JPH1169998A - 核酸の増幅および検出のための一体化された方法 ならびにシステム - Google Patents
核酸の増幅および検出のための一体化された方法 ならびにシステムInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の増幅および検出のための一体化された
方法ならびにデバイスを提供する。 【解決手段】 (a) 核酸を検出しようとするサンプルを
用意し、(b) デバイス内で、検出すべき核酸に特異的な
少なくとも１種の核酸プライマーおよび検出すべき核酸
に特異的な少なくとも１種の捕捉プローブの存在下で核
酸を増幅し、その際、捕捉プローブは該デバイスの少な
くとも１つの内面に固定化されており、かつ核酸と捕捉
プローブとのハイブリッドが核酸とプライマーとのハイ
ブリッドより低い融解温度をもつように選択されてお
り、前記増幅は核酸とプライマーとのハイブリッドが安
定しているが核酸と捕捉プローブとのハイブリッドは不
安定であるような条件下で行い、そして(c) 固定化した
捕捉プローブに増幅産物を結合させることにより核酸を
検出することを特徴とする核酸の検出法。
方法ならびにデバイスを提供する。 【解決手段】 (a) 核酸を検出しようとするサンプルを
用意し、(b) デバイス内で、検出すべき核酸に特異的な
少なくとも１種の核酸プライマーおよび検出すべき核酸
に特異的な少なくとも１種の捕捉プローブの存在下で核
酸を増幅し、その際、捕捉プローブは該デバイスの少な
くとも１つの内面に固定化されており、かつ核酸と捕捉
プローブとのハイブリッドが核酸とプライマーとのハイ
ブリッドより低い融解温度をもつように選択されてお
り、前記増幅は核酸とプライマーとのハイブリッドが安
定しているが核酸と捕捉プローブとのハイブリッドは不
安定であるような条件下で行い、そして(c) 固定化した
捕捉プローブに増幅産物を結合させることにより核酸を
検出することを特徴とする核酸の検出法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の増幅および
検出を一体化して行うことを可能にする方法ならびにデ
バイスに関するものである。
検出を一体化して行うことを可能にする方法ならびにデ
バイスに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】核酸を検出するための不均一法(heterog
eneous method)は、検出すべき核酸を固定化する工程を
包含する。これは例えば、固相に核酸を共有結合させる
ことにより直接行うか、またはアフィニティー対の相手
に核酸を結合させ、アフィニティー対の他方の相手を固
相に結合させることで達成される。別の結合方法として
は、検出すべき核酸に少なくとも部分的に相補的な、固
相に結合されたいわゆる捕捉プローブへのハイブリダイ
ゼーションによって検出すべき核酸を固定化する方法が
ある。この捕捉プローブは所望の方法で固相に結合させ
たり、結合可能にすることができる。
eneous method)は、検出すべき核酸を固定化する工程を
包含する。これは例えば、固相に核酸を共有結合させる
ことにより直接行うか、またはアフィニティー対の相手
に核酸を結合させ、アフィニティー対の他方の相手を固
相に結合させることで達成される。別の結合方法として
は、検出すべき核酸に少なくとも部分的に相補的な、固
相に結合されたいわゆる捕捉プローブへのハイブリダイ
ゼーションによって検出すべき核酸を固定化する方法が
ある。この捕捉プローブは所望の方法で固相に結合させ
たり、結合可能にすることができる。
【０００３】検出すべき核酸を捕捉プローブで固定化す
る方法の例は、直接結合に関してはEP-A-0 078 139に、
アフィニティー対を介する結合に関してはEP-A-0 192 1
68に記載されている。これらの文献に記載された方法で
は、検出すべき核酸を、やはり検出すべき核酸とハイブ
リダイズし得る検出プローブとハイブリダイズさせ、過
剰の検出プローブを除去した後に、形成されたハイブリ
ッドを検出プローブのマーカー基により固相上で検出す
る。サンプル中にまれにしか存在しない核酸を検出する
ためには、通常、標的特異的増幅が行われる。このよう
な方法、例えば、ジゴキシゲニンマーカー基が増幅され
た核酸に取り込まれる方法はWO92/06216に記載されてい
る。
る方法の例は、直接結合に関してはEP-A-0 078 139に、
アフィニティー対を介する結合に関してはEP-A-0 192 1
68に記載されている。これらの文献に記載された方法で
は、検出すべき核酸を、やはり検出すべき核酸とハイブ
リダイズし得る検出プローブとハイブリダイズさせ、過
剰の検出プローブを除去した後に、形成されたハイブリ
ッドを検出プローブのマーカー基により固相上で検出す
る。サンプル中にまれにしか存在しない核酸を検出する
ためには、通常、標的特異的増幅が行われる。このよう
な方法、例えば、ジゴキシゲニンマーカー基が増幅され
た核酸に取り込まれる方法はWO92/06216に記載されてい
る。
【０００４】従来の一般的な核酸診断法では、核酸の増
幅と検出が別々の系で行われており、その結果、増幅に
より得られた産物が検出前に周囲の物質と接触すること
となった。したがって、交差汚染や偽陽性結果のリスク
が高かった。さらに、数回のピペット分取工程および少
なくとも１回の転移工程を行う必要があった。
幅と検出が別々の系で行われており、その結果、増幅に
より得られた産物が検出前に周囲の物質と接触すること
となった。したがって、交差汚染や偽陽性結果のリスク
が高かった。さらに、数回のピペット分取工程および少
なくとも１回の転移工程を行う必要があった。
【０００５】閉鎖系での増幅・検出組合せ法はUS-A-5,2
10,015に記載されており、この方法では増幅工程が検出
プローブの存在下で行われる。この検出プローブは増幅
条件下で標的ＤＮＡと結合し、かつリポーター基とクエ
ンチャー基(quencher group)を含んでいる。ポリメラー
ゼのヌクレアーゼ活性がリポーター基を該プローブから
開裂させて、検出可能なシグナルを発生させる。しかし
ながら、この方法は感度が低いという欠点を有する。加
えて、プローブはその配列および融解温度の点で細心の
注意を払って選択する必要があった。
10,015に記載されており、この方法では増幅工程が検出
プローブの存在下で行われる。この検出プローブは増幅
条件下で標的ＤＮＡと結合し、かつリポーター基とクエ
ンチャー基(quencher group)を含んでいる。ポリメラー
ゼのヌクレアーゼ活性がリポーター基を該プローブから
開裂させて、検出可能なシグナルを発生させる。しかし
ながら、この方法は感度が低いという欠点を有する。加
えて、プローブはその配列および融解温度の点で細心の
注意を払って選択する必要があった。
【０００６】Findlayらの刊行物(Clin. Chem. 39 (199
3), 1927-1933)は、核酸を増幅し検出するための自動化
法を開示しており、この方法では、いくつかの分離した
区画をもつ単一の反応容器が用いられ、第１区画におい
て増幅中に生成された混合産物を、検出のために別の第
２検出区画に移行させる必要がある。この方法の欠点
は、複雑な構成の反応容器および／またはめんどうな移
行技術を用いなければならない点である。
3), 1927-1933)は、核酸を増幅し検出するための自動化
法を開示しており、この方法では、いくつかの分離した
区画をもつ単一の反応容器が用いられ、第１区画におい
て増幅中に生成された混合産物を、検出のために別の第
２検出区画に移行させる必要がある。この方法の欠点
は、複雑な構成の反応容器および／またはめんどうな移
行技術を用いなければならない点である。
【０００７】WO93/10267も核酸の増幅・検出法を開示し
ており、この方法では、反応中に検出プローブが存在
し、該プローブは少なくともその3'末端に電気化学的発
光マーカー基をもつため、増幅用のプライマーとしては
作用し得ない。この方法の欠点は、検出プローブの複雑
な構築が必要であることである。その上、添加された検
出プローブによる増幅反応の干渉を排除することが不可
能である。
ており、この方法では、反応中に検出プローブが存在
し、該プローブは少なくともその3'末端に電気化学的発
光マーカー基をもつため、増幅用のプライマーとしては
作用し得ない。この方法の欠点は、検出プローブの複雑
な構築が必要であることである。その上、添加された検
出プローブによる増幅反応の干渉を排除することが不可
能である。
【０００８】EP-A-0 628 568は、核酸を増幅し、その後
核酸を捕捉プローブとハイブリダイズさせることで固定
化または検出する方法を開示しており、この方法では、
捕捉プローブが酵素的伸長および／または形成されたハ
イブリッドの酵素的分解から保護されている。この捕捉
プローブは増幅反応中にすでに存在していてもよい。こ
の方法も、保護された捕捉プローブの作製が複雑である
上に、捕捉プローブによる増幅反応の干渉を排除できな
いという欠点を抱えている。
核酸を捕捉プローブとハイブリダイズさせることで固定
化または検出する方法を開示しており、この方法では、
捕捉プローブが酵素的伸長および／または形成されたハ
イブリッドの酵素的分解から保護されている。この捕捉
プローブは増幅反応中にすでに存在していてもよい。こ
の方法も、保護された捕捉プローブの作製が複雑である
上に、捕捉プローブによる増幅反応の干渉を排除できな
いという欠点を抱えている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、現技術水準が抱える諸欠点を少なくとも部分的
に排除した核酸の増幅・検出法を提供することである。
特に、核酸の増幅および検出は、反応手順の間開く必要
のない単一のデバイス内で行われるべきである。さら
に、その手順は迅速で、取扱いが簡単で、自動化が可能
で、安価であるべきである。
目的は、現技術水準が抱える諸欠点を少なくとも部分的
に排除した核酸の増幅・検出法を提供することである。
特に、核酸の増幅および検出は、反応手順の間開く必要
のない単一のデバイス内で行われるべきである。さら
に、その手順は迅速で、取扱いが簡単で、自動化が可能
で、安価であるべきである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明による目的は下記
の核酸検出法により達成され、この方法は、(a) 核酸を
検出しようとするサンプルを用意し、(b) デバイス内
で、検出すべき核酸に特異的な少なくとも１種の核酸プ
ライマーおよび検出すべき核酸に特異的な少なくとも１
種の捕捉プローブの存在下で核酸を増幅し、その際、捕
捉プローブは該デバイスの少なくとも１つの内面に固定
化されており、かつ核酸と捕捉プローブとのハイブリッ
ドが核酸とプライマーとのハイブリッドより低い融解温
度をもつように選択されており、前記増幅は核酸とプラ
イマーとのハイブリッドが安定しているが核酸と捕捉プ
ローブとのハイブリッドは不安定であるような条件下で
行い、そして(c) 固定化した捕捉プローブに増幅産物を
結合させることにより核酸を検出する、ことを含んでな
る。
の核酸検出法により達成され、この方法は、(a) 核酸を
検出しようとするサンプルを用意し、(b) デバイス内
で、検出すべき核酸に特異的な少なくとも１種の核酸プ
ライマーおよび検出すべき核酸に特異的な少なくとも１
種の捕捉プローブの存在下で核酸を増幅し、その際、捕
捉プローブは該デバイスの少なくとも１つの内面に固定
化されており、かつ核酸と捕捉プローブとのハイブリッ
ドが核酸とプライマーとのハイブリッドより低い融解温
度をもつように選択されており、前記増幅は核酸とプラ
イマーとのハイブリッドが安定しているが核酸と捕捉プ
ローブとのハイブリッドは不安定であるような条件下で
行い、そして(c) 固定化した捕捉プローブに増幅産物を
結合させることにより核酸を検出する、ことを含んでな
る。
【００１１】
【発明の実施の態様】本発明による方法は、増幅条件下
でプライマーおよび／または検出すべき核酸とハイブリ
ダイズしない捕捉プローブを選択することにより、既知
の方法と比べて相当の感度の向上を達成することができ
る。さらに、増幅および検出のために一体化された閉鎖
デバイスを使用することにより、汚染のリスクを最小限
に抑えられる。その上、この方法は実施するのが簡単
で、洗浄工程を行う必要がまったくない。さらに、本発
明による方法は、例えば別様に標識された種々のプライ
マーを用いることにより多重増幅を可能にし、また、例
えば特定の表面位置に固定化された異なる捕捉プローブ
を用いることにより多重検出を可能にする。
でプライマーおよび／または検出すべき核酸とハイブリ
ダイズしない捕捉プローブを選択することにより、既知
の方法と比べて相当の感度の向上を達成することができ
る。さらに、増幅および検出のために一体化された閉鎖
デバイスを使用することにより、汚染のリスクを最小限
に抑えられる。その上、この方法は実施するのが簡単
で、洗浄工程を行う必要がまったくない。さらに、本発
明による方法は、例えば別様に標識された種々のプライ
マーを用いることにより多重増幅を可能にし、また、例
えば特定の表面位置に固定化された異なる捕捉プローブ
を用いることにより多重検出を可能にする。
【００１２】本発明の方法の工程(a) は、検出すべき核
酸を含有するサンプルを用意することを含んでなる。こ
のサンプルは天然のサンプル、例えば血液、血清、血
漿、尿、髄液などの体液、組織サンプルもしくは培養物
サンプル、またはプロセス工程により天然サンプルから
調製されたサンプルであってもよい。好ましい実施態様
において、サンプルは核酸診断法において天然に存在す
る核酸の検出に用いられる生物由来の天然サンプルであ
る。
酸を含有するサンプルを用意することを含んでなる。こ
のサンプルは天然のサンプル、例えば血液、血清、血
漿、尿、髄液などの体液、組織サンプルもしくは培養物
サンプル、またはプロセス工程により天然サンプルから
調製されたサンプルであってもよい。好ましい実施態様
において、サンプルは核酸診断法において天然に存在す
る核酸の検出に用いられる生物由来の天然サンプルであ
る。
【００１３】本発明の方法の工程(b) は、増幅に適した
デバイス内で核酸を増幅することを含んでなる。検出す
べき核酸は公知のどのような方法で増幅してもよい。好
ましくは、増幅は１種または数種の核酸プライマーを用
いて行われ、該プライマーは、検出すべき核酸と増幅条
件下で安定なハイブリッドを形成し得るように、検出す
べき核酸に対し十分相補的なものとする。これらのプラ
イマーはＤＮＡポリメラーゼのような、やはり反応混合
物中に存在する酵素により伸長されることが好ましい。
適当な増幅法の例はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、特に
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。さらに、増幅
は数サイクル（例えば、２０〜３０サイクル）のサーモ
サイクリック反応として耐熱性酵素を用いて行うことが
好ましい。
デバイス内で核酸を増幅することを含んでなる。検出す
べき核酸は公知のどのような方法で増幅してもよい。好
ましくは、増幅は１種または数種の核酸プライマーを用
いて行われ、該プライマーは、検出すべき核酸と増幅条
件下で安定なハイブリッドを形成し得るように、検出す
べき核酸に対し十分相補的なものとする。これらのプラ
イマーはＤＮＡポリメラーゼのような、やはり反応混合
物中に存在する酵素により伸長されることが好ましい。
適当な増幅法の例はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、特に
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。さらに、増幅
は数サイクル（例えば、２０〜３０サイクル）のサーモ
サイクリック反応として耐熱性酵素を用いて行うことが
好ましい。
【００１４】本発明の方法で用いる核酸プライマーは、
その3'末端で酵素的伸長を受けやすいオリゴヌクレオチ
ドまたは修飾オリゴヌクレオチドである。核酸プライマ
ーの長さは諸要件に応じて広範囲にわたって変化しうる
が、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドである。増幅中
に同様に存在する捕捉プローブもオリゴヌクレオチドま
たは修飾オリゴヌクレオチド、例えばペプチド核酸であ
り得る。捕捉プローブとしては、酵素的伸長を受けやす
い3'末端をもたないものを使用することが好ましい。捕
捉プローブは一体化増幅・検出デバイスの内面に固定化
される。固定化は公知のどのような方法で行ってもよ
く、例えば共有結合により、または高親和性の生物学的
相互作用により行うことができる。
その3'末端で酵素的伸長を受けやすいオリゴヌクレオチ
ドまたは修飾オリゴヌクレオチドである。核酸プライマ
ーの長さは諸要件に応じて広範囲にわたって変化しうる
が、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドである。増幅中
に同様に存在する捕捉プローブもオリゴヌクレオチドま
たは修飾オリゴヌクレオチド、例えばペプチド核酸であ
り得る。捕捉プローブとしては、酵素的伸長を受けやす
い3'末端をもたないものを使用することが好ましい。捕
捉プローブは一体化増幅・検出デバイスの内面に固定化
される。固定化は公知のどのような方法で行ってもよ
く、例えば共有結合により、または高親和性の生物学的
相互作用により行うことができる。
【００１５】適当な核酸固定化法の例は、Langmuir-Blo
dgett 技法を用いて検出デバイスの内面にシンナモイル
ブチルエーテルセルロース単層を移行させるものであ
る。フィルムの移行後、この単層をオレフィン性二重結
合の光重合により安定化させる。フィルム中に残存する
二重結合は、高親和性生物学的相互作用により結合相手
を固定化し得るストレプトアビジンまたは他の物質（例
えば抗体またはレクチン）の後続の共有結合のために、
ＯｓＯ4 およびＮａＩＯ4 で処理してアルデヒド基に変
換することができる。続いて、フィルムを、共有結合さ
せるべき物質、例えばストレプトアビジン水溶液（１０
μg/ml）と適当な条件下で接触させる。場合により、不
活性物質（例えばウシ血清アルブミン）によるブロッキ
ング工程をその後実施してもよい。
dgett 技法を用いて検出デバイスの内面にシンナモイル
ブチルエーテルセルロース単層を移行させるものであ
る。フィルムの移行後、この単層をオレフィン性二重結
合の光重合により安定化させる。フィルム中に残存する
二重結合は、高親和性生物学的相互作用により結合相手
を固定化し得るストレプトアビジンまたは他の物質（例
えば抗体またはレクチン）の後続の共有結合のために、
ＯｓＯ4 およびＮａＩＯ4 で処理してアルデヒド基に変
換することができる。続いて、フィルムを、共有結合さ
せるべき物質、例えばストレプトアビジン水溶液（１０
μg/ml）と適当な条件下で接触させる。場合により、不
活性物質（例えばウシ血清アルブミン）によるブロッキ
ング工程をその後実施してもよい。
【００１６】この表面に、高親和性生物学的相互作用の
ための相補的結合相手（例えばビオチン）を含む捕捉プ
ローブを固定化することができる。この固定化は該表面
を捕捉プローブを含有する溶液（例えば２００nmol/lの
濃度）と３７℃で１時間接触させることにより達成でき
る。捕捉プローブをコートした表面の作製に必要とされ
る工程の正確な手順は、例えばFurchら, SPIE 2928 (19
96), 220-226 に記載されている。
ための相補的結合相手（例えばビオチン）を含む捕捉プ
ローブを固定化することができる。この固定化は該表面
を捕捉プローブを含有する溶液（例えば２００nmol/lの
濃度）と３７℃で１時間接触させることにより達成でき
る。捕捉プローブをコートした表面の作製に必要とされ
る工程の正確な手順は、例えばFurchら, SPIE 2928 (19
96), 220-226 に記載されている。
【００１７】本発明の方法にとって絶対必要なことは、
プライマーの伸長反応を、固定化捕捉プローブと本方法
で検出すべき核酸とのハイブリッドの融解温度より高い
温度で行うことである。これにより、この試験の特異性
と感度が著しく向上する。
プライマーの伸長反応を、固定化捕捉プローブと本方法
で検出すべき核酸とのハイブリッドの融解温度より高い
温度で行うことである。これにより、この試験の特異性
と感度が著しく向上する。
【００１８】特に好ましくは、捕捉プローブと検出すべ
き核酸とのハイブリッドの融解温度より少なくとも２℃
高い、特に少なくとも５℃高い、最も好ましくは少なく
とも８℃高い温度で増幅を実施する。適当な捕捉プロー
ブ配列の選択は、核酸ハイブリッド（例えば核酸−核酸
ハイブリッドまたは核酸とペプチド核酸のハイブリッ
ド）の安定性に関する公知の表を参考にして容易に行う
ことができる。
き核酸とのハイブリッドの融解温度より少なくとも２℃
高い、特に少なくとも５℃高い、最も好ましくは少なく
とも８℃高い温度で増幅を実施する。適当な捕捉プロー
ブ配列の選択は、核酸ハイブリッド（例えば核酸−核酸
ハイブリッドまたは核酸とペプチド核酸のハイブリッ
ド）の安定性に関する公知の表を参考にして容易に行う
ことができる。
【００１９】本発明の方法の更なる利点は、多重増幅を
行うことができる点である。このような多重増幅では、
例えば、各プライマーが並列検出可能な異なるマーカー
基をもつような、数種の異なるプライマーを使用するこ
とができる。この方法では、例えば、検出すべき核酸の
アレル特異的増幅について互いに競合するプライマー
を、例えばLee and Hall, Annals of the Entomologica
l Society of America 89 (1996), 20-27 に記載される
ように使用することができる。
行うことができる点である。このような多重増幅では、
例えば、各プライマーが並列検出可能な異なるマーカー
基をもつような、数種の異なるプライマーを使用するこ
とができる。この方法では、例えば、検出すべき核酸の
アレル特異的増幅について互いに競合するプライマー
を、例えばLee and Hall, Annals of the Entomologica
l Society of America 89 (1996), 20-27 に記載される
ように使用することができる。
【００２０】本発明の方法の工程(c) は、固定化捕捉プ
ローブに結合させることによる工程(b) で得られた増幅
産物の検出を含んでなる。この検出工程は増幅工程より
低い温度、すなわち、検出すべき核酸と捕捉プローブと
の安定したハイブリッドが形成される温度で行うことが
得策である。捕捉プローブに結合された核酸の検出は、
基本的にはどのような方法で行ってもよく、例えば、プ
ラズモン共鳴を用いて層の厚さを介しての結合の直接測
定、または増幅反応中に増幅産物に組み込まれるマーカ
ー基の測定により行うことができる。
ローブに結合させることによる工程(b) で得られた増幅
産物の検出を含んでなる。この検出工程は増幅工程より
低い温度、すなわち、検出すべき核酸と捕捉プローブと
の安定したハイブリッドが形成される温度で行うことが
得策である。捕捉プローブに結合された核酸の検出は、
基本的にはどのような方法で行ってもよく、例えば、プ
ラズモン共鳴を用いて層の厚さを介しての結合の直接測
定、または増幅反応中に増幅産物に組み込まれるマーカ
ー基の測定により行うことができる。
【００２１】特に好ましくは、固定化捕捉プローブへの
核酸の結合は一過性に誘導された蛍光により検出され
る。そのために、捕捉プローブをデバイスの光学的に透
明な内面、例えばマイクロタイタープレートのウェルに
固定化することが好ましい。増幅反応の間に、蛍光標識
ヌクレオチドが増幅産物に組み込まれる。これは、蛍光
標識プライマーおよび／または蛍光標識ジデオキシヌク
レオシド三リン酸モノマーを用いることにより達成でき
る。一過性に誘導された蛍光は、顕微鏡、例えば共焦点
検鏡により局部的に分解されたものにより、スキャナー
またはＣＣＤカメラにより検出することができる。時間
分解測定または実時間測定が可能である。
核酸の結合は一過性に誘導された蛍光により検出され
る。そのために、捕捉プローブをデバイスの光学的に透
明な内面、例えばマイクロタイタープレートのウェルに
固定化することが好ましい。増幅反応の間に、蛍光標識
ヌクレオチドが増幅産物に組み込まれる。これは、蛍光
標識プライマーおよび／または蛍光標識ジデオキシヌク
レオシド三リン酸モノマーを用いることにより達成でき
る。一過性に誘導された蛍光は、顕微鏡、例えば共焦点
検鏡により局部的に分解されたものにより、スキャナー
またはＣＣＤカメラにより検出することができる。時間
分解測定または実時間測定が可能である。
【００２２】本発明の方法での検出は多重検出として行
うことができる。この場合には、数種の異なる捕捉プロ
ーブ（それぞれが一体化された増幅・検出デバイスの表
面上の異なる位置に固定化される）が用いられる。この
方法では、特に、検出すべき核酸と捕捉プローブとのデ
ィファレンシャルハイブリダイゼーション条件を用いて
（例えば制御した温度増加により）検出を行う場合に
は、検出すべき核酸の突然変異分析を行うことが可能で
ある。
うことができる。この場合には、数種の異なる捕捉プロ
ーブ（それぞれが一体化された増幅・検出デバイスの表
面上の異なる位置に固定化される）が用いられる。この
方法では、特に、検出すべき核酸と捕捉プローブとのデ
ィファレンシャルハイブリダイゼーション条件を用いて
（例えば制御した温度増加により）検出を行う場合に
は、検出すべき核酸の突然変異分析を行うことが可能で
ある。
【００２３】捕捉プローブを固定化し得る光学的に透明
な材料の例は、光を通す有機または無機材料、例えばガ
ラス、石英、ケイ素、プラスチック（例：ポリカーボネ
ート、アクリルポリマーまたはポリスチレン）である。
反応デバイスの表面への捕捉プローブの固定化は、増幅
反応中の温度で捕捉プローブの有意な剥離が起こらない
ように、熱安定性の固定化とする。一方では、共有結合
的固定化技術により固相上に捕捉プローブを固定化する
ことができる。他方では、そして好ましくは、高親和性
結合対（例えばストレプトアビジン／ビオチン）を用い
て固定化を達成することができる。
な材料の例は、光を通す有機または無機材料、例えばガ
ラス、石英、ケイ素、プラスチック（例：ポリカーボネ
ート、アクリルポリマーまたはポリスチレン）である。
反応デバイスの表面への捕捉プローブの固定化は、増幅
反応中の温度で捕捉プローブの有意な剥離が起こらない
ように、熱安定性の固定化とする。一方では、共有結合
的固定化技術により固相上に捕捉プローブを固定化する
ことができる。他方では、そして好ましくは、高親和性
結合対（例えばストレプトアビジン／ビオチン）を用い
て固定化を達成することができる。
【００２４】一過性に誘導された蛍光による核酸の検出
はすでに知られており（例えば、EP-A-0 245 206; WO96
/09532参照）、こうした公知方法には明確な言及がなさ
れている。しかしながら、驚いたことに、固定化した非
干渉性の捕捉プローブの存在下での増幅反応と一過性に
誘導された蛍光による増幅産物の検出との組合せを含ん
でなる本発明の方法により、特に感度がよく、信頼でき
る試験結果が得られることが判明した。
はすでに知られており（例えば、EP-A-0 245 206; WO96
/09532参照）、こうした公知方法には明確な言及がなさ
れている。しかしながら、驚いたことに、固定化した非
干渉性の捕捉プローブの存在下での増幅反応と一過性に
誘導された蛍光による増幅産物の検出との組合せを含ん
でなる本発明の方法により、特に感度がよく、信頼でき
る試験結果が得られることが判明した。
【００２５】本発明の更なる主題は核酸検出用の試薬キ
ットであって、該キットは、(a) デバイスの少なくとも
１つの内面に固定化された少なくとも１種の捕捉プロー
ブを含有する、核酸の増幅および検出のためのデバイ
ス、(b) 少なくとも１種の核酸プライマー、(c) 任意
に、デオキシリボヌクレオチド、および(d) 任意に、核
酸プライマーを伸長するのに適した酵素、を含んでな
り、前記捕捉プローブは検出すべき核酸と捕捉プローブ
とのハイブリッドが検出すべき核酸とプライマーとのハ
イブリッドより低い融解温度をもつように選択されるこ
とを特徴とする。
ットであって、該キットは、(a) デバイスの少なくとも
１つの内面に固定化された少なくとも１種の捕捉プロー
ブを含有する、核酸の増幅および検出のためのデバイ
ス、(b) 少なくとも１種の核酸プライマー、(c) 任意
に、デオキシリボヌクレオチド、および(d) 任意に、核
酸プライマーを伸長するのに適した酵素、を含んでな
り、前記捕捉プローブは検出すべき核酸と捕捉プローブ
とのハイブリッドが検出すべき核酸とプライマーとのハ
イブリッドより低い融解温度をもつように選択されるこ
とを特徴とする。
【００２６】このデバイスは好ましくはサンプル中に存
在する核酸の増幅および検出の一体化を可能にする閉鎖
系である。適当な増幅・検出デバイスの例は反応容器、
例えばマイクロタイタープレートのような容量が１００
μl までの微量反応容器である。さらに、バイオセンサ
ー（例えば、チップ）のような他のデバイスももちろん
使用可能である。かかるデバイスの光学的に透明な表面
に捕捉プローブを固定化することが有利である。好まし
くは、このキットは蛍光標識、例えば標識核酸プライマ
ーおよび／または標識デオキシリボヌクレオチドを含有
する。このキットに含まれる酵素は好ましくは耐熱性の
ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼであ
る。
在する核酸の増幅および検出の一体化を可能にする閉鎖
系である。適当な増幅・検出デバイスの例は反応容器、
例えばマイクロタイタープレートのような容量が１００
μl までの微量反応容器である。さらに、バイオセンサ
ー（例えば、チップ）のような他のデバイスももちろん
使用可能である。かかるデバイスの光学的に透明な表面
に捕捉プローブを固定化することが有利である。好まし
くは、このキットは蛍光標識、例えば標識核酸プライマ
ーおよび／または標識デオキシリボヌクレオチドを含有
する。このキットに含まれる酵素は好ましくは耐熱性の
ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼであ
る。
【００２７】本発明の更なる態様は核酸の検出方法であ
って、該方法は、(a) 核酸を検出しようとするサンプル
を用意し、(b) 閉鎖デバイス内で、検出すべき核酸に特
異的な少なくとも１種の核酸プライマーおよび検出すべ
き核酸に特異的な少なくとも１種の捕捉プローブの存在
下で核酸を増幅し、その際、捕捉プローブは該デバイス
の少なくとも１つの光学的に透明な内面に固定化されて
おり、かつ蛍光標識が増幅産物に組み込まれ、そして
(c) 増幅産物を固定化捕捉プローブに結合させて、一過
性に誘導された蛍光により核酸を検出する、ことを含ん
でなる。
って、該方法は、(a) 核酸を検出しようとするサンプル
を用意し、(b) 閉鎖デバイス内で、検出すべき核酸に特
異的な少なくとも１種の核酸プライマーおよび検出すべ
き核酸に特異的な少なくとも１種の捕捉プローブの存在
下で核酸を増幅し、その際、捕捉プローブは該デバイス
の少なくとも１つの光学的に透明な内面に固定化されて
おり、かつ蛍光標識が増幅産物に組み込まれ、そして
(c) 増幅産物を固定化捕捉プローブに結合させて、一過
性に誘導された蛍光により核酸を検出する、ことを含ん
でなる。
【００２８】本発明はまた核酸検出用の試薬キットに関
し、該キットは、(a) デバイスの透明な内面に固定化さ
れた少なくとも１種の捕捉プローブを含有する、核酸の
増幅および検出のためのデバイス、(b) 少なくとも１種
の核酸プライマー、(c) 任意に、デオキシリボヌクレオ
チド、(d) 任意に、核酸プライマーを伸長するのに適し
た酵素、(e) 蛍光標識、および(f) 任意に、一過性に誘
導された蛍光により増幅産物を検出するための手段、を
含んでなる。
し、該キットは、(a) デバイスの透明な内面に固定化さ
れた少なくとも１種の捕捉プローブを含有する、核酸の
増幅および検出のためのデバイス、(b) 少なくとも１種
の核酸プライマー、(c) 任意に、デオキシリボヌクレオ
チド、(d) 任意に、核酸プライマーを伸長するのに適し
た酵素、(e) 蛍光標識、および(f) 任意に、一過性に誘
導された蛍光により増幅産物を検出するための手段、を
含んでなる。
【００２９】この試薬キットはまた、閉鎖系での一体化
された核酸の増幅および検出にも有利に使用される。上
記方法および試薬キットの好ましい特徴は本発明の第１
の態様に関して上述したとおりである。
された核酸の増幅および検出にも有利に使用される。上
記方法および試薬キットの好ましい特徴は本発明の第１
の態様に関して上述したとおりである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレゴール サグネア ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペン ツバーグ，マイケルベックシュトラーセ 16
Claims (20)
- 【請求項１】 核酸の検出方法であって、 (a) 核酸を検出しようとするサンプルを用意し、 (b) デバイス内で、検出すべき核酸に特異的な少なくと
も１種の核酸プライマーおよび検出すべき核酸に特異的
な少なくとも１種の捕捉プローブの存在下で核酸を増幅
し、その際、捕捉プローブは該デバイスの少なくとも１
つの内面に固定化されており、かつ核酸と捕捉プローブ
とのハイブリッドが核酸とプライマーとのハイブリッド
より低い融解温度をもつように選択されており、前記増
幅は核酸とプライマーとのハイブリッドが安定している
が核酸と捕捉プローブとのハイブリッドは不安定である
ような条件下で行い、そして (c) 固定化した捕捉プローブに増幅産物を結合させるこ
とにより核酸を検出する、ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記反応の間は閉鎖された単一のデバイ
ス内で前記増幅および検出を行うことを特徴とする、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 捕捉プローブが前記デバイスの光学的に
透明な内面に固定化されていることを特徴とする、請求
項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記増幅産物に蛍光標識が組み込まれる
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項５】 前記増幅産物の捕捉プローブへの結合が
一過性に誘導された蛍光によって検出されることを特徴
とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 核酸およびペプチド核酸から選択される
固定化捕捉プローブを用いることを特徴とする、請求項
１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記反応をマイクロタイタープレートの
ウェルで行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項８】 異なる捕捉プローブのそれぞれが前記デ
バイスの異なる位置に固定化されていることを特徴とす
る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 別様に標識された種々のプライマーを用
いることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１０】 核酸検出用の試薬キットであって、 (a) デバイスの少なくとも１つの内面に固定化された少
なくとも１種の捕捉プローブを含有する、核酸の増幅お
よび検出のためのデバイス、 (b) 少なくとも１種の核酸プライマー、 (c) 任意に、デオキシリボヌクレオチド、および (d) 任意に、核酸プライマーを伸長するのに適した酵
素、 を含んでなり、前記捕捉プローブは検出すべき核酸と捕
捉プローブとのハイブリッドが検出すべき核酸とプライ
マーとのハイブリッドより低い融解温度をもつように選
択されることを特徴とするキット。 - 【請求項１１】 捕捉プローブが前記デバイスの光学的
に透明な表面に固定化されていることを特徴とする、請
求項１０に記載のキット。 - 【請求項１２】 前記デバイスが閉鎖系であることを特
徴とする、請求項１０または１１に記載のキット。 - 【請求項１３】 蛍光標識を含有することを特徴とす
る、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のキット。 - 【請求項１４】 前記酵素が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
であることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか
１項に記載のキット。 - 【請求項１５】 閉鎖系で核酸の増幅および検出を一体
化して行うための請求項１０〜１４のいずれか１項に記
載の試薬キットの使用。 - 【請求項１６】 核酸の検出方法であって、 (a) 核酸を検出しようとするサンプルを用意し、 (b) 閉鎖デバイス内で、検出すべき核酸に特異的な少な
くとも１種の核酸プライマーおよび検出すべき核酸に特
異的な少なくとも１種の捕捉プローブの存在下で核酸を
増幅し、その際、捕捉プローブは該デバイスの少なくと
も１つの光学的に透明な内面に固定化されており、かつ
蛍光標識が増幅産物に組み込まれ、そして (c) 増幅産物を固定化捕捉プローブに結合させて、一過
性に誘導された蛍光により核酸を検出する、 ことを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 請求項１、２および６〜９のいずれか
１項に記載の特徴をさらに含んでなる、請求項１６に記
載の方法。 - 【請求項１８】 核酸検出用の試薬キットであって、 (a) デバイスの透明な内面に固定化された少なくとも１
種の捕捉プローブを含有する、核酸の増幅および検出の
ためのデバイス、 (b) 少なくとも１種の核酸プライマー、 (c) 任意に、デオキシリボヌクレオチド、 (d) 任意に、核酸プライマーを伸長するのに適した酵
素、 (e) 蛍光標識、および (f) 任意に、一過性に誘導された蛍光により増幅産物を
検出するための手段、を含むことを特徴とする試薬キッ
ト。 - 【請求項１９】 請求項１０、１２および１４のいずれ
か１項に記載の特徴をさらに含んでなる、請求項１８に
記載の試薬キット。 - 【請求項２０】 閉鎖系で核酸の増幅および検出を一体
化して行うための請求項１８または１９に記載の試薬キ
ットの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19730359A DE19730359A1 (de) | 1997-07-15 | 1997-07-15 | Integriertes Verfahren und System zur Amplifizierung und zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| DE19730359:5 | 1997-07-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1169998A true JPH1169998A (ja) | 1999-03-16 |
Family
ID=7835805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10200212A Pending JPH1169998A (ja) | 1997-07-15 | 1998-07-15 | 核酸の増幅および検出のための一体化された方法 ならびにシステム |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6270965B1 (ja) |
| EP (1) | EP0892070B1 (ja) |
| JP (1) | JPH1169998A (ja) |
| AT (1) | ATE398186T1 (ja) |
| DE (2) | DE19730359A1 (ja) |
| ES (1) | ES2307306T3 (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000036151A1 (en) * | 1998-12-14 | 2000-06-22 | Li-Cor, Inc. | A heterogeneous assay for pyrophosphate detection |
| DE10002566A1 (de) * | 2000-01-21 | 2001-08-02 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren und Einrichtung zur Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen, wie z. B. DNA-Sequenzen, in einer Probe |
| US7829313B2 (en) * | 2000-03-24 | 2010-11-09 | Eppendorf Array Technologies | Identification and quantification of a plurality of biological (micro)organisms or their components |
| US7875442B2 (en) * | 2000-03-24 | 2011-01-25 | Eppendorf Array Technologies | Identification and quantification of a plurality of biological (micro)organisms or their components |
| KR20010097731A (ko) * | 2000-04-25 | 2001-11-08 | 김희태 | 다양한 종류의 특이 핵산 시발자( 이하 프라이머 )를피씨알 튜브안에 함께 부착하여 핵산 중합 반응( 이하피씨알 )을 함께 수행하여 준 뒤 여기에 표지자가 부착된탐침자( 이하 프로브 )를 핵산 결합 반응을 시켜주어유전정보를 알 수 있게 하는 실험기법. |
| DE10214019A1 (de) * | 2002-03-30 | 2003-10-16 | Detlef Mueller-Schulte | Lumineszierende, sphärische, nicht autofluoreszierende Silicagel-Partikel mit veränderbaren Emissionsintensitäten und -frequenzen |
| DE60321961D1 (de) * | 2002-11-07 | 2008-08-14 | Yoichi Matsubara | Verfahren zum genmutationsnachweis |
| US7429923B2 (en) * | 2004-10-22 | 2008-09-30 | Honeywell International Inc. | Neuronal sensor networks |
| US20060088844A1 (en) * | 2004-10-22 | 2006-04-27 | Honeywell International Inc. | Real-time PCR microarray based on evanescent wave biosensor |
| WO2008092291A1 (en) * | 2007-01-17 | 2008-08-07 | Honeywell International Inc. | Microarray reader based on evanescent wave detection and method of reading a microarray |
| US9650668B2 (en) | 2008-09-03 | 2017-05-16 | Nabsys 2.0 Llc | Use of longitudinally displaced nanoscale electrodes for voltage sensing of biomolecules and other analytes in fluidic channels |
| US8262879B2 (en) | 2008-09-03 | 2012-09-11 | Nabsys, Inc. | Devices and methods for determining the length of biopolymers and distances between probes bound thereto |
| KR101236695B1 (ko) | 2010-03-04 | 2013-02-25 | 케이맥(주) | 가지상 ｄｎａ 복합체의 형성 촉진을 통한 핵산 검출 방법 |
| WO2011143791A1 (en) | 2010-05-20 | 2011-11-24 | Honeywell International Inc. | Microarray reader based on evanescent wave detection |
| JP5998148B2 (ja) | 2010-11-16 | 2016-09-28 | ナブシス ２．０ エルエルシー | ハイブリダイズされたプローブの相対位置を検出することによる生体分子のシークエンシングのための方法 |
| US11274341B2 (en) | 2011-02-11 | 2022-03-15 | NABsys, 2.0 LLC | Assay methods using DNA binding proteins |
| US8703653B2 (en) | 2011-02-18 | 2014-04-22 | NVS Technologies, Inc. | Quantitative, highly multiplexed detection of nucleic acids |
| US9914966B1 (en) | 2012-12-20 | 2018-03-13 | Nabsys 2.0 Llc | Apparatus and methods for analysis of biomolecules using high frequency alternating current excitation |
| EP2956550B1 (en) * | 2013-01-18 | 2020-04-08 | Nabsys 2.0 LLC | Enhanced probe binding |
| US10040069B2 (en) | 2015-07-23 | 2018-08-07 | General Electric Company | Amplification and detection of nucleic acids |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5192510A (en) * | 1991-01-30 | 1993-03-09 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Apparatus for performing fluorescent assays which separates bulk and evanescent fluorescence |
| GB9119735D0 (en) * | 1991-09-16 | 1991-10-30 | Secr Defence | Gene probe biosensor method |
| EP0717779B1 (en) * | 1992-04-06 | 2001-10-31 | Abbott Laboratories | Method and device for detection of nucleic acid or analyte using total internal reflectance |
| DE69327326T2 (de) * | 1992-07-24 | 2001-08-16 | Diatech Pty. Ltd., Brisbane | Vervielfältigungs- und detektionsprozess |
| US5599668A (en) * | 1994-09-22 | 1997-02-04 | Abbott Laboratories | Light scattering optical waveguide method for detecting specific binding events |
| CA2229226A1 (en) * | 1995-08-14 | 1997-02-27 | Abbott Laboratories | All-in-one nucleic acid amplification assay |
-
1997
- 1997-07-15 DE DE19730359A patent/DE19730359A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-07-14 EP EP98113091A patent/EP0892070B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-14 DE DE59814239T patent/DE59814239D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-14 ES ES98113091T patent/ES2307306T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-14 AT AT98113091T patent/ATE398186T1/de active
- 1998-07-15 JP JP10200212A patent/JPH1169998A/ja active Pending
- 1998-07-15 US US09/115,906 patent/US6270965B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| US6270965B1 (en) | 2001-08-07 |
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| ES2307306T3 (es) | 2008-11-16 |
| EP0892070A3 (de) | 2003-07-09 |
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