KR0173133B1 - 생체외 증폭을 이용한 폴리뉴클레오티드 검체분석 - Google Patents

생체외 증폭을 이용한 폴리뉴클레오티드 검체분석 Download PDF

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Abstract

검체 서열을 가진 검체 폴리뉴클레오티드 가닥은 혼성화 조건하에서 포획 프로브와 검체 폴리뉴클레오티드를 접촉시킴으로써 폴리뉴클레오티드를 함유한 샘플내에서 검출되고, 여기서 포획 프로브는 고체상 제2결합 파트너에 특이적인 제1결합 파트너를 가진다.
그런다음 결과 듀플렉스는 결합 파트너들간의 특이적 결합으로 고정되고 비-결합된 폴리뉴클레오티드는 결합된 종들로부터 분리된다.
검체 폴리뉴클레오티드는 고체상으로부터 선택적으로 치환된 다음 PCR로 증폭된다. PCR 프라이머는 각각 검체 폴리뉴클레오티드 영역에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 영역을 가지고 프라이머를 적어도 하나는 고체상 결합 파트너를 결합시킬 수 있는 추가의 결합 파트너중 더 가진다.
그런다음 증폭된 생성물은 결합 파트너간의 특이적 결합으로 반응 혼합물로 부터 분리되고 증폭 생성물은 검출된다.

Description

[발명의 명칭]
생체외 증폭을 이용한 폴리뉴클레오티드 검체분석
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 핵산화학 및 생화학 분석의 분야에 관한 것이다.
더 상세히는 본 발명은 신규한 폴리뉴클레오티드 증폭(polynucleotide amplification)과 검출방법 및 시약에 관한 것이다.
[발명의 배경]
핵산 혼성화(hybridization)는 이제는 유전자 연구, 생약학적 연구 및 임상진단에 있어 통상 이용되고 있다. 기본적인 핵산 혼성화 분석은 단일가닥 검체 핵산(DNA 또는 RNA의 어느 하나)을 표지된 핵산 프로프(labeled nucleic acid probe)와 혼성화시키고 얻어진 표지된 듀플렉스(duplex)를 검출하는 것이다. 방사성 또는 비방사성 표지가 모두 사용되었다.
외래물질로부터 검출되는 듀플렉스의 분리를 용이하게 하기 위해 및/ 또는 검출되는 신호(signal)를 증폭하기 위해 이러한 기본적인 스킴에 대해 여러 변형방법이 개발 되었다.
미국 특허출원 제 807,624호(1985.12.11.출원)는 검체 핵산을 표지화 프로브 세트(labeling probe set)와 포획 프로브 세트(capturing probe set)와 혼성화시키는 용액상 핵산 혼성화 분석법을 기술하고 있다. 프로브-검체 복합체(complex)는 포획 프로브 세트에 상보적인 고체-지지 포획 프로브와 혼성화에 의해 커플링된다. 이로써 검체 핵산은 고체상 복합체로써 용액으로부터 분리된다. 고체상 복합체 형태의 검체를 얻으면 분석의 다음 분리단계가 용이해진다. 표지화 프로브 세트는 혼성화를 통해 고체상/ 검체 복합체와 결합하는 표지된 프로브와 상보적(complementery)이다.
PCT 출원 84/03520 및 EPA 124221은 효소-표지 올리고뉴클레오티드에 상보적인 테일(tail)을 가진 단일가닥 DNA 프로브에 검체를 어닐링( annealing) 하고 (2) 얻은 테일된 듀플렉스를 효소-표지 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키는 DNA 혼성화 분석법을 기술하고 있다. Enzo Biochem Bio-Bridge표지법은 이들 두 특허출원에 기재된 방법과 비슷한 것으로 보인다. Bio-Bridge법은 말단 데옥시뉴클레오티드 트랜스페라제를 이용하여 변형되지 않은 3'-폴리T-테일을 DNA 프로브에 가한다.폴리T-테일 프로브를 표적 DNA 서열에 이어서 비오틴-변형 폴리A와 혼성화시킨다.
EPA 204510은 폴리-dT 테일과 같은 테일, 프로브의 테일에 혼성화되고 복수의 표지된 가닥과 결합할 수 있는 폴리-dA 서열과 같은 서열을 갖는 증폭자(amplifier) 가닥과 검체 DNA를 접촉시키는 DNA혼성화 분석법을 기술하고 있다.
콜린스 등의 미국특허 제 4,818,680호는 표적 DNA 서열을 부분적인 이중가닥 프로브로부터의 표지된 신호가닥과 치환하는 폴리뉴클레오티드 치환분석법을 개시하였다. 치환된 신호가닥은 혼성화에 의해 포획 프로브에 포획되고 세척후에 남은 표지된 신호가닥의 양을 정량화한다.
베리의 미국특허 제 4,795,701호는 신호가닥으로 바람직하게는 RNA를 사용하여 프로브시약을 DNA/RNA 프로브/신호가닥 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 를 만드는 다른 폴리뉴클레오티드 치환분석법을 개시하였다. 치환된 단일가닥의 양은 치환된 가닥을 각각의 뉴클레오티드로 소화(digestion)하고 그렇게 생성된 ADP를 ATP로 전환시켜 이 반응에 의해 루시페라제(luciferase)로 ATP를 분석함으로써 정량화한다. 이 방법의 결점은 이것이 치환된 신호가닥만의 완전한 소화에만 의존하고, 샘플에 자연적으로 존재하는 ATP 때문에 높은 배경수준을 나타내고, 신호는 신호가닥의 아데노신 함량에 따라 변하게 된다는 단점이 있다.
이들 종래의 혼성화 분석법의 주된 문제점은 이들이 충분한 특이성(specificity) 및/ 또는 매우 낮은 수준의 검체를 분석하는데 유용한 신호를 결여하고 있다는 것이다. 본 발명의 주목적은 재현성이 높은 신호, 재현성이 높은 신호-대-노이즈(noise) 비 그리고 비특이적 결합이 낮으며 스스로 재현성이 있고 특이적으로 일반적인 신호 부분과 낮은 농도의 검체가 결합하여 안정한 복합체를 형성할 수 있는 핵산 혼성화법에 유용한 증폭을 제공하는 것이다.
DNA 증폭, 폴리머라제 사슬반응(PCR) 기술의 개량은 물리스 등의 미국특허 4,683,195 및 4,683,202에 개시되어 있고 이것을 본 명세서에 참고로 통합한다. PCR 기술에서는 소망하는 서열의 대향 말단과 매칭(matching)되는 짧은 올리고뉴클레오티드 프라이머(primer) 사이의 서열은 알 필요가 없다. DAN(또는 RNA) 샘플을 추출하고 변성시킨다(바람직하게는 열에 의해). 이어서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 dNTP와 폴리머라제 (바람직하게는 열에 안정한 Taq 폴리머라제)와 함께 몰 과량으로 첨가한다. DNA가 복제되고 다시 변성된다. 이 결과로 각각의 프라이머에서 시작한 두 개의 긴 산물(long product)과 두 개의 원(original)가닥 (듀플렉스 DNA 분자당)이 얻어진다.
이어서 반응 혼합물을 중합조건 (예컨대 온도를 낮추거나, 변성제를 불활성화시키거나 폴리머라제를 첨가하는 것 등)으로 되돌려 두번째 사이클이 개시된다. 두번째 사이클은 두개의 원가닥, 사이클1로부터의 두개의 긴 산물, 두개의 새로운 긴산물(원가닥에서 복제된)과 긴 산물로부터 복제된 두개의 짧은 산물(short product) 을 제공한다. 짧은 산물은 각각의 말단에서 프라이머로 표적서열(sence 또는 antisense)의 서열을 갖는다. 각각의 추가적인 사이클에서 추가로 두 개의 긴 산물이 생성되고 다수의 짧은 산물은 이전 사이클의 말단에 남아있는 긴 그리고 짧은 산물의 수와 같다. 따라서 짧은 산물의 수는 매사이클마다 지수적으로 증가한다. 이러한 특이적 검체서열의 증폭에 의해서 극히 소량의 DNA도 검출할 수 있다.
최근에 출현한 PCR기술은 극미량(1 fg)에 존재하는 특이적 DNA 서열의 검출을 가능하게 하였다. 그러나 검출한계 근처에서 정확한 결과를 얻기 위해서는 외래 DNA의 오염을 피하기 위하여 극히 조심하지 않으면 안된다. 샘플에서 유래하는 DNA가 아닌 유리용기나 시약에 존재하는 DNA가 증폭되어 잘못된 결과가 초래될 가능성이 있다.
[본 발명의 개시]
본 발명은 현행 분석법의 문제점과 단점을 극복하는 것이다. 본 발명은 표적서열의 정제와 PCR산물의 신속한 검출을 제공한다. 본 발명의 방법에서는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 샘플을 검체 서열과 혼성화할 수 있는 포획 프로브와 혼성화 조건에서 접촉시켜 검체-포획 프로브 듀플렉스를 형성함으로써 검체 폴리뉴클레오티드 가닥에 대하여 샘플을 분석하며, 여기서 포획 프로브는 검체-결합영역과 제1특이적 결합 파트너(partner)로 이루어진 것이다. 검체-결합영역은 검체 폴리뉴클레오티드의 구역과 혼성화할 수 있으며, 제1특이적 결합 파트너는 제2결합 파트너에 특이적이다. 제2결합 파트너는 제1지지체 위에 고정된다. 이어서 듀플렉스를 제2결합 파트너와 접촉시키고 따라서 지지체 위에 듀플렉스를 고정한다. 비결합 폴리뉴클레오티드는 전형적으로는 세척에 의해 상기 샘플에서 제거된다. 검체-포획 프로브 복합체는 지지체로부터 선택적으로 치환되어 검체 폴리뉴클레오티드의 제1프라이머-결합영역에 상보적인 제1프라이머와 혼성조건하에 접촉된다. 달리 지지체에 결합되어 있는 동안 프로브를 혼성할 수도 있다. 검체 뉴클레오티드에 상보적인 가닥을 뉴클레오티드 중합(예컨대 뉴클레오티드 폴리머라제를 사용)에 의해 합성하여 검체-상보적 가닥 듀플렉스를 형성한다. 이어서 듀플렉스를 변성시키고 두 가닥을 프라이머(상보적 가닥을 그것과 혼성화할 수 있는 제2프라이머와 접촉시킨다)와 접촉시킨 후,검체 서열의 사본(copy)과 상보적 가닥의 다른 사본을 만든다. 다음에 듀플렉스를 변성시키고 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드가 될 때까지 이 과정을 반복한다. 그후 폴리뉴클레오티드를 검출하여 검체 서열의 존재를 지시한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 용액 등을 포함하는 여러 인자에 의존한다. 예컨대 진단적용에 있어서, 검체서열의 복잡성에 의존하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로는 15-20 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하며 그보다 적게 포함할 수도 있다. 일반적으로 짧은 프라이머는 주형(template)과 충분히 안정한 혼성복합체를 형성하기 위하여 더 낮은 온도가 필요하다.
여기에서의 프라이머는 증폭되는 각 표적 뉴클레오티드 서열의 서로 다른 가닥에 실질적으로상보적이다. 이것은 프라이머가 중합조건하에 각각의 가닥과 혼성화될 수 있도록 충분히 상보적이어야 한다는 것을 의미한다. 따라서 프라이머 서열은 주형의 정확한 서열을 반영할 필요가 없다. 예컨대, 비상보적 뉴클레오티드 서열은 프라이머의 5'-말단에 부착될 수 있으며 프라이머 서열의 나머지는 그 가닥에 상보적이다. 달리, 프라이머 서열이 혼성화되기 위해 증폭되는 가닥의 서열과 충분히 상보적이어서 다른 프라이머의 신장 산물의 합성을 위한 주형을 형성할 수 있다면, 비상보적 염기 또는 더 긴 서열은 프라이머내로 삽입될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 사용되는 프라이머는 DNA 중합반응을 시발할 수 있고 하기의 특이적 결합 파트너에 커플될 수 있는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함한다. 검체 뉴클레오티드 및 검체 가닥이란 용어는 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 단일-또는 이중-가닥의 핵산분자를 지칭한다.
검체-상보적 가닥 이란 용어는 제1프라이머에서 시작하고 폴리머라제 작용의 방향을 따라 신장하고 검체 폴리뉴클레오티드의 해당 부분에 상보적인 가닥을 형성하는 폴리뉴클레오티드 가닥을 지칭한다. 검체 사본가닥 이란 용어는 검체-상보적 가닥에 상보적인 뉴클레오티드로서 (그래서 원래의 검체 뉴클레오티드와 실질적으로 동일하다) 시발점에서 제2프라이머를 가지며 제1프라이머에 상보적인 영역의 시발점까지 신장된다. 검체 사본/상보적 듀플렉스 뉴클레오티드라는 용어는 검체 상보가닥에 혼성화되는 검체 사본가닥으로 구성된 이중가닥 분자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 결합 파트너란 용어는 예컨대 항체와 그것에 대해 특이적인 모노클론 항체에서의 경우와 같이 높은 특이성으로 리간드 분자를 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 일반적으로 특이적 결합 파트너는 검체사본/ 상보가닥 듀플렉스(포획 프로브의 경우)를 반응 및 분리조건하에 고정시키기에 충분한 친화성을 가져야 한다. 다른 특이적 결합 파트너는 이 기술분야에서 공지된 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙트 아비딘, IgG 및 단백질 A, 그리고 수많은 수용체-리간드 커플을 포함한다. 본 발명의 실시에 있어서, 바람직한 결합 파트너는 상보적인 뉴클레오티드 가닥이다. 포획 프로브의 특이적 결합 뉴클레오티드는 바람직하게는 적어도 약 15-40 염기의 길이를 가지며, GC 함량이 약 40-60%이다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 합성 DNA 유사체로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 포획 프로브라는 용어는 결합 파트너에 커플된 단일가닥 폴리뉴클레오티드로 이루어진 분자를 지칭한다. 단일가닥 폴리뉴클레오티드 영역은 검체 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적이고 고체표면에 검체 폴리뉴클레오티드를 고정하는데 충분한 친화성을 줄 수 있게 충분히 길고 매칭된다(결합 파트너를 통해). 결합 파트너는 고체 지지체의 표면에 결합되는 제2결합 파트너에 특이적이다.
본 명세서에서 사용된 커플이란 용어는 공유결합 또는 강한 비공유결합에 의한 부착을 지칭한다(예컨대, 강한 리간드-수용체 결합 및 관련된 상호작용). 공유결합은 에스테로, 에테르, 포스포에스테르, 아미드, 펩티드, 이미드, 탄소-황 결합, 탄소-인 결합 등일 수 있으며 본 발명에서 바람직하다.
지지체란 용어는 특이적 결합 파트너가 정착할 수 있는 어떠한 고체 또는 반고체 표면을 지칭한다. 적절한 지지체에는 유리, 플라스틱, 금속 중합체 겔 등이 있으며, 비드, 웰, 봉, 막 등의 형태를 취할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 지지체는 폴리스티렌 비드 또는 마이크로타이터 디쉬 웰이다.
본 명세서에서 사용된 표지라는 용어는 검출가능한(바람직하게는 정량적으로) 신호를 제공하고 핵산 또는 단백질에 부착될 수 있는 어떠한 원자나 분자를 지칭한다. 표지는 형광, 방사도, 색도, X-선 회절 또는 흡수, 자장, 효소 활성도 등에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다. 적절한 표지는 특이적 결합 파트너를 가지는 리간드, 효소, 전자-고밀화제(electron-dense reagent), 방사성 원자(특히32p 및125I), 발색단 및 발광단을 포함한다. 효소는 전형적으로는 그들의 활성에 의해 검출된다. 예컨대 양고추냉이(horseradish) 페록시다제는 보통 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(TMB)을 청색 색소로 전환시키는 능력에 의해 검출되며, 스펙트로포토메타에 의해 정량될 수 있다. 상기 기재는 여러 표지를 구분되는 종류로 나누려는 것이 아니고 같은 표지라도 여러 가지 상이한 방식으로 기능할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대,125I는 방사성 표지 또는 전자-고밀화제로서 기능할 수 있다. HRP는 MAb에 대한 항원 또는 효소로서 기능할 수 있다. 또한, 소망하는 효과를 위해서 여러 표지를 결합할 수 있다. 예컨대, Mab 및 아비딘은 본 발명의 실시에 있어서 표지를 필요로 한다. 따라서 프로브를 비오틴으로 표지하고125I로 표지된 아비딘으로 그 존재를 검출하거나 HRP로 표지된 안티-비오틴 MAb로써 한다. 다른 교환이나 가능성은 이 분야의 전문가에게 명백할 것이며 균등물로써 본 발명의 범위내로 간주되어야 한다.
특이적 혼성화란 용어는 프로브와 샘플 검체 사이에 정확한 상보성이 필요한 엄격한 혼성화 조건을 지칭한다. 그런 조건은 이 분야의 기술자에게는 자명한 사항이며 서열의 길이와 염기조성에 의존한다. 일반적으로 혼성화 용액의 온도, 이온강도 및 카오트로픽화제(chaotropic agent)의 농도를 변화시켜 정확한 매칭이 없이 실질적으로 서열이 혼성화되지 않는 조건을 얻는다. DNA에 결합된 서열의 혼성화에 대해서 표준조건(0.9M NaCl)하에서 최적온도를 계산하는 실험식은 다음과 같다.
T(℃) = 4(NG+NC) + 2(NA+ NT)-5℃
상기식에서 NG, NC, NA및 NT는 서열의 G,C,A 및 T 염기의 수이다(J. Meinkoth 등, Anal Biochem(1984) 138:267-84).
[일반적인 방법]
포획 프로브 및 프라이머는 통상의 핵산 합성기술로 제조한다.
본 발명의 방법은 다음과 같이 실시될 수 있다. 검체 핵산(바람직하게는 단일가닥)을 포함하는 샘플을 과량의 단일가닥 핵산 포획프로브(또는 프로브 세트)로 혼성화 조건하에 배양(incubation)하는데, 이것은 검체에 상보적인 제1결합서열과 고체상 제2결합 파트너에 특이적인 치환가능한 제1결합 파트너, 바람직하게는 고체상에 결합된 단일가닥 올리고뉴클레오티드에 상보적인 결합 뉴클레오티드를 가진다. 그 결과 하나 또는 그 이상의 프로브가 결합된 검체 폴리뉴클레오티드가 얻어진다. 프로브의 제2결합서열은 그들이 검체에 상보적이지 않기 때문에 단일가닥 테일로서 남는다. 각각의 유형의 복수개의 프로브를 사용할 수 있으며 프로브는 동일 또는 상이한 혼성화 서열을 가질 수 있고 동일 또는 상이한 결합 파트너를 가질 수 있다. 중첩되지 않는 여러개의 포획 프로브(포획 프로브 세트)를 사용하는 것이 바람직하다.
이 복합체는 제2특이적 결합 파트너, 바람직하게는 포획 프로브의 결합서열에 상보적인 것에 결합된 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 가지는 고체상에 결합조건하에 첨가된다. 포획 프로브 세트가 사용되는 경우에 동일한 결합 파트너를 사용하는 것이 바람직하며, 제1 및 제2결합 파트너가 폴리뉴클레오티드(즉, 각각의 포획 프로브는 유일한 검체결합영역을 가지지만 동일한 제1결합 파트너 서열을 공유할 수 있다) 인 경우 특히 그러하다. 얻어진 산물은 고체상에 결합된 올리고뉴클레오티드와 포획 프로브의 제2결합 서열에 의해 형성된 듀플렉스를 통해 고체상에 결합된 복합체로 이루어진다. 결합 복합체를 가진 고체상은 비결합 물질로부터 일반적으로는 세척에 의해 분리된다.
미결합 물질의 분리후에 고체지지체로부터 검체 뉴클레오티드를 선택적으로 치환할 수 있다. 제1 및 제2결합 파트너가 올리고뉴클레오티드인 경우에는 제1결합 파트너 또는 제2결합 파트너에 더 높은 친화성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 첨가하고 올리고뉴클레오티드를 치환하여 결합 파트너와 혼성화시킴으로써 이 치환이 실행될 수 있다(프로브 치환에 관하여 베리의 미국특허 제4,795,701호의 실시예 참조, 전게서). 여러 가지 올리고뉴클레오티드의 친화성은 프로브의 길이 및 염기쌍 매칭의 충실도를 증가시켜 친화도를 높여 조절하거나 불일치(mismatching)시켜서 친화도를 감소시켜 조절할 수 있다. 제1 및 제2결합 파트너가 단백질인 경우에 고친화성의 리간드(또는 고농도)로 경쟁을 유발하거나 완충조건을 변경(예컨대, 용질의 농도를 증감하거나 용매를 변경하는 등)시키거나 적절한 프로테아제를 가하여 치환을 유발할 수 있다. 달리, 적절한 조건하에 치환없이 계속할 수도 있다. 표적서열이 고체지지체에 결합된 검체영역으로부터 충분한 거리를 두고 이격되어 있을 때, 즉 프라이머 결합영역과 포획 프로브 결합영역 사이에 충분한 격리가 있을 때 표적서열의 PCR증폭을 실행하는 것이 가능하다. 선행의 치환없이 표적서열을 증폭하는 것이 바람직하다면, 프라이머 결합영역과 포획프로브 결합영역은 적어도 500bp 이격되게 선택되어야 한다.
생물학적 유체 및 고체, 음식물, 환경물질, 법정 또는 고고학적 샘플 등을 포함하는 여러 공급원으로부터 검체핵산을 얻을 수 있고 여러 가지 수단, 예컨대 프로테아제 K/SDS, 카오트로픽 염 등에 의해 혼성화 분석을 위해 제조될 수 있다. 또한 효소적, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 예컨대 제한효소, 초음파처리, 화학적 분해(예컨대 금속이온) 등에 의해 검체핵산의 평균 크기를 줄이는 것이 유익할 수 있다. 단편은 0.1kb 만큼 작게 할 수도 있지만, 보통은 적어도 약0.5kb이고 1kb 또는 그 이상일 수도 있다. 검체서열은 분석을 위한 단일가닥 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 서열이 단일가닥 형태로 자연히 존재하는 경우에 의미있는 2차구조가 존재하지 않는다면 변성은 보통 불필요하다. 변성은 여러 가지 기술, 예컨대 알칼리처리 일반적으로는 0.05 내지 0.2M 수산화물, 포름 아미드, 염, 열, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
검체서열에 상보적인 포획 프로브의 서열은 각각 적어도 15 뉴클레오티드(nt), 보통은 적어도 25nt, 바람직하게는 약 5kb 이하, 보통은 약 1kb 이하, 바람직하게는 약 100nt 이하인 것이 바람직하다. 이들은 전형적으로는 약 30-50nt이다. 이들은 정상적으로는 검체의 상이한 서열에 결합하도록 선택될 것이다. 검체결합서열은 여러 기준에 근거해서 선택될 수 있다. 검체의 성질에 따라서, 일치되는 서열, 다형현상과 관련된 서열, 특히 표현형 또는 유전형, 특별한 균주에 관심을 가질 수 있다.
포획기 프로브 또는 프로브 세트의 검체결합서열의 적절한 선택에 의해서, 상이한 핵산분자의 일부로 존재하는 특별한 유전자 또는 다른 서열을 포함하는 특이적 핵산 분자를 동정(indentification) 할 수 있다. 주어진 서열을 역시 포함하는 다른 분자로부터 관심있는 핵산분자를 식별하기 위하여, 프로브중의 하나는 주어진 서열에 상보적이 되도록 만들고 다른 것은 그 분자에 유일한 서열을 갖는 분자의 다른 서열에 상보적이 되게 만든다.
포획 프로브의 특이적 결합 파트너는 고체상에 부착된 제2결합파트너에 특이적으로 결합하고 샘플/검체의 내부성분과 만나지 않도록 선택된다. 제1 및 제2결합파트너로서 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 결합서열은 포획 프로브의 검체결합서열에 인접하거나 중간의 비상보적 서열에 의해 이격될 수 있다. 프로브는 소망에 따라 다른 비상보적 서열을 포함할 수 있다. 이들 비상보적 서열은 결합서열의 결합을 방해하거나 발생하는 비특이적 결합을 유발해서는 안된다. 포획 프로브는 올리고뉴클레오티드 합성방법 또는 클로닝에 의해 제조될 수 있고 전자가 바람직하다.
결합서열의 호모듀플렉스를 제공하는데 필요한 완벽한 상보성을 가질 필요는 없는 것으로 이해되어야 한다. 많은 경우에 약 10-30% 이하의 염기가 불일치되고 5 또는 그이상의 뉴클레오티드의 루프를 무시하고, 헤테로듀플렉스는 만족된다. 따라서 본 명세서에서 사용된 상보성이란 용어는 안정한 듀플렉스 구조를 제공하기에 충분한 상보성의 정도를 의도하는 것이다. 본 발명의 실시예에서 더 큰 상보성을 가지는 폴리뉴클레오티드로 혼성화에 의해 결합파트너를 치환할 수 있도록 헤테로듀플렉스를 사용하는 것이 바람직하다.
본 분석법에서 사용된 고체상(solid phase)은 입상 또는 고상, 특히 어떠한 형태의 용기 예컨대 원심분리 튜브, 칼럼, 마이크로타이터 플레이트 웰, 필터, 튜빙 등의 고체벽 표면도 가능하다. 입자가 사용될 때, 그 크기는 약 0.4 내지 200미크론 범위가 바람직하고 약 0.8 내지 4.0㎛인 것이 더 바람직하다. 입자는 라텍스, 폴리스티렌 또는 유리와 같은 어떠한 편리한 물질도 가능하다. 폴리스티렌 비드 및 마이크로타이터 플레이트는 본 발명의 바람직한 고체표면이다. 고체상 결합 파트너는 공지의 방법에 의해 작용기를 통해 고체표면에 안정하게 부착될 수 있다.
표지된 올리고뉴클레오티드는 화학합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 편리한 작용성(functionality)을 갖는 말단기를 제공함으로써 작용성을 통해 여러 가지 표지가 결합될 수 있다. 따라서 카르복시, 티올, 아민, 히드라진, 또는 서열과의 듀플렉스 형성에 나쁜 영향이 없이 여러 가지 표지가 결합될 수 있는 다른 작용성을 제공할 수 있다. 본 발명에서는 아민의 사용이 바람직하다(M. Urdea 등, Nuc Acids Res(1988) 16:4937-56). 이미 지적한 바와 같이, 표지서열에 상보적인 서열에 결합된 복수개의 표지를 한 분자를 얻을 수 있다. 달리, 표지서열에 결합된 리간드를 얻고 그 리간드에 결합하는 표지된 수용체를 사용하여 표지된 검체복합체를 제공할 수 있다.
포획 프로브와 검체의 예상되는 몰에 대한 표지된 프로브의 비는 각각 적어도 화학양론적이어야 하고 과잉인 것이 바람직하다. 정상적으로는 2:1 내지 10,000:1 범위이다. 각각의 프로브의 농도는 일반적으로 10-9내지 10-6M 범위이고 샘플핵산의 농도는 10-21내지 10-12M로 변한다. 본 분석법의 혼성화 단계는 일반적으로 10분 내지 2시간 걸리고, 약 15분에 완료되는 경우가 흔하다. 혼성화는 온화하게 승온하면서 실시될 수 있으며 약 20℃ 내지 80℃가 일반적이고 약 35℃ 내지 70℃가 더 많이 쓰이며 65℃가 특히 좋다.
혼성화 반응은 보통 수성매질에서 행해지며, 여러 첨가제를 포함한 완충 수성매질이 특히 좋다. 사용될 수 있는 첨가제로는 저농도의 세제(0.1 내지 1%), 염, 예컨대 시트로산나트륨(0.017 내지 0.170M), 피콜(Ficoll), 폴리비닐피롤리딘, 담체 핵산, 담체 단백질 등이 있다. 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 알코올 및 포름아미드와 같은 비수성 용매를 수성매질에 첨가할 수 있다. 이들 다른 용매는 약 2 내지 50% 범위의 양으로 존재할 수 있다.
혼성화 매질의 엄격함은 온도, 염 농도, 용매계 등에 의해 조절될 수 있다. 따라서 관심있는 서열의 길이와 성질에 따라 엄격함이 변할 수 있다.
본 분석법의 분리단계에서 사용된 방법은 고체상의 성질에 따라 변할 수 있다. 입자에 대해서 원심분리 또는 여과에 의해 편리하게 입자를 분리하고 상징액을 버리거나 상징액을 분리할 수 있다. 입자를 분석하는 경우에 입자를 완전히, 보통은 1 내지 5회, 적절한 완충매질 예컨대 SDS 또는 NP40과 같은 세제를 함유하는 PBS로 세척할 수 있다. 분리수단이 벽 또는 지지체일 때, 상징액을 분리 또는 버리고 벽을 입자에 대한 것과 같은 방법으로 세척할 수 있다.
적절한 프라이머는 이 분야의 전문가에게 알려진 수단, 예컨대 클로닝 및 적절한 서열의 절단에 의해, 또는 직접 화학합성하여 제조한다. 예컨대 여기에 참고로 포함된 S.A Narang 등의 Meth Enzymol(1979)68:90과 U.S. Pat. No. 4,356,270에 기재된 포스포트리에스테르 방법을 사용할 수 있다.
달리, 여기에 참고로 포함된 E.L.Brown 등의 Meth Enzymol(1979)68:109에 개시된 포스포디에스테르 방법을 사용할 수도 있다. 다른 방법으로는 Beaucage 등의 Tetrahedron Lett(1981) 22:1859-62에 개시된 포스포아미디트 방법과 U.S Pat. No. 4,458,066에 개시된 고체 지지체 방법이 있다. 프라이머도 필요로 한다면 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단으로 검출가능한 수단을 혼입함으로써 표지될 수 있다. 예를들면 프라이머로는32P, 형광 염료, 전자가 조밀한 시약, 효소(ELISA에 흔히 사용 되는 것처럼), 비오틴 또는 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용될 수 있는 헵텐 또는 단백질을 들 수 있다. 표지는 그것이 프라이머에 직접 부착될 경우 변성 조건을 견디어낼 수 있도록 선택되어야 한다.
검체 가닥이 오염물질로부터 분리되었을때 그리고 (필요로 한다면) 고체 지지체로부터 치환되었을 때, 그것은 추가의 핵산 가닥을 합성하기 위한 주형으로 사용될 준비가 된다. 이 합성은 어떤 적당한 방법을 사용하여 행할 수 있다. 반응은 일반적으로 완충 수용액에서 행해지고 바람직하게는 pH7-9, 가장 바람직하게는 약 pH8에서 행해진다. 바람직하게는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 과량의 몰(클로닝된 핵산에 있어서는 대개 약 1000:1 프라이머/주형이고 게놈 또는 바이러스 핵산에 있어서는 대개 약 108: 1 프라이머:주형)을 분리된 주형 가닥을 함유한 완충액에 첨가한다. 그러나 만약 여기서의 방법이 진단에 사용될 경우 상보적 가닥의 양은 알려지지 않을 수도 있으므로 상보적 가닥의 양에 상대적인 프라이머의 양은 확실하게 결정할 수는 없다는 것을 이해할 것이다.
그러나 실제적인 문제로서 첨가되는 프라이머의 양은 증폭되는 서열이 복잡한 장쇄 핵산 가닥의 혼합물에 함유되어 있을 때 상보적 가닥(주형)의 양에 대해 과량의 몰수이다. 몰 초과량이 크면 본 방법의 효율을 개선시키는데 바람직하다.
사용되는 프라이머는 검체 혼성화 영역과 포획 또는 프로브 결합 영역사이의 전사를 정지시키는 수단을 포함한다는 것이 중요하다. 여기에 기재되는 구속 링커로 검체-혼성화 영역과 포획 또는 프로브-결합영역을 접합시키는 것이 바람직하다. 그러나 다른 방법도 이용할 수 있다. 예를들면, 선택된 폴리머라제가 복제를 계속하지 않도록 하는, 프로브 세그먼트를 접합시키는 링커 또는 접합부 부근 염기의 일탈을 사용할 수 있다. 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP도 적절한 양으로 합성 혼합물에 첨가할 수 있으며 결과 용액을 약 90-100℃로 약 1 내지 10분간 바람직하게는 1 내지 4분간 가열한다. 가열후 용액을 실온으로 냉각한다. 이것은 프라이머 혼성화에 바람직하다. 냉각된 혼합물에 중합화 제제를 첨가하고 본분야 공지인 조건하에서 반응을 행하였다. 이 합성 반응은 실온에서부터 중합화 제제가 더 이상 효과적으로 작용하지 않는 온도까지 일어날 수 있다. 따라서 예를들면 E. coli DNA 폴리머라제가 중합화 제제로 사용되면 최대온도는 일반적으로 약 40℃보다 크지 않다. 가장 편리하게는, E. coli 폴리머라제를 사용하는 반응은 실온에서 일어난다. 더욱 가혹한 조건이 필요한 경우 반응은 고온에서 열안정성 효소 Taq 폴리머라제를 사용하여 행해진다.
중합화 제제는 효소를 포함하여 뉴클레오티드 트리포스페이트로부터 프라이머 신장 생성물을 합성하도록 작용하는 어떤 화합물 또는 시스템일 수 있다. 이러한 목적에 적당한 효소로는 예컨대 E. coli DNA 폴리머라제 I, E. coli DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편, T4 DAN 폴리머라제, 다른 이용가능한 DNA 폴리머라제, 역전사효소 및 Taq 폴리머라제와 같은 열에 안정한 효소를 포함한 기타 효소가 있고, 이것들은 적당한 방법으로 뉴클레오티드를 조합시켜 각 핵산가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물을 형성하도록 한다. 일반적으로 합성은 각 프라이머의 3' 단부에서 개시되고 주형가닥을 따라 5' 방향으로 합성이 종결될 때까지 진행하여 길이가 다른 분자들을 생성한다. 그러나 상기한 것과 동일한 방법을 사용하여 5' 단부에서 합성을 개시하여 다른 방향으로 진행하는 제제가 있을 수 있다: 본 발명의 방법에서 그러한 제제를 사용하는 것도 본 발명의 범위내에 든다고 간주된다. 새로 합성된 검체-상보적 가닥과 원래의 검체핵산가닥은 본 방법의 후속단계에서 사용되는 이중가닥분자를 형성한다. 다음 단계에서 듀플렉스 분자의 가닥은 상기한 방법중 어떤 것을 사용하여 분리되어 단일가닥분자를 제공한다. 새로운 핵산이 단일가닥분자상에서 합성된다. 추가의 중합화 제제, 뉴클레오티드 및 프라이머가 상기한 조건하에서 반응을 진행하는데 필요하다면 추가될 수 있다. 또한 합성은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 한쪽 단부에서 개시되고 주형의 단일 가닥을 따라 진행하여 추가의 핵산을 생성한다. 이 단계후 신장 생성물의 절반이 2개의 프라이머에 의해 결합된 특정 핵산서열로 이루어질 것이다.
가닥 분리 및 신장 생성물 합성단계는 필요한 양의 특정 핵산서열을 생성하는데 필요한 횟수만큼 반복될 수 있다. 이하 더욱 상세히 기재하는 것처럼 생성되는 특이적 핵산의 양은 지수식으로 축적될 것이다.
필요하다면 포개진 프라이머를 사용하여 표적서열을 두 단계로 증폭할 수도 있다. 이러한 변경은 반응의 특이성을 증가시키기 위한 수단으로 사용될 수 있다. PCR의 제1단계는 정상적인프라이머, 즉 중합화를 구속하지 않는 프라이머를 사용하여 행해질 수 있는 반면 제2단계는 본 발명의 구속 프라이머로 수행된다. 프라이머 결합영역은 제2세트(구속 프라이머)가 제1세트에 대한 프라이머 결합 영역사이의 검체서열영역에 결합하도록 선택된다(따라서 제2세트 결합영역이 존재한다면 증폭될 수 있게 된다). 제2도는 그러한 배열을 나타낸다. 검체 폴리뉴클레오티드와 그의 보체는 201과 202로 나타내었다. 검체 폴리뉴클레오티드의 한쪽 단부에 독특한 혼성화 영역을 가지고 테일에 대한 공통서열을 공유하는 포획 프로브(203a, 203b 및 203C)가 혼성화된다. 프라이머(204a, 204b)는 PCR 증폭의 제1(선택적)회에 사용되는 통상의 프라이머이다. 프라이머(205, 209)는 통상의 프라이머 결합영역에 의해 결합되는 검체 및 보체의 영역에 혼성화한다. 프라이머(205,209) 각각은 구속링커(207, 210)를 가지고 이것은 프라이머의 특정 결합 파트너 영역(208, 211)의 중합화를 방지한다.
증폭과정은 일단 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드가 축적되면 어느때라도 종결될 수 있다. 일반적으로 적당한 검출수단을 사용하여 증폭된 반응 혼합물에 존재하는 표적 서열의 존재 및/ 또는 양을 결정할 수 있다. 샘플내 표적서열의 존재는 일반적으로 표지된 프로브에 의해 결합의 존재 또는 비존재로 결정된다. 본 발명의 한 구체예에서 검체 사본 가닥 및/ 또는 검체 상보적 가닥에 존재하는 서열에 상보적인 표지된 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 이 구체예에서 검체 사본/ 상보적 듀플렉스는 변성되고 프로브가 첨가되고 프로브-가닥 컴플렉스가 비-결합된 프로브로부터 분리되고 표지가 검출된다. 달리, 제1 또는 제2 프라이머는 거기에 부착된 제3 결합 파트너를 수반할 수 있고, 이것은 표지에 부착된 제4결합 파트너에 결합할 수 있다. 이 바람직한 구체예에서 제3 및 제4결합 파트너는 상보적 올리고뉴클레오티드이다. 표지된 프로브는 검체 사본 또는 상보적 서열에 혼성화하지 않는 제1 또는 제2 프라이머의 신장부에 혼성화한다. 예컨대 겔 크로마토그래피 등과 같은 종래법으로 분리할 수 있다. 그러나 제1 또는 제2 프라이머에 부착된 제5 특이적 결합 파트너를 지지체에 부착된 제6 특이적 결합 파트너에 결합시켜 생성물 듀플렉스를 분리시키는 것이 바람직하다. 여기서 바람직한 제5 및 제6 결합 파트너는 또한 상보적 올리고뉴클레오티드 서열이다. 표지의 특성에 따라 표지의 존재를 검출하는데 각종 기술을 사용할 수 있다. 형광제에 있어서 다수의 다른 형광계를 이용할 수 있다. 화학발광계에 있어 루미노미터 또는 필름을 이용할 수 있다. 효소로는 형광성, 화학발광성, 또는 착색된 생성물이 제공되며 형광계로, 루미노미터로, 분광분석계로 또는 눈으로 검출될 수 있다. 면역분석에 사용될 수 있는 각종 표지 및 면역분석에 적용할 수 있는 방법을 주분석과 함께 사용할 수 있다.
본발명에 따른 증폭된 핵산 혼성화 분석을 수행하기 위한 키트는 적어도 하기 시약의 패키지 조합으로 이루어진다: 포획 프로브, 포획 프로브를 결합할 수 있는 제1 지지체 및 검체 폴리뉴클레오티드에 특이적인 제1 및 제2 프라이머.
이 키트는 바람직하게는 또한 제1 또는 제2 프로브에 결합할 수 있는 표지화된 프로브 및 증폭에 앞서 고체표면으로부터 결합된 검체를 방출하기 위한 치환 수단(예컨대 치환 올리고뉴클레오티드)도 포함할 수 있다. 이 시약들은 주로 키트안의 별도의 용기에 제공될 것이다. 또한 E. coli DNA 폴리머라제 I (Klenow단편), Taq 폴리머라제 따위의 DNA 폴리머라제, 검체를 변성시키는 변성시약, 혼성화 완충액, 세척 용액, 효소 기질, 음성 및 양성 표준, 그리고 분석을 위한 지침서도 포함할 수 있다.
[실시예]
하기 실시예는 본 분야에서 통상의 기술을 가진자에 대한 추가의 지침으로 제공되는 것이며 본 발명을 어떤식으로든 제한하기 위한 것은 아니다.
[실시예 1]
[구속 링커의 제조]
여기에서 설명되는 링커는 검체-혼성화 영역과 본발명의 프로브 및 프라이머의 포획 또는 프로브 결합 영역을 결합시켜, 사용되는 뉴클레오티드 폴리머라제가 링키지를 통해 판독할 수 없도록 하는데 사용된다. 복제는 구속 링커에서 정지한다. 이 섹션에서 하기 약자들을 사용한다: DMT =디메톡시트리틸; T = 데옥시티미딘; DMF = 디메틸포름아미드; BDMS = t- 부틸디메틸실릴; C = 데옥시시티딘; TLC = 박층 크로마토 그래피; DMAP = N,N- 디메틸아미노피리딘; THF = 테트라히드로푸란; DIPEA = 디이소프로필 에틸아민; LEV = 레불린에스테르; DCA = 디클로로아세트산; DCC = 디시클로헥실카르보디이미드; DCHU = 디시클로헥실우레아; TEA = 트리에틸아민; TMS = 트리메틸실릴; FMOC = 9-플루오레닐메톡시카르보닐.
A. 구속 링커의 합성
5-DMT-T-OH(27.3g, 50mmol)과 이미다졸(10g, 150mmol)을 200mL DMF 로 공증발시켰다. 잔류물을 250 mL DMF에 용해시키고 BDMS 염화물(75mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 18시간동안 교반하였다. 메탄올(50mL)을 첨가하고 30분후에 용매를 진공에서 제거하였다. 오일상 잔류물을 50mL 에틸아세테이트에 용해시키고 유기층을 5% NaHCO3수용액(2 x 500mL)과 80% 포화 NaCl 수용액(500mL)으로 추출하고 마지막으로 고체 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 진공에서 제거하여 35g (50 mmol)의 5'-DMT-3'BDMS T을 얻었다(100% 수율). 이 물질을 더 정제하지 않고 사용하였다. 트리아졸(25.6g)을 0℃에서 CH3CN400mL에 현탁시키고 POCI3(8mL)을 신속하게 교반하면서 첨가하였다. 그런다음 트리에틸아민(60mL)을 0℃에서 30분 동안 교반된 슬러리에 15분에 걸쳐 적가하였다. 100mL CH3CN에 용해시킨 5'-DMT-3'BDMS T(25 mmole 조생성물)을 0℃에서 교반 슬러리에 적가하였다. 빙수욕을 제거하고 20℃에서 1시간동안 계속 교반 하였다. 반응 혼합물을 800mL 에틸아세테이트로 희석하고 유기층을 5% NaHCO3(2 x 500mL)과 80% 포화 NaCl 수용액(500mL)로 추출하였다. 유기층을 고체 Na2SO4로 건조시킨후 용매를 진공에서 제거하였다. 결과 잔류물을 톨루엔(400mL)과 CH3CN(400mL)으로 공증발시켜 백색 포옴으로서 5'-DMT-3'BDMS -5-메틸-4-트리아조일 β-D-2-데옥시리보푸라노실-2(1H)-피리미딘온을 정량적인 수율로 얻었다. 이 물질을 더 정제하지 않고서 사용하였다. 400mL CH3CN중의 6-아미노핵산올(11.7g, 100mmole)의 용액에 100mL CH3CN에 용해시킨 5'-DMT-3-BDMS-5-메틸-4-트리아조일 β-D-2-데옥시리보푸라노실-2(1H)-피리미딘온(8.7g, 12 mmole)을 적가하고 반응 혼합물을 20℃에서 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 감시하고(매30분마다) 출발물질이 완전히 사라졌을때(흔히 1-2시간내)반응 혼합물을 500mL 에틸아세테이트로 희석하고 이것을 상기한 것처럼 5% NaHCO3수용액과 80% 포화 NaCl수용액으로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시킨후 용매를 진공에서 제거하여 7.0g(9.2mmole)의 생성물 5'-DMT-3'BDMS-5-메틸-N4-6-히드록시헥실 데옥시시티딘을 얻었다(수율 77%). 이 물질을 더 정제하지 않고 사용하였다.
100mL THF중의 5'-DMT-3'BDMS-5-메틸-N4-6-히드록시헥실 데옥시시티딘(7g, 9.2mmole)의 용액에 100mL THF에 용해시킨(CH3COCH2CH2CO)2O(50mmole)을 첨가한 다음 2,6-루티딘/THF 중의 10mL 6.5% DMAP를 첨가하였다. 반응혼합물을 30분동안 교반하면서 두었다. TLC분석은 출발물질이 완전히 소비되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 700mL 에틸아세테이트로 희석하고 5% NaHCO3수용액(3 x 500mL)과 80% 포화 NaCl수용액(500mL)으로 상기한 것처럼 추출하였다. 고체 Na2SO4로 건조시킨후 용매를 제거하고 잔류물을 톨루엔(200mL)과 CH3CN(200mL)로 공증발시켜 조생성물 12.3g을 얻었다.
이 조생성물을 100mL THF에 용해시키고 THF 중의 테트라 부틸암모늄 플루오라이드 1.1M 용액 10mL를 첨가하였다. 반응의 진행을 TLC로 감시하였다. 반응은 대개 30분내로 끝나지만 더 오래걸릴 수도 있다. 출발물질이 다 소비되었을때 반응 혼합물을 700mL 에틸아세테이트로 희석하고 NaHCO3와 NaCl 용액으로 상기한 것처럼 추출하였다. 용매를 제거하여 8.5g의 조생성물을 5'-DMT-5-메틸-N4(0-레불리닐-6-옥시헥실)-2'-데옥시시티딘을 얻었다. 이 물질을 실리카겔 크로마토그래피하였다. 정제된 생성물을 CH2Cl2중의 4% 메탄올로 용출하여 분리하여 약간 갈색인 포옴 5.0g을 얻었다(6.7mmole; 73% 수율).
실리카로 정제한 5'-DMT-5-메틸-N4(0-레불리닐-6-옥시헥실)-2'-데옥시시티딘(7.7mmole)을 CH3CN으로 2회 공증발시켰다. 결과의 건조분말을 아르곤하 플래스크에서 4.9mL DIPEA를 함유한 70mL CH2Cl2에 용해시켰다. 0℃로 냉각시킨후 1.65mL (8.6 mmole)의 N,N- 디이소프로필 아미노에톡시 클로로포스핀을 주사기로 첨가하고 혼합물을 0℃에서 30분동안 교반하였다. 400mL 에틸아세테이트로 희석한후 유기층을 400mL의 80% 포화 NaCl 수용액으로 4회 세척한 다음 고체 Na2SO4로 건조시키고 여과하였다. 용매를 진공에서 제거하고 결과 잔류물을 톨루엔으로 2회 공증발하여 오일을 얻었다. 이 오일을 30mL 톨루엔에 용해시키고 400mL의 차가운 핵산(약 -20℃)에 적가하였다. 침전물을 여과하여 재빨리 모으고 진공에서 18시간동안 건조시켜 5.45g의 포스포아미디트를 얻었다(6.0mmole, 78% 수율).
B. 다른 구속 링커의 합성
200mL CH2Cl2중의 상기한 것처럼 제조한 5'-DMT-3-BDMS-5-메틸-N4-6-히드록시헥실 데옥시시티딘(34g, 50mmole)의 용액에 1.5g의 N,N-디메틸아미노피리딘과 25mL 트리에틸아민을 첨가하였다. O℃의 이 용액에 CH2Cl2(100mL)에 용해시킨 DMT-Cl(75mmole, 25.5g)을 적가하였다. 반응혼합물을 1시간동안 교반하면서 두었다. 분석결과 출발물질이 완전히 소비되었음을 나타내면 50mL의 MeOH를 첨가하였다. 30분후 반응 혼합물을 800mL 에틸 아세테이트로 희석하고 이것을 5% NaHCO3(2 x 500mL)와 80% 포화 NaCl 수용액(500mL)으로 상기한 것처럼 추출하였다. 고체 Na2SO4로 건조시킨후 용매를 진공에서 제거하고 잔류물을 톨루엔(200mL)과 CH3CN(200mL)로 공증발시켰다.
이 조생성물을 200mL THF에 용해시키고 THF중의 테트라부틸암모늄 플루오라이드 1.1M 용액 200mL를 첨가하였다. 반응 진행을 TLC로 감시하였다. 대개 30분내 끝나지만 더 오래 걸릴 수도 있다. 출발 물질이 다 소비되었을때 반응 혼합물을 700mL 에틸 아세테이트로 희석하고 NaHCO3와 NaCl 용액으로 상기한 것처럼 추출하였다. 용매를 제거하여 36g의 조생성물 5'-DMT-5-메틸-N4(0-DMT-6-옥시헥실)데옥시시티딘을 얻었다. 이 물질을 실리카겔 크로마토그래피로 처리하여 정제된 생성물을 CH2Cl2중의 2-4% 메탄올로 용출하여 분리함으로써 32.7g의 순 생성물을 얻었다(34mmole;5'-DMT-T-OH를 기준으로 한 수율:69%).
실리카로 정제한 5'-DMT-5-메틸-N4(0-DMT-6-옥시헥실)-2'-데옥시시티딘(34mmole)을 CH3CN으로 2회 공증발시켰다. 결과의 건조 분말을 아르곤하 플라스크에서 7.5mL DIPEA를 함유한 100mL CH2Cl2에 용해시켰다. 0℃로 냉각시킨후 7.37mL(38mmole)의 N,N- 디이소프로필아미노메톡시 클로로포스핀을 주사기로 첨가하고 혼합물을 0℃에서 30분동안 교반하였다. 800mL 에틸아세테이트로 희석한후 유기층을 800mL의 80% 포화 NaCl 수용액으로 4회 세척한 다음 고체 Na2SO4로 건조시키고 여과하였다. 용매를 진공에서 제거하고 결과 잔류물을 톨루엔으로 2회 공증발시켜 오일을 얻었다. 이 오일을 80mL 톨루엔에 용해시키고 700mL의 차가운 핵산(약 -20℃)에 적가하였다. 침전물을 여과하여 재빨리 모으고 진공에서 18시간동안 건조시켜 31.8g의 포스포아미디트를 얻었다(28.7mmole; 84% 수율).
5'-DMT-T-OH(16.4, 30mmole)을 건조 200mL CH3CN에 용해시키고 1-(TMS)이미다졸(14.6mL, 100mmole) 을 첨가하였다. 60분후 용매를 진공에서 제거하였다. 오일상 잔류물을 700mL 에틸아세테이트에 용해시키고 유기층을 5% NaHCO3수용액 (2 x 500mL)과 80% 포화 NaCl 수용액(500mL)으로 추출하고 마지막으로 고체 Na2SO4로 건조시켰다. 용매를 진공에서 제거하여 30mmole의 5'-DMT-3'-TMS-T 를 얻었다(100% 수율). 이 물질을 더 정제하지 않고 사용하였다. 트리아졸(37.8g)을 450mL의 CH3CN에 현탁시키고(0℃에서) POCl3(12mL)를 신속하게 교반하면서 첨가하였다. 트리에틸아민(90mL)을 30분동안 0℃에서 교반한 슬러리에 15분에 걸쳐 적가하였다. 100mL CH3CN에 용해시킨 5'-DMT-3'-TMS-T (30mmole 조생성물)를 0℃에서 교반되는 슬러리에 적가하였다. 빙-수욕을 제거하고 20℃에서 1시간동안 교반을 계속하였다. 반응혼합물을 800mL 에틸아세테이트로 희석하고 유기층을 5% NaHCO3(2 x 500mL)와 80% 포화 NaCl 수용액(500mL)으로 추출하였다. 유기층을 고체 Na2SO4로 건조시킨후 용매를 진공에서 제거하였다. 결과 잔류물을 톨루엔(400mL)과 CH3CN(400mL)으로 공증발시켜 5'-DMT-3'-TMS-5-메틸-4-트리아졸 β-D-데옥시리보푸라노실-2(1H)-피리미딘온을 백색 포옴으로서 정량적인 수율로 얻었다. 이 물질을 더 정제하지 않고 사용하였다. 400mL CH3CN중의 6-아미노헥산올(23g, 200mmole)의 용액에 100mL CH3CN에 용해시킨 5'-DMT-3'-TMS-5-메틸-4-트리아조일 β-D-데옥시리보푸라노실-2 (1H)-피리미딘온(20g, 30mmole)을 적가하고 반응 혼합물을 20℃에서 교반하였다. 반응의 진행을 TLC로 감시하고(매 30분마다)출발물질이 완전히 사라졌을때(통상 1-2 시간내)반응 혼합물을 800mL 에틸아세테이트로 희석하고 이것을 5% NaHCO3수용액과 80% 포화 NaCl 수용액으로 상기한 것처럼 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시킨후 용매를 진공에서 제거하여 20.3g(~ 30mmole)의 생성물 5'-DMT-3'-TMS-5-메틸-N4-6-히드록시헥실 데옥시시티딘을 얻었다. 이 물질을 더 정제하지 않고 사용하였다.
250mL 메탄올중의 5'-DMT-3'-TMS-5-메틸-N4(6-히드록시헥실) 데옥시시티딘의 용액에 25mL의 진한 NH4OH 수용액을 첨가하고 반응 혼합물을 마개로 한 둥근바닥 플라스크에서 1시간동안 교반하면서 두었다. 용매를 진공에서 제거하고 1 x 200mL 에탄올, 1 x 100mL 톨루엔 및 1 x 100mL CH3CN으로 공증발시켜 5'-DMT-5-메틸-N4(6-히드록시헥실) 데옥시시티딘을 정량적인 수율로 얻었다. 이 물질을 더 정제하지 않고 사용하였다. 이 물질을 200mL CH2Cl2에 용해시키고 피리딘 4mL를 가한 다음 CH2Cl2(50mL)에 용해시킨 FMOC-Cl(7.8g, 30mmole)을 적가하였다. 반응 혼합물을 30분동안 교반하면서 두었다. 분석으로 출발물질이 완전히 소비되었음을 알았다. 반응혼합물을 500mL 에틸아세테이트로 희석하고 5% NaHCO3(3 x 500mL)수용액과 80% 포화 NaCl 수용액(500mL)로 상기한 것처럼 추출하였다. 고체 Na2SO4로 건조시킨후 용매를 제거하고 잔류물을 톨루엔(200mL)과 CH3CN(200mL)로 공증발시켜 23.7g의 조생성물을 얻었다. 이 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 처리하였다. CH2Cl2중의 약 4% 메탄올로 용출하여 정제된 생성물은 13.3g(15.3mmole)의 순수한 5'-DMT-5-메틸-N4-(0-FMOC-6-옥시헥실) 데옥시시티딘이었다(5'-DMT-TOH 기준으로 50% 수율). 실리카로 정제된 5'-DMT-5-메틸-N4(0-FMOC-6-옥시헥실)-2'-데옥시시티딘(15.3mmole)을 CH3CN으로 2회 공증발시켰다. 결과의 건조 분말을 아르곤하 플라스크에서 4.1mL DIPEA를 함유한 60mL CH2Cl2에 용해시켰다. 0℃로 냉각시킨후 3.19mL(16.5mmole)의 N,N- 디이소프로필 아미노 메톡시 클로로포스핀을 주사기로 첨가하고 혼합물을 0℃에서 30분동안 교반하였다. 400mL 에틸아세테이트로 희석한후 유기층을 400mL의 80% 포화 NaCl 수용액으로 4회 세척한 다음 고체 Na2SOl4로 건조시키고 여과하였다. 용매를 진공에서 제거하고 결과 잔류물을 톨루엔으로 2회 공증발시켜 오일을 얻었다. 이 오일을 50mL 톨루엔에 용해시키고 400mL의 차가운 핵산(약-20℃)에 적가하였다. 침전물을 여과하여 신속하게 모으고 진공에서 18시간동안 건조시켜 12.15g의 포스포아미디트(11.8 mmole; 77% 수율)를 얻었다. 고체상 합성동안 0-FMOC기의 제거: 20℃에서 1시간 동안 t-부틸아민/피리딘(1:10 v/v). 0-레불리닐기의 제거: 20℃에서 15분 동안 피리딘/ 빙초산(4:1 v/v) 중의 0.5M 히드라진 수화물.
[실시예 2]
[간염 B 바이러스에 대한 분석]
A. 표준검체 HBV DNA
Eco RI로 선형화된 플라스미드 pBR 325의 Eco RI 부위에 클로닝된 완전한 3.2kb HBV 게놈으로 구성되고 정상적인 사람 혈청으로 희석된 플라스미드 pHE 63을 표준검체로 사용하였다. 검체는 제1도에 1로 지정하였다.
B. 고체상 프로브
X가 시티딘의 N4-(2-아미노에틸)유도체를 나타내는 21개 염기 올리고머 5'-XCACCACTTTCTCCAAAGAAG-3'를 합성하고 여기에 참고로 포함된 Urdea 등의 미국특허 제4,868,105호에 기재된 것처럼 0.1M 인산 나트륨중(pH7.5)의 N- 히드록시 숙시님딜 비오틴을 사용하여 비오티닐화하였다. 이 비오티닐화된 단편의 5μL (800 pmoles)를 취하여 1 x PBS에 0.25%(w/v) 2.8μm 아비딘 폴리스티렌 비이드를 500μL 함유한 1.5mL 에펜도로프 튜브에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 배양한후 비이드를 500μL의 0.1% SDS, 4 x SSC로 원심분리에 의해 3회 세척한 다음 사용할때까지 동일한 용액을 재현탁시켜 저장하였다. 고체상 프로브는 지지체 표면(비이드)(4(9))에 결합되어 제1도에 3과 8로 나타나있다.
C. 표지화 프로브
X가 상기한 것과 같은 18개 염기올리고머 5'-XGGTCCTAGCCTGACAGC-3'를 합성하였다. 소의 내장의 알칼리성 포스파타제 (AP)(11)(완충액중의 3mg; 면역학적분석 등급, 베링거-만하임)를 센트리콘 30 마이크로컨센트레이터(Centricon 30 Microconcentrator) 에 놓았다. 약 2mL의 0.1M 붕산나트륨(pH9.5)을 첨가하고 최종부피가 40μL 가 될 때까지 장치를 3500rpm에서 회전시켰다. 알킬 아미노 올리고뉴클레오티드를 DITC로 활성화 하고 부탄올로 추출한 다음 단백질과 합하였다. PAGE, 용출(0.1M Tris, pH 7.5, 0.1M NaCl, 10mM MgCl2, 0.1mM ZnCl2로 행함) 및 농축으로 최종생성물(제1도에 10)을 얻고 4℃에서 저장하였다.
D. 포획 프로브
HBV 게놈의 특이적 서열에 상보적인 가변적 30-염기 길이 부분과 고체상(상기한 파트B)에 결합된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 불변의 20 염기길이의 3'-부분을 각각 가진 5개의 단일가닥 폴리뉴클레오티드로 된 한 세트를 상기한 B 파트에서 기재한 방법대로 합성하였다.
E. 프라이머
상기한 B 파트의 방법대로 프라이머(6과7)를 합성하였다. 프라이머(7)는 HBV 게놈의 부분에 상보적인 서열(71), 포획 프로브(8)에 상보적인 부분(72)및 구속 링커(73)5-메틸-N4(6-옥시헥실)-2'-데옥시시티딘으로 이루어진다. 프라이머(6)는 HBV 게놈의 다른 가닥에 상보적인 서열(61), 표지 프로브서열(10)에 상보적인 부분 및 구속 링커(63) 5-메틸-N4(6-옥시헥실)-2'-데옥시시티딘으로 이루어진다. 서열(61)은 (구속 링커로부터의)TTG TTC CCA AGA ATA TGG이다. 서열(71)은 두개의 서열(구속 링커로의)의 혼합물이다: TAC (T/A)GC ACT CAG GCA AGC.
F. 비이드 분석방법
혈청 또는 혈장(또는 표준 검체)의 10μL 샘플을 1.5mL 에펜도르프 튜브에 넣고 12.5μL의 프로테이나제 K/SDS(Gene(1987)61:254에 기재된 것처럼)로 37℃에서 30분동안 처리하였다. 각 샘플에 5개의 포획 프로브 각각 50 fmole을 함유한 1M NaOH 5μL를 첨가하고 튜브를 10분동안 100℃로 가열하였다. 샘플을 얼음위에 5분동안 놓아두고 10초동안 마이크로퓨지(microfuge)하고 0.38M 아세트산, 12.3 X SSC(최종적으로 4 X SSC)로 중성화하였다. 55℃에서 1시간동안 프로브를 검체에 어닐링하였다. 계속해서 25μL의 포획 비이드를 가하고 용액을 55℃에서 15분 더 두었다. 비이드를 500μL의 0.1% SDS, 4 X SSC로 2회 세척하였다. 이때 PCR 시약(적당한 폴리머라제, 뉴클레오티드 트리포스페이트등)외에 프라이머(6과7)를 첨가하고 프라이머로 돌출된(bracketed) HBV 서열을 증폭하였다. R. Higuchi 등(Nature (1988) 332: 543)과 R. Saiki 등(Science(1988) 239: 487)등이 기재한대로 각 프라이머 50pm과 400μM dNTP를 사용하여 PCR을 행하였다. 94℃에서 30분동안 변성시키고 50℃에서 30초동안 프라이머 어닐링하고 72℃에서 1.0분동안 Tag 폴리머라제(Perkin-Elmer Cetus 사로부터 구입가능)신장을 행하였다. 결합된 검체는 선택적으로 예컨대 포획 프로브 2a-c의 공통 부분에 상보적인 치환 프로브(제1도의 5)로 PCR완충액에서 15분동안 55℃에서 배양함으로써 치환될 수 있다. 용액을 4 x SSC, 0.1% SDS로 조절하고 55℃에서 15분동안 둔다음 상기한 것처럼 세척하였다.
HM에 표지화 프로브(10) 250 fmole을 함유한 20μL로 1시간동안 37℃에서 표지화 하였다. 3회 세척후 킴와이프스위에 뒤집어 비이드의 물기를 완전히 빼내고 적당한 기질로 처리한 다음 이하 기재하는 것처럼 측정하였다.
AP 검출을 위해 Lumigen 사로부터 구입한 효소로-유발되는 디옥세탄(Schaap 등, Tetrahedron Lett(1987)28: 1159-1162 및 EPA Publication No. 0254051)을 사용하였다. 검출과정은 다음과 같다: 표지화 단계를 위해 AP 프로브를 지닌 20μL HM 완충액을 표지화된 검체에 첨가하고, 55℃에서 15분동안 배양하였다. 상징액을 제거하고 비이드를 380μL의 0.1 X SSC-0.1% SDS로 2회 세척하였다. 비이드를 380μL의 0.1 X SSC로 2회 세척하여 잔존 SDS를 제거하였다. CTAB 완충액중의 20μL의 3.3 x 10-4M 디옥세탄을 20μL를 각 비이드 알리큇에 첨가하였다. 시약이 바닥에 떨어지도록 비이드를 가볍게 두드리고 부드럽게 저은 다음 37℃ 오븐에서 1시간동안 배양하였다. 그런다음. 비이드를 루미노미터(luminometer)읽었다.

Claims (25)

  1. 폴리뉴클레오티드를 함유한 샘플내에 검체 서열을 가진 검체 폴리뉴클레오티드 가닥을 검출하기 위한 방법에 있어서, a) 상기 검체 폴리뉴클레오티드를 혼성화 조건하에서 포획 프로브와 접촉시켜 검체-포획 프로브 컴플렉스를 형성하는 단계, 상기 포획 프로브는 검체-결합 영역과 제1특이적 결합 파트너로 이루어지고, 상기 검체-결합 영역은 상기 검체 폴리뉴클레오티드 영역과 혼성화할 수 있으며 상기 제1 특이적 결합 파트너는 제2결합 파트너에 대한 특이성을 가지며; b) 상기 제1결합 파트너를 상기 제2 결합파트너에 접촉시키는 단계, 여기서 상기 제2 결합 파트너는 제1 지지체상에 고정되고 그것에 의해 상기 검체-포획 프로브 컴플렉스는 상기 제1지지체에 고정되어 고정된 검체-포획 프로브 컴플렉스를 제공하게 되고; c) 비-결합 폴리뉴클레오티드를 상기 고정된 검체-포획 프로브 컴플렉스로부터 분리시키는 단계; d)상기 검체 폴리뉴클레오티드를 혼성화 조건하에서 상기 검체 폴리뉴클레오티드의 제1프라이머-결합영역에 상보적인 제1 프라이머와 접촉시키는 단계, 상기 제1 프라이머는 제3 특이적 결합 파트너에 링크된 검체-혼성화 영역으로 이루어지고, 상기 혼성화 영역-결합 파트너 링크는 상기 링크에서 전사를 구속하고; e) 상기 제1프라이머에서 중합 수단에 의해 뉴클레오티드 중합을 개시하여 검체-상보적 가닥 듀플렉스를 형성하는 단계; f) 상기 듀플렉스를 변성시키는 단계; g) 상기 상보적 가닥을 상기 검체-상보적 가닥의 제2프라이머-결합 영역에 혼성시킬 수 있는 제2 프라이머와 접촉시키고 상기 검체 폴리뉴클레오티드를 제1 프라이머와 접촉시키는 단계; h) 중합 수단에 의해 뉴클레오티드 중합을 개시하여 상기 제1 프라이머-결합 영역을 함유한 상기 검체-상보적 가닥의 영역에 상보적인 가닥을 가진 검체-사본 듀플렉스와 검체-상보적 가닥 듀플렉스를 형성하는 단계; i) f-h의 단계를 반복하여 상기 제1과 제2 프라이머, 상기 검체 서열 및 상기 검체 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 검출가능한 양의 증폭된 생성물을 제공하는 단계; 및 j) 상기 증폭된 생성물을 검출하는 단계로 이루어지는 방법.
  2. 제1항에서 있어서, 상기 제1 결합 파트너는 상기 검체가닥에 상보적이지 않는 서열을 가진 제1 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지고, 상기 제2 결합 파트너는 상기 제1 결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적이고 상기 검체 가닥에는 상보적이지 않는 제2 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 검체 가닥은 상기 제2 결합 파트너 폴리뉴클레오티드가닥에 상기 제2 결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적인 영역을 가진 치환 폴리뉴클레오티드 가닥을 혼성화함으로써 상기 제1 지지체로부터 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 검체 가닥은 상기 제1 결합 파트너 폴리뉴클레오티드가닥에 상기 제1결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적인 영역을 가진 치환 폴리뉴클레오티드 가닥을 혼성화함으로써 상기 제1 지지체로부터 치환되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에서 있어서, 상기 제1 프라이머는 그것의 3' 단부에 있는 제3 결합 파트너로 더 이루어지고 상기 제3 결합 파트너는 제4 결합 파트너에 특이적으로 결합할 수 있고 여기서 상기 제4 결합파트너는 고체 지지체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 검출 단계는 상기 증폭된 생성물을 제4 결합 파트너가 결합되어 있는 고체 지지체와 접촉시키고 상기 제3 결합 파트너를 상기 제4 결합 파트너에 혼성화시켜 고정된 증폭 생성물을 제공하고; 비-결합 폴리뉴클레오티드를 상기 고정된 증폭 생성물로 부터 분리시키고; 상기 증폭된 생성물을 검출하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에서 있어서, 상기 제3 결합 파트너는 구속 링커에 의해 상기 프라이머에 결합된 상기 검체 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제3 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지고 상기 제4 결합 파트너는 상기 제3 결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적이고 상기 검체 가닥에 상보적이 아닌 제4폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 그것의 3' 단부에서 제6 결합 파트너에 특이적으로 결합될 수 있는 구속링커에 의해 상기 프라이머에 결합되어있는 제5 특이적 결합 파트너로 더 이루어지고 상기 제6 결합 파트너는 검출가능한 표지에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출 단계는 상기 고정된 증폭 생성물을 상기 표지된 제6 결합 파트너와 접촉시키고; 비-결합된 제6 결합 파트너를 분리시키고; 결합된 제6 결합 파트너의 존재를 결정하는 것으로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제5 결합 파트너는 상기 검체 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제5 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지고, 상기 제6 결합 파트너는 상기 제5 결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적이고 상기 검체 가닥 또는 상기 검체 상보적 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제6 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 그것의 3' 단부에 구속링커에 의해 상기 프라이머에 결합되는 제3 결합 파트너를 더 포함하고 상기 제3 결합 파트너는 제4 결합 파트너를 특이적으로 결합할 수 있으며 상기 제4 결합 파트너는 지지체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 검출단계는 상기 제4 결합 파트너가 결합되어 있는 고체 지지체와 상기 증폭 생성물을 접촉시키고, 상기 제3 결합파트너를 상기 제4 결합 파트너에 혼성화하여 고정된 증폭 생성물을 제공하고; 비-결합된 폴리뉴클레오티드를 상기 고정된 증폭 생성물로 부터 분리시키고; 상기 증폭생성물의 존재를 검출하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제3 결합 파트너는 상기 검체 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제3 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지고 상기 제4결합파트너는 상기 제3결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적이고 상기 검체 가닥 또는 상기 검체-상보적 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제4 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 3' 단부에서 구속링커에 의해 상기 프라이머에 결합되어 있는 제5 특이적 결합파트너로 더 이루어지고 상기 제6 결합 파트너는 검출 가능한 표지에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 검출단계는 상기 고정된 증폭 생성물을 상기 표지된 제6 결합 파트너와 접촉시키고; 비-결합된 제6 결합파트너를 분리시키고; 결합된 제6 결합 파트너의 존재를 결정하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제5 결합파트너는 상기 검체 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제5 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지고 상기 제6 결합 파트너는 상기 제5 결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적이고 상기 검체 가닥 또는 상기 검체-상보적 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제6 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 검체를 상기 제1 프라이머와 접촉시키기에 앞서 제3 및 제4 프라이머로 상기 검체 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 것으로 더 이루어지고 상기 제3 및 제4 프라이머는 상기 제1 프라이머-결합 영역과 제2 프라이머 결합 영역에 의해 결합된 영역의 바깥쪽 상기 검체의 보체와 상기 검체의 영역에 혼성화하여 검체서열과 제1 및 제2 프라이머-결합 영역을 함유한 검체 및 그것의 보체 부분을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 폴리뉴클레오티드를 함유한 샘플내에 검체 서열을 가진 검체 폴리뉴클레오티드 가닥을 증폭 및 검출하기 위한 분석 키트에 있어서, 치환가능한 제1 특이적 결합 파트너에 결합된 상기 검체 폴리뉴클레오티드의 영역에 상보적인 검체-결합서열로 이루어지는 포획 프로브; 상기 제1 파트너에 특이적인 제2 결합 파트너가 결합되어 있는 제1 지지체; 상기 검체 폴리뉴클레오티드의 제1 프라이머-결합 영역에 상보적인 제1 프라이머; 및 상기 검체-상보적 가닥의 제2 프라이머 결합 영역에 상보적인 제2 프라이머로 이루어지고, 상기 제2 프라이머 결합영역은 실질적으로 상기 제1 프라이머-결합영역과 중복되지 않는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 결합 파트너는 구속 링커에 의해 상기 프라이머에 결합된 상기 검체 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제1폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지고 상기 제2결합 파트너는 상기 제1결합 파트너 폴리뉴클레오티드 가닥에 상보적이고 상기 검체 가닥에 상보적이 아닌 서열을 가진 제2 폴리뉴클레오티드 가닥으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제2 겨합 파트너 폴리뉴클레오티드에 상보적인 영역을 가진 치환 폴리뉴클레오티드로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 그것의 3' 단부에 구속 링커에 의해 상기 프라이머에 결합된 제4 결합 파트너를 특이적으로 결합시킬 수 있는 제3 결합 파트너를 더 포함하고 상기 키트는 상기 제4 결합 파트너가 결합되어 있는 지지체로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 그것의 3' 단부에 제6 결합 파트너에 특이적으로 결합할 수 있는 구속링커에 의해 상기 프라이머에 결합된 제5 특이적 결합 파트너로 더 이루어지고 상기 키트는 검출가능한 표지에 결합된 제6 결합 파트너로 더 이루어지는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
  23. 제18항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 그것의 3' 단부에 구속 링커에 의해 상기 프라이머에 결합된 제3 결합 파트너로 더 이루어지고, 상기 제3 결합 파트너는 제4 결합 파트너를 특이적으로 결합시킬 수 있고, 상기 키트는 상기 제4 결합 파트너가 결합되어 있는 제2 지지체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 구속 링커에 의해 상기 프라이머에 결합된 제5 특이적 결합 파트너로 더 이루어지고 상기 제5 특이적 결합 파트너는 제6 결합 파트너를 특이적으로 결합시킬 수 있고, 상기 키트는 검출가능한 표지에 결합된 제6 결합 파트너를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 검체 폴리뉴클레오티드와 그 보체에 상보적인 제3 및 제4 프라이머를 더 포함하고, 상기 제3 및 제4 프라이머는 상기 제1 프라이머-결합영역과 제2 프라이머-결합 영역에 의해 결합된 영역바깥쪽에 있는 검체 폴리뉴클레오티드와 그것의 보체의 영역에 혼성화하는 것을 특징으로 하는 분석 키트.
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