方法および試薬に関する。
発明の背景 近年、核酸のハイブリダイゼーションは、遺伝研究、
生体医学研究および臨床診断において、一般的に用いら
れている。基本的な核酸のハイブリダイゼーションアッ
セイでは、一本鎖分析物核酸（DNAまたはRNA）が、標識
された核酸プローブにハイブリダイズされ、その結果得
られる標識された二本鎖が検出される。放射性標識と非
放射性標識の両方が使用されている。
生体医学研究および臨床診断において、一般的に用いら
れている。基本的な核酸のハイブリダイゼーションアッ
セイでは、一本鎖分析物核酸（DNAまたはRNA）が、標識
された核酸プローブにハイブリダイズされ、その結果得
られる標識された二本鎖が検出される。放射性標識と非
放射性標識の両方が使用されている。
外来物質から検出される二本鎖の分離すること、およ
び／または検出されるシグナルを増幅させるために、こ
のような基本的な方法の改変が開発されている。
び／または検出されるシグナルを増幅させるために、こ
のような基本的な方法の改変が開発されている。
1985年12月11日に提出された、係属中の同出願人によ
る米国特許第807,624号は、分析物核酸が標識プローブ
セットおよび捕捉プローブセットにハイブリダイズされ
る、液相の核酸ハイブリダイゼーションアッセイについ
て記載している。プローブ−分析物の複合体は、捕捉プ
ローブセットに相補的な、固体に支持された捕捉プロー
ブと、ハイブリダイゼーションすることによって結合さ
れる。これにより、分析物核酸は、固相複合体として、
溶液から取り出される。分析物を固相複合体の形態にす
ることにより、アッセイにおける次の分離工程が容易に
なる。標識プローブセットは、ハイブリダイゼーション
によって固相／分析物複合体に結合した、標識されたプ
ローブに相補的である。
る米国特許第807,624号は、分析物核酸が標識プローブ
セットおよび捕捉プローブセットにハイブリダイズされ
る、液相の核酸ハイブリダイゼーションアッセイについ
て記載している。プローブ−分析物の複合体は、捕捉プ
ローブセットに相補的な、固体に支持された捕捉プロー
ブと、ハイブリダイゼーションすることによって結合さ
れる。これにより、分析物核酸は、固相複合体として、
溶液から取り出される。分析物を固相複合体の形態にす
ることにより、アッセイにおける次の分離工程が容易に
なる。標識プローブセットは、ハイブリダイゼーション
によって固相／分析物複合体に結合した、標識されたプ
ローブに相補的である。
PCT出願第84/03520号およびEPA 124221号は、以下の
ようなDNAハイブリダイゼーションアッセイについて記
載している。このアッセイでは、分析物は、酵素で標識
されたオリゴヌクレオチドに相補的なテールを有する、
一本鎖DNAプローブにアニールされ、（２）結果として
得られるテールを有する複合体は、酵素で標識されたオ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。Enzo Bioch
em“Bio−Bridge"標識システムは、これら２つの特許出
願に記載のシステムと同様のようである。“Bio−Bridg
e"システムは、DNAプローブに非修飾の３′−ポリＴテ
ール部を加えるために、末端デオキシヌクレオチドトラ
ンスフェラーゼを使用する。ポリＴテールを有するプロ
ーブは、標的DNA配列にハイブリダイズされ、次いでビ
オチンで修飾されたポリＡにハイブリダイズされる。
ようなDNAハイブリダイゼーションアッセイについて記
載している。このアッセイでは、分析物は、酵素で標識
されたオリゴヌクレオチドに相補的なテールを有する、
一本鎖DNAプローブにアニールされ、（２）結果として
得られるテールを有する複合体は、酵素で標識されたオ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。Enzo Bioch
em“Bio−Bridge"標識システムは、これら２つの特許出
願に記載のシステムと同様のようである。“Bio−Bridg
e"システムは、DNAプローブに非修飾の３′−ポリＴテ
ール部を加えるために、末端デオキシヌクレオチドトラ
ンスフェラーゼを使用する。ポリＴテールを有するプロ
ーブは、標的DNA配列にハイブリダイズされ、次いでビ
オチンで修飾されたポリＡにハイブリダイズされる。
EPA 204510は、以下のようなDNAハイブリダイゼーシ
ョンアッセイについて記載している。このアッセイにお
いては、分析物DNAは、ポリ−dTテールのようなテール
を有する、プローブ、および複数の標識された鎖と結合
し得、ポリ−dA配列のような配列を有する増幅鎖と接触
される。
ョンアッセイについて記載している。このアッセイにお
いては、分析物DNAは、ポリ−dTテールのようなテール
を有する、プローブ、および複数の標識された鎖と結合
し得、ポリ−dA配列のような配列を有する増幅鎖と接触
される。
Collinsら、米国特許第4,818,680号は、標的DNA配列
が、部分的に二本鎖のプローブからの標識された一本鎖
を除去する、ポリヌクレオチド除去アッセイを開示して
いる。除去された一本鎖は、捕捉プローブへのハイブリ
ダイゼーションによって捕捉され、洗浄後残った標識さ
れたシグナル鎖の量が定量される。
が、部分的に二本鎖のプローブからの標識された一本鎖
を除去する、ポリヌクレオチド除去アッセイを開示して
いる。除去された一本鎖は、捕捉プローブへのハイブリ
ダイゼーションによって捕捉され、洗浄後残った標識さ
れたシグナル鎖の量が定量される。
Varyは、米国特許第4,795,701号で、他のポリヌクレ
オチド除去アッセイを開示している。このアッセイにお
いては、シグナル鎖は好ましくはRNAであり、これによ
り、プローブ試薬は、DNA/RNAのプローブ／シグナル鎖
ヘテロ二本鎖になっている。除去された一本鎖の量は、
除去された鎖を個々のヌクレオチドに分解し、このよう
にして生産されたADPをATPに変換し、ATPをルシフェラ
ーゼとの反応によってアッセイすることにより定量され
る。この方法の欠点は、除去されたシグナル鎖のみの完
全な分解に依存するが、試料中に天然に存在するATPか
らの高度な背景レベル中で測定されること、およびシグ
ナルが、シグナル鎖のアデノシン含有量によって変化し
得ることである。
オチド除去アッセイを開示している。このアッセイにお
いては、シグナル鎖は好ましくはRNAであり、これによ
り、プローブ試薬は、DNA/RNAのプローブ／シグナル鎖
ヘテロ二本鎖になっている。除去された一本鎖の量は、
除去された鎖を個々のヌクレオチドに分解し、このよう
にして生産されたADPをATPに変換し、ATPをルシフェラ
ーゼとの反応によってアッセイすることにより定量され
る。この方法の欠点は、除去されたシグナル鎖のみの完
全な分解に依存するが、試料中に天然に存在するATPか
らの高度な背景レベル中で測定されること、およびシグ
ナルが、シグナル鎖のアデノシン含有量によって変化し
得ることである。
これらの従来のハイブリダイゼーションアッセイの主
要な問題点は、これらのアッセイが、非常に低レベルの
分析物を検出するのに有用な十分な特異性および／また
はシグナルを欠いていることである。本発明の主要な目
的は、核酸のハイブリダイゼーションに用いられる増幅
を提供することにある。これは、再生可能なシグナルの
高い獲得、再生可能な高いノイズに対するシグナル比、
および低度な非特異的結合を提供する。さらに、それ自
身再生可能で、「ユニバーサル」なシグナル部分および
低濃度の分析物と特異的に結合して、安定した複合対を
形成し得る。
要な問題点は、これらのアッセイが、非常に低レベルの
分析物を検出するのに有用な十分な特異性および／また
はシグナルを欠いていることである。本発明の主要な目
的は、核酸のハイブリダイゼーションに用いられる増幅
を提供することにある。これは、再生可能なシグナルの
高い獲得、再生可能な高いノイズに対するシグナル比、
および低度な非特異的結合を提供する。さらに、それ自
身再生可能で、「ユニバーサル」なシグナル部分および
低濃度の分析物と特異的に結合して、安定した複合対を
形成し得る。
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）すなわちDNA増幅技術の改
良は、本願に援用したMullisによる米国特許第4,683,19
5号（Mullisら）および4,683,202号に開示された。PCR
法では、所望の配列の相対する末端とマッチする短いオ
リゴヌクレオチドプライマーが調製される。プライマー
間の配列は知る必要がない。DNA（またはRNA）の試料は
抽出され、（好ましくは加熱により）変性される。次い
で、オリゴヌクレオチドプライマーは、各種dNTPおよび
ポリメラーゼ（好ましくは、熱に対して安定なTaqポリ
メラーゼ）と共に、モル過剰に加えられる。DNAは複製
され、次いで再び変性される。これにより、（二本鎖DN
A1分子当り）各々のプライマーから開始する２つの「長
い産物」、および２つのオリジナル鎖が生産される。次
いで、反応混合物は、（例えば、温度を下げる、変性剤
を不活性化させる、またはさらにポリメラーゼを加える
ことによって）重合条件下に戻され、２回目のサイクル
が開始する。２回目のサイクルにより、２つのオリジナ
ル鎖、サイクル１から得られた２つの長い産物、（オリ
ジナル鎖から複製した）新たな２つの長い産物、および
長い産物から複製した２つの「短い産物」が提供され
る。この短い産物は、それぞれの末端にプライマーを有
する標的配列（センスまたはアンチセンス）を有してい
る。各サイクルを重ねるごとに、さらに２つの長い産
物；および１つ前のサイクルが終了したときに残存する
長い産物および短い産物の数と同数の短い産物とが生産
される。従って、短い産物の数は、各サイクルで、指数
関数的に増える。特異的分析物配列のこのような増幅に
より、非常に少量のDNAの検出が可能になる。
良は、本願に援用したMullisによる米国特許第4,683,19
5号（Mullisら）および4,683,202号に開示された。PCR
法では、所望の配列の相対する末端とマッチする短いオ
リゴヌクレオチドプライマーが調製される。プライマー
間の配列は知る必要がない。DNA（またはRNA）の試料は
抽出され、（好ましくは加熱により）変性される。次い
で、オリゴヌクレオチドプライマーは、各種dNTPおよび
ポリメラーゼ（好ましくは、熱に対して安定なTaqポリ
メラーゼ）と共に、モル過剰に加えられる。DNAは複製
され、次いで再び変性される。これにより、（二本鎖DN
A1分子当り）各々のプライマーから開始する２つの「長
い産物」、および２つのオリジナル鎖が生産される。次
いで、反応混合物は、（例えば、温度を下げる、変性剤
を不活性化させる、またはさらにポリメラーゼを加える
ことによって）重合条件下に戻され、２回目のサイクル
が開始する。２回目のサイクルにより、２つのオリジナ
ル鎖、サイクル１から得られた２つの長い産物、（オリ
ジナル鎖から複製した）新たな２つの長い産物、および
長い産物から複製した２つの「短い産物」が提供され
る。この短い産物は、それぞれの末端にプライマーを有
する標的配列（センスまたはアンチセンス）を有してい
る。各サイクルを重ねるごとに、さらに２つの長い産
物；および１つ前のサイクルが終了したときに残存する
長い産物および短い産物の数と同数の短い産物とが生産
される。従って、短い産物の数は、各サイクルで、指数
関数的に増える。特異的分析物配列のこのような増幅に
より、非常に少量のDNAの検出が可能になる。
PCR技術が近年開発されたために、非常に少量（＜1f
g）で存在する特異的DNA配列の検出が可能になった。し
かし、検出限界付近の正確な結果を得るためには、異種
DNAによるコンタミネーションを避けるように多大な注
意を払わなければならない。試料由来のDNAの代わり
に、ガラス容器上または試薬中に存在するDNAを増幅さ
せる可能性もあり、誤った結果を導くことになる。
g）で存在する特異的DNA配列の検出が可能になった。し
かし、検出限界付近の正確な結果を得るためには、異種
DNAによるコンタミネーションを避けるように多大な注
意を払わなければならない。試料由来のDNAの代わり
に、ガラス容器上または試薬中に存在するDNAを増幅さ
せる可能性もあり、誤った結果を導くことになる。
発明の開示 本発明は、現在のアッセイ方法の問題点および欠点を
克服する。本発明は、標的配列の精製およびPCR産物の
迅速な検出を提供する。本発明の方法では、ハイブリダ
イゼーション条件下で、試料と分析物配列にハイブリダ
イズし得る捕捉プローブとを接触させ、分析物−捕捉プ
ローブ二本鎖を形成することによって、ポリヌクレオチ
ドを含む試料の分析物ポリヌクレオチド鎖をアッセイす
る。ここで、捕捉プローブは、分析物結合領域および第
１特異的結合パートナーを含む。分析物結合領域は、分
析物ポリヌクレオチドの領域とハイブリダイズし得、第
１特異的結合パートナーは、第２結合パートナーに特異
的である。この第２結合パートナーは、第１支持体上に
固定化され。次いで、二本鎖を、固定化した第２結合パ
ートナーと接触させ、これによって、支持体上に二本鎖
を固定化させる。次いで、非結合ポリヌクレオチドを、
通常、洗浄によって、該試料から除去する。分析物−捕
捉プローブ複合体は、必要に応じて、支持体から除去さ
れ得、ハイブリダイゼーション条件下で、分析物ポリヌ
クレオチドの第１プライマー結合領域に相補的な第１プ
ライマーと接触させ得る。あるいは、プローブは、支持
体に結合する間にハイブリダイズし得る。分析物ヌクレ
オチドに相補的な鎖は、ヌクレオチド重合によって（例
えば、ヌクレオチドポリメラーゼを用いて）合成され、
分析物−相補的な鎖間での二本鎖が形成される。次い
で、二本鎖は変性され、両鎖をプライマーに接触させ
（相補的鎖は、相補的鎖にハイブリダイズし得る第２プ
ライマーと接触させる）、次いで、分析物配列の複製お
よび相補的鎖の他の複製を生産する。次いで、これらの
二本鎖を変性し、検出可能な量のポリヌクレオチドが存
在するようになるまで工程を繰り返す。次いで、ポリヌ
クレオチドを検出し、これは、分析物配列の存在を示
す。
克服する。本発明は、標的配列の精製およびPCR産物の
迅速な検出を提供する。本発明の方法では、ハイブリダ
イゼーション条件下で、試料と分析物配列にハイブリダ
イズし得る捕捉プローブとを接触させ、分析物−捕捉プ
ローブ二本鎖を形成することによって、ポリヌクレオチ
ドを含む試料の分析物ポリヌクレオチド鎖をアッセイす
る。ここで、捕捉プローブは、分析物結合領域および第
１特異的結合パートナーを含む。分析物結合領域は、分
析物ポリヌクレオチドの領域とハイブリダイズし得、第
１特異的結合パートナーは、第２結合パートナーに特異
的である。この第２結合パートナーは、第１支持体上に
固定化され。次いで、二本鎖を、固定化した第２結合パ
ートナーと接触させ、これによって、支持体上に二本鎖
を固定化させる。次いで、非結合ポリヌクレオチドを、
通常、洗浄によって、該試料から除去する。分析物−捕
捉プローブ複合体は、必要に応じて、支持体から除去さ
れ得、ハイブリダイゼーション条件下で、分析物ポリヌ
クレオチドの第１プライマー結合領域に相補的な第１プ
ライマーと接触させ得る。あるいは、プローブは、支持
体に結合する間にハイブリダイズし得る。分析物ヌクレ
オチドに相補的な鎖は、ヌクレオチド重合によって（例
えば、ヌクレオチドポリメラーゼを用いて）合成され、
分析物−相補的な鎖間での二本鎖が形成される。次い
で、二本鎖は変性され、両鎖をプライマーに接触させ
（相補的鎖は、相補的鎖にハイブリダイズし得る第２プ
ライマーと接触させる）、次いで、分析物配列の複製お
よび相補的鎖の他の複製を生産する。次いで、これらの
二本鎖を変性し、検出可能な量のポリヌクレオチドが存
在するようになるまで工程を繰り返す。次いで、ポリヌ
クレオチドを検出し、これは、分析物配列の存在を示
す。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法を模式的に示す。
図２は、本発明の捕捉プローブおよびプライマーの、
分析物ポリヌクレオチドおよびその相補体へのハイブリ
ダイゼーションを模式的に示す。
分析物ポリヌクレオチドおよびその相補体へのハイブリ
ダイゼーションを模式的に示す。
発明を実施するための形態 A.定義 プライマー、プローブ、検出されるオリゴマーフラグ
メント、オリゴマーコントロールおよび標識されていな
いブロッキングオリゴマーを言及するのに、本願で使用
される用語「オリゴヌクレオチド」は、２個またはそれ
以上、好ましくは３個より多くのデオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドを含む分子として定義され
る。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、その要
因はオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依
存し得る。
メント、オリゴマーコントロールおよび標識されていな
いブロッキングオリゴマーを言及するのに、本願で使用
される用語「オリゴヌクレオチド」は、２個またはそれ
以上、好ましくは３個より多くのデオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドを含む分子として定義され
る。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、その要
因はオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依
存し得る。
本願で使用される用語「プライマー」は、適切な条件
下においたときに、合成の開始点として作用し得るオリ
ゴヌクレオチドを指す。プライマーは、複製されるポリ
ヌクレオチド鎖の領域に完全にまたは実質的に相補的で
あり得る。従って、ハイブリダイゼーションを行う条件
下では、プライマーは、分析物鎖の相補的な領域にアニ
ールし得る。適切な反応物（例えば、DNAポリメラー
ゼ、ヌクレオチドトリホスフェート等）を付加すると、
プライマーは、ポリメラーゼにより伸長し、分析物鎖の
複製物を形成する。プライマーは、増幅が最大に効果的
に行われるように、一本鎖であることが好ましいが、部
分的に、または完全に二本鎖であってもよい。好ましく
は、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで
ある。プライマーは、ポリメラーゼの存在下で、伸長産
物の合成を開始するのに十分な長さでなければならな
い。プライマーの正確な長さは、温度、溶質等を含む多
くの要因に依存し得る。例えば、診断に応用する場合
は、分析物の複合性に依存し、オリゴヌクレオチドプラ
イマーは、通常、15−25またはそれ以上のヌクレオチド
を含む。しかしこれよりも少ないヌクレオチドを含んで
もよい。短いプライマーの場合、一般に、テンプレート
との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するため
には、低い温度が必要である。
下においたときに、合成の開始点として作用し得るオリ
ゴヌクレオチドを指す。プライマーは、複製されるポリ
ヌクレオチド鎖の領域に完全にまたは実質的に相補的で
あり得る。従って、ハイブリダイゼーションを行う条件
下では、プライマーは、分析物鎖の相補的な領域にアニ
ールし得る。適切な反応物（例えば、DNAポリメラー
ゼ、ヌクレオチドトリホスフェート等）を付加すると、
プライマーは、ポリメラーゼにより伸長し、分析物鎖の
複製物を形成する。プライマーは、増幅が最大に効果的
に行われるように、一本鎖であることが好ましいが、部
分的に、または完全に二本鎖であってもよい。好ましく
は、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで
ある。プライマーは、ポリメラーゼの存在下で、伸長産
物の合成を開始するのに十分な長さでなければならな
い。プライマーの正確な長さは、温度、溶質等を含む多
くの要因に依存し得る。例えば、診断に応用する場合
は、分析物の複合性に依存し、オリゴヌクレオチドプラ
イマーは、通常、15−25またはそれ以上のヌクレオチド
を含む。しかしこれよりも少ないヌクレオチドを含んで
もよい。短いプライマーの場合、一般に、テンプレート
との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するため
には、低い温度が必要である。
本願のプライマーは、増幅される各標的ポリヌクレオ
チド配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるものが
選択される。このことは、プライマーが、重合条件下
で、各々の鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的で
なければならないことを意味する。従って、プライマー
配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はな
い。例えば、プライマー配列の残りが、鎖に相補的であ
れば、非相補的ヌクレオチド配列がプライマーの５′末
端に付着され得る。あるいは、プライマー配列が、増幅
される鎖の配列に対して十分な相補性を有し、これとハ
イブリダイズし、他のプライマーの伸長産物を合成する
ためのテンプレートを形成するならば、非相補的塩基ま
たはより長い配列は、プライマー中に挿入され得る。
チド配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるものが
選択される。このことは、プライマーが、重合条件下
で、各々の鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的で
なければならないことを意味する。従って、プライマー
配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はな
い。例えば、プライマー配列の残りが、鎖に相補的であ
れば、非相補的ヌクレオチド配列がプライマーの５′末
端に付着され得る。あるいは、プライマー配列が、増幅
される鎖の配列に対して十分な相補性を有し、これとハ
イブリダイズし、他のプライマーの伸長産物を合成する
ためのテンプレートを形成するならば、非相補的塩基ま
たはより長い配列は、プライマー中に挿入され得る。
本発明の現在好ましい実施態様において使用されるプ
ライマーは、下記のような特異的結合パートナーと結合
した、DNAポリメラーゼ反応を開始させ得るポリヌクレ
オチド領域を含む。
ライマーは、下記のような特異的結合パートナーと結合
した、DNAポリメラーゼ反応を開始させ得るポリヌクレ
オチド領域を含む。
用語「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物鎖」
は、生物学的試料に存在し得る、一本鎖または二本鎖核
酸の分子を指す。用語「分析物に相補的な鎖」は、第１
プライマーから始まり、ポリメラーゼ作用の方向に伸長
し、分析物ポリヌクレオチドの鎖部分に相補的な鎖を形
成する、ポリヌクレオチド鎖を指す。用語「分析物コピ
ー鎖」は、その開始点に第２プライマーを有し、第１プ
ライマーに相補的な領域の開始点まで伸長する、分析物
に相補的な鎖に相補的（従って、オリジナルの分析物ポ
リヌクレオチドに実質的に同一の）ポリヌクレオチドを
指す。用語「分析物コピー／相補的二本鎖ポリヌクレオ
チド」は、分析物に相補的な鎖にハイブリダズした分析
物複製鎖からなる二本鎖分子を指す。
は、生物学的試料に存在し得る、一本鎖または二本鎖核
酸の分子を指す。用語「分析物に相補的な鎖」は、第１
プライマーから始まり、ポリメラーゼ作用の方向に伸長
し、分析物ポリヌクレオチドの鎖部分に相補的な鎖を形
成する、ポリヌクレオチド鎖を指す。用語「分析物コピ
ー鎖」は、その開始点に第２プライマーを有し、第１プ
ライマーに相補的な領域の開始点まで伸長する、分析物
に相補的な鎖に相補的（従って、オリジナルの分析物ポ
リヌクレオチドに実質的に同一の）ポリヌクレオチドを
指す。用語「分析物コピー／相補的二本鎖ポリヌクレオ
チド」は、分析物に相補的な鎖にハイブリダズした分析
物複製鎖からなる二本鎖分子を指す。
本願で使用される用語「結合パートナー」は、例え
ば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場
合のように、高い特異性を有するリガンド分子結合し得
る分子を指す。一般に、特異的結合パートナーは、反応
および分離条件下で、（捕捉プローブの場合の）分析物
複製／相補的鎖二本鎖を固定化するのに十分な親和性を
もって結合しなければならない。他の特異的結合パート
ナーには、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジ
ン、IgGとタンパク質Ａ、および当該技術分野に公知の
多数のレセプター−リガンド結合体を含む。本発明の実
施において、現在好ましい結合パートナーは、相補的な
ポリヌクレオチド鎖である。捕捉プローブの特異的結合
ポリヌクレオチド領域は、好ましくは、長さが少なくと
も約15−40塩基であり、約40−60％のGCを含有する。ポ
リヌクレオチドは、DNA、RNA、または合成DNAアナログ
を含み得る。
ば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場
合のように、高い特異性を有するリガンド分子結合し得
る分子を指す。一般に、特異的結合パートナーは、反応
および分離条件下で、（捕捉プローブの場合の）分析物
複製／相補的鎖二本鎖を固定化するのに十分な親和性を
もって結合しなければならない。他の特異的結合パート
ナーには、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジ
ン、IgGとタンパク質Ａ、および当該技術分野に公知の
多数のレセプター−リガンド結合体を含む。本発明の実
施において、現在好ましい結合パートナーは、相補的な
ポリヌクレオチド鎖である。捕捉プローブの特異的結合
ポリヌクレオチド領域は、好ましくは、長さが少なくと
も約15−40塩基であり、約40−60％のGCを含有する。ポ
リヌクレオチドは、DNA、RNA、または合成DNAアナログ
を含み得る。
本願で使用される用語「捕捉プローブ」は、結合パー
トナーに結合した、一本鎖ポリヌクレオチドを含む分子
を指す。一本鎖ポリヌクレオチド領域は、分析物ポリヌ
クレオチドの領域に相補的であり、十分に長く、分析物
ポリヌクレオチドを固体表面に（結合パートナーを介し
て）固定化するのに十分な親和性を供与するのに適して
いる。結合パートナーは、固体支持体の表面に結合した
第２結合パートナーに対して特異的である。
トナーに結合した、一本鎖ポリヌクレオチドを含む分子
を指す。一本鎖ポリヌクレオチド領域は、分析物ポリヌ
クレオチドの領域に相補的であり、十分に長く、分析物
ポリヌクレオチドを固体表面に（結合パートナーを介し
て）固定化するのに十分な親和性を供与するのに適して
いる。結合パートナーは、固体支持体の表面に結合した
第２結合パートナーに対して特異的である。
本願で使用される用語「結合した」は、共有結合また
は強力な非共有結合（例えば、強力なリガンド−レセプ
ター結合および関連の相互作用）による付着を指す。共
有結合は、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミ
ド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄結合、炭素−リン結
合等であり得、これらが現在好ましい。本発明の実施に
は、当該技術分野に公知の任意の標識／結合技術が使用
され得る。
は強力な非共有結合（例えば、強力なリガンド−レセプ
ター結合および関連の相互作用）による付着を指す。共
有結合は、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミ
ド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄結合、炭素−リン結
合等であり得、これらが現在好ましい。本発明の実施に
は、当該技術分野に公知の任意の標識／結合技術が使用
され得る。
用語「支持体」は、特異的結合パートナーが固定され
得る、任意の固体または半固体表面を指す。適切な支持
体には、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲル等
が含まれ、ビーズ、ウェル、ディップスティック（dips
ticks）、膜等の形態をとり得る。現在好ましい支持体
は、ポリスチレンビーズまたはミクロタイターディッシ
ュウェルとして提供されている。
得る、任意の固体または半固体表面を指す。適切な支持
体には、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲル等
が含まれ、ビーズ、ウェル、ディップスティック（dips
ticks）、膜等の形態をとり得る。現在好ましい支持体
は、ポリスチレンビーズまたはミクロタイターディッシ
ュウェルとして提供されている。
本願で使用される用語「標識」は、検出可能（好まし
くは定量可能）なシグナルを提供するのに使用され得、
核酸またはタンパク質に付着し得る任意の原子または分
子を指す。標識は、蛍光、放射能、比色分析、Ｘ線回析
または吸収、磁気、酵素活性等によって検出可能なシグ
ナルを提供し得る。適切な標識は、蛍光体、発色団、放
射性原子（特に、32Pおよび125I）、高電子密度試薬、
酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドを
含む。酵素は、通常、それらの活性によって検出され
る。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、
通常、3,3′、5,5′−テトラメチルベンジジン（TMB）
を分光計で定量可能なブルー色素に変換する能力によっ
て検出される。同一の標識が、いくつかの異なる形態で
作用し得るため、上記の説明は、様々な標識を異なるク
ラスに分類することを意味するものではないことを理解
しなければならない。例えば、125Iは、放射性標識また
は高電子密度の試薬として作用し得る。HRPは、酵素ま
たはMAbに対する抗原として作用し得る。さらに、望ま
しい効果を得るために、様々な標識を組み合わせてもよ
い。たとえば、MAb類およびアビジンはまた、本発明の
実施において標識を必要とする。従って、ビオチンでプ
ローブを標識し、その存在を、125Iで標識されたアビジ
ン、またはHRPで標識された抗ビオチンMAbで検出し得
る。他の改変または可能性は、当業者に容易に自明であ
り、本発明の範囲内の等価物と見なされる。
くは定量可能）なシグナルを提供するのに使用され得、
核酸またはタンパク質に付着し得る任意の原子または分
子を指す。標識は、蛍光、放射能、比色分析、Ｘ線回析
または吸収、磁気、酵素活性等によって検出可能なシグ
ナルを提供し得る。適切な標識は、蛍光体、発色団、放
射性原子（特に、32Pおよび125I）、高電子密度試薬、
酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドを
含む。酵素は、通常、それらの活性によって検出され
る。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、
通常、3,3′、5,5′−テトラメチルベンジジン（TMB）
を分光計で定量可能なブルー色素に変換する能力によっ
て検出される。同一の標識が、いくつかの異なる形態で
作用し得るため、上記の説明は、様々な標識を異なるク
ラスに分類することを意味するものではないことを理解
しなければならない。例えば、125Iは、放射性標識また
は高電子密度の試薬として作用し得る。HRPは、酵素ま
たはMAbに対する抗原として作用し得る。さらに、望ま
しい効果を得るために、様々な標識を組み合わせてもよ
い。たとえば、MAb類およびアビジンはまた、本発明の
実施において標識を必要とする。従って、ビオチンでプ
ローブを標識し、その存在を、125Iで標識されたアビジ
ン、またはHRPで標識された抗ビオチンMAbで検出し得
る。他の改変または可能性は、当業者に容易に自明であ
り、本発明の範囲内の等価物と見なされる。
用語「特異的ハイブリダイゼーション」は、プローブ
と試料分析物配列との正確な相補性が必要とされる厳格
なハイブリダイゼーション条件を指す。このような条件
は、当業者に容易に認識され得、配列の長さおよび塩基
組成に依存する。一般に、「正確なマッチ」がなければ
実質的に１つの配列もハイブリダイズしない条件を得る
ために、ハイブリダイゼーション溶液中の温度、イオン
強度、およびカオトロピズム剤の濃度を変化させ得る。
ある配列を、結合したDNAにハイブリダイズさせるため
の、標準条件下（0.9M NaCl）での最適温度を計算する
実験式は、以下の通りである。
と試料分析物配列との正確な相補性が必要とされる厳格
なハイブリダイゼーション条件を指す。このような条件
は、当業者に容易に認識され得、配列の長さおよび塩基
組成に依存する。一般に、「正確なマッチ」がなければ
実質的に１つの配列もハイブリダイズしない条件を得る
ために、ハイブリダイゼーション溶液中の温度、イオン
強度、およびカオトロピズム剤の濃度を変化させ得る。
ある配列を、結合したDNAにハイブリダイズさせるため
の、標準条件下（0.9M NaCl）での最適温度を計算する
実験式は、以下の通りである。
Ｔ（℃）＝４（NG＋NC）＋２（NA＋NT）−５℃ ここで、NG、NC、NAおよびNTは、配列中のＧ、Ｃ、Ａ
およびＴ塩基の数である（J.Meinkothら、Anal Biochem
（1984）138:267−84）。
およびＴ塩基の数である（J.Meinkothら、Anal Biochem
（1984）138:267−84）。
B.一般的方法 捕捉プローブおよびプライマーを、従来の核酸合成技
術によって調製する。
術によって調製する。
本発明の方法は、以下のようにして実施され得る。分
析物核酸（好ましくは一本鎖）を含む試料を、ハイブリ
ダイゼーション条件下で、過剰の一本鎖核酸捕捉プロー
ブ（またはプローブセット）とインキュベートする。こ
の捕捉プローブは、分析物に相補的な第１結合配列、お
よび固相第２結合パートナーに特異的な除去可能な第１
結合パートナーであって、好ましくは固相に結合した一
本鎖オリゴヌクレオチドに相補的な結合ポリヌクレオチ
ドを含む。結果として、１つまたはそれ以上のプローブ
が結合した分析物ポリヌクレオチドが得られる。プロー
ブの第２結合配列は、分析物に相補的ではないため、一
本鎖テールとして残る。各タイプの多数のプローブが使
用され得、同一のまたは異なるハイブリダイジング配
列、および同一のまたは異なる結合パートナーを有し得
る。複数の非オーバーラピング捕捉プローブ（捕捉プロ
ーブセット）を用いるのが現在好ましい。
析物核酸（好ましくは一本鎖）を含む試料を、ハイブリ
ダイゼーション条件下で、過剰の一本鎖核酸捕捉プロー
ブ（またはプローブセット）とインキュベートする。こ
の捕捉プローブは、分析物に相補的な第１結合配列、お
よび固相第２結合パートナーに特異的な除去可能な第１
結合パートナーであって、好ましくは固相に結合した一
本鎖オリゴヌクレオチドに相補的な結合ポリヌクレオチ
ドを含む。結果として、１つまたはそれ以上のプローブ
が結合した分析物ポリヌクレオチドが得られる。プロー
ブの第２結合配列は、分析物に相補的ではないため、一
本鎖テールとして残る。各タイプの多数のプローブが使
用され得、同一のまたは異なるハイブリダイジング配
列、および同一のまたは異なる結合パートナーを有し得
る。複数の非オーバーラピング捕捉プローブ（捕捉プロ
ーブセット）を用いるのが現在好ましい。
次いで、この複合体を、第２特異的結合パートナーを
有する固相に結合条件下で加える。好ましくは、この第
２特異的結合パートナーには、捕捉プローブの結合配列
に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。捕捉プロ
ーブセットが用いられる場合、特に、第１および第２結
合パートナーが、ポリヌクレオチドである場合（すなわ
ち、各捕捉プローブが、特有の分析物結合領域を有する
が、同一の第１結合パートナー配列は共通する場合）に
は同一の結合パートナーを使用するのが好ましい。得ら
れる産物は、固相に結合した複合体を含む。この結合
は、固相に結合したオリゴヌクレオチドと捕捉プローブ
の第２結合配列とで形成される二本鎖を介してなされ
る。次いで、結合複合体を有する固相は、一般に洗浄に
よって、非結合物質から分離される。
有する固相に結合条件下で加える。好ましくは、この第
２特異的結合パートナーには、捕捉プローブの結合配列
に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドである。捕捉プロ
ーブセットが用いられる場合、特に、第１および第２結
合パートナーが、ポリヌクレオチドである場合（すなわ
ち、各捕捉プローブが、特有の分析物結合領域を有する
が、同一の第１結合パートナー配列は共通する場合）に
は同一の結合パートナーを使用するのが好ましい。得ら
れる産物は、固相に結合した複合体を含む。この結合
は、固相に結合したオリゴヌクレオチドと捕捉プローブ
の第２結合配列とで形成される二本鎖を介してなされ
る。次いで、結合複合体を有する固相は、一般に洗浄に
よって、非結合物質から分離される。
非結合物質を分離後、分析物ポリヌクレオチドは、固
相支持体から必要に応じて除去され得る。第１および第
２結合パートナーがオリゴヌクレオチドである場合に
は、この除去は、第１結合パートナーまたは第２結合パ
ートナーに対してより高い親和性を有するオリゴヌクレ
オチドを加え、除去用のオリゴヌクレオチドを結合パー
トナーにハイブリダイズさせることによって行われる
（例えば、Vary、プローブ除去に関する米国特許第4,79
5,701号、上記、を参照のこと）。様々なオリゴヌクレ
オチドの親和性は、プローブの長さおよび塩基対マッチ
の精度を高めて親和性を向上させること、またはプロー
ブの長さを短くし、ミスマッチを許容して親和性を低下
させることによって、調整され得る。第１および第２結
合パートナーがタンパク質である場合には、一般に除去
は、より高い親和性（またはより高い濃度）をもつリガ
ンドとの競合によって、緩衝液の条件を変化させる（例
えば、溶質の濃度を増加または減少させる、溶媒を変化
させる等）ことによって、または適切なプロテアーゼを
加えることによって、行われる。あるいは、適切な条件
下で、除去を行わずに工程を続けてもよい。標的配列
が、固相支持体に結合した分析物の領域から十分な距離
がある場合、すなわち、プライマー結合領域と捕捉プロ
ーブ結合領域との間が十分に分離されている場合には、
標的配列のPCR増幅を行うことが一般に可能である。除
去を予めすることなく、標的配列を増幅することが望ま
しい場合には、プライマー結合領域と捕捉プローブ結合
領域とは、少なくとも500bp間隔をおいて選択しなけれ
ばならない。
相支持体から必要に応じて除去され得る。第１および第
２結合パートナーがオリゴヌクレオチドである場合に
は、この除去は、第１結合パートナーまたは第２結合パ
ートナーに対してより高い親和性を有するオリゴヌクレ
オチドを加え、除去用のオリゴヌクレオチドを結合パー
トナーにハイブリダイズさせることによって行われる
（例えば、Vary、プローブ除去に関する米国特許第4,79
5,701号、上記、を参照のこと）。様々なオリゴヌクレ
オチドの親和性は、プローブの長さおよび塩基対マッチ
の精度を高めて親和性を向上させること、またはプロー
ブの長さを短くし、ミスマッチを許容して親和性を低下
させることによって、調整され得る。第１および第２結
合パートナーがタンパク質である場合には、一般に除去
は、より高い親和性（またはより高い濃度）をもつリガ
ンドとの競合によって、緩衝液の条件を変化させる（例
えば、溶質の濃度を増加または減少させる、溶媒を変化
させる等）ことによって、または適切なプロテアーゼを
加えることによって、行われる。あるいは、適切な条件
下で、除去を行わずに工程を続けてもよい。標的配列
が、固相支持体に結合した分析物の領域から十分な距離
がある場合、すなわち、プライマー結合領域と捕捉プロ
ーブ結合領域との間が十分に分離されている場合には、
標的配列のPCR増幅を行うことが一般に可能である。除
去を予めすることなく、標的配列を増幅することが望ま
しい場合には、プライマー結合領域と捕捉プローブ結合
領域とは、少なくとも500bp間隔をおいて選択しなけれ
ばならない。
分析物核酸は、生物学的液体および固体、食物、環境
物質、法医学および考古学の試料等を含む、様々な物質
から得られる。そして、例えば、プロテイナーゼK/SD
S、カオトロピズム塩等の様々な手段によって、ハイブ
リダイゼーション分析用に調製され得る。さらに、例え
ば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオ
ン）等の酵素的、物理的または化学的手段によって分析
物核酸の平均サイズを減少させることも有利であり得
る。フラグメントは、0.1kb程度でもあり得るが、通
常、少なくとも約0.5kb、および1kb以上であり得る。分
析物配列は、好ましくは、一本鎖形態で分析に提供され
る。配列が一本鎖形態で天然に存在する場合には、重要
な二次構造が存在しない限り、変性は通常必要ではな
い。しかし、配列が二本鎖形態で存在する場合には、配
列はまず変性されなければならない。変性は、アルカリ
処理、一般に、約0.05から0.2Mの水酸化物、ホルムアミ
ド、塩類、熱、またはこれらの組合せのような様々な技
術によって実施され得る。
物質、法医学および考古学の試料等を含む、様々な物質
から得られる。そして、例えば、プロテイナーゼK/SD
S、カオトロピズム塩等の様々な手段によって、ハイブ
リダイゼーション分析用に調製され得る。さらに、例え
ば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオ
ン）等の酵素的、物理的または化学的手段によって分析
物核酸の平均サイズを減少させることも有利であり得
る。フラグメントは、0.1kb程度でもあり得るが、通
常、少なくとも約0.5kb、および1kb以上であり得る。分
析物配列は、好ましくは、一本鎖形態で分析に提供され
る。配列が一本鎖形態で天然に存在する場合には、重要
な二次構造が存在しない限り、変性は通常必要ではな
い。しかし、配列が二本鎖形態で存在する場合には、配
列はまず変性されなければならない。変性は、アルカリ
処理、一般に、約0.05から0.2Mの水酸化物、ホルムアミ
ド、塩類、熱、またはこれらの組合せのような様々な技
術によって実施され得る。
分析物配列に相補的な捕捉プローブの配列は、それぞ
れ、少なくとも15のヌクレオチド（nt）、通常は少なく
とも25nt、好ましくは約5kb以下、通常は約1kb以下、好
ましくは約100nt以下であり得る。通常は、約30−50nt
であり得る。通常は、分析物の異なる配列に結合するよ
うに選択され得る。分析物結合配列は、様々な点を考慮
して、選択され得る。分析物の性質によって、コンセン
サス配列、多型性に関与する配列、特定の表現型または
遺伝子型、特定の菌株等に興味がもたれ得る。
れ、少なくとも15のヌクレオチド（nt）、通常は少なく
とも25nt、好ましくは約5kb以下、通常は約1kb以下、好
ましくは約100nt以下であり得る。通常は、約30−50nt
であり得る。通常は、分析物の異なる配列に結合するよ
うに選択され得る。分析物結合配列は、様々な点を考慮
して、選択され得る。分析物の性質によって、コンセン
サス配列、多型性に関与する配列、特定の表現型または
遺伝子型、特定の菌株等に興味がもたれ得る。
捕捉プローブまたはプローブセットの分析物結合配列
を適切に選択することによって、特定の遺伝子を含む特
異的な核酸分子、または異なる核酸分子の一部として存
在する他の配列が同定され得る。目的の核酸分子を、同
じく所定の配列を含む他の分子から区別するために、プ
ローブの一方を、所定の配列に対して相補的にし、もう
一方のプローブを、分子に対して特有である（すなわ
ち、所定の配列を含む他の分子中には存在しない）他の
配列に相補的にする。
を適切に選択することによって、特定の遺伝子を含む特
異的な核酸分子、または異なる核酸分子の一部として存
在する他の配列が同定され得る。目的の核酸分子を、同
じく所定の配列を含む他の分子から区別するために、プ
ローブの一方を、所定の配列に対して相補的にし、もう
一方のプローブを、分子に対して特有である（すなわ
ち、所定の配列を含む他の分子中には存在しない）他の
配列に相補的にする。
捕捉プローブの特異的結合パートナーは、固相に付着
した第２結合パートナーに特異的に結合し、試料／分析
物中の外因性成分と結合しないように、選択する。第１
および第２結合パートナーとして、オリゴヌクレオチド
配列を用いることが現在好ましい。結合配列は、捕捉プ
ローブにおける分析物結合配列に連続し得るか、または
中間的な非相補的配列によって分析物結合配列から間隔
をおいて配置され得る。必要に応じて、プローブは、他
の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、
結合配列の結合を阻止したり、または非特異的結合を発
生させてならない。捕捉プローブは、オリゴヌクレオチ
ド合成手法またはクローニングによって調製され得る
が、前者が好ましい。
した第２結合パートナーに特異的に結合し、試料／分析
物中の外因性成分と結合しないように、選択する。第１
および第２結合パートナーとして、オリゴヌクレオチド
配列を用いることが現在好ましい。結合配列は、捕捉プ
ローブにおける分析物結合配列に連続し得るか、または
中間的な非相補的配列によって分析物結合配列から間隔
をおいて配置され得る。必要に応じて、プローブは、他
の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、
結合配列の結合を阻止したり、または非特異的結合を発
生させてならない。捕捉プローブは、オリゴヌクレオチ
ド合成手法またはクローニングによって調製され得る
が、前者が好ましい。
結合配列は、ホモ二本鎖を提供するのに、完全な相補
性を有する必要はない。約10−30％未満の塩基がミスマ
ッチであるとき、５個以上のヌクレオチドのループを無
視すれば、多くの場合、ヘテロ二本鎖で十分である。従
って、本願で使用される用語「相補的」は、安定した二
本鎖構造を提供するのに十分な相補性の程度を示す。本
発明の実施態様では、より高度な相補性を有するポリヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーションによって、結合
パートナーを除去し得るように、ヘテロ二本鎖を使用す
るのが好ましい場合がある。
性を有する必要はない。約10−30％未満の塩基がミスマ
ッチであるとき、５個以上のヌクレオチドのループを無
視すれば、多くの場合、ヘテロ二本鎖で十分である。従
って、本願で使用される用語「相補的」は、安定した二
本鎖構造を提供するのに十分な相補性の程度を示す。本
発明の実施態様では、より高度な相補性を有するポリヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーションによって、結合
パートナーを除去し得るように、ヘテロ二本鎖を使用す
るのが好ましい場合がある。
アッセイに使用される固相は、微粒子または固体であ
り得、特に、種々の容器、例えば遠心分離用チューブ、
カラム、マイクロタイタプレートウェル、フィルター、
チュービングなどの固体壁表面であり得る。粒子が使用
される場合、粒子径は好ましくは約0.4から200ミクロン
の範囲であり、さらに好ましくは約0.8〜4.0ミクロンで
ある。粒子は、ラテックス、ポリスチレンまたはガラス
のような適切な素材であり得る。ポリスチレンビーズお
よびマイクロタイタプレートは、現在好ましい固体表面
である。固相に結合するパートナーは、周知の工程によ
り官能基を介して支持体表面に安定して結び付き得る。
り得、特に、種々の容器、例えば遠心分離用チューブ、
カラム、マイクロタイタプレートウェル、フィルター、
チュービングなどの固体壁表面であり得る。粒子が使用
される場合、粒子径は好ましくは約0.4から200ミクロン
の範囲であり、さらに好ましくは約0.8〜4.0ミクロンで
ある。粒子は、ラテックス、ポリスチレンまたはガラス
のような適切な素材であり得る。ポリスチレンビーズお
よびマイクロタイタプレートは、現在好ましい固体表面
である。固相に結合するパートナーは、周知の工程によ
り官能基を介して支持体表面に安定して結び付き得る。
標識オリゴヌクレオチドは化学合成によって適切に調
製され得る。適切な機能性を有する末端基を与えること
により、その機能性により種々の標識が結合され得る。
このようにして、配列との二本鎖の形成を阻害すること
なく種々の標識が結合され得る、カルボキシ、チオー
ル、アミン、ヒドラジンまたは他の機能性を得ることが
できる。アミンの使用は現在好適とされている（M.Urde
aら，Nuc Acids Res（1988）16:4937−56参照）。既に
述べたように、標識配列に相補的な配列と結合した複数
の標識を有する分子が得られる。あるいは、標識配列に
結合したリガンドを用いて、標識分析物複合体を与える
ためにリガンドに結合するための標識受容体を使用し得
る。
製され得る。適切な機能性を有する末端基を与えること
により、その機能性により種々の標識が結合され得る。
このようにして、配列との二本鎖の形成を阻害すること
なく種々の標識が結合され得る、カルボキシ、チオー
ル、アミン、ヒドラジンまたは他の機能性を得ることが
できる。アミンの使用は現在好適とされている（M.Urde
aら，Nuc Acids Res（1988）16:4937−56参照）。既に
述べたように、標識配列に相補的な配列と結合した複数
の標識を有する分子が得られる。あるいは、標識配列に
結合したリガンドを用いて、標識分析物複合体を与える
ためにリガンドに結合するための標識受容体を使用し得
る。
分析物の予測モルに対する捕捉プローブおよび標識プ
ローブの割合は、少なくとも化学量論的量であり、好ま
しくは過剰である。通常は2:1から10,000:1の範囲であ
る。各プローブの濃度は一般的に10-9から10-6Mの範
囲、試料の核酸の濃度は、10-21から1012Mの範囲であ
る。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的
に約10分から２時間を要し、多くは約15分以内に終了す
る。ハイブリダイゼーションは、やや高い温度で、一般
的には20℃から80℃の範囲で、さらに好ましくは35℃か
ら70℃の範囲で、特に好ましくは65℃で行われ得る。
ローブの割合は、少なくとも化学量論的量であり、好ま
しくは過剰である。通常は2:1から10,000:1の範囲であ
る。各プローブの濃度は一般的に10-9から10-6Mの範
囲、試料の核酸の濃度は、10-21から1012Mの範囲であ
る。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的
に約10分から２時間を要し、多くは約15分以内に終了す
る。ハイブリダイゼーションは、やや高い温度で、一般
的には20℃から80℃の範囲で、さらに好ましくは35℃か
ら70℃の範囲で、特に好ましくは65℃で行われ得る。
ハイブリダイゼーション反応は、通常水性溶媒中で、
好ましくは種々の添加物を含み得る緩衝水溶液中で行な
われる。使用され得る添加物は低濃度の界面活性剤（0.
1から１％）、塩、例えばクエン酸ナトリウム（0.017か
ら0.170M）、フィコール、ポリビニルピロリジン、キャ
リア核酸、キャリアタンパク質などが含まれる。非水性
溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、、アルコールおよびホルムアミドのような水性溶媒
に加えられ得る。これらの他の溶媒は約２から50％の範
囲の量で含まれ得る。
好ましくは種々の添加物を含み得る緩衝水溶液中で行な
われる。使用され得る添加物は低濃度の界面活性剤（0.
1から１％）、塩、例えばクエン酸ナトリウム（0.017か
ら0.170M）、フィコール、ポリビニルピロリジン、キャ
リア核酸、キャリアタンパク質などが含まれる。非水性
溶媒は、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、、アルコールおよびホルムアミドのような水性溶媒
に加えられ得る。これらの他の溶媒は約２から50％の範
囲の量で含まれ得る。
ハイブリダイゼーション媒体の緊縮性は、温度、塩濃
度、溶媒システムなどによって制御され得る。このよう
に、問題の配列の長さおよび性質によって、緊縮性は変
化する。
度、溶媒システムなどによって制御され得る。このよう
に、問題の配列の長さおよび性質によって、緊縮性は変
化する。
アッセイの分離工程で使用される操作は、固相の性質
に依存して変化する。粒子は遠心分離または濾過によ
り、適切に分離され、上澄を除去または分離する。粒子
がアッセイされる場合では、粒子は、通常１から５回、
適切な緩衝溶媒、例えば、SDSまたはNP40のような界面
活性剤を含むPBSなどで完全に洗浄される。分離手段が
壁または支持体である場合、上澄は分離または除去され
得、壁は粒子の場合に述べた方法と同じ方法で洗浄され
得る。
に依存して変化する。粒子は遠心分離または濾過によ
り、適切に分離され、上澄を除去または分離する。粒子
がアッセイされる場合では、粒子は、通常１から５回、
適切な緩衝溶媒、例えば、SDSまたはNP40のような界面
活性剤を含むPBSなどで完全に洗浄される。分離手段が
壁または支持体である場合、上澄は分離または除去され
得、壁は粒子の場合に述べた方法と同じ方法で洗浄され
得る。
適切なプライマーは当該分野の当業者に周知の方法、
例えば、クーロニングおよび適切な配列の制限、または
直接化学的な合成によって、調製され得る。例えば、こ
こに参考として援用されているS.A.Narangら，Meth Enz
ymol（1979）68:90および米国特許第4,356,270号に記載
のホスホトリエステル法を使用し得る。あるいは、ここ
に参考として援用されているE.L.Brownら，Meth Enzymo
l（1979）68:109に開示されているホスホジエステル法
を使用し得る。他の方法として、Beaucageら，Tetrahed
ron Lett（1981）22:1859−62に開示されているホスホ
ルアミダイト法および米国特許第4,458,066号の固体支
持体法がある。所望されれば、分光、光化学、生化学、
免疫化学または化学的な手段によって検出可能な取り込
み方法により、プライマーもまた標識され得る。例え
ば、プライマーは、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、
酵素（ELISAなどで通常使用されている）、ビオチン、
またはハプテン、または抗血清またはモノクローナル抗
体が使用可能なタンパク質が含まれ得る。標識がプライ
マーに直接結合する場合は、この標識は変性条件に耐え
るように選択されなければならない。
例えば、クーロニングおよび適切な配列の制限、または
直接化学的な合成によって、調製され得る。例えば、こ
こに参考として援用されているS.A.Narangら，Meth Enz
ymol（1979）68:90および米国特許第4,356,270号に記載
のホスホトリエステル法を使用し得る。あるいは、ここ
に参考として援用されているE.L.Brownら，Meth Enzymo
l（1979）68:109に開示されているホスホジエステル法
を使用し得る。他の方法として、Beaucageら，Tetrahed
ron Lett（1981）22:1859−62に開示されているホスホ
ルアミダイト法および米国特許第4,458,066号の固体支
持体法がある。所望されれば、分光、光化学、生化学、
免疫化学または化学的な手段によって検出可能な取り込
み方法により、プライマーもまた標識され得る。例え
ば、プライマーは、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、
酵素（ELISAなどで通常使用されている）、ビオチン、
またはハプテン、または抗血清またはモノクローナル抗
体が使用可能なタンパク質が含まれ得る。標識がプライ
マーに直接結合する場合は、この標識は変性条件に耐え
るように選択されなければならない。
分析物の鎖は、混入物質から分離されたときおよび
（所望されれば）固体支持体から外れたとき、さらなる
核酸鎖の合成のための鋳型として使用される。この合成
は、あらゆる適切な方法によっても行なわれ得る。反応
は、一般的に緩衝水溶液中、好ましくはpH7−９、さら
に好ましくは約８で行なわれる。好ましくは、モル過剰
の２つのオリゴヌクレオチドプライマー（クローニング
された核酸は、通常約1000:1プライマー／鋳型、および
ゲノムまたはウィルスの核酸は、通常108:1プライマ
ー：鋳型）を、分離した鋳型鎖を含む緩衝液に加える。
しかし、このプロセスが診断用に適用される場合は、相
補鎖の量はわかっていないこともあり得るので、相補鎖
の量に対するプライマーの量は正確には決定し得ないこ
とがわかる。しかし、実際には、増幅される配列が複雑
な長鎖の核酸鎖の混合物の中に存在する場合には、加え
られるプライマーの量は一般的に相補鎖（鋳型）の量に
対してモル過剰である。プロセスの効果性を改良するた
めには、大過剰が好ましい。
（所望されれば）固体支持体から外れたとき、さらなる
核酸鎖の合成のための鋳型として使用される。この合成
は、あらゆる適切な方法によっても行なわれ得る。反応
は、一般的に緩衝水溶液中、好ましくはpH7−９、さら
に好ましくは約８で行なわれる。好ましくは、モル過剰
の２つのオリゴヌクレオチドプライマー（クローニング
された核酸は、通常約1000:1プライマー／鋳型、および
ゲノムまたはウィルスの核酸は、通常108:1プライマ
ー：鋳型）を、分離した鋳型鎖を含む緩衝液に加える。
しかし、このプロセスが診断用に適用される場合は、相
補鎖の量はわかっていないこともあり得るので、相補鎖
の量に対するプライマーの量は正確には決定し得ないこ
とがわかる。しかし、実際には、増幅される配列が複雑
な長鎖の核酸鎖の混合物の中に存在する場合には、加え
られるプライマーの量は一般的に相補鎖（鋳型）の量に
対してモル過剰である。プロセスの効果性を改良するた
めには、大過剰が好ましい。
使用されるプライマーが、分析物ハイブリダイズ領域
と捕捉またはプローブ結合領域の間の転写を阻止する手
段を有していることは重要である。分析物とハイブリダ
イズする領域と捕捉またはプローブ結合領域を、ここに
記載する阻止リンカーによって結合することは現在好ま
れている。しかし、他の方法も適用される。例えば、選
択されたポリメラーゼの複製の継続を防ぐプローブセグ
メント、または結合部近くの塩基の誘導体を結合するい
かなるリンカーも使用され得る。
と捕捉またはプローブ結合領域の間の転写を阻止する手
段を有していることは重要である。分析物とハイブリダ
イズする領域と捕捉またはプローブ結合領域を、ここに
記載する阻止リンカーによって結合することは現在好ま
れている。しかし、他の方法も適用される。例えば、選
択されたポリメラーゼの複製の継続を防ぐプローブセグ
メント、または結合部近くの塩基の誘導体を結合するい
かなるリンカーも使用され得る。
デオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP、dCTP、dGTP
およびdTTPもまた適切な量で合成混合物に加え、得られ
た溶液を約90−100℃に約１から10分間、好ましくは１
から４分間加熱する。加熱後、プライマーのハイブリダ
イゼーションに適するように、この溶液を放冷して室温
に戻す。放冷混合物に重合剤を加え、この反応を当該分
野で周知の条件で実施する。合成反応は、室温から、そ
れより高い温度では重合剤が効果的に機能しなくなる温
度までの範囲で起こる。このように、例えば、E.coli D
NAポリメラーゼが重合剤として使用される場合は、最高
温度は一般的に約40℃よりも高温にはならない。最も好
適には、E.coliポリメラーゼを使用する反応は、室温で
起こる。より大きな緊縮性が要求される場合、この反応
は、温度安定性の酵素Taqポリメラーゼを高温で使用し
て行なわれる。
およびdTTPもまた適切な量で合成混合物に加え、得られ
た溶液を約90−100℃に約１から10分間、好ましくは１
から４分間加熱する。加熱後、プライマーのハイブリダ
イゼーションに適するように、この溶液を放冷して室温
に戻す。放冷混合物に重合剤を加え、この反応を当該分
野で周知の条件で実施する。合成反応は、室温から、そ
れより高い温度では重合剤が効果的に機能しなくなる温
度までの範囲で起こる。このように、例えば、E.coli D
NAポリメラーゼが重合剤として使用される場合は、最高
温度は一般的に約40℃よりも高温にはならない。最も好
適には、E.coliポリメラーゼを使用する反応は、室温で
起こる。より大きな緊縮性が要求される場合、この反応
は、温度安定性の酵素Taqポリメラーゼを高温で使用し
て行なわれる。
重合剤は、ヌクレオチド三リン酸からプライマー伸長
生成物の合成を達成するために機能するあらゆる化合物
であり得、または酵素を含むシステムであり得る。この
目的のために好ましい酵素は、例えば、E.coli DNAポリ
メラーゼＩ、E.coli DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグ
メント、T4 DNAポリメラーゼ、使用可能な他のDNAポリ
メラーゼ、逆転写酵素、およびTaqポリメラーゼのよう
な熱安定性酵素を含む他の酵素であって、各核酸鎖に相
補的なプライマー伸長生成物を形成するための適切な方
法でヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる。一
般的に、合成は各プライマーの３′末端から開始し、鋳
型鎖に沿って５′の方向へ合成が完了するまで進み、長
さの異なる分子を形成する。しかし、５′末端から合成
を始め、上述の工程と同じ工程を用いて逆方向に進む薬
剤も存在し得る：本発明の工程中におけるそのような薬
剤の使用は、本発明の範囲内にあると考えられる。
生成物の合成を達成するために機能するあらゆる化合物
であり得、または酵素を含むシステムであり得る。この
目的のために好ましい酵素は、例えば、E.coli DNAポリ
メラーゼＩ、E.coli DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグ
メント、T4 DNAポリメラーゼ、使用可能な他のDNAポリ
メラーゼ、逆転写酵素、およびTaqポリメラーゼのよう
な熱安定性酵素を含む他の酵素であって、各核酸鎖に相
補的なプライマー伸長生成物を形成するための適切な方
法でヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる。一
般的に、合成は各プライマーの３′末端から開始し、鋳
型鎖に沿って５′の方向へ合成が完了するまで進み、長
さの異なる分子を形成する。しかし、５′末端から合成
を始め、上述の工程と同じ工程を用いて逆方向に進む薬
剤も存在し得る：本発明の工程中におけるそのような薬
剤の使用は、本発明の範囲内にあると考えられる。
新しく合成された分析物−相補鎖と元の分析物核酸鎖
は、この工程の次の段階で使用される二本鎖分子を形成
する。次の段階では、二本鎖は、上述した工程のいずれ
かを用いて一本鎖分子を得るために分離される。
は、この工程の次の段階で使用される二本鎖分子を形成
する。次の段階では、二本鎖は、上述した工程のいずれ
かを用いて一本鎖分子を得るために分離される。
新しい核酸は一本鎖分子上で合成される。先に述べた
条件の下で反応が進行するために必要であれば、さらな
る重合剤、ヌクレオチドおよびプライマーが加えられ得
る。ここでも、合成はオリゴヌクレオチドプライマーの
一端から開始され、新たな核酸を産生するために鋳型の
一本鎖に沿って進む。この段階の後では、伸長生成物の
半分は、２つのプライマーと結合した特定の核酸配列か
らなっている。
条件の下で反応が進行するために必要であれば、さらな
る重合剤、ヌクレオチドおよびプライマーが加えられ得
る。ここでも、合成はオリゴヌクレオチドプライマーの
一端から開始され、新たな核酸を産生するために鋳型の
一本鎖に沿って進む。この段階の後では、伸長生成物の
半分は、２つのプライマーと結合した特定の核酸配列か
らなっている。
鎖分離および伸長生成物の合成の段階は、所望する量
の特定の核酸配列を産生するために、必要なだけ繰り返
される。以下でさらに詳しく述べられるように、産生さ
れる特定の核酸配列の量は、指数関数的に増加する。
の特定の核酸配列を産生するために、必要なだけ繰り返
される。以下でさらに詳しく述べられるように、産生さ
れる特定の核酸配列の量は、指数関数的に増加する。
所望されれば、組になったプライマーを使用して、２
つの段階で標的配列が増幅され得る。この改変は、反応
の特異性を増すための手段として使用され得る。PCRの
第１の段階は、「通常の」プライマー、即ち重合を阻害
しないプライマーを用いて実施され、第２段階では、本
発明の阻止プライマーを用いて実施される。プライマー
結合領域は、第２の組（阻止プライマー）が第１の組の
プライマー結合領域の間にある分析物配列の領域と結合
するように選択される（このようにして、第２の組の結
合領域が、もし存在していれば確実に増幅される）。図
２はそのような配置を図示する。分析物ポリヌクレオチ
ドおよびその相補体を、201および202で示す。分析物ポ
リヌクレオチドの一端にハイブリダイズしているもの
は、独自のハイブダイズ領域を有し、「テール」の共通
の配列を有する、捕捉プローブ203a、203bおよび203cで
ある。プライマー204aおよび204bは、便利なプライマー
で、PCR増幅の第１段階（任意）に使用される。プライ
マー205および209は、従来のプライマー結合領域によっ
て結合されている分析物および補体の領域をハイブリダ
イズする。プライマー205および209の各々は、阻止リン
カー207および210を有しており、これらはプライマーの
特定の結合パートナー領域である208および211の重合を
防ぐ。
つの段階で標的配列が増幅され得る。この改変は、反応
の特異性を増すための手段として使用され得る。PCRの
第１の段階は、「通常の」プライマー、即ち重合を阻害
しないプライマーを用いて実施され、第２段階では、本
発明の阻止プライマーを用いて実施される。プライマー
結合領域は、第２の組（阻止プライマー）が第１の組の
プライマー結合領域の間にある分析物配列の領域と結合
するように選択される（このようにして、第２の組の結
合領域が、もし存在していれば確実に増幅される）。図
２はそのような配置を図示する。分析物ポリヌクレオチ
ドおよびその相補体を、201および202で示す。分析物ポ
リヌクレオチドの一端にハイブリダイズしているもの
は、独自のハイブダイズ領域を有し、「テール」の共通
の配列を有する、捕捉プローブ203a、203bおよび203cで
ある。プライマー204aおよび204bは、便利なプライマー
で、PCR増幅の第１段階（任意）に使用される。プライ
マー205および209は、従来のプライマー結合領域によっ
て結合されている分析物および補体の領域をハイブリダ
イズする。プライマー205および209の各々は、阻止リン
カー207および210を有しており、これらはプライマーの
特定の結合パートナー領域である208および211の重合を
防ぐ。
増幅工程は、ポリヌクレオチドの検出可能な量が一度
蓄積されれば、いつでも終結され得る。一般的に、好ま
しい検出手段は、増幅反応混合物に存在する標的配列の
有無および／または量を決定するために使用される。試
料中の標的配列の存在は、一般的に標識プローブによる
結合の有無によって決定される。本発明の１つの実施態
様では、分析物コピー鎖および／または分析物相補鎖中
に存在する配列と相補的な、標識オリゴヌクレオチドが
得られる。この実施態様では、分析物コピー／相補二本
鎖は変性され、プローブが加えられ、プローブ−鎖複合
体は非結合プローブから分離され、標識が検出される。
あるいは、第１または第２のプライマーは、それに結合
した第３の結合パートナーを搬送し得る。第３の結合パ
ートナーは、標識に付いた第４の結合パートナーに結合
し得る。好ましい実施態様では、第３および第４の結合
パートナーは相補的オリゴヌクレオチドである：標識プ
ローブは、分析物コピーまたは相補的配列にハイブリダ
イズしない第１または第２のプライマーの伸長物にハイ
ブリダイズする。分離は、例えばゲルクロマトグラフィ
ーなどの従来の方法で行なわれ得る。しかし、第１また
は第２のプライマーに結合した第５番目の特定の結合パ
ートナーと、支持体に結合した第６番目の結合パートナ
ーを結び付けることによって、二本鎖になった生成物を
分離することが現在行われている。この現在好適な第５
と第６の結合パートナーは、やはり相補的オリゴヌクレ
オチド配列を有している。
蓄積されれば、いつでも終結され得る。一般的に、好ま
しい検出手段は、増幅反応混合物に存在する標的配列の
有無および／または量を決定するために使用される。試
料中の標的配列の存在は、一般的に標識プローブによる
結合の有無によって決定される。本発明の１つの実施態
様では、分析物コピー鎖および／または分析物相補鎖中
に存在する配列と相補的な、標識オリゴヌクレオチドが
得られる。この実施態様では、分析物コピー／相補二本
鎖は変性され、プローブが加えられ、プローブ−鎖複合
体は非結合プローブから分離され、標識が検出される。
あるいは、第１または第２のプライマーは、それに結合
した第３の結合パートナーを搬送し得る。第３の結合パ
ートナーは、標識に付いた第４の結合パートナーに結合
し得る。好ましい実施態様では、第３および第４の結合
パートナーは相補的オリゴヌクレオチドである：標識プ
ローブは、分析物コピーまたは相補的配列にハイブリダ
イズしない第１または第２のプライマーの伸長物にハイ
ブリダイズする。分離は、例えばゲルクロマトグラフィ
ーなどの従来の方法で行なわれ得る。しかし、第１また
は第２のプライマーに結合した第５番目の特定の結合パ
ートナーと、支持体に結合した第６番目の結合パートナ
ーを結び付けることによって、二本鎖になった生成物を
分離することが現在行われている。この現在好適な第５
と第６の結合パートナーは、やはり相補的オリゴヌクレ
オチド配列を有している。
標識の性質に依存して、標識の存在を検出するための
種々の技術が使用され得る。蛍光体の場合は、多数の異
なる蛍光光度計が使用できる。化学発光体の場合は、ル
ミノメーターまたはフィルムが使用できる。酵素には、
蛍光体、化学発光体または着色生成物が提供され、蛍光
的、発光的、分光光度的または可視的に検出され得る。
免疫アッセイに使用される様々な標識および免疫アッセ
イに適用される技術は、目的のアッセイと共に使用され
得る。
種々の技術が使用され得る。蛍光体の場合は、多数の異
なる蛍光光度計が使用できる。化学発光体の場合は、ル
ミノメーターまたはフィルムが使用できる。酵素には、
蛍光体、化学発光体または着色生成物が提供され、蛍光
的、発光的、分光光度的または可視的に検出され得る。
免疫アッセイに使用される様々な標識および免疫アッセ
イに適用される技術は、目的のアッセイと共に使用され
得る。
本発明の増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイを
実施するためのキットは、少なくとも以下の試薬の組み
合わせからなる：捕捉プローブ、捕捉プローブを結合で
きる第１支持体、および分析物ポリヌクレオチドに特異
的な第１および第２のプライマー。キットはまた、好ま
しくは第１または第２のプライマーと結合できる標識プ
ローブ、および増幅の前に結合した分析物を固体表面か
ら外すための除去手段（例えば、除去用オリゴヌクレオ
チド）を含む。これらの試薬は、典型的にはキット内の
別々の容器に用意される。キットはまた、E.coli DNAポ
リメラーゼＩ（Klenowフラグメント）、Taqポリメラー
ゼなどのようなDNAポリメラーゼ、分析物を変性する変
性剤、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄液、酵素基
質、陰性および陽性コントロールおよびアッセイを実施
するための指示書を含み得る。
実施するためのキットは、少なくとも以下の試薬の組み
合わせからなる：捕捉プローブ、捕捉プローブを結合で
きる第１支持体、および分析物ポリヌクレオチドに特異
的な第１および第２のプライマー。キットはまた、好ま
しくは第１または第２のプライマーと結合できる標識プ
ローブ、および増幅の前に結合した分析物を固体表面か
ら外すための除去手段（例えば、除去用オリゴヌクレオ
チド）を含む。これらの試薬は、典型的にはキット内の
別々の容器に用意される。キットはまた、E.coli DNAポ
リメラーゼＩ（Klenowフラグメント）、Taqポリメラー
ゼなどのようなDNAポリメラーゼ、分析物を変性する変
性剤、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄液、酵素基
質、陰性および陽性コントロールおよびアッセイを実施
するための指示書を含み得る。
C.実施例 以下に示す実施例は、当該分野の当業者のためのさら
なるガイドとして提供されるものであって、いかなる点
においても本発明を限定することを意図するものではな
い。
なるガイドとして提供されるものであって、いかなる点
においても本発明を限定することを意図するものではな
い。
実施例１ （阻止リンカーの調整） ここに記載するリンカーは、分析物とハイブリダイズ
する領域と、本発明のプローブおよびプライマーの捕捉
またはプローブ結合領域とを結びつけ、使用するヌクレ
オチドポリメラーゼが連鎖を読み過ごしできないように
するために使用される。複製は阻止リンカーの位置で停
止する。
する領域と、本発明のプローブおよびプライマーの捕捉
またはプローブ結合領域とを結びつけ、使用するヌクレ
オチドポリメラーゼが連鎖を読み過ごしできないように
するために使用される。複製は阻止リンカーの位置で停
止する。
このセクションでは下記の省略を使用する:DMT＝ジメ
トキシトリチル;T＝デオキシチミジン;DMF＝ジメチルホ
ルムアミド;BDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリル;C＝デオ
キシシチジン;TLC＝薄層クロマトグラフィー;DMAP＝N,N
−ジ−メチルアミノピリジン;THF＝テトラヒドロフラ
ン;DIPEA＝ジ−イソプロピルエチルアミン;LEV＝レブリ
ンエステル;DCA＝ジ−クロロ酢酸;DCC＝ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド;DCHU＝ジシクロヘキシルウレア;TEA
＝トリエチルアミン;TMS＝トリメチルシリル;FMOC＝９
−フルオレニルメトキシカルボニル。
トキシトリチル;T＝デオキシチミジン;DMF＝ジメチルホ
ルムアミド;BDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリル;C＝デオ
キシシチジン;TLC＝薄層クロマトグラフィー;DMAP＝N,N
−ジ−メチルアミノピリジン;THF＝テトラヒドロフラ
ン;DIPEA＝ジ−イソプロピルエチルアミン;LEV＝レブリ
ンエステル;DCA＝ジ−クロロ酢酸;DCC＝ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド;DCHU＝ジシクロヘキシルウレア;TEA
＝トリエチルアミン;TMS＝トリメチルシリル;FMOC＝９
−フルオレニルメトキシカルボニル。
A.阻止リンカーの合成： ５−DMT−Ｔ−OH（27.3g,50mmole）およびイミダゾー
ル（10g、150mmole）をDMF200mLで共沸した。DMF250mL
中に残渣を溶解し、BDMSクロリド（75mmol）を加えた。
この反応混合物を、20℃で18時間撹拌した。メタノール
（50mL）を加え、30分後に溶媒を減圧で除去した。この
油性残渣を酢酸エチル50mL中に溶解させ、５％NaHCO3水
溶液（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）で
有機相を抽出し、最後に固体NaSO4上で乾燥した。この
溶媒を減圧で除去し、35g（50mmole）の５′−DMT−
３′BDMS Tを得た（収率100％）。この物質を、さらな
る精製をせずに使用した。
ル（10g、150mmole）をDMF200mLで共沸した。DMF250mL
中に残渣を溶解し、BDMSクロリド（75mmol）を加えた。
この反応混合物を、20℃で18時間撹拌した。メタノール
（50mL）を加え、30分後に溶媒を減圧で除去した。この
油性残渣を酢酸エチル50mL中に溶解させ、５％NaHCO3水
溶液（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）で
有機相を抽出し、最後に固体NaSO4上で乾燥した。この
溶媒を減圧で除去し、35g（50mmole）の５′−DMT−
３′BDMS Tを得た（収率100％）。この物質を、さらな
る精製をせずに使用した。
トリアゾール（25.6g）を400mLのCH3CN中に０℃で懸
濁し、POCl3（8mL）をすばやく撹拌しながら加えた。そ
の後、トリエチルアミン（60mL）を15分に渡って、０℃
で30分間撹拌したスラリーに滴下して加えた。CH3CN 10
0mLに溶解した５′−DMT−３′BDMS T（クルードで25mm
ole）を、０℃で撹拌したスラリーに滴下して加えた。
氷水浴を取り除き、20℃で１時間撹拌を続けた。この反
応混合物を、酢酸エチル800mLで希釈し、有機相を５％N
aHCO3（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）
で抽出した。固体Na2SO4上で有機相を乾燥した後、溶媒
を減圧で除去した。得られた残渣を、トルエン（400m
L）およびCH3CN（400mL）と共に共沸し、５′−DMT−
３′−BDMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−デオ
キシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノンを定量的
な収量で白色泡沫として得た。この物質を、さらなる精
製を加えずに使用した。
濁し、POCl3（8mL）をすばやく撹拌しながら加えた。そ
の後、トリエチルアミン（60mL）を15分に渡って、０℃
で30分間撹拌したスラリーに滴下して加えた。CH3CN 10
0mLに溶解した５′−DMT−３′BDMS T（クルードで25mm
ole）を、０℃で撹拌したスラリーに滴下して加えた。
氷水浴を取り除き、20℃で１時間撹拌を続けた。この反
応混合物を、酢酸エチル800mLで希釈し、有機相を５％N
aHCO3（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）
で抽出した。固体Na2SO4上で有機相を乾燥した後、溶媒
を減圧で除去した。得られた残渣を、トルエン（400m
L）およびCH3CN（400mL）と共に共沸し、５′−DMT−
３′−BDMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−デオ
キシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノンを定量的
な収量で白色泡沫として得た。この物質を、さらなる精
製を加えずに使用した。
６−アミノヘキサノール（11.7g、100mmole）のCH3CN
溶液400mLに、CH3CN 100mLに溶解させた５′−DMT−
３′−BDMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−２−
デオキシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノン（8.
7g,12mmole）を滴下して加え、この反応混合物を20℃で
撹拌した。反応の進行をTLC（30分毎）でモニターし、
出発物質が完全になくなったとき（通常１−２時間以
内）、反応混合物を酢酸エチル500mLで希釈し、これを
上記に記載したように５％NaHCO3水溶液および80％NaCl
飽和水溶液で抽出した。Na2SO4上で有機相を乾燥した
後、溶媒を減圧で除去して、7.0g（9.2mmole）の生成物
５′−DMT−３′−BDMS−５−メチル−N4−６−ヒドロ
キシヘキシルデオキシシチジンを得た（収率77％）。こ
の物質を、さらなる精製を加えずに使用した。
溶液400mLに、CH3CN 100mLに溶解させた５′−DMT−
３′−BDMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−２−
デオキシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノン（8.
7g,12mmole）を滴下して加え、この反応混合物を20℃で
撹拌した。反応の進行をTLC（30分毎）でモニターし、
出発物質が完全になくなったとき（通常１−２時間以
内）、反応混合物を酢酸エチル500mLで希釈し、これを
上記に記載したように５％NaHCO3水溶液および80％NaCl
飽和水溶液で抽出した。Na2SO4上で有機相を乾燥した
後、溶媒を減圧で除去して、7.0g（9.2mmole）の生成物
５′−DMT−３′−BDMS−５−メチル−N4−６−ヒドロ
キシヘキシルデオキシシチジンを得た（収率77％）。こ
の物質を、さらなる精製を加えずに使用した。
５′−DMT−３′−BDMS−５−メチル−N4−６−ヒド
ロキシヘキシルデオキシシチジン（7g,9.2mmole）のTHF
溶液100mLに、THF 100mLに溶解した（CH3COCH2CH2CO）2
O（50mmole）を加え、その後、2,6−ルチジン/THFに溶
解した6.5％DMAPを10mL加えた。この反応混合物を30分
間撹拌した。TLC分析によって、出発物質が完全になく
なったことがわかった。この反応混合物を酢酸エチル70
0mLで希釈し、これを上記のように５％NaHCO3水溶液（3
x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）で抽出し
た。固体Na2SO4上で乾燥した後、溶媒を除去し、残渣
を、トルエン（200mL）およびCH3CN（200mL）と共に共
沸して、12.3gの粗生成物を得た。
ロキシヘキシルデオキシシチジン（7g,9.2mmole）のTHF
溶液100mLに、THF 100mLに溶解した（CH3COCH2CH2CO）2
O（50mmole）を加え、その後、2,6−ルチジン/THFに溶
解した6.5％DMAPを10mL加えた。この反応混合物を30分
間撹拌した。TLC分析によって、出発物質が完全になく
なったことがわかった。この反応混合物を酢酸エチル70
0mLで希釈し、これを上記のように５％NaHCO3水溶液（3
x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）で抽出し
た。固体Na2SO4上で乾燥した後、溶媒を除去し、残渣
を、トルエン（200mL）およびCH3CN（200mL）と共に共
沸して、12.3gの粗生成物を得た。
この粗生成物を、THF 100mLに溶解し、1.1Mテトラブ
チルアンモニウムフロリドのTHF溶液10mLを加えた。反
応の進行をTLCでモニターした；通常は30分以内に終了
するが、これより長時間要する場合もある。出発物質が
完全になくなってから、反応混合物を酢酸エチル700mL
で希釈し、これを上記のようにNaHCO3およびNaCl溶液で
抽出した。溶媒を除去し、8.5gの５′−DMT−５−メチ
ル−N4（Ｏ−レブニリル−６−オキシヘキシル）−２′
−デオキシシチジン粗生成物を得た。この物質をシリカ
ゲルクロマトグラフィーにかけた。精製された生成物
を、CH2Cl2中４％のメタノールで抽出し、5.0gの薄茶色
の泡沫を得た（6.7mmole;収率73％）。
チルアンモニウムフロリドのTHF溶液10mLを加えた。反
応の進行をTLCでモニターした；通常は30分以内に終了
するが、これより長時間要する場合もある。出発物質が
完全になくなってから、反応混合物を酢酸エチル700mL
で希釈し、これを上記のようにNaHCO3およびNaCl溶液で
抽出した。溶媒を除去し、8.5gの５′−DMT−５−メチ
ル−N4（Ｏ−レブニリル−６−オキシヘキシル）−２′
−デオキシシチジン粗生成物を得た。この物質をシリカ
ゲルクロマトグラフィーにかけた。精製された生成物
を、CH2Cl2中４％のメタノールで抽出し、5.0gの薄茶色
の泡沫を得た（6.7mmole;収率73％）。
シリカ精製した５′−DMT−５−メチル−N4（Ｏ−レ
ブニリル−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシシチ
ジン（7.7mmole）をCH3CNで２回共沸した。得られた乾
燥パウダーを、フラスコ中アルゴン雰囲気下で、DIPEA
4.9mLを含むCH2Cl2 70mLに溶解した。０℃に冷却した
後、N,N−ジイソプロピル−アミノメトキシクロロホス
フィン1.65mL（8.5mmole）を注射器で加え、この混合物
を０℃で30分間撹拌した。酢酸エチル400mLで希釈した
後、有機相を80％NaCl飽和水溶液（400mL）で４回洗浄
し、その後、固体Na2SO4上で乾燥して濾過した。この溶
媒を減圧で除去し、得られた残渣をトルエンで２回共沸
して、オイルを得た。このオイルをトルエン30mLに溶解
し、冷却ヘキサン400mL（約−20℃）中に滴下して加え
た。この沈澱物を、濾過してすばやく集め、減圧で18時
間乾燥して、5.45gのホスホルアミダイトを得た（6.0mm
ole;収率78％）。
ブニリル−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシシチ
ジン（7.7mmole）をCH3CNで２回共沸した。得られた乾
燥パウダーを、フラスコ中アルゴン雰囲気下で、DIPEA
4.9mLを含むCH2Cl2 70mLに溶解した。０℃に冷却した
後、N,N−ジイソプロピル−アミノメトキシクロロホス
フィン1.65mL（8.5mmole）を注射器で加え、この混合物
を０℃で30分間撹拌した。酢酸エチル400mLで希釈した
後、有機相を80％NaCl飽和水溶液（400mL）で４回洗浄
し、その後、固体Na2SO4上で乾燥して濾過した。この溶
媒を減圧で除去し、得られた残渣をトルエンで２回共沸
して、オイルを得た。このオイルをトルエン30mLに溶解
し、冷却ヘキサン400mL（約−20℃）中に滴下して加え
た。この沈澱物を、濾過してすばやく集め、減圧で18時
間乾燥して、5.45gのホスホルアミダイトを得た（6.0mm
ole;収率78％）。
B.他の阻止リンカーの合成 上記のように調製された５′−DMT−３−BDMS−５−
メチル−N4−６−ヒドロキシヘキシルデオキシシチジン
（34g,50mmole）のCH2Cl2溶液200mLに、1.5gのN,N−ジ
−メチルアミノピリジンおよびトリメチルアミン25mLを
加えた。この溶液に０℃で、CH2Cl2（100mL）に溶解し
たDMT−Cl（75mmole,25.5g）を滴下して加えた。この反
応混合物を１時間撹拌した。分析によると、出発物質は
完全になくなった。その後、MeOH 50mLを加えた。30分
後に、反応混合物を酢酸エチル800mLで希釈し、これを
５％NaHCO3（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500
mL）で上記のように抽出した。固体Na2SO4上で乾燥した
後、溶媒を減圧で除去し、残渣を、トルエン（200mL）
およびCH3CH（200mL）と共に共沸した。
メチル−N4−６−ヒドロキシヘキシルデオキシシチジン
（34g,50mmole）のCH2Cl2溶液200mLに、1.5gのN,N−ジ
−メチルアミノピリジンおよびトリメチルアミン25mLを
加えた。この溶液に０℃で、CH2Cl2（100mL）に溶解し
たDMT−Cl（75mmole,25.5g）を滴下して加えた。この反
応混合物を１時間撹拌した。分析によると、出発物質は
完全になくなった。その後、MeOH 50mLを加えた。30分
後に、反応混合物を酢酸エチル800mLで希釈し、これを
５％NaHCO3（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500
mL）で上記のように抽出した。固体Na2SO4上で乾燥した
後、溶媒を減圧で除去し、残渣を、トルエン（200mL）
およびCH3CH（200mL）と共に共沸した。
この粗生成物を、THF 200mLに溶解し、1.1Mテトラブ
チルアンモニウムフロリドのTHF溶液200mLを加えた。反
応の進行をTLCでモニターした；通常は30分以内に終了
するが、これより長時間を要する場合もある。出発物質
が完全になくなってから、反応混合物を酢酸エチル700m
Lで希釈し、これを上記のようにNaHCO3およびNaCl溶液
で抽出した。溶媒を除去して、36gの５′−DMT−５−メ
チル−N4（Ｏ−DMT−６−オキシヘキシル）デオキシシ
チジン粗生成物を得た。この物質をシリカゲルクロマト
グラフィーにかけ、精製された生成物を、CH2Cl2中２−
４％のメタノール溶出で分離し、32.7gの純物質を得た
（34mmole;収率は５′−DMT−Ｔ−OH換算で:69％）。
チルアンモニウムフロリドのTHF溶液200mLを加えた。反
応の進行をTLCでモニターした；通常は30分以内に終了
するが、これより長時間を要する場合もある。出発物質
が完全になくなってから、反応混合物を酢酸エチル700m
Lで希釈し、これを上記のようにNaHCO3およびNaCl溶液
で抽出した。溶媒を除去して、36gの５′−DMT−５−メ
チル−N4（Ｏ−DMT−６−オキシヘキシル）デオキシシ
チジン粗生成物を得た。この物質をシリカゲルクロマト
グラフィーにかけ、精製された生成物を、CH2Cl2中２−
４％のメタノール溶出で分離し、32.7gの純物質を得た
（34mmole;収率は５′−DMT−Ｔ−OH換算で:69％）。
シリカ精製した５′−DMT−５−メチル−N4（Ｏ−DMT
−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシシチジン（34
mmole）をCH3CNで２回共沸した。得られた乾燥パウダー
を、フラスコ中アルゴン雰囲気下で、DIPEA 7.5mLを含
むCH2Cl2 100mLに溶解した。０℃に冷却した後、N,N−
ジイソプロピル−アミノメトキシクロロホスフィン7.37
mL（38mmole）を注射器で加え、この混合物を０℃で30
分間撹拌した。酢酸エチル800mLで希釈した後、有機相
を80％NaCl飽和水溶液（800mL）で４回洗浄し、その
後、固体Na2SO4上で乾燥して濾過した。この溶媒を減圧
で除去し、得られた残渣をトルエンで２回共沸して、オ
イルを得た。このオイルをトルエン80mLに溶解し、冷却
ヘキサン700mL（約−20℃）中に滴下して加えた。この
沈澱物を、濾過してすばやく集め、減圧で18時間乾燥し
て、31.8gのホスホルアミダイトを得た（28.7mmole;収
率84％）。
−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシシチジン（34
mmole）をCH3CNで２回共沸した。得られた乾燥パウダー
を、フラスコ中アルゴン雰囲気下で、DIPEA 7.5mLを含
むCH2Cl2 100mLに溶解した。０℃に冷却した後、N,N−
ジイソプロピル−アミノメトキシクロロホスフィン7.37
mL（38mmole）を注射器で加え、この混合物を０℃で30
分間撹拌した。酢酸エチル800mLで希釈した後、有機相
を80％NaCl飽和水溶液（800mL）で４回洗浄し、その
後、固体Na2SO4上で乾燥して濾過した。この溶媒を減圧
で除去し、得られた残渣をトルエンで２回共沸して、オ
イルを得た。このオイルをトルエン80mLに溶解し、冷却
ヘキサン700mL（約−20℃）中に滴下して加えた。この
沈澱物を、濾過してすばやく集め、減圧で18時間乾燥し
て、31.8gのホスホルアミダイトを得た（28.7mmole;収
率84％）。
５′−DMT−Ｔ−OH（16.4,30mmole）を乾燥CH3CN 200
mL中に溶解し、１−（TMS）イミダゾール（14.6mL,100m
mole）を加えた。60分後、溶媒を減圧で除去した。この
油性の残渣を、酢酸エチル700mL中に溶解し、有機相を
５％NaHCO3水溶液（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶
液（500mL）で抽出し、最後に固体Na2SO4上で乾燥し
た。溶媒を減圧で除去し、５′−DMT−３′−TMS−Ｔ
（収率100％）を得た。この物質を、さらなる精製をせ
ずに使用した。
mL中に溶解し、１−（TMS）イミダゾール（14.6mL,100m
mole）を加えた。60分後、溶媒を減圧で除去した。この
油性の残渣を、酢酸エチル700mL中に溶解し、有機相を
５％NaHCO3水溶液（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶
液（500mL）で抽出し、最後に固体Na2SO4上で乾燥し
た。溶媒を減圧で除去し、５′−DMT−３′−TMS−Ｔ
（収率100％）を得た。この物質を、さらなる精製をせ
ずに使用した。
トリアゾール（37.8g）を450mLのCH3CN中（０℃）で
懸濁し、POCl3（12mL）をすばやく撹拌しながら加え
た。トリエチルアミン（90mL）を、０℃で30分間撹拌し
たスラリーに15分に渡って滴下して加えた。CH3CN 100m
Lに溶解した５′−DMT−３′−TMS−Ｔ（クルードで30m
mole）を、０℃で撹拌したスラリーに滴下して加えた。
氷水浴を取り除き、20℃で１時間撹拌を続けた。この反
応混合物を、酢酸エチル800mLで希釈し、有機相を５％N
aHCO3（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）
で抽出した。固体Na2SO4上で有機相を乾燥した後、溶媒
を減圧で除去した。得られた残渣を、トルエン（400m
L）およびCH3CN（400mL）と共に共沸し、５′−DMT−
３′−TMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−２−
デオキシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノンを定
量的な収量で白色泡沫として得た。この物質を、さらな
る精製を加えずに使用した。
懸濁し、POCl3（12mL）をすばやく撹拌しながら加え
た。トリエチルアミン（90mL）を、０℃で30分間撹拌し
たスラリーに15分に渡って滴下して加えた。CH3CN 100m
Lに溶解した５′−DMT−３′−TMS−Ｔ（クルードで30m
mole）を、０℃で撹拌したスラリーに滴下して加えた。
氷水浴を取り除き、20℃で１時間撹拌を続けた。この反
応混合物を、酢酸エチル800mLで希釈し、有機相を５％N
aHCO3（2x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500mL）
で抽出した。固体Na2SO4上で有機相を乾燥した後、溶媒
を減圧で除去した。得られた残渣を、トルエン（400m
L）およびCH3CN（400mL）と共に共沸し、５′−DMT−
３′−TMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−２−
デオキシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノンを定
量的な収量で白色泡沫として得た。この物質を、さらな
る精製を加えずに使用した。
６−アミノヘキサノール（23g、200mmole）のCH3CN溶
液400mLに、CH3CN 100mLに溶解させた５′−DMT−３′
−TMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−２−デオ
キシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノン（20g,30
mmole）を滴下して加え、反応混合物を20℃で撹拌し
た。反応の進行をTLC（30分毎）でモニターし、出発物
質が完全になくなってから（通常１−２時間以内）、こ
の反応混合物を酢酸エチル800mLで希釈し、これを上記
に記載したように５％NaHCO3水溶液および80％NaCl飽和
水溶液で抽出した。Na2SO4上で有機相を乾燥した後、溶
媒を減圧で除去して、20.3g（約30mmole）の生成物５′
−DMT−３′−TMS−５−メチル−N4−６−ヒドロキシヘ
キシルデオキシシチジンを得た。この物質を、さらなる
精製を加えずに使用した。
液400mLに、CH3CN 100mLに溶解させた５′−DMT−３′
−TMS−５−メチル−４−トリアゾルβ−Ｄ−２−デオ
キシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノン（20g,30
mmole）を滴下して加え、反応混合物を20℃で撹拌し
た。反応の進行をTLC（30分毎）でモニターし、出発物
質が完全になくなってから（通常１−２時間以内）、こ
の反応混合物を酢酸エチル800mLで希釈し、これを上記
に記載したように５％NaHCO3水溶液および80％NaCl飽和
水溶液で抽出した。Na2SO4上で有機相を乾燥した後、溶
媒を減圧で除去して、20.3g（約30mmole）の生成物５′
−DMT−３′−TMS−５−メチル−N4−６−ヒドロキシヘ
キシルデオキシシチジンを得た。この物質を、さらなる
精製を加えずに使用した。
５′−DMT−３′−TMS−５−メチル−N4（６−ヒドロ
キシヘキシル）デオキシシチジンのメタノール溶液25mL
に、濃NH4OH水溶液25mLを加え、反応混合物を閉鎖した
丸底フラスコ内で１時間撹拌した。この溶媒をその後減
圧で除去し、エタノール1x200mL、トルエン1x100mLおよ
びCH3CN 1x100mLと共に共沸し、５′−DMT−５−メチル
−N4（６−ヒドロキシヘキシル）デオキシシチジンを定
量的な収量で得た。この物質を、さらなる精製を加えず
に使用した。この物質をCH2Cl2 200mLに溶解した。ピリ
ジン4mLを加え、次にCH2Cl2（50mL）に溶解したFMOC−C
l（7.8g,30mmole）を滴下して加えた。この反応混合物
を30分間撹拌した。分析によって、出発物質が完全にな
くなったことがわかった。この反応混合物を、酢酸エチ
ル500mLで希釈し、これを上記で記載したように５％NaH
CO3水溶液（3x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500m
L）で抽出した。固体Na2SO4上で乾燥した後、溶媒を除
去し、残渣を、トルエン（200mL）およびCH3CN（200m
L）と共に共沸して、23.7gの粗生成物を得た。この粗生
成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにかけた。精製
された生成物を、CH2Cl2中約４％メタノールで抽出し、
13.3g（15.3mmole）の純物質５′−DMT−５−メチル−N
4（Ｏ−FMOC−６−オキシヘキシル）デオキシシチジン
を得た。（５′−DMT−TOH換算で収率50％）。
キシヘキシル）デオキシシチジンのメタノール溶液25mL
に、濃NH4OH水溶液25mLを加え、反応混合物を閉鎖した
丸底フラスコ内で１時間撹拌した。この溶媒をその後減
圧で除去し、エタノール1x200mL、トルエン1x100mLおよ
びCH3CN 1x100mLと共に共沸し、５′−DMT−５−メチル
−N4（６−ヒドロキシヘキシル）デオキシシチジンを定
量的な収量で得た。この物質を、さらなる精製を加えず
に使用した。この物質をCH2Cl2 200mLに溶解した。ピリ
ジン4mLを加え、次にCH2Cl2（50mL）に溶解したFMOC−C
l（7.8g,30mmole）を滴下して加えた。この反応混合物
を30分間撹拌した。分析によって、出発物質が完全にな
くなったことがわかった。この反応混合物を、酢酸エチ
ル500mLで希釈し、これを上記で記載したように５％NaH
CO3水溶液（3x500mL）および80％NaCl飽和水溶液（500m
L）で抽出した。固体Na2SO4上で乾燥した後、溶媒を除
去し、残渣を、トルエン（200mL）およびCH3CN（200m
L）と共に共沸して、23.7gの粗生成物を得た。この粗生
成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにかけた。精製
された生成物を、CH2Cl2中約４％メタノールで抽出し、
13.3g（15.3mmole）の純物質５′−DMT−５−メチル−N
4（Ｏ−FMOC−６−オキシヘキシル）デオキシシチジン
を得た。（５′−DMT−TOH換算で収率50％）。
シリカ精製した５′−DMT−５−メチル−N4（Ｏ−FMO
C−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシシチジンを
（15.3mmole）をCH3CNで２回共沸した。得られた乾燥パ
ウダーを、フラスコ中アルゴン雰囲気下で、DIPEA 4.1m
Lを含むCH2Cl2溶液60mLに溶解した。０℃に冷却した
後、N,N−ジイソプロピル−アミノメトキシクロロホス
フィン3.19mL（16.5mmole）を注射器で加え、この混合
物を０℃で30分間撹拌した。酢酸エチル400mLで希釈し
た後、有機相を80％NaCl飽和水溶液（400mL）で４回洗
浄し、その後、固体Na2SO4上で乾燥して濾過した。この
溶媒を減圧で除去し、得られた残渣を２回トルエンで共
沸して、オイルを得た。このオイルをトルエン50mLに溶
解し、冷却ヘキサン400mL（約−20℃）中に滴下して加
えた。この沈澱物を、濾過してすばやく集め、減圧で18
時間乾燥して、12.15gのホスホルアミダイト（11.8mmol
e;収率77％）を得た。固相合成中のＯ−FMOC基の脱離:t
−ブチルアミン／ピリジン（1:10 V/V）、20℃で１時
間。Ｏ−レブニリル基の脱離：ピリジン／氷酢酸（4:1
V/V）中の0.5Mヒドラジン水和物、20℃で15分間。
C−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシシチジンを
（15.3mmole）をCH3CNで２回共沸した。得られた乾燥パ
ウダーを、フラスコ中アルゴン雰囲気下で、DIPEA 4.1m
Lを含むCH2Cl2溶液60mLに溶解した。０℃に冷却した
後、N,N−ジイソプロピル−アミノメトキシクロロホス
フィン3.19mL（16.5mmole）を注射器で加え、この混合
物を０℃で30分間撹拌した。酢酸エチル400mLで希釈し
た後、有機相を80％NaCl飽和水溶液（400mL）で４回洗
浄し、その後、固体Na2SO4上で乾燥して濾過した。この
溶媒を減圧で除去し、得られた残渣を２回トルエンで共
沸して、オイルを得た。このオイルをトルエン50mLに溶
解し、冷却ヘキサン400mL（約−20℃）中に滴下して加
えた。この沈澱物を、濾過してすばやく集め、減圧で18
時間乾燥して、12.15gのホスホルアミダイト（11.8mmol
e;収率77％）を得た。固相合成中のＯ−FMOC基の脱離:t
−ブチルアミン／ピリジン（1:10 V/V）、20℃で１時
間。Ｏ−レブニリル基の脱離：ピリジン／氷酢酸（4:1
V/V）中の0.5Mヒドラジン水和物、20℃で15分間。
実施例２ （Ｂ型肝炎ウイルスのためのアッセイ） A.標準分析物HBV DNA EcoR Iで直線化したプラスミドpBR325のEcoR Iの部位
にクローンニングし、正常なヒト血清中に希釈した、3.
2kbの全HBVゲノムを含むプラスミドpHE63を、標準分析
物として用いた。図１において、分析物を１で示す。
にクローンニングし、正常なヒト血清中に希釈した、3.
2kbの全HBVゲノムを含むプラスミドpHE63を、標準分析
物として用いた。図１において、分析物を１で示す。
B.固相プローブ 参考のために援用する、Urdeaらの米国特許第4,868,1
05号に記載されているように、21塩基オリゴマー、すな
わち、５′−XCACCACTTTCTCCAAAGAAG−３′を合成し、
0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.5、中のＮ−ヒドロキシス
クシンイミジルビオチンを用いてビオチン化した。但
し、Ｘは、シチジンのN4−（２−アミノエチル）誘導体
を表す。このビオチン化した断片の一部５μＬ（800ピ
コモル）を、1X PBS溶液中0.25％（w/v）の2.8μｍアビ
ジンポリスチレンビーズ500μＬを入れた1.5mLのエッペ
ンドルフ（Eppendorf）チューブに添加した。前記ビー
ズを37℃で１時間インキュベートした後、遠心分離によ
り、0.1％SDS、4X SSC 500μＬで３回洗浄した。その
後、再懸濁して、使用するまで、同一の溶液中で保存し
た。図１において、固相プローブ（単数または複数）
は、支持体表面（ビーズ）４（９）に結合された３およ
び８で示す。
05号に記載されているように、21塩基オリゴマー、すな
わち、５′−XCACCACTTTCTCCAAAGAAG−３′を合成し、
0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.5、中のＮ−ヒドロキシス
クシンイミジルビオチンを用いてビオチン化した。但
し、Ｘは、シチジンのN4−（２−アミノエチル）誘導体
を表す。このビオチン化した断片の一部５μＬ（800ピ
コモル）を、1X PBS溶液中0.25％（w/v）の2.8μｍアビ
ジンポリスチレンビーズ500μＬを入れた1.5mLのエッペ
ンドルフ（Eppendorf）チューブに添加した。前記ビー
ズを37℃で１時間インキュベートした後、遠心分離によ
り、0.1％SDS、4X SSC 500μＬで３回洗浄した。その
後、再懸濁して、使用するまで、同一の溶液中で保存し
た。図１において、固相プローブ（単数または複数）
は、支持体表面（ビーズ）４（９）に結合された３およ
び８で示す。
C.標識プローブ 18塩基オリゴマー、すなわち、５′−XGGTCCTAGCCTGA
CAGC−３′を合成した。但し、Ｘは上記の通りである。
セントリコン30マイクロコンセントレーター（Centrico
n 30 Microconcentrator）中に、仔ウシ腸のアルカリホ
スファターゼ（AP）11（緩衝液中3mg;イムノアッセイ階
級、Boehringer−Mannheim）に入れた。その後、0.1Mホ
ウ酸ナトリウム、pH9.5、約2mLを添加し、最終溶液40μ
Ｌが得られるまで、装置を3500rpmで回転させた。その
後、アルキルアミノオリゴヌクレオチドをDITCで活性化
させ、ブタノールで抽出し、そしてタンパク質に合せ
た。PAGE、溶出（0.1M Tris、pH7.5、0.1M NaCl、10mM
MgCl2、0.1mM ZnCl2を含有する）、および濃縮によっ
て、最終生成物（図１の10）を得、それを４℃で保存し
た。
CAGC−３′を合成した。但し、Ｘは上記の通りである。
セントリコン30マイクロコンセントレーター（Centrico
n 30 Microconcentrator）中に、仔ウシ腸のアルカリホ
スファターゼ（AP）11（緩衝液中3mg;イムノアッセイ階
級、Boehringer−Mannheim）に入れた。その後、0.1Mホ
ウ酸ナトリウム、pH9.5、約2mLを添加し、最終溶液40μ
Ｌが得られるまで、装置を3500rpmで回転させた。その
後、アルキルアミノオリゴヌクレオチドをDITCで活性化
させ、ブタノールで抽出し、そしてタンパク質に合せ
た。PAGE、溶出（0.1M Tris、pH7.5、0.1M NaCl、10mM
MgCl2、0.1mM ZnCl2を含有する）、および濃縮によっ
て、最終生成物（図１の10）を得、それを４℃で保存し
た。
D.捕捉プローブ 各々、HBVゲノムの特異的配列に相補的な、30塩基の
長い可変部位を有する、５つの一本鎖ポリヌクレオチ
ド、および、固相（上記のＢ）に結合されたオリゴヌク
レオチドに相補的な20塩基の長い定常３′部位を、上記
Ｂに記載した工程で合成した。
長い可変部位を有する、５つの一本鎖ポリヌクレオチ
ド、および、固相（上記のＢ）に結合されたオリゴヌク
レオチドに相補的な20塩基の長い定常３′部位を、上記
Ｂに記載した工程で合成した。
E.プライマー： プライマー６および７も、上記Ｂの工程に従って合成
した。プライマー７は、HBVゲノムの一部位に相補的な
配列71、捕捉プローブ８に相補的な部位72、および、阻
止リンカー73、すなわち、５−メチル−N4（６−オキシ
ヘキシル）−２′−デオキシシチジンから成る。プライ
マー６は、HBVゲノムの他の鎖に相補的な配列61、標識
プローブ配列10に相補的の部位、および、阻止リンカー
63、すなわち、５−メチル−N4（６−オキシヘキシル）
−２′−デオキシシチジンから成る。
した。プライマー７は、HBVゲノムの一部位に相補的な
配列71、捕捉プローブ８に相補的な部位72、および、阻
止リンカー73、すなわち、５−メチル−N4（６−オキシ
ヘキシル）−２′−デオキシシチジンから成る。プライ
マー６は、HBVゲノムの他の鎖に相補的な配列61、標識
プローブ配列10に相補的の部位、および、阻止リンカー
63、すなわち、５−メチル−N4（６−オキシヘキシル）
−２′−デオキシシチジンから成る。
配列61（阻止リンカーから）は、TTG TTC CCA AGA AT
A TGGであった。配列71は、２つの配列（阻止リンカー
へ）の混合、すなわち、TAC（T/A）GC ACT CAG GCA AGC
であった。
A TGGであった。配列71は、２つの配列（阻止リンカー
へ）の混合、すなわち、TAC（T/A）GC ACT CAG GCA AGC
であった。
F.ビーズアッセイ工程 血清またはプラズマ（または標準分析物）のサンプル
10μＬを、1.5mLのエッペンドルフチューブ中に入れ
て、37℃で30分間、プロテイナーゼK/SDS 12.5μＬ中で
（Gene（1987）61:254に記載されているように）処理す
る。各々のサンプルに、５つの捕捉プローブ各々を50フ
ェムトモル含有する1M NaOH 5μＬを添加し、チューブ
を100℃で10分間加熱した。サンプルを、氷上に５分間
載置して、10秒間微小遠心し、0.38M酢酸12.3X SSC（最
終4X SSC）で中和した。分析物への、プローブのアニー
リングを、55℃で１時間行った。続いて、捕捉ビーズ25
μＬを添加し、溶液を55℃で、さらに15分間放置した。
ビーズを0.1％ SDS、4X SSC 500μＬで２回洗浄した。
10μＬを、1.5mLのエッペンドルフチューブ中に入れ
て、37℃で30分間、プロテイナーゼK/SDS 12.5μＬ中で
（Gene（1987）61:254に記載されているように）処理す
る。各々のサンプルに、５つの捕捉プローブ各々を50フ
ェムトモル含有する1M NaOH 5μＬを添加し、チューブ
を100℃で10分間加熱した。サンプルを、氷上に５分間
載置して、10秒間微小遠心し、0.38M酢酸12.3X SSC（最
終4X SSC）で中和した。分析物への、プローブのアニー
リングを、55℃で１時間行った。続いて、捕捉ビーズ25
μＬを添加し、溶液を55℃で、さらに15分間放置した。
ビーズを0.1％ SDS、4X SSC 500μＬで２回洗浄した。
この時、PCR試薬（適当なポリメラーゼ、ヌクレオチ
ドトリホスフェートなど）に加えてプライマー６および
７を添加し、プライマーによって囲まれたHBV配列を増
幅させた。R.HiguchiらのNature（1988）332:543、およ
びR.SaikiらのScience（1988）239:487に記載されてい
るように、各々のプライマー50pmおよび400μＭのdNTP
を用いてPCRを行った。94℃で30秒間、変性を行い、50
℃で30秒間、プライマーのアニーリングを行い、72℃で
1.0分間Tagポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetusから市
販されている）伸長を行った。結合した分析物は、選択
的に、例えば、捕捉プローブ2a−ｃの共通部位に相補的
な除去用プローブ（図１の５）とともに、PCR緩衝液中
で55℃で15分間インキュベートすることによって、除去
し得る。
ドトリホスフェートなど）に加えてプライマー６および
７を添加し、プライマーによって囲まれたHBV配列を増
幅させた。R.HiguchiらのNature（1988）332:543、およ
びR.SaikiらのScience（1988）239:487に記載されてい
るように、各々のプライマー50pmおよび400μＭのdNTP
を用いてPCRを行った。94℃で30秒間、変性を行い、50
℃で30秒間、プライマーのアニーリングを行い、72℃で
1.0分間Tagポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetusから市
販されている）伸長を行った。結合した分析物は、選択
的に、例えば、捕捉プローブ2a−ｃの共通部位に相補的
な除去用プローブ（図１の５）とともに、PCR緩衝液中
で55℃で15分間インキュベートすることによって、除去
し得る。
溶液を4X SSC、0.1％SDSに調整し、55℃で15分間載置
し、その後、上記のように洗浄した。
し、その後、上記のように洗浄した。
250フェムトモル標識プローブ10の、HM溶液20μＬ中
で、37℃で１時間、標識づけを行った。３回洗浄した
後、キムワイプ（Kimwipes）上に取り出して、ビーズを
丹念に排液し、適切な基質で処理し、上記したように測
定した。
で、37℃で１時間、標識づけを行った。３回洗浄した
後、キムワイプ（Kimwipes）上に取り出して、ビーズを
丹念に排液し、適切な基質で処理し、上記したように測
定した。
AP検出のためには、Lumigen Inc.から入手した酵素ト
リガジオキセタン（Schaapら、Tetrahedron Lett（198
7）28:1159−1162および欧州特許出願第0254051号を用
いる。検出工程は以下の通りである：標識づけのため
に、APプローブと共にHM緩衝液20μＬを標識分析物に添
加し、55℃で15分間インキュベートする。上澄を除去
し、ビーズを0.1X SSC−0.1％SDS 380μＬで２回洗浄し
た。その後、ビーズを0.1X SSC 380μＬで２回洗浄する
ことにより、残留SDSをすべて除去した。CTAB緩衝液中
の3.3x10-4Mのジオキセタン20μＬを、ビーズの一部に
添加する。試薬が底に落ちるように、ビーズを軽く叩
き、穏やかにかき混ぜ、37℃のオーブンで１時間インキ
ュベートする。その後、ビーズをルミノメーターで測定
する。
リガジオキセタン（Schaapら、Tetrahedron Lett（198
7）28:1159−1162および欧州特許出願第0254051号を用
いる。検出工程は以下の通りである：標識づけのため
に、APプローブと共にHM緩衝液20μＬを標識分析物に添
加し、55℃で15分間インキュベートする。上澄を除去
し、ビーズを0.1X SSC−0.1％SDS 380μＬで２回洗浄し
た。その後、ビーズを0.1X SSC 380μＬで２回洗浄する
ことにより、残留SDSをすべて除去した。CTAB緩衝液中
の3.3x10-4Mのジオキセタン20μＬを、ビーズの一部に
添加する。試薬が底に落ちるように、ビーズを軽く叩
き、穏やかにかき混ぜ、37℃のオーブンで１時間インキ
ュベートする。その後、ビーズをルミノメーターで測定
する。
Claims (25)
- 【請求項１】ポリヌクレオチドを含有する試料中で、分
析物配列を有する分析物ポリヌクレオチド鎖を検出する
方法であって： ａ）ハイブリダイゼーションの条件下で、該分析物ポリ
ヌクレオチドを捕捉プローブに接触させることにより、
分析物−捕捉プローブ複合体を形成する工程であって、
該捕捉プローブが分析物結合領域および第１の特異的結
合パートナーを含有し、該分析物結合領域は該分析物ポ
リヌクレオチドの領域とのハイブリダイズが可能であ
り、該第１の特異的結合パートナーが第２の結合パート
ナーに対して特異性を有する、工程； ｂ）該第１の結合パートナーを該第２の結合パートナー
に接触させる工程であって、該第２の結合パートナーが
第１の支持体上に固定化され、それによって、該分析物
−捕捉プローブ複合体が該第１の支持体に固定化され
て、固定化分析物−捕捉プローブ複合体を提供する、工
程； ｃ）該固定化分析物−捕捉プローブ複合体から結合して
いない、ポリヌクレオチドを分離する、工程； ｄ）ハイブリダイゼーションの条件下で、該分析物ポリ
ヌクレオチドを、該分析物ポリヌクレオチドの第１のプ
ライマー結合領域に相補的な第１のプライマーに接触さ
せる工程であって、該第１のプライマーが、直接結合し
ているかまたは転写を阻止する手段を介して結合してい
る、分析物ポリヌクレオチドの第１のプライマー結合領
域に相補的な領域および第３の特異的結合パートナーを
含む、工程； ｅ）該第１のプライマーにおいて、重合手段を用いてヌ
クレオチド重合を開始することにより、分析物−相補的
二本鎖を形成する、工程； ｆ）該二本鎖を変性させる、工程； ｇ）該相補鎖を、該分析物相補鎖の第２のプライマー結
合領域にハイブリダイズ可能な第２のプライマーに接触
させ、該分析物ポリヌクレオチドを第１のプライマーに
接触させる、工程； ｈ）重合手段を用いてヌクレオチド重合を開始すること
により、該第１のプライマー結合領域を含有する該分析
物相補鎖の領域に相補的な鎖を有する分析物−コピー二
本鎖、および分析物相補的二本鎖を形成する、工程； ｉ）ｆからｈの工程を反復することにより、該第１およ
び該第２のプライマー、該分析物配列、そして該分析物
配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含有する増幅生
成物を提供する、工程；および ｊ）該増幅生成物を検出する、工程； を包含する、方法。 - 【請求項２】前記第１の結合パートナーが、前記分析物
鎖に相補的でない配列を有する第１のポリヌクレオチド
鎖を含有し、前記第２の結合パートナーが、前記第１の
結合パートナーポリヌクレオチド鎖に相補的であり、そ
して前記分析物鎖には相補的でない配列を有する第２の
ポリヌクレオチド鎖を含有する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】前記第２の結合パートナーポリヌクレオチ
ド鎖に相補的な領域を有する除去用ポリヌクレオチド鎖
を、前記第２の結合パートナーポリヌクレオチド鎖にハ
イブリダイズすることにより、前記分析物鎖が、前記第
１の支持体から除去される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】前記第１の結合パートナーポリヌクレオチ
ド鎖に相補的な領域を有する除去用ポリヌクレオチド鎖
を、前記第１の結合パートナーポリヌクレオチド鎖にハ
イブリダイズすることにより、前記分析物鎖が、前記第
１の支持体から除去される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】前記第１のプライマーが、さらに、その
３′末端に、第３の結合パートナーを含有し、該第３の
結合パートナーは第４の結合パートナーに特異的に結合
可能であり、該第４の結合パートナーが固体支持体に結
合されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記検出する工程が、 前記増幅生成物を、前記第４の結合パートナーが結合さ
れた固体支持体に接触させること、および前記第３の結
合パートナーを前記第４の結合パートナーにハイブリダ
イズすることにより、固定化増幅生成物を提供する、工
程； 前記固定化増幅生成物から、結合していないポリヌクレ
オチドを分離する、工程；および 前記増幅生成物の存在を検出する、工程； を包含する、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】前記第３の結合パートナーが、阻止リンカ
ーによって前記プライマーに結合された前記分析物鎖に
相補的でない配列を有する第３のポリヌクレオチド鎖を
含有し、前記第４の結合パートナーが、前記第３の結合
パートナーポリヌクレオチド鎖に相補的であり前記分析
物鎖には相補的でない配列を有する第４のポリヌクレオ
チド鎖を含有する、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】前記第２のプライマーが、さらに、その
３′末端に、阻止リンカーによって前記プライマーに結
合された第５の特異的結合パートナーを含有し、該第５
の特異的結合パートナーは第６の結合パートナーに特異
的に結合可能であり、該第６の結合パートナーが検出可
能な標識に結合されている、請求項６に記載の方法。 - 【請求項９】前記検出する工程が、さらに、 前記固定化増幅生成物を、前記標識された第６の結合パ
ートナーに接触させる、工程； 結合していない第６の結合パートナーを分離する、工
程；および 結合した第６の結合パートナーの存在を判定する、工
程； を包含する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】前記第５の結合パートナーが、前記分析
物鎖に相補的でない配列を有する第５のポリヌクレオチ
ド鎖を含有し、そして前記第６の結合パートナーが、前
記第５の結合パートナーポリヌクレオチド鎖に相補的で
あり、そして前記分析物鎖にも前記分析物相補鎖にも相
補的でない配列を有する第６のポリヌクレオチド鎖を含
有する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】前記第２のプライマーが、さらに、その
３′末端に、阻止リンカーによって前記プライマーに結
合された第３の結合パートナーを含有し、該第３の結合
パートナーは第４の結合パートナーに特異的に結合可能
であり、該第４の結合パートナーが支持体に結合されて
いる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】前記検出する工程が、 前記増幅生成物を、前記第４の結合パートナーが結合さ
れた固体支持体に接触させること、および前記第３の結
合パートナーを前記第４の結合パートナーにハイブリダ
イズすることにより、固定化増幅生成物を提供する、工
程； 前記固定化増幅生成物から、結合していないポリヌクレ
オチドを分離する、工程；および 前記増幅生成物の存在を検出する、工程； を包含する、請求項11に記載の方法。 - 【請求項１３】前記第３の結合パートナーが、前記分析
物鎖に相補的でない配列を有する第３のポリヌクレオチ
ド鎖を含有し、前記第４の結合パートナーが、前記第３
の結合パートナーポリヌクレオチド鎖に相補的であり、
そして前記分析物鎖にも前記分析物相補鎖にも相補的で
ない配列を有する第４のポリヌクレオチド鎖を含有す
る、請求項11に記載の方法。 - 【請求項１４】前記第１のプライマーが、さらに、その
３′末端に、阻止リンカーによって前記プライマーに結
合された第５の特異的結合パートナーを含有し、該第５
の特異的結合パートナーが第６の結合パートナーに特異
的に結合可能であり、該第６の結合パートナーが検出可
能な標識に結合されている、請求項11に記載の方法。 - 【請求項１５】前記検出する工程が、さらに、 前記固定化増幅生成物を、前記標識された第６の結合パ
ートナーに接触させる、工程； 結合していない第６の結合パートナーを分離する、工
程；および 結合した第６の結合パートナーの存在を判定する、工
程； を包含する、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】前記第５の結合パートナーが、前記分析
物鎖に相補的でない配列を有する第５のポリヌクレオチ
ド鎖を含有し、前記第６の結合パートナーが、前記第５
の結合パートナーポリヌクレオチド鎖に相補的であり、
そして前記分析物鎖にも前記分析物相補鎖にも相補的で
ない配列を有する第６のポリヌクレオチド鎖を含有す
る、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１７】請求項１に記載の方法であって、さら
に、前記分析物を前記第１のプライマーに接触させる前
に、第３および第４のプライマーで前記分析物ポリヌク
レオチドを増幅させる工程を包含し、該第３および第４
のプライマーが、前記分析物およびその相補体の領域の
うち、前記第１のプライマー結合領域および前記第２の
プライマー結合領域によって結合された領域外の領域に
ハイブリダイズされ、それによって、前記分析物および
その相補体のうち、前記分析物配列そして第１および第
２のプライマー結合領域を含有する部分を増幅する、方
法。 - 【請求項１８】ポリヌクレオチドを含有する試料中で、
分析物配列を有する分析物ポリヌクレオチド鎖を増幅さ
せ、検出するためのアッセイキットであって、 除去可能な第１の特異的結合パートナーに結合された、
該分析物ポリヌクレオチドの領域に相補的な分析物結合
配列を含有する、捕捉プローブ； 該第１のパートナーに対して特異的な第２の結合パート
ナーを結合された第１の支持体； 直接結合しているかまたは転写を阻止する手段を介して
結合している、分析物ポリヌクレオチドの第１のプライ
マー結合領域に相補的な領域および第３の特異的結合パ
ートナーを含む、第１のプライマー；および 該分析物相補鎖の第２のプライマー結合領域に相補的な
第２のプライマーであって、実質的に該第１のプライマ
ー結合領域と重複しない第２のプライマー； を含有する、アッセイキット。 - 【請求項１９】前記第１の結合パートナーが、阻止リン
カーによって前記プライマーに結合された前記分析物鎖
に相補的でない配列を有する第１のポリヌクレオチド鎖
を含有し、前記第２の結合パートナーが、前記第１の結
合パートナーポリヌクレオチド鎖に相補的であり、そし
て前記分析物鎖には相補的でない配列を有する第２のポ
リヌクレオチド鎖を含有する、請求項18に記載のアッセ
イキット。 - 【請求項２０】請求項19に記載のアッセイキットであっ
て、さらに、前記第２の結合パートナーポリヌクレオチ
ドに相補的な領域を有する除去用ポリヌクレオチドを含
有する、アッセイキット。 - 【請求項２１】前記第１のプライマーが、さらに、その
３′末端に、阻止リンカーによって前記プライマーに結
合された第４の結合パートナーを特異的に結合すること
のできる第３の結合パートナーを含有し、さらに、前記
第４の結合パートナーを結合された支持体を含有する、
請求項18に記載のアッセイキット。 - 【請求項２２】前記第２のプライマーが、さらに、３′
末端に、阻止リンカーによって該プライマーに結合され
た第５の特異的結合パートナーを含有し、該第５の特異
的結合パートナーは第６の結合パートナーに特異的に結
合可能であり、さらに、検出可能な標識に結合された第
６の結合パートナーを含有する、請求項21に記載のアッ
セイキット。 - 【請求項２３】前記第２のプライマーが、さらに、その
３′末端に、阻止リンカーによって前記プライマーに結
合された第３の結合パートナーを含有し、該第３の結合
パートナーは第４の結合パートナーに特異的に結合可能
であり、さらに、該第４の結合パートナーが結合された
第２の結合パートナーを含有する、請求項18に記載のア
ッセイキット。 - 【請求項２４】前記第１のプライマーが、さらに、阻止
リンカーによって該プライマーに結合された第５の特異
的結合パートナーを含有し、該第５の特異的結合パート
ナーが第６の結合パートナーに特異的に結合可能であっ
て、さらに、検出可能な標識に結合された第６の結合パ
ートナーを含有する、請求項23に記載のアッセイキッ
ト。 - 【請求項２５】請求項18に記載のアッセイキットであっ
て、さらに、前記分析物ポリヌクレオチドおよびその相
補体に相補的な第３および第４のプライマーを含有し、
該第３および第４のプライマーが、該分析物およびその
相補体の領域のうち、該第１のプライマー結合領域およ
び前記第２のプライマー結合領域によって結合された領
域外の領域にハイブリダイズされる、アッセイキット。
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