JP2022506546A - ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析 - Google Patents
ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022506546A JP2022506546A JP2021523956A JP2021523956A JP2022506546A JP 2022506546 A JP2022506546 A JP 2022506546A JP 2021523956 A JP2021523956 A JP 2021523956A JP 2021523956 A JP2021523956 A JP 2021523956A JP 2022506546 A JP2022506546 A JP 2022506546A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- sequence
- nucleotides
- sample
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000037452 priming Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 title abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 225
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 123
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 105
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 523
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 493
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 439
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 438
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 389
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 318
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 317
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 300
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 297
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 297
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 213
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 121
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 107
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 107
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 89
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 82
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 74
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 70
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 60
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 51
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 46
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 41
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 36
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 34
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 20
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 claims description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 15
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 14
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 12
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 11
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 10
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 10
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 8
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 8
- 239000011325 microbead Substances 0.000 claims description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 7
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 6
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 6
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 6
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 5
- 239000002907 paramagnetic material Substances 0.000 claims description 5
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 5
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 5
- JLBJTVDPSNHSKJ-UHFFFAOYSA-N 4-Methylstyrene Chemical compound CC1=CC=C(C=C)C=C1 JLBJTVDPSNHSKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 4
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 4
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 2
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 143
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 509
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 215
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 203
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 78
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 53
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 37
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 36
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 36
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 36
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 28
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 26
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 24
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 24
- 241000894007 species Species 0.000 description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 11
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 11
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 10
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 8
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 6
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 238000003491 array Methods 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 5
- 150000002243 furanoses Chemical group 0.000 description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- 102100032412 Basigin Human genes 0.000 description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091029499 Group II intron Proteins 0.000 description 3
- 101000798441 Homo sapiens Basigin Proteins 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 101000974834 Homo sapiens Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3 Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100022792 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 3
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 3
- 229920000909 polytetrahydrofuran Polymers 0.000 description 3
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 3
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PDBUTMYDZLUVCP-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydro-1,4-benzoxazin-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)CNC2=C1 PDBUTMYDZLUVCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical compound C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000058063 Glucose Transporter Type 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 2
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006296 SLC2A1 Proteins 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000007845 assembly PCR Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000016446 peptide cross-linking Effects 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 description 2
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 2
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000001847 surface plasmon resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- AFDXODALSZRGIH-QPJJXVBHSA-N (E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enoic acid Chemical compound COC1=CC=C(\C=C\C(O)=O)C=C1 AFDXODALSZRGIH-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 1
- IOWQHNLDXBGENT-UHFFFAOYSA-N 1-hexyl-4-(1-hexylpyridin-1-ium-4-yl)pyridin-1-ium Chemical compound C1=C[N+](CCCCCC)=CC=C1C1=CC=[N+](CCCCCC)C=C1 IOWQHNLDXBGENT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 10H-phenothiazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3SC2=C1 WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-c]pyridin-4-amine Chemical compound NC1=NC=CC2=C1N=CN2 UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZADFIRBJNODAA-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrimidine Chemical compound [CH]1NC=CC=N1 GZADFIRBJNODAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 2-fluoroadenine Chemical compound NC1=NC(F)=NC2=C1N=CN2 WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 2-vinylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=CC=N1 KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSSXLFACIJSBOM-UHFFFAOYSA-N 2h-pyran-2-ol Chemical compound OC1OC=CC=C1 GSSXLFACIJSBOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1,5-dihydroimidazo[4,5-c]pyridin-4-one Chemical compound O=C1NC(N)=CC2=C1N=CN2 KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- 101150065370 ATP10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026423 Adhesion G protein-coupled receptor E5 Human genes 0.000 description 1
- 102100036523 Anoctamin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 125000006519 CCH3 Chemical group 0.000 description 1
- 102100037917 CD109 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102100026099 Claudin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102100021469 Equilibrative nucleoside transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108091093094 Glycol nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 101000800023 Homo sapiens 4F2 cell-surface antigen heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 101000718243 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E5 Proteins 0.000 description 1
- 101000924727 Homo sapiens Alternative prion protein Proteins 0.000 description 1
- 101000928362 Homo sapiens Anoctamin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000738399 Homo sapiens CD109 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000912657 Homo sapiens Claudin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000605020 Homo sapiens Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 101000969763 Homo sapiens Myelin protein zero-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000604054 Homo sapiens Neuroplastin Proteins 0.000 description 1
- 101000728095 Homo sapiens Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001062776 Homo sapiens Protein FAM234A Proteins 0.000 description 1
- 101000701334 Homo sapiens Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000974846 Homo sapiens Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021270 Myelin protein zero-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700015679 Nested Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100038434 Neuroplastin Human genes 0.000 description 1
- 101100110224 Oreochromis mossambicus atp2b2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100029751 Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 102100030560 Protein FAM234A Human genes 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108091030145 Retron msr RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 102000012987 SLC1A5 Human genes 0.000 description 1
- 108060002241 SLC1A5 Proteins 0.000 description 1
- 108091006551 SLC29A1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006313 SLC3A2 Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100030458 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022791 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N Trioxochromium Chemical compound O=[Cr](=O)=O WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N [(1r,2s,4r,5r)-3-hydroxy-4-(4-methylphenyl)sulfonyloxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-2-yl] 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)O[C@H]1C(O)[C@@H](OS(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)[C@@H]2OC[C@H]1O2 NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N 0.000 description 1
- SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N [(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-[[(3s,4r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,4r,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-5-(phosphonooxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OC2[C@@H](O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@H]2O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(=O)OCC([C@@H](O)[C@H]1O)OC1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 SIIZPVYVXNXXQG-KGXOGWRBSA-N 0.000 description 1
- NOXMCJDDSWCSIE-DAGMQNCNSA-N [[(2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-4-oxo-3H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O NOXMCJDDSWCSIE-DAGMQNCNSA-N 0.000 description 1
- OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- DMLAVOWQYNRWNQ-UHFFFAOYSA-N azobenzene Chemical group C1=CC=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 DMLAVOWQYNRWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033590 base-excision repair Effects 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 229910000423 chromium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007697 cis-trans-isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 150000001923 cyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000000596 cyclohexenyl group Chemical group C1(=CCCCC1)* 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003302 ferromagnetic material Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 125000005704 oxymethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])O[*:1] 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229950000688 phenothiazine Drugs 0.000 description 1
- 125000001644 phenoxazinyl group Chemical class C1(=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 150000008299 phosphorodiamidates Chemical class 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- SRBUGYKMBLUTIS-UHFFFAOYSA-N pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=CC2=CC=NC2=N1 SRBUGYKMBLUTIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 150000002909 rare earth metal compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 235000021092 sugar substitutes Nutrition 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical group NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229910052715 tantalum Inorganic materials 0.000 description 1
- GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N tantalum atom Chemical compound [Ta] GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010809 targeting technique Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N trihydridoboron Substances B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/04—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis using dynamic combinatorial chemistry techniques
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2018年11月8日に出願された米国特許仮出願第62/757,757号の利益を主張するものである。この関連出願の内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、2019年11月7日に作成されたサイズが4キロバイトの68EB_298705_WOという名称のファイルとして提供されている。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、分子生物学の分野に、例えば、分子バーコーディングを使用して細胞の遺伝子発現プロファイルを決定することに関する。
一部の実施形態では、本方法は、第1のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第2のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して複数の伸長産物を増幅し、それにより第1の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含む。一部の実施形態では、複数の伸長産物の増幅は、配列決定プライマーおよび/もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに/またはそれらの一部を、複数の伸長産物に付加することを含む。一部の実施形態では、本方法は、第1の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含む。
一部の実施形態では、核酸標的は、細胞成分結合性試薬を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、細胞成分結合性試薬に付随している。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子および細胞成分結合性試薬を解離させることを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも10個は、異なる分子標識配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも6個のヌクレオチドを含む。
本明細書で参照されているすべての特許、公開特許出願、他の刊行物、ならびにGenBankおよび他のデータベースの配列は、関連技術に関してその全体が参照により組み込まれる。
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照されたい。本開示の目的のため、以下の用語を下記にて定義する。
一部の実施形態では、抗体は、機能的抗体断片である。例えば、抗体断片は、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、およびsFvなどの、抗体の一部であってもよい。抗体断片は、全長抗体により認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、ならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)などの、抗体の可変領域からなる単離断片を含むことができる。例示的な抗体としては、これらに限定されないが、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体(例えば、CD8、CD34、およびCD45)に結合する抗体、ならびに治療用抗体を挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「試料採取デバイス」または「デバイス」という用語は、試料の切片を採取し、および/または切片を基材に配置することができるデバイスを指すことができる。試料デバイスは、例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)機械、細胞選別機械、生検針、生検デバイス、組織切片化デバイス、マイクロ流体デバイス、ブレードグリッド、および/またはミクロトームを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子特異的確率論的バーコード」という用語は、標識および遺伝子特異的である標的結合性領域を含むポリヌクレオチド配列を指すことができる。確率論的バーコードは、確率論的バーコーディングのために使用することができるポリヌクレオチド配列であってもよい。確率論的バーコードは、試料内の標的を定量化するために使用することができる。確率論的バーコードは、標識が標的に付随した後で生じ得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率論的バーコードは、増幅エラーまたは配列決定エラーを評価するために使用することができる。標的に付随している確率論的バーコードは、確率論的バーコード-標的または確率論的バーコード-タグ-標的と呼ばれる場合がある。
ここで使用される場合、「標的」という用語は、バーコード(例えば、確率論的バーコード)を付随させることができる組成物を指すことができる。本開示の方法、デバイス、および系による分析のための例示的で好適な標的としては、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、mRNA、マイクロRNA、およびtRNAなどが挙げられる。標的は、一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、標的は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、標的は脂質である。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と同義的に使用することができる。
確率論的バーコーディングなどのバーコーディングは、例えば、米国特許出願公開第20150299784号明細書、国際公開第2015031691号パンフレット、およびFu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2011 May 31; 108(22):9026-31に記載されており、こうした刊行物の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるバーコードは、標的を確率論的に標識(例えば、バーコード、タグ)するために使用することができるポリヌクレオチド配列であってもよい確率論的バーコードであってもよい。バーコードは、確率論的バーコードの異なるバーコード配列の数および標識されることになる標的のいずれかの出現数の比が、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、もしくは約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、またはこうした値の任意の2つの間の数値もしくは範囲であり得る場合、確率論的バーコードと呼ぶことができる。標的は、同一のまたはほぼ同一の配列を有するmRNA分子を含むmRNA種であってもよい。バーコードは、確率論的バーコードの異なるバーコード配列の数および標識されることになる標的のいずれかの出現数の比が、少なくとも1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、もしくは100:1であるか、または最大で1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、もしくは100:1である場合、確率論的バーコードと呼ぶことができる。確率論的バーコードのバーコード配列は、分子標識と呼ばれる場合がある。
バーコードは、1つまたは複数のユニバーサル標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、1つまたは複数のユニバーサル標識は、所与の固体支持体に付着されているバーコードのセット内のすべてのバーコードで同じであってもよい。一部の実施形態では、1つまたは複数のユニバーサル標識は、複数のビーズに付着されているすべてのバーコードで同じであってもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。配列決定プライマーは、ユニバーサル標識を含むバーコードの配列決定に使用することができる。配列決定プライマー(例えば、ユニバーサル配列決定プライマー)は、ハイスループット配列決定プラットフォームに付随する配列決定プライマーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、PCRプライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーおよびPCRプライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。配列決定プライマーまたはPCRプライマーにハイブリダイズすることが可能なユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位と呼ばれる場合がある。ユニバーサル標識は、バーコードの転写を開始するために使用することできる配列を含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、バーコードまたはバーコード内の領域の伸長に使用することができる配列を含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、もしくは約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の2つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。例えば、ユニバーサル標識は、少なくとも約10個のヌクレオチドを含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、もしくは300ヌクレオチド長であってもよく、または最大で1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、もしくは300ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、切断可能なリンカーまたは修飾ヌクレオチドは、バーコードが支持体から切断されることが可能になるようにユニバーサル標識配列の一部であってもよい。
バーコードは、1つまたは複数のディメンション標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ディメンション標識は、標識付与(例えば、確率論的標識付与)が生じたディメンションに関する情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、ディメンション標識は、標的がバーコード化された時点に関する情報を提供することができる。ディメンション標識は、試料内のバーコーディング(例えば、確率論的バーコーディング)の時点に関連付けられていてもよい。ディメンション標識は、標識付与の時点で活性化されることができる。異なるディメンション標識を異なる時点で活性化することができる。ディメンション標識は、標的、標的のグループ、および/または試料がバーコード化された順序に関する情報を提供する。例えば、細胞の集団を、細胞周期のG0期にてバーコード化することができる。細胞を、細胞周期のG1期にてバーコード(例えば、確率論的バーコード)で再度パルスすることができる。細胞を、細胞周期のS期などにてバーコードで再度パルスすることができる。各パルス(例えば、細胞周期の各期)におけるバーコードは、異なるディメンション標識を含むことができる。このように、ディメンション標識は、細胞周期のどの期でどの標的が標識化されたかに関する情報を提供する。ディメンション標識により、多数の異なる生物学的時点を調査することができる。例示的な生物学的時点としては、これらに限定されないが、細胞周期、転写(例えば、転写開始)、および転写物分解を挙げることができる。別の例では、試料(例えば、細胞、細胞の集団)は、薬物および/または療法による治療前および/または治療後に標識することができる。別個の標的のコピー数の変化は、薬物および/または療法に対する試料の応答を示すことができる。
バーコードは、1つまたは複数の空間標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、空間標識は、バーコードが付随している標的分子の空間的方向性に関する情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。空間標識は、試料の座標に関連付けられてもよい。座標は、固定座標であってもよい。例えば、座標は、基材を基準にして固定されていてもよい。空間標識は、二次元または三次元グリッドを基準していてもよい。座標は、目印を基準にして固定されていてもよい。目印は、空間にて識別可能であってもよい。目印は、画像化することができる構造であってもよい。目印は、生物学的構造、例えば、解剖学的目印であってもよい。目印は、細胞性の目印、例えば細胞小器官であってもよい。目印は、カラーコード、バーコード、磁気特性、蛍光物質、放射能、または固有のサイズもしくは形状などの識別可能な識別子を有する構造などの非天然の目印であってもよい。空間標識は、物理的な区画(例えば、ウェル、容器、または液滴)に関連付けられていてもよい。一部の実施形態では、空間における1つまたは複数の位置をコード化するために、複数の空間標識が一緒に使用される。
バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、1つまたは複数の細胞標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞を起源とするかを決定するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞標識は、所与の固体支持体(例えば、ビーズ)に付着されているすべてのバーコードで同一であるが、異なる固体支持体(例えば、ビーズ)毎に異なる。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、100%、もしくは約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、100%、またはこうした値の任意の2つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、もしくは100%であってもよく、または約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、もしくは100%であってもよい。例えば、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも60%が、同じ細胞標識を含んでいてもよい。別の例として、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも95%が、同じ細胞標識を含んでいてもよい。
バーコードは、1つまたは複数のバーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、バーコード配列は、バーコードにハイブリダイズした特定のタイプの標的核酸種を識別するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。バーコード配列は、バーコード(例えば、標的結合性領域)にハイブリダイズした標的核酸種の具体的な出現の計数手段を提供する(例えば、大まかな近似値を提供する)核酸配列を含んでいてもよい。
バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、1つまたは複数の分子標識を含んでいてもよい。分子標識は、バーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、分子標識は、バーコードにハイブリダイズした特定のタイプの標的核酸種を識別するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。分子標的は、バーコード(例えば、標的結合性領域)にハイブリダイズした標的核酸種の具体的な出現の計数手段を提供する核酸配列を含んでいてもよい。
バーコードは、捕捉プローブなど、1つまたは複数の標的結合性領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、目的の標的とハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、標的結合性領域は、標的(例えば、標的核酸、標的分子、例えば、分析しようとする細胞性核酸)に、例えば特定の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、特定の標的核酸の特定の位置に付着する(例えば、ハイブリダイズする)ことができる核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、制限酵素部位突出(例えば、EcoRI粘着末端突出)に対する特異的ハイブリダイゼーションが可能である核酸配列を含んでいてもよい。次いで、バーコードは、制限部位突出に相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートすることができる。
確率論的バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、バーコードを方向付ける(例えば、アラインさせる)ために使用することができる1つまたは複数の方向付け特性を含んでいてもよい。バーコードは、等電点電気泳動のための部分を含んでいてもよい。異なるバーコードは、異なる等電点電気泳動点を構成することができる。こうしたバーコードが試料に導入されている場合、バーコードを既知の方向へと方向付けるために、試料を等電点電気泳動にかけることができる。このように、方向付け特性を使用すると、試料内のバーコードの既知マップを作成することができる。例示的な方向付け特性としては、電気泳動移動度(例えば、バーコードのサイズに基づく)、等電点、スピン、導電率、および/または自己組織化を挙げることができる。例えば、自己組織化の方向付け特性を有するバーコードは、活性化されると特定の方向(例えば、核酸ナノ構造)へと自己組織化することができる。
バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、1つまたは複数の親和性特性を含んでいてもよい。例えば、空間標識は、親和性特性を含んでいてもよい。親和性特性は、バーコードと別の実体(例えば、細胞受容体)との結合を容易にすることができる化学的および/または生物学的部分を含んでいてもよい。例えば、親和性特性は、抗体、例えば、試料上の特定の部分(例えば、受容体)に対して特異的な抗体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、抗体は、バーコードを、特定の細胞タイプまたは分子へと導くことができる。特定の細胞タイプにあるおよび/または付近にある標的を標識する(例えば、確率論的に標識する)ことができる。抗体はバーコードを特定の位置に導くことができるため、一部の実施形態では、親和性特性は、空間標識のヌクレオチド配列に加えて、空間情報を提供することができる。抗体は、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、ヒト化またはキメラ化されていてもよい。抗体は、ネイキッド抗体または融合抗体であってもよい。
抗体断片は、例えば、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、およびsFvなどの抗体の一部であってもよい。一部の実施形態では、抗体断片は、全長抗体により認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、ならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)などの、抗体の可変領域からなる単離断片を含むことができる。例示的な抗体としては、これらに限定されないが、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体(CD8、CD34、CD45)に結合する抗体、および治療用抗体を挙げることができる。
バーコードは、1つまたは複数のユニバーサルアダプタープライマーを含んでいてもよい。例えば、遺伝子特異的確率論的バーコードなどの遺伝子特異的バーコードは、ユニバーサルアダプタープライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、すべてのバーコードにわたってユニバーサルであるヌクレオチド配列を指すことができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、遺伝子特異的バーコードを構築するために使用することができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 27、28、29、30ヌクレオチド長、もしくは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 27、28、29、30ヌクレオチド長、またはこれらのうちの任意の2つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド長であってもよく、または最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、5~50ヌクレオチド長であってもよい。
バーコードが、1つよりも多くのタイプの標識を含む場合(例えば、1つの分子標識などの、1つよりも多くの細胞標識または1つよりも多くのバーコード配列)、標識は、リンカー標識配列で分散されていてもよい。リンカー標識配列は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。リンカー標識配列は、最大で約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長、例えば、12ヌクレオチド長であってもよい。リンカー標識配列を使用して、バーコードの合成を容易にすることができる。リンカー標識は、エラー訂正(例えば、ハミング)コードを含んでいてもよい。
本明細書で開示される確率論的バーコードなどのバーコードは、一部の実施形態では、固体支持体に付随していてもよい。固体支持体は、例えば、合成粒子であってもよい。一部の実施形態では、固体支持体上の複数のバーコード(例えば、第1の複数のバーコード)の確率論的バーコード(例えば、第1のバーコード配列)の分子標識などの、バーコード配列の一部またはすべては、少なくとも1つのヌクレオチドが異なる。同じ個体支持体上のバーコードの細胞標識は、同じであってもよい。異なる固体支持体上のバーコードの細胞標識は、少なくとも1つのヌクレオチドが異なっていてもよい。例えば、第1の固体支持体上の第1の複数のバーコードの第1の細胞標識は同じ配列を有してもよく、第2の固体支持体上の第2の複数のバーコードの第2の細胞標識は同じ配列を有してもよい。第1の固体支持体上の第1の複数のバーコードの第1の細胞標識および第2の固体支持体上の第2の複数のバーコードの第2の細胞標識は、少なくとも1つのヌクレオチドが異なっていてもよい。細胞標識は、例えば、約5~20ヌクレオチド長であってもよい。バーコード配列は、例えば、約5~20ヌクレオチド長であってもよい。合成粒子は、例えば、ビーズであってもよい。
また、生物学的刺激を使用して、ビーズの破壊、溶解、または分解を誘発することができる。一般に、生物学的誘発因子は、化学的誘発因子に類似するが、多数の例では、生体分子、または酵素、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、および核酸など、生体系に一般的に見出される分子が使用される。例えば、ビーズは、特定のプロテアーゼによる切断に感受性であるペプチド架橋連結を有するポリマーを含んでいてもよい。より具体的には、一例は、GFLGKペプチド架橋連結を含むマイクロカプセルを含むことができる。プロテアーゼカテプシンBなどの生物学的誘発因子を添加すると、シェル壁のペプチド架橋連結が切断され、ビーズの内容物が放出される。他の場合では、プロテアーゼは、熱活性化することができる。別の例では、ビーズは、セルロースを含むシェル壁を含む。加水分解酵素キトサンの添加は、セルロース結合の切断、シェル壁の解重合、およびその内部内容物の放出のための生物学的誘発因子としての役目を果たす。
また、ビーズは、熱刺激の適用時にそれらの内容物を放出するように誘導することができる。温度の変化は、ビーズに様々な変化を引き起こすことができる。熱の変化は、ビーズの融解を引き起こし、ビーズ壁を崩壊させることができる。他の場合では、熱は、ビーズの内部成分の内圧を上昇させ、ビーズを破裂または爆発させることができる。さらに他の場合では、熱は、ビーズを変形して収縮脱水状態にすることができる。また、熱は、ビーズの壁内の熱感受性ポリマーに作用して、ビーズの破壊を引き起こすことができる。
また、ビーズは、電気刺激の結果として、破壊、溶解、または分解することができる。前節で説明した磁気粒子と同様に、電気的感受性ビーズは、ビーズの破裂誘発、ならびに電場でのアラインメント、電気伝導性、または酸化還元反応などの他の機能を両方とも可能にすることができる。一例では、電気的感受性材料を含有するビーズは、電場にてアラインされ、内部試薬の放出を制御することができる。他の例では、電場は、ビーズ壁自体内での酸化還元反応を誘導することができ、それにより多孔性を増加させることができる。
また、光刺激を使用して、ビーズを破壊することができる。数多くの光誘発因子が考えられ、特定の波長範囲の光子を吸収可能なナノ粒子および発色団などの種々の分子を使用する系を挙げることができる。例えば、金属酸化物コーティングを、カプセル誘発因子として使用することができる。SiO2でコーティングされた高分子電解質カプセルをUV照射すると、ビーズ壁の崩壊を引き起こすことができる。さらに別の例では、アゾベンゼン基などの光スイッチング可能な物質をビーズ壁に組み込むことができる。UV光または可視光を適用すると、これらのような化学物質は、光子の吸収時に可逆的なシス-トランス異性化を起こす。この態様では、光子スイッチの組込みは、光誘発因子を適用すると崩壊するかまたはより多孔性になり得るビーズ壁をもたらす。
一部の実施形態では、ビーズ(例えば、標識が付着されるビーズ)は、ヒドロゲルビーズである。一部の実施形態では、ビーズはヒドロゲルを含む。
ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Dynabeads(登録商標)、MACS(登録商標)マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ(例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ)、プロテインAコンジュゲートビーズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA/Gコンジュゲートビーズ、プロテインLコンジュゲートビーズ、オリゴ(dT)コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびBcMag(商標)カルボキシル末端化磁気ビーズを挙げることができる。
固体支持体は、不溶性、半可溶性、または不溶性の材料を含んでいてもよい。固体支持体は、それに付着されているリンカー、スキャフォールド、構造ブロック、または他の反応性部分を含む場合「官能化」されていると呼ぶことができ、固体支持体は、それに付着されているそのような反応性部分を欠如する場合、「非官能化」されていると呼ぶことができる。固体支持体は、マイクロタイターウェル形式、カラムなどのフロースルー形式、または浸漬スティックなどにおいて、溶液中に浮遊させて使用することができる。
固体支持体は、膜、紙、プラスチック、コーティング表面、平坦表面、ガラス、スライド、チップ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。固体支持体は、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何学的構成の形態をとっていてもよい。固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、毛細管、ガラス繊維フィルター、ガラス表面、金属表面(鋼鉄、金銀、アルミニウム、ケイ素、および銅)などの平坦支持体、ガラス支持体、プラスチック支持体、ケイ素支持体、チップ、フィルター、膜、マイクロウェルプレート、スライド、マルチウェルプレートもしくは膜を含むプラスチック材料(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリドで形成されている)、および/またはウェーハ、コーム、ピン、もしくは針(例えば、コンビナトリアル合成もしくは分析に好適なピンのアレイ)、またはウェーハ(例えば、シリコンウェーハ)、フィルター底部を有するもしくは有しないピットを有するウェーハなどの平坦表面のピットもしくはナノリットルウェルのアレイ中のビーズを含むことができる。
本明細書で使用される場合、基材は、あるタイプの固体支持体を指すことができる。基材は、本開示のバーコードまたは確率論的バーコードを含んでいてもよい固体支持体を指すことができる。基材は、例えば、複数のマイクロウェルを含んでいてもよい。例えば、基材は、2つまたはそれよりも多くのマイクロウェルを含むウェルアレイであってもよい。一部の実施形態では、マイクロウェルは、規定容積の小型反応チャンバーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つまたは複数の細胞を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つのみの細胞を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つまたは複数の固体支持体を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つのみの固体支持体を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、単一細胞および単一固体支持体(例えば、ビーズ)を閉じ込める。マイクロウェルは、本開示のバーコード試薬を含むことができる。
本開示は、物理的試料(例えば、組織、臓器、腫瘍、細胞)中の別個の位置にある別個の標的の数を推定するための方法を提供する。本方法は、バーコード(例えば、確率論的バーコード)を試料の近傍に配置すること、試料を溶解すること、別個の標的にバーコードを付随させること、標的を増幅すること、および/または標的をデジタル的に計数することを含んでいてもよい。本方法は、バーコードにある空間標識から得られる情報を分析および/または視覚化することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、方法は、試料中の複数の標的を視覚化することを含む。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップまたは三次元マップを生成することを含んでいてもよい。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディングする(例えば、確率論的にバーコーディングする)前にまたは後で生成することができる。試料中の複数の標的の視覚化は、複数の標的を試料のマップにマッピングすることを含んでいてもよい。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップまたは三次元マップを生成することを含んでいてもよい。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディングする前にまたは後で生成することができる。一部の実施形態では、二次元マップおよび三次元マップは、試料を溶解する前にまたは後で生成することができる。二次元マップまたは三次元マップを生成する前にまたは後で試料を溶解することは、試料を加熱すること、試料を界面活性剤と接触させること、試料のpHを変化させること、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
本開示は、試料(例えば、細胞)を、本開示の基材と接触させるための方法を提供する。例えば、細胞、臓器、または組織の薄い切片を含む試料を、バーコード(例えば、確率論的バーコード)と接触させることができる。例えば、重力流により細胞を接触させることができ、その場合、細胞は沈降して単層を作出することができる。試料は、組織の薄い切片であってもよい。薄い切片を、基材上に配置することができる。試料は1次元であってもよい(例えば、平面状表面を形成してもよい)。試料(例えば、細胞)は、例えば、細胞を基材上で増殖/培養することにより、基材全体に広げることができる。
バーコードが標的の近傍に存在すると、標的は、バーコードにハイブリダイズすることができる。別個の標的の各々に本開示の別個のバーコードが付随し得るように、バーコードを非枯渇比率で接触させることができる。標的とバーコードと効率的な付随を保証するため、標的をバーコードと架橋連結してもよい。
細胞およびバーコードを配分した後、細胞を溶解して標的分子を遊離させてもよい。細胞溶解は、様々な手段のいずれかにより、例えば、化学的もしくは生化学的手段により、浸透圧ショックにより、または熱溶解、機械的溶解、もしくは光学的溶解により達成することができる。細胞は、界面活性剤(例えば、SDS、ドデシル硫酸Li、Triton X-100、Tween-20、もしくはNP-40)、有機溶媒(例えば、メタノールもしくはアセトン)、または消化酵素(例えば、プロテイナーゼK、ペプシン、もしくはトリプシン)、またはそれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液の添加により溶解することができる。標的へのバーコードの付随を増加させるため、標的分子の拡散速度を、例えば、温度を低減させることおよび/または溶解物の粘度を増加させることにより変更してもよい。
一部の実施形態では、溶解は、機械的溶解、熱溶解、光学的溶解、および/または化学的溶解により実施することができる。化学的溶解は、プロテイナーゼK、ペプシン、およびトリプシンなどの消化酵素の使用を含んでいてもよい。溶解は、溶解緩衝液を基材に添加することにより実施することができる。溶解緩衝液は、Tris HClを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、少なくとも約0.01、0.05、0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度のTris HClを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、最大で約0.01、0.05、0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度のTris HCLを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、約0.1MのTris HClを含んでいてもよい。溶解緩衝液のpHは、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも高くともよい。溶解緩衝液のpHは、最大で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも高くともよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液のpHは約7.5である。溶解緩衝液は、塩(例えば、LiCl)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、少なくとも約0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、最大で約0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の塩濃度は、約0.5Mである。溶解緩衝液は、界面活性剤(例えば、SDS、ドデシル硫酸Li、triton X、tween、NP-40)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、少なくとも約0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、または7%、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、最大で約0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、または7%、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、約1%ドデシル硫酸Liである。溶解法に使用される時間は、使用される界面活性剤の量に依存する場合がある。一部の実施形態では、使用される界面活性剤が多いほど、溶解に必要な時間が短くなる。溶解緩衝液は、キレート剤(例えば、EDTA、EGTA)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、少なくとも約1、5、10、15、20、25、または30mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、最大で約1、5、10、15、20、25、または30mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、約10mMである。溶解緩衝液は、還元剤(例えば、ベータ-メルカプトエタノール、DTT)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、少なくとも約1、5、10、15、または20mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、最大で約1、5、10、15、または20mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、約5mMである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、約0.1MのTris HCl、約pH7.5、約0.5MのLiCl、約1%のドデシル硫酸リチウム、約10mMのEDTA、および約5mMのDTTを含んでいてもよい。
細胞を溶解し、それらから核酸分子を放出させた後、核酸分子に、共局在化されている固体支持体のバーコードをランダムに付随させることができる。付随は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の相補的部分とのハイブリダイゼーションを含んでいてもよい(例えば、バーコードのオリゴ(dT)は、標的のポリ(A)テイルと相互作用することができる)。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件(例えば、緩衝液pH、イオン強度、温度など)は、特異的で安定したハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。一部の実施形態では、溶解された細胞から放出された核酸分子に、基材上の複数のプローブを付随させる(例えば、基材上のプローブとハイブリダイズする)ことができる。プローブがオリゴ(dT)を含む場合、mRNA分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写され得る。オリゴヌクレオチドのオリゴ(dT)部分は、cDNA分子の第一鎖合成のプライマーとして作用することができる。例えば、図2に例示されているバーコーディングの非限定的な例では、ブロック216において、mRNA分子を、ビーズ上のバーコードにハイブリダイズさせることができる。例えば、一本鎖ヌクレオチド断片は、バーコードの標的結合性領域にハイブリダイズすることができる。
付着されている標的-バーコード分子の固体支持体に基づくコレクションの回収は、磁気ビーズおよび外部から印加される磁場を使用することにより実施することができる。標的-バーコード分子をプールしたら、すべてのさらなる処理は、単一反応容器で進めることができる。さらなる処理は、例えば、逆転写反応、増幅反応、切断反応、解離反応、および/または核酸伸長反応を含んでいてもよい。マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞に由来する標識化標的核酸分子を最初にプールすることなく、さらなる処理反応を実施してもよい。
本開示は、逆転写を使用して標的-バーコードコンジュゲートを作出するための方法を提供する(例えば、図2のブロック224において)。標的-バーコードコンジュゲートは、バーコードおよび標的核酸のすべてまたは一部の相補配列(すなわち、確率論的バーコード化cDNA分子などのバーコード化cDNA分子)を含んでいてもよい。付随しているRNA分子の逆転写は、逆転写酵素と共に逆転写プライマーを添加することにより生じ得る。逆転写プライマーは、オリゴ(dT)プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。オリゴ(dT)プライマーは、12~18ヌクレオチド長であってもよく、または約12~18ヌクレオチド長であってもよく、哺乳動物mRNAの3’末端にある内因性ポリ(A)テイルに結合することができる。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、様々な相補的部位にてmRNAに結合することできる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、選択的に目的のmRNAからのプライミングを生じる。
逆転写は、繰り返して生じて、複数の標識化cDNA分子を産生することができる。本明細書で開示される方法は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100回の逆転写反応を実施することを含んでいてもよい。
1つまたは複数の核酸増幅反応(例えば、図2のブロック228における)を実施して、標識化標的核酸分子の複数コピーを作出することができる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅されるマルチプレックス様式で実施することができる。増幅反応を使用して、配列決定アダプターを核酸分子に付加することができる。増幅反応は、存在する場合、試料標識の少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、細胞標識および/またはバーコード配列(例えば、分子標識)の少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、試料タグ、細胞標識、空間標識、バーコード配列(例えば、分子標識)、標的核酸、またはそれらの組合せの少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、複数の核酸の0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、100%、またはこうした値の任意の2つの間の範囲もしくは数値を増幅することを含んでいてもよい。本方法は、1つまたは複数のcDNA合成反応を実施して、試料標識、細胞標識、空間標識、および/またはバーコード配列(例えば、分子標識)を含む標的-バーコード分子の1つまたは複数のcDNAコピーを産生することをさらに含んでいてもよい。
標識化核酸の増幅は、PCRベース法または非PCRベース法を含んでいてもよい。標識化核酸の増幅は、標識化核酸の指数関数的増幅を含んでいてもよい。標識化核酸の増幅は、標識化核酸の線形増幅を含んでいてもよい。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施することができる。PCRは、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のDNA配列をin vitro増幅するための反応を指すことができる。PCRは、これらに限定されないが、RT-PCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、定量的PCR、マルチプレックスPCR、デジタルPCR、サプレッションPCR、半サプレッシブPCR(semi-suppressive PCR)、およびアセンブリPCRを含む、この反応の派生形態を包含することができる。
増幅は、複数の核酸を含む1つまたは複数の試料に1つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含んでいてもよい。増幅は、複数の核酸に1つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含んでいてもよい。対照核酸は、対照標識を含んでいてもよい。
本明細書で開示される一部の実施形態は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬(タンパク質結合性試薬など)を各々が含む複数の組成物であって、オリゴヌクレオチドは、それがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬の固有識別子を含む組成物を提供する。細胞成分結合性試薬(バーコード化抗体など)およびそれらの使用(細胞の試料インデックス付与など)は、米国特許出願公開第2018/0088112号明細書および米国特許出願第15/937,713号明細書に記載されている。これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬のカクテル(例えば、抗体カクテル)を使用して、本明細書で開示される方法での標識付与感度を増加させることができる。いかなる特定の理論にも束縛されないが、これは、細胞成分発現またはタンパク質発現が、細胞タイプ間および細胞状態間で様々であり得るため、すべての細胞タイプを標識するユニバーサルな細胞成分結合性試薬または抗体を見出すことが困難であるためであり得ると考えられる。例えば、細胞成分結合性試薬のカクテルを使用すると、より多くの試料タイプのより高感度で効率的な標識付与を可能にすることができる。細胞成分結合性試薬のカクテルは、2つまたはそれよりも多くの異なるタイプの細胞成分結合性試薬、例えば、より広範囲の細胞成分結合性試薬または抗体を含むことができる。異なる細胞成分標的を標識する細胞成分結合性試薬を一緒にプールして、目的のすべての細胞タイプまたは1つもしくは複数の細胞タイプを十分に標識するカクテルを作出することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、本明細書に開示された組成物およびバーコード配列(例えば、分子標識配列)を細胞成分結合性試薬(例えば、タンパク質結合性試薬)のオリゴヌクレオチドに付随させ得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、試料中の複数の細胞成分標的(例えば、タンパク質標的)の定量分析に使用することができる。細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドは、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなどであるか、またはこれらを含んでもよい。一部の実施形態では、試料は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、血液試料などであり得る。一部の実施形態では、試料は、正常細胞、腫瘍細胞、血液細胞、B細胞、T細胞、母体細胞、胎児細胞など、または様々な対象からの細胞の混合物を含み得る。
一部の実施形態では、試料は、マイクロウェルアレイにおけるマイクロウェルなどの個々のコンパートメント中に分離した複数の単一細胞を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、複数の細胞成分標的との特異的結合のために、複数の組成物を試料と接触させることを提供する。使用される条件は、細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の、細胞成分標的への特異的結合を可能にし得ることが認識されるであろう。接触させるステップの後に、未結合の組成物を除去してもよい。例えば、試料が細胞を含み、かつ組成物が、細胞表面タンパク質などの細胞表面細胞成分である細胞成分標的に特異的に結合する実施形態では、未結合の組成物は、細胞成分標的に特異的に結合する組成物のみが細胞と共に残るように、細胞を緩衝液で洗浄することによって除去され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、本明細書に開示された組成物および細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドと核酸標的分子との両方にバーコード配列(例えば、分子標識配列)に付随し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、試料中の複数の細胞成分標的(例えば、タンパク質標的)および複数の核酸標的分子の同時定量分析のために使用され得る。複数の細胞成分標的および複数の核酸標的分子の同時定量分析の他の方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20180088112号明細書に記載されている。一部の実施形態では、試料は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、血液試料などであり得る。一部の実施形態では、試料は、正常細胞、腫瘍細胞、血液細胞、B細胞、T細胞、母体細胞、胎児細胞などの細胞型の混合物、または同じ対象もしくは異なる対象からの細胞の混合物を含み得る。
一部の実施形態では、試料は、マイクロウェルアレイ中のマイクロウェルなどの個々のコンパートメント中に分離された複数の単一細胞を含み得る。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬を、複数の細胞成分標的と特異的に結合させるために、試料と接触させる。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、洗浄することによって除去され得る。試料が細胞を含む実施形態では、細胞に特異的に結合していない任意の細胞成分結合性試薬が除去され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、複数の細胞成分標的との特異的結合のために、複数の組成物を試料と接触させることを提供する。使用される条件は、細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の、細胞成分標的への特異的結合を可能にし得ることが認識されるであろう。接触させるステップの後に、未結合の組成物を除去してもよい。例えば、試料が細胞を含み、かつ組成物が、細胞表面タンパク質などの細胞表面上にある細胞成分標的に特異的に結合する実施形態では、未結合の組成物は、細胞成分標的に特異的に結合する組成物のみが細胞と共に残るように、細胞を緩衝液で洗浄することによって除去され得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプローブを固体支持体上に固定化させ得る。固体支持体は、浮動性、例えば、溶液中のビーズであってもよい。固体支持体は、半固体または固体アレイ中に封入されていてもよい。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体上に固定化されていなくてもよい。複数のオリゴヌクレオチドプローブが、複数の核酸標的分子および細胞成分結合性試薬の複数のオリゴヌクレオチドに近接して存在する場合、複数の核酸標的分子および細胞成分結合性試薬の複数のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし得る。別個の核酸標的分子および細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドの各々に、本開示の異なるバーコード配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ(例えば、分子標識)が付随し得るように、オリゴヌクレオチドプローブを非枯渇的比率で接触させることができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、複数種の標的分子、例えば、タンパク質および核酸標的の同時定量分析のために使用することができる。例えば、標的分子は、細胞成分であってもよく、または細胞成分を含んでもよい。図6は、単一細胞における核酸標的と他の細胞成分標的(例えば、タンパク質)との両方の同時定量分析の例示的方法の概略図を示す。一部の実施形態では、各々が抗体などの細胞成分結合性試薬を含む複数の組成物605、605b、605cなどが提供される。異なる細胞成分標的に結合する、抗体などの異なる細胞成分結合性試薬が、異なる固有識別子とコンジュゲートされる。次に、細胞成分結合性試薬は、複数の細胞610を含有する試料とインキュベートされ得る。異なる細胞成分結合性試薬は、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せなどの細胞表面上の細胞成分に特異的に結合することができる。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、緩衝液で細胞を洗浄することにより、除去され得る。次いで、細胞成分結合性試薬を含む細胞は、単一のコンパートメント615が単一細胞および単一ビーズ620に適合するように所定のサイズにされているマイクロウェルアレイなどの複数のコンパートメント中に分離され得る。各ビーズは、ビーズ上のすべてのオリゴヌクレオチドプローブと共通の細胞標識、およびバーコード配列(例えば、分子標識配列)を含み得る複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、標的結合性領域、例えば、ポリ(dT)配列を含み得る。細胞成分結合性試薬にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド625は、化学的、光学的または他の手段を使用して、細胞成分結合性試薬から脱離され得る。細胞は溶解されて(635)、ゲノムDNAまたは細胞のmRNA630などの細胞内の核酸を放出し得る。細胞のmRNA630、オリゴヌクレオチド625またはその両方は、ビーズ620上のオリゴヌクレオチドプローブによって、例えば、ポリ(dT)配列にハイブリダイズすることによって、捕捉され得る。逆転写酵素を使用して、細胞のmRNA630およびオリゴヌクレオチド625にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを細胞のmRNA630およびオリゴヌクレオチド625を鋳型として使用して伸長することができる。逆転写酵素によって生成された伸長産物は、増幅および配列決定に供され得る。配列決定リードは、試料中の各単一細胞の細胞成分および遺伝子発現のデジタルな表現をもたらすことができる、細胞標識、バーコード(例えば、分子標識)、遺伝子、細胞成分結合性試薬に特異的なオリゴヌクレオチド(例えば、抗体に特異的なオリゴヌクレオチド)などの配列または識別子のデマルチプレクシングに供され得る。
細胞成分結合性試薬(例えば、抗原結合性試薬またはタンパク質結合性試薬)および/または核酸分子に付随しているオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブにランダムに付随し得る。本明細書において、結合性試薬オリゴヌクレオチドと称される細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチドは、本開示のオリゴヌクレオチド、例えば、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなどであってもよく、またはこれらを含んでもよい。付随は、例えば、標的核酸分子および/またはタンパク質結合性試薬のオリゴヌクレオチドの相補的部分へのオリゴヌクレオチドプローブの標的結合性領域のハイブリダイゼーションを含む。例えば、バーコード(例えば、確率論的バーコード)のオリゴ(dT)領域は、標的核酸分子のポリ(A)テイルおよび/またはタンパク質結合性試薬のオリゴヌクレオチドのポリ(A)テイルと相互作用可能である。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件(例えば、緩衝液のpH、イオン強度、温度など)は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。
一部の実施形態では、分子標識は、オリゴヌクレオチドプローブ標的結合性領域と標的核酸分子の一部および/または細胞成分結合性試薬に付随している(例えば、現在、または以前に付随した)オリゴヌクレオチドとのライゲーションにより追加され得る。例えば、標的結合性領域は、制限部位オーバーハング(例えば、EcoRI付着末端オーバーハング)への特異的ハイブリダイゼーションが可能となり得る核酸配列を含み得る。本方法は、制限部位オーバーハングを生成するために制限酵素(例えば、EcoRI)で標的核酸および/または細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチドを処置することをさらに含み得る。2つの断片を接続するために、リガーゼ(例えば、T4 DNAリガーゼ)を使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、各固有識別子、各核酸標的分子、および/または各結合性試薬オリゴヌクレオチド(例えば、抗体オリゴヌクレオチド)のための固有分子標識配列の数または存在を決定することを含む。例えば、配列決定リードを使用して、各固有識別子、各核酸標的分子、および/または各結合性試薬オリゴヌクレオチドのための固有分子標識配列の数を決定することができる。別の例として、配列決定リードを使用して、分子標識配列(例えば、配列決定リードにおける標的に付随している分子標識配列、結合性試薬オリゴヌクレオチド、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなど)の存在または非存在を決定することができる。
本明細書に開示された一部の実施形態は、試料中の複数の細胞成分(例えば、タンパク質)および/または複数の核酸標的分子の同時定量分析のためのキットおよび組成物を提供する。キットおよび組成物は、一部の実施形態では、各々がオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした複数の細胞成分結合性試薬(例えば、複数のタンパク質結合性試薬)を含むことができ、オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬に対する固有識別子、および複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、複数のオリゴヌクレオチドプローブの各々は、標的結合性領域、バーコード配列(例えば、分子標識配列)を含み、バーコード配列は、固有バーコード配列の多様なセットに由来する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、分子標識、細胞標識、試料標識、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、リンカーを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、オリゴヌクレオチドプローブの結合部位、例えば、ポリ(A)テイルを含み得る。例えば、ポリ(A)テイルは、例えば、oligodA18(固体支持体に係留していない)またはoligoA18V(固体支持体に係留している)であり得る。オリゴヌクレオチドは、DNA残基、RNA残基、またはその両方を含み得る。
本明細書の開示は、試料を識別するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する1つまたは複数の細胞を、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、1つまたは複数の細胞の各々は、1つまたは複数の細胞成分標的を含み、複数の試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、1つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも2つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと;複数のバーコード(例えば、確率論的バーコード)を使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディング(例えば、確率論的にバーコーディング)して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること;複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること;および複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、1つまたは複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞の試料起源を識別することを含む。
本明細書の開示は、細胞のオーバーローディングおよびマルチプレットを識別するための方法、キットおよびシステムも含む。このような方法、キットおよびシステムは、例えば、オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を用いて細胞成分の発現レベル(例えば、タンパク質発現レベル)を測定するための方法、キットおよびシステムなどの、本明細書に開示された任意の適切な方法、キットおよびシステムにおいて、またはそれらと組み合わせて使用され得る。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコードを使用して細胞の複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することであって、複数のバーコードの各々は、細胞標識配列を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも2つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと;およびバーコード化標的の配列決定データを得ることを含む。複数のバーコードを使用して複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することは、標的のコピーをバーコードの標的結合性領域と接触させること;および複数のバーコードを使用して複数の標的を逆転写して、複数の逆転写標的を生成することを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、複数のバーコードを、細胞識別オリゴヌクレオチドと接触させて、細胞識別オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること;および細胞識別オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含む。バーコードを伸長することは、DNAポリメラーゼを使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。バーコードを伸長することは、逆転写酵素を使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングして複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、細胞識別オリゴヌクレオチドを確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
本明細書における開示は、適合する配列決定装置(例えば、Illumina(登録商標)配列決定装置)で配列決定するために、cDNA産物(例えば、BD Rhapsody単一細胞分析系のcDNA産物)から全トランスクリプトーム解析(WTA)ライブラリーを生成するための方法を含む。現在、標準的なBD Rhapsody RNAワークフローでは、まずBD Rhapsody細胞捕捉ビーズ(以降、「ビーズ」と呼ぶ)での3’捕捉およびcDNA合成によりRNAトランスクリプトームを捕捉し、続いて2回の多重化ネステッドPCR増幅を行って目的のRNA標的を富化する(標的化アッセイ)。この方法の一部の実施形態では、標的化RNA分析は、一般に、低発現標的に対してより高い感度をもたらすが、WTA RNA分析は、より広い範囲の遺伝子の調査を提供する。一部の実施形態では、所望の標的の増幅を成功させるには、目的のモデル系における各RNAの3’末端およびそのポリアデニル化部位の使用の十分な理解が必要となる場合がある。例えば、BD Rhapsodyを共に使用するWTA法は、いくつかのレベルの情報の取得を可能にし、1)モデル系において興味深いRNA標的を識別して、設計しようとする1パネルの遺伝子を識別すること;2)モデル系におけるトランスクリプトームの3’末端を、BD Rhapsodyの新世代PCRパネル設計への入力として特徴付けること;および3)標準的なBD Rhapsody標的化手法と比較してより幅広い遺伝子をアッセイすることにより、ユーザが発見生物学(discovery biology)を行うことを可能にすることを含む。
本明細書で開示されるRPEに基づくWTA法は、低存在量の転写物の感度増加、新しい転写物の検出、新しい細胞タイプの検出、および/または配列決定コストの低減をもたらすことができる。本明細書で提供されるRPEに基づくWTA法の一部の実施形態は、代替的な、RPEに基づかないWTA法(例えば、ライゲーションに基づくWTA法または断片化に基づくWTA法)と比較して、低存在量の転写物の感度増加、新しい転写物の検出、新しい細胞タイプの検出、および/または配列決定コストの低減をもたらす。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と同義的に使用することができる。
全トランスクリプトーム解析(WTA)のためのランダムプライミングおよび伸長(RPE)プロトコール。
以下に提供される本プロトコールは、ランダムプライミング手法を使用してRhapsodyビーズから全トランスクリプトームライブラリーを生成するための例示的な実施形態を概説するものである。以下に提供されるプロトコールと同様の手順を実施例1で使用した。
BD Rhapsody標的化mRNAおよびAbSeq増幅キット(BD Biosciences、633774);SPRIselect試薬(Beckman Coulter Life Sciences、B23318);100%エチルアルコール;無ヌクレアーゼ水;Klenow断片(3’->5’exo-)(New England Biolabs、M0212L);10mM dNTP(New England Biolabs);ならびに100uMの濃度に事前希釈したノナマー2(5’TCA GAC GTG TGC TCT TCC GAT CTNNNNNNNNN3’;配列番号1)(1ヌクレオチド内容物当たり25%の混合塩基を手作業による混合で達成した)。
ピペット(P10、P20、P200、P1000);低保持濾過ピペットチップ;1.5mLマイクロ遠心分離チューブ(Eppendorf、022431021);DNA LoBindチューブ、1.5mL(Eppendorf、0030108051);および0.2mL PCRストリップチューブ。
機器
1.5~2.0mLチューブ用のマイクロ遠心分離機;0.2mLチューブ用マイクロ遠心分離機;ボルテックス混合器;Pipet-Aid;1.5mLチューブ用の6チューブ磁気分離ラック(New England Biolabs、S1506S);0.2mLの8ストリップチューブ用の薄型磁気分離スタンド(V&P Scientific、Clontech;VP772F4-1、635011);デジタルタイマー;マルチチャネルピペット(P20、P200);ヒートブロック;およびThermomixer。
mRNAを有していないビーズの生成(「コールド」ビーズ)
1. Rhapsodyビーズの1つのチューブ(約600,000個のビーズ、3セットのカートリッジビーズに添加するのに十分なコールドビーズを含む)を磁石と共にインキュベートした。液体をすべて除去し、ペレットを750μlの試料緩衝液で再懸濁した。
2. チューブを磁石と共にインキュベートし、すべての液体を廃棄した。
3. ビーズを、42μlの1×溶解緩衝液(5mM DTTを含む)と共に2分間インキュベートした。5mM DTTを有する溶解緩衝液は、10uLの1M DTTおよび2mLの溶解緩衝液を組み合わせて製作した。
4. 次いで、各々を1mLの1×溶解緩衝液(5mM DTTを含む)で希釈し、磁石と共にインキュベートし、液体をすべて除去した。
5. 1.0mLのビーズ洗浄緩衝液を添加した。混合し、磁石と共にインキュベートした後、液体をすべて除去した。
6. 1.0mLのビーズ洗浄緩衝液を添加した。
7. RT緩衝液反応ミックスを、表1に示されているように調製した。
8. ビーズを磁石と共にインキュベートし、液体をすべて除去した。
9. 600μLのRT緩衝液ミックスをビーズに添加し、ピペッティングで混合した。
10. ビーズを、ThermoMixerで1200RPMにて振とうしながら、37℃で20分間インキュベートした。
11. チューブを氷上に短時間配置した後、磁石と共にインキュベートし、液体をすべて除去した。
12. エキソヌクレアーゼIミックスを、表2に示されているように調製した。
13. 600μlのExoIミックスをビーズに添加し、ピペッティングで混合した。
14. ビーズを、ThermoMixerで1200RPMにて振とうしながら、37℃で30分間インキュベートした。
15. ビーズを振とうせずに20分間80℃へと移動させ、次いで氷上に1分間配置した。
17. 各ビーズペレットを、600μLのビーズ再懸濁緩衝液で再懸濁した。得られた濃度は、およそ1000ビーズ/μLだった。一部の場合では、スキャナーのビーズ計数プログラムを使用して、最終ビーズ濃度を決定した。
cDNAを有するBD Rhapsodyビーズ上でのランダムプライミングおよび伸長(RPE)
1. 増幅前作業場所において、新しい1.5mLのLoBindチューブに、表3に列挙されている成分を表示の順序でピペッティングした。
2. ランダムプライマーミックスを、穏やかなピペッティングで混合した。
3. 一部の場合では、エキソヌクレアーゼIで処理したBD Rhapsody細胞捕捉ビーズの試料全体に対して、ランダムプライミングおよび伸長を実施し、手順を飛ばしてステップ7に進んだ。一部の場合では、エキソヌクレアーゼIで処理したBD Rhapsody細胞捕捉ビーズの部分試料に対して、ランダムプライミングおよび伸長を実施し、ユーザはステップ4へと進んだ。
5. カートリッジ実験のビーズを、最終ビーズ容積が200μLになるように「コールド」ビーズと組み合わせた(総ビーズ数は約200,000個だった)。例えば、2000個の細胞を有する40uLのビーズの場合、160uLのコールドビーズを添加した。あるいは、一部の場合では、以下のように計算を実施した:追加するコールドビーズの数=200000*(1-(部分サンプリングする細胞/ビーズ洗浄後の総細胞))。
7. チューブを磁石から取り外し、次いで低保持チップを使用して175μLのランダムプライマーミックスをチューブへとピペッティングした。ピペット混合を10回実施し、ビーズを再懸濁した。
8. チューブを95℃のヒートブロックに2分間配置し、次いで試料を、37℃で5分間1,200rpmで、25℃で5分間1,200rpmで遠心分離沈降させた。
9. 25μLのプライマー伸長反応ミックス(表4に示されている)を、ビーズを含む試料チューブへとピペッティングした(総容積は200μL)。ピペット混合を10回実施した。
10. チューブを、37℃で30分間1,200rpmにてthermomixerに配置した。
11. チューブを95℃のヒートブロックに2分間配置し、Thermomixerで約20秒間振とうし、1.5mL磁石に配置し、上清(ランダムプライマー伸長産物、すなわちRPE産物)を直ちに新しい1.5mLのLoBindチューブに移し、そのチューブを氷上で保管した。
13. 一部の場合では、200μLのコールドビーズ再懸濁緩衝液(PN650000066)を、残りのビーズを有するチューブへとピペッティングした。ビーズを、ピペット混合のみで穏やかに再懸濁した(ボルテックスはしなかった)。ビーズを、増幅前作業場所で4℃にて保管した。残りのビーズは、BD Rhapsody標的化およびBD AbSeqライブラリー生成に使用することできる。
1. 新しい5.0mLのLoBindチューブに、4.0mLの無水エチルアルコールを1.0mLの無ヌクレアーゼ水にピペッティングすることにより、5mLの新鮮な80%(容積/容積)エチルアルコールを調製した。チューブを10秒間ボルテックスした。新鮮な80%エチルアルコールを作り、24時間以内に使用した。
2. SPRI Selectビーズを、使用前に1分間高速でボルテックスした。ビーズは、均質で均一な色を呈した。
3. 320μL(1.6×)のSPRI Selectビーズを、200μLのRPE産物上清を含むチューブにピペッティングした。
4. ピペット混合を少なくとも10回実施し、次いで短時間遠心分離した。
5. 懸濁物を室温で10分間インキュベートし、次いでそれを1.5mLチューブ磁石に5分間配置した。
7. ビーズを有する元のチューブを磁石上で維持し、このチューブに600μLの新鮮な80%エチルアルコールを穏やかにピペッティングした。
8. 試料を磁石上で30秒間インキュベートした。
9. 磁石上に置いたまま、SPRI Selectビーズを乱すことなく、上清を注意深く除去し、適切に廃棄した。
10. エタノール洗浄ステップを繰り返して、合計2回の80%エタノール洗浄を行った。
11. 磁石上に置いたまま、少容積ピペットを使用して、一切の残留上清をチューブから除去した。
13. チューブを磁石から取り外し、31μLの溶出緩衝液(PN650000075)をチューブへとピペッティングした。溶液が懸濁し、均一な色を呈するまで、懸濁物を少なくとも10回ピペット混合した。
14. 試料を室温で2分間インキュベートした。
15. チューブを短時間遠心分離して、内容物を底部に収集した。
16. 溶液が透明になるまで(通常は≦30秒)、チューブを磁石上に配置した。
17. 溶出液全体(約30μL)を新しいPCRチューブにピペッティングした。これは、精製されたBD Rhapsody RPE産物だった。これをPCRするまで氷上または4℃で維持した。
RPE PCR
1. 増幅前作業場所において、新しい1.5mLのLoBindチューブに、表5に示されている成分を表示の順序でピペッティングした。
2. 70μLのRPE PCRミックスを、30μLの精製RPE産物と組み合わせた。
3. RPE PCR反応物を、1チューブ当たり50μLの反応ミックスを有する2つのPCRチューブに分割した。
4. 表6に示されているPCRプログラムを実行し、PCRサイクルの数を表7に従って決定した。
5. RPE PCR反応が完了したら、チューブを短時間遠心分離して、内容物をチューブの底部に収集した。
6. 2つの反応物を、新しい0.2mLのPCRチューブへと組み合わされた。
RPE PCR増幅産物の精製(片側クリーンアップ)
1. 一部の場合では、2μLのRPE PCR反応産物を、バイオアナライザー分析のために採取した(後に精製産物と比較するため)。
3. 最終増幅産物を有するチューブを短時間遠心分離した。
4. 100.0μL(1.0×)のSPRI Selectビーズを最終増幅産物へとピペッティングした。
5. 少なくとも10回のピペット混合を実施し、次いで試料を短時間遠心分離した。
6. 懸濁物を室温で5分間インキュベートし、次いでストリップチューブ磁石に3~5分間配置した。
8. チューブを磁石上に維持したまま、200μLの新鮮な80%エチルアルコールを穏やかにピペッティングした。
9. 試料を磁石上で30秒間インキュベートした。
10. 磁石上に置いたまま、ユーザは、SPRI Selectビーズを乱すことなく上清のみを注意深く除去し、適切に廃棄した。
11. 80%エタノール洗浄を繰り返して、合計で2回の洗浄を行った。
13. チューブを磁石上で開けたままにして、SPRI Selectビーズを、室温で少なくとも5分間、またはビーズがもはや光沢を見せなくなるまで乾燥させた。
14. 30μLの溶出緩衝液(PN650000075)をチューブへとピペッティングし、パルスボルテックスして、SPRI Selectビーズを完全に再懸濁した。
15. 試料を室温で2分間インキュベートした。
16. チューブを短時間遠心分離して、内容物を底部に収集した。
17. 溶液が透明になるまで(通常は≦30秒)、チューブを磁石上に配置した。
18. 溶出液全体(約30μL)を、新しい1.5mLのLoBindチューブへとピペッティングした。これで、RPE PCR溶出液をインデックスPCRに使う準備ができた。一部の場合では、このステップは休止地点であり、RPE PCRライブラリーを-20℃で≦6か月間保管することができた。
WTAインデックスPCR
1. RPE PCR溶出液を、200~1000bpピークの濃度が約1~2nMになるように希釈した。例えば、200~1000bpピークのバイオアナライザー測定値が約6nMだった場合、試料を1:3希釈して2nMにした。
2. 表8に示されている成分を、表示の順序で新しい1.5mLチューブにピペッティングした。
3. WTAインデックスPCRミックスを、以下のようにPCR1鋳型と組み合わせた:(a)1つの試料の場合、47μLのWTAインデックスPCRミックスを、3μLの1~2nMのRPE PCR溶出液(鋳型)と組み合わせた;または(b)異なるリバースライブラリーインデックスを有する複数の試料の場合、WTAインデックスPCRミックスを、5μLのリバースインデックスおよび3μLのRPE PCR溶出液(鋳型)と組み合わせた。
4. 表9に示されているPCRプログラムを実行した。
5. WTAインデックスPCRが完了したら、チューブを短時間遠心分離して、内容物をチューブの底部に収集した。
WTAインデックスPCR産物の精製(両側クリーンアップ)
1. 一部の場合では、2μLのWTAインデックスPCR反応産物を、バイオアナライザー分析のために採取した(後に精製産物と比較するため)。
3. WTAインデックスPCR産物を有するチューブを短時間遠心分離した。
4. 50μLの水を、100μLの最終容積になるようにWTAインデックスPCR産物に添加した。
5. 55μL(0.55×)のSPRI Selectビーズを、WTAインデックスPCR産物へとピペッティングした。
6. 少なくとも10回のピペット混合を実施し、次いで試料を短時間遠心分離した。
8. ステップ5のストリップチューブが依然として磁石上にある間に、ユーザは、磁石に引き付けられたビーズを乱すことなく155μLの上清を注意深く取り出し、新しい0.2mLストリップチューブへと移し、ピペットで10回混合した。
9. 15μL(0.70×)のSPRI Selectビーズを、上清を含む新しいストリップチューブへとピペッティングした。
10. 懸濁物を室温で5分間インキュベートし、次いで新しいチューブを0.2mLチューブ磁石に5分間配置した。
11. 磁石上に置いたまま、ユーザは、SPRI Selectビーズを乱すことなく上清のみを注意深く除去し、適切に廃棄した。
12. チューブを磁石上に維持したまま、200μLの新鮮な80%エチルアルコールを穏やかにピペッティングした。
14. 磁石上に置いたまま、ユーザは、SPRI Selectビーズを乱すことなく上清のみを注意深く除去し、適切に廃棄した。
15. 80%エタノール洗浄を繰り返して、合計で2回の洗浄を行った。
16. チューブを磁石上に維持したまま、少容積ピペットを使用して、一切の残留上清をチューブから除去した。
17. チューブを磁石上で開けたままにして、SPRI Selectビーズを、室温で5分間乾燥させた。
19. 試料を室温で2分間インキュベートした。
20. チューブを短時間遠心分離して、内容物を底部に収集した。
21. 溶液が透明になるまで(通常は≦30秒)、チューブを磁石上に配置した。
22. 溶出液全体(約30μL)を、新しい1.5mLのLoBindチューブへとピペッティングした。WTAインデックスPCR溶出液は、最終配列決定ライブラリーだった。一部の場合では、このステップは休止地点だった。インデッスクPCRライブラリーを、配列決定まで-20℃で≦6か月間保管することができた。
23. ユーザは、Qubit dsDNA HSアッセイを使用したQubit(商標)蛍光光度計およびAgilent高感度DNAキットを使用したAgilent2100バイオアナライザーを用いて、インデックスPCRライブラリーを定量化し、品質管理を実施した。
配列決定
一部の場合では、1細胞当たり50,000リードで配列決定を実施し、20%PhiXを配列決定実行に負荷した。
全トランスクリプトーム解析(WTA)を実施するためのランダムプライミングおよび伸長(RPE)に基づく方法の開発および改良
本明細書で提供される全トランスクリプトーム解析(WTA)を実施するためのランダムプライミングおよび伸長(RPE)に基づく方法を、表10に提供されている非限定的な例示的WTA性能評価項目および現行の利用可能なWTA法との比較に、部分的に基づいて開発および最適化した。例えば、RPEに基づくWTA法は、以下を考慮して開発した:(1)一般的なWTA評価項目(例えば、1細胞当たりの遺伝子/UMI)、しかしながら、異なるWTA法は異なる遺伝子タイプに由来する固有のバイアスを有するため、これらはバイアスを受けていている可能性がある;および(2)例えば、様々な発現レベルの遺伝子およびバイアス(リボソーム遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、ハウスキーピング遺伝子など)にわたるWTAドロップアウト率などの追加の評価項目。一部の場合では、主要な免疫細胞タイプ(B細胞、NK、T細胞、および骨髄細胞)の識別は、BD DataViewのtSNEおよび特徴選択初期設定を使用して行った。
ヘキサマー(ID010HK6)またはノナマー(ID010NK6)のいずれかを使用して、本明細書で提供されるWTAを実施するためのRPEに基づく方法を、ジャーカット/ラモス細胞(表11)およびPMBC(表12)において、現行の利用可能なライゲーションに基づくWTA法(ID010UG1)と比較した。図13A~Bは、ライゲーションに基づく全トランスクリプトーム解析、ならびに6merランダマーおよび9merランダマーによるランダムプライミングおよび伸長を用いた全トランスクリプトーム解析を実施するための非例示的な感度評価項目を示すプロットである。ジャーカット/ラモス細胞では、RPEに基づくWTA法を使用すると、ライゲーションに基づくWTA法と比較してより多くの遺伝子および分子が検出された。さらに、ノナマーに基づくRPE法を使用すると、ヘキサマーに基づく方法と比較してより多くの遺伝子および分子が検出された。一部のマーカーは、ジャーカット細胞では発現しなかった。ライゲージョンに基づく方法は、IGLC3のより良好な検出を示すことが認められた。
図15A~15Bは、ID010NK6(RPE WTAノナマー)が、ID010UG1(ライゲーションに基づくWTA法)よりも多くの細胞表面マーカーを捕捉するようであったことを示す非限定的な例示的円グラフである。図15Aは、特定の遺伝子を発現する細胞の数が、RPE WTAノナマー法またはライゲーションに基づくWTA法においてより多かったことを示す円グラフである。図15Bは、特定の遺伝子を発現する1細胞当たりのUMIが、RPEノナマー法またはライゲーションに基づくWTA法においてより多いことを示す円グラフである。さらに、表13および14に示されているように、ノナマーRPEに基づくWTA法は、ライゲーションに基づくWTA法よりも多くの細胞表面マーカーを捕捉した。
加えて、本明細書で開示されるRPEに基づくWTA法は、より短いWTAプロトコールを提供することができる。単一細胞捕捉からcDNA合成完了までは、既存の液滴に基づくWTA法、既存のライゲーションに基づくWTA法、およびRPEに基づくWTA法では、それぞれ85分、130分、および130分の時間がかかる。ライブラリー調製からQCまでは、既存の液滴に基づくWTA法、既存のライゲーションに基づくWTA法、およびRPEに基づくWTA法では、それぞれ375分、520分、および330分の時間がかかる。したがって、本明細書で提供されるWTAを実施するための新規方法には、プロトコール時間を短縮するという利点がある。
ヘキサマーまたはノナマーのいずれかを使用して、本明細書で提供されるWTAを実施するためのRPEに基づく方法を、PBMCおよびジャーカット/ラモス細胞で試験した。
図16A~16Dは、1つのランダムプライミングステップおよび1つのPCRステップを含むRPE法を使用すると、ジャーカット/ラモスは、健常ドナー末梢血単核細胞(PBMC)よりも高いRNA含有量を有し(1細胞当たりのUMI計数を比較すると約5×)、PBMCライブラリーは、165bpの夾雑物を生成したことを示す非限定的な例示的バイオアナライザープロットである。夾雑物は、これらのピークの配列決定が可能であったため、ランダマーダイマーである可能性が高かった。図16A~16Bは、それぞれジャーカット/ラモスおよびPBMCにおけるヘキサマーRPEバイオアナライザープロットを示し、図16C~16Dは、それぞれジャーカット/ラモスおよびPBMCにおけるノナマーRPEバイオアナライザープロットを示す。
ヘキサマーまたはノナマーのいずれかを使用して本明細書で提供されるWTAを実施するためのRPEに基づく方法のための伸長酵素の使用を調査した。
図17A~17Dは、ランダムプライミングおよび伸長(1つのランダムプライミングステップおよび1つのPCRステップを含むRPE法を使用する)によるWTA分析を実施する一部の実施形態では、鎖置換活性を有するKlenow Exo-が、T4 DNAポリメラーゼよりも好ましいことを示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット(RPE PCR)である。様々なポリメラーゼを試験した。部分サンプリングしたジャーカット/ラモス細胞の数は1000個だった。図17A~17Bは、それぞれヘキサマーおよびノナマーを使用したKlenow Eco-のバイオアナライザープロットを示し、図17C~17Dは、それぞれヘキサマーおよびノナマーを使用したT4 DNAポリメラーゼのバイオアナライザープロットを示す。プロットは、Klenow Exo-が中程度の鎖置換活性を有し、T4 DNAポリメラーゼが鎖置換活性を有しなかったことを示す。2つの酵素の間にはエキソヌクレアーゼ活性にも違いがあった。Klenow Exo-は、複数のランダムプライミング伸長産物を生成することができるため、ヘキサマーおよびノナマーの両方でより高い収量をもたらした。一部の実施形態では、Klenowを伸長に使用する。一部の実施形態では、Klenow exo-を伸長に使用する。
ヘキサマーまたはノナマーのいずれかを使用して本明細書で提供されるWTAを実施するためのRPEに基づく方法のランダムプライミングステップの数およびランダマーの長さを調査した。
本明細書で提供されるWTAを実施するためのRPEに基づく方法のための最適なSPRIクリーンアップ比を調査した。
図20A~20Fは、RPEに基づくWTA法の性能に対するSPRIクリーンアップ比の効果を示す非限定的な例示的データである。図20A~20Bは、1.6×(図20A)および1.0×(図20B)SPRIクリーンアップ比を比較する非限定的な例示的バイオアナライザープロットである。加えて、リード/細胞(図20C)、遺伝子中央値/細胞(図20D)、分子中央値/細胞(図20E)、ならびにリボソーム分子%およびミトコンドリア分子%(図20F)を、1.6×および1.0×のSPRIクリーンアップ比で比較した。こうしたデータにより、1.6×RPEクリーンアップ比は、1.0×クリーンアップ比よりも高い収量をもたらし、1.6×クリーンアップ比は、より少ないリード/細胞を有するにも関わらず、1.0×クリーンアップ比よりも多くの分子および遺伝子/細胞の検出をもたらすことが実証される。
本明細書で提供されるWTAを実施するためのRPEに基づく方法のための様々なランダムプライマー濃度およびRPE条件を調査した。
図21A~21Gは、RPEに基づくWTA法に対する様々なランダムプライマー濃度およびRPE条件の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット(RPE PCR、SPRIクリーンアップ後)である。具体的には、実験では以下の条件を比較した:ID019-1(図21A、10uMランダムプライマー;コールドビーズの添加無し、6.186nM)、ID019-2(図21B、10uMランダムプライマー、コールドビーズを添加、2.138nM)、ID019-3(図21C、5uMランダムプライマー、コールドビーズを添加、0.538nM)、ID019-4(図21D、1uMランダムプライマー、コールドビーズを添加、0.314nM)、ID019-5(図21E、0.5uMランダムプライマー、コールドビーズを添加、0.438nM)、ID019-6(図21F、1uMランダムプライマー、コールドビーズを添加、0.652nM)、およびID019-7(図21G、0.5uMランダムプライマー、コールドビーズを添加、0.242nM)。図21Aおよび21Bを比較すると、コールドビーズの添加は、RPE PCRの所望の産物の収量を減少させることが観察される。ID017(下記に記載)は、反対のPCR収量結果を有したが、これはPCR条件が異なるためであった可能性があり、ID019でのRPEクリーンアップ条件を片側クリーンアップに改変した。
図28A~28Cは、2PCRライブラリー生成プロトコール(図28A~28B)および1PCRライブラリー生成プロトコール(図28C)を用いた本開示のランダムプライミングおよび伸長に基づくWTA分析の例示的な性能を示す例示的なバイオアナライザープロットである。図28Aは、2PCRライブラリー生成プロトコールのPCR1(例えば、RPE PCR)を示し、図28Bは、2PCRライブラリー生成プロトコールのPCR2(例えば、インデックスPCR)を示し、図28Cは、単一PCRステップの結果を示す。2PCRライブラリー生成プロトコール(RPE PCR)の第1のPCRには、リード1&2プライマーを使用した。1PCRライブラリー生成プロトコールの第1のPCRには、インデックスP5/P7プライマーを使用した。インデックスプライマーの使用は、16サイクル後に<1ng/uLだった、強度が高い165bpピーク(30uLで溶出)をもたらした。PCR1におけるインデックスプライマーの使用(1PCRライブラリー生成プロトコ-ル)は、量的に大きな165bpピークに結び付いた(図28Cの矢印で示されている)。このピークは、リード1/リード2試料(図28A)ではそれほど顕著ではなかった(71bpとして現れた)。したがって、PCR1にてR1/R2プライマーを使用すると、PCR1で生成される165bpピークがより少なくなり、産物がわずかにより少なくなるが、ユーザは、第2のPCRにおいてより多くの収量を得ることができる。したがって、2PCRライブラリー生成プロトコールでは、165bp夾雑物ピークがより少なく、総ライブラリー収量はより多くなった。したがって、2回のPCRに基づくRPE WTA法は、よりクリーンなライブラリー生成を可能にすることができる。
タンパク質結合性試薬に付随させるためのオリゴヌクレオチド
この実施例は、タンパク質結合性試薬がコンジュゲートし得るオリゴヌクレオチドの設計について実証する。オリゴヌクレオチドを使用して、タンパク質発現と遺伝子発現を同時に決定することができる。オリゴヌクレオチドを試料インデックス付与のために使用して、同一または異なる試料の細胞を決定することもできる。
95merのオリゴヌクレオチドの設計
以下の方法を使用して、タンパク質発現と遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のための、候補オリゴヌクレオチド配列および対応するプライマー配列を生成した。
以下のプロセスを使用して、タンパク質発現と遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列を生成した。
ステップ1a.所望の長さ(45bp)を有するいくつかの候補配列(50000配列)をランダムに生成する。
ステップ1b.生成した配列の5’末端に転写調節LSRR配列および生成した配列の3’末端にポリ(A)配列(25bp)を付加する。
ステップ1c.生成および付加した配列で、40%~50%の範囲のGC含量を有さない配列を除去する。
ステップ1d.残った配列で、各々1つまたは複数のヘアピン構造を有する配列を除去する。
残った候補オリゴヌクレオチド配列の数は、423であった。
残った423の候補オリゴヌクレオチド配列のプライマーを設計するために、以下の方法を使用した。
2.1 N1プライマー:N1プライマーとして、ユニバーサルN1配列:5’-GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG-3’(LSRR配列;配列番号4)を使用する。
2.2 N2プライマー(特定試料インデックスオリゴヌクレオチドの増幅を目的とする;例えば、図29B~29DのN2プライマー):
2.2a.N1配列の下流で開始しない候補N2プライマーを除去する。
2.2b.候補オリゴヌクレオチド配列の最後の35bpにおいて重複する候補N2プライマーを除去する。
2.2c.オリゴヌクレオチドを使用して試験される細胞の種のトランスクリプトーム(例えば、ヒトトランスクリプトームまたはマウストランスクリプトーム)とアラインするプライマー候補を除去する。
2.2d.プライマー-プライマー相互作用を最小限にするかまたは回避するために、デフォルト対照としてILR2配列(ACACGACGCTCTTCCGATCT;配列番号5)を使用する。
423の候補オリゴヌクレオチド配列のうち、390候補に対するN2プライマーを設計した。
残った390の候補プライマー配列をフィルタリングするために、以下のプロセスを使用した。
3a.すべてのバーコードについてポリ(A)テイルを同じ長さに維持するために、Aで終わるランダム配列を有する(すなわち、ポリ(A)配列の有効長さが25bpを超える)あらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
3b.Gが連続するオリゴ合成では、コストが余分にかかり、しかも収率が低い可能性があるため、4以上の連続するG(>3G)を含むあらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
図29Aは、上記の方法を使用して生成した非限定的な例示的候補オリゴヌクレオチド配列を示す。
200merのオリゴヌクレオチドの設計
以下の方法を使用して、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定ならびに試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列および対応するプライマー配列を生成した。
以下を使用して、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定ならびに試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列を生成した。
1a.所望の長さ(128bp)を有するいくつかの候補配列(100000配列)をランダムに生成する。
1b.生成した配列の5’末端に転写調節LSRR配列と、非ヒト、非マウスの追加アンカー配列を、および生成した配列の3’末端にポリ(A)配列(25bp)を付加する。
1c.生成および付加した配列で、40%~50%の範囲のGC含量を有さない配列を除去する。
1d.ヘアピン構造スコアに基づき、残った候補オリゴヌクレオチド配列を選別する。
1e.最も低いヘアピンスコアを有する1000の残った候補オリゴヌクレオチド配列を選択する。
最も低いヘアピンスコアを有する400の候補オリゴヌクレオチド配列のプライマーを設計するために、以下の方法を使用した。
2.1 N1プライマー:N1プライマーとして、ユニバーサルN1配列:5’-GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG-3’(LSRR配列;配列番号4)を使用する。
2.2 N2プライマー(特定の試料インデックスオリゴヌクレオチドの増幅を目的とする;例えば、図29Bおよび29CのN2プライマー):
2.2a.N1配列の23nt下流で開始しない候補N2プライマーを除去する(アンカー配列は、すべての候補オリゴヌクレオチド配列についてユニバーサルであった)。
2.2b.標的配列の最後の100bpにおいて重複する候補N2プライマーを除去する。得られたプライマー候補は、標的配列の48番目のヌクレオチドと100番目のヌクレオチドとの間に存在し得る。
2.2c.オリゴヌクレオチドを使用して試験される細胞の種のトランスクリプトーム(例えば、ヒトトランスクリプトームまたはマウストランスクリプトーム)とアラインするプライマー候補を除去する。
2.2d.プライマー-プライマー相互作用を最小限にするかまたは回避するために、デフォルト対照としてILR2配列 5’-ACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(配列番号5)を使用する。
2.2e.標的配列の最後の100bpにおいて重複するN2プライマー候補を除去する。
400の候補オリゴヌクレオチド配列のうち、392候補に対するN2プライマーを設計した。
残った392の候補プライマー配列をフィルタリングするために、以下を使用した。
3a.すべてのバーコードについてポリ(A)テイルを同じ長さに維持するために、Aで終わるランダム配列を有する(すなわち、ポリ(A)配列の有効長さが25bpを超える)あらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
3b.Gが連続するオリゴ合成では、コストが余分にかかり、しかも収率が低い可能性があるため、4以上の連続するG(>3G)を含むあらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
まとめると、これらのデータは、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のために、異なる長さのオリゴヌクレオチド配列を設計することができることを示す。オリゴヌクレオチド配列は、ユニバーサルプライマー配列、抗体特異的オリゴヌクレオチド配列または試料インデックス付与配列、およびポリ(A)配列を含み得る。
オリゴヌクレオチドが付随している抗体のワークフロー
この実施例は、タンパク質標的の発現プロファイルを決定するためにオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を使用するワークフローを実証する。
対象の凍結細胞(例えば、凍結末梢血単核細胞(PBMC))を解凍する。解凍した細胞を一定温度で一定期間(例えば、室温で20分間)オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体(例えば、0.06μg/100μlの抗CD4抗体(オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体ストックの1:333希釈液))で染色する。オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体は、1、2、または3種のオリゴヌクレオチド(「抗体オリゴヌクレオチド」)にコンジュゲートされている。抗体オリゴヌクレオチドの配列を図30に示す。細胞を洗浄して、未結合のオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を除去する。目的の細胞(例えば、生細胞)を得るために、フローサイトメトリーによる選別を目的として、細胞をCalcein AM(BD(Franklin Lake、New Jersey))およびDraq7(商標)(Abcam(Cambridge、United Kingdom))で染色してもよい。細胞を洗浄して、過剰なCalcein AMおよびDraq7(商標)を除去してもよい。フローサイトメトリーを使用して、Calcein AM(生細胞)で染色され、Draq7(商標)(死滅または透過処理していない細胞)で染色されていない単一細胞をBD Rhapsody(商標)カートリッジ中に選別する。
まとめると、この実施例は、目的の標的のタンパク質発現プロファイルを決定するためにオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を使用することを記載する。この実施例は、目的の標的のタンパク質発現プロファイルおよび目的の遺伝子のmRNA発現プロファイルを同時に決定することができることをさらに記載する。
Claims (67)
- 試料中の核酸標的を標識するための方法であって、
核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第1のユニバーサル配列、分子標識、および前記核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと;
前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること;
ランダムプライマーを前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、前記ランダムプライマーの各々は、第2のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと;ならびに
前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成すること
を含む方法。 - 前記第1のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および前記第2のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して前記複数の伸長産物を増幅し、それにより第1の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の伸長産物の増幅は、配列決定プライマーおよび/もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに/またはそれらの一部を、前記複数の伸長産物に付加することを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、前記試料中の前記核酸標的のコピー数を決定することを含む、請求項2または3に記載の方法。
- 試料中の核酸標的の数を決定するための方法であって、
核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第1のユニバーサル配列、分子標識、および前記核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと;
前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること;
ランダムプライマーを前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、前記ランダムプライマーの各々は、第2のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと;
前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成すること;
前記第1のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および前記第2のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して前記複数の伸長産物を増幅し、それにより第1の複数のバーコード化アンプリコンを生成すること;ならびに
前記第1の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、前記試料中の前記核酸標的のコピー数を決定すること
を含む方法。 - 核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含み、
前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、前記複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含み、および
前記試料中の前記核酸標的のコピー数の決定は、前記複数の核酸標的の各々の配列を含む前記第1の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する前記分子標識の数に基づき、前記試料中の前記複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む、
請求項4または5に記載の方法。 - 前記複数の核酸標的の各々の配列は、前記複数の核酸標的の各々の部分配列を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード化アンプリコン中の前記核酸標的の配列は、前記核酸標的の部分配列を含む、請求項4~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および前記第2のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して前記第1の複数のバーコード化アンプリコンを増幅し、それにより第2の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード化アンプリコンの増幅は、配列決定プライマーおよび/もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに/またはそれらの一部を、前記第1の複数のバーコード化アンプリコンに付加することを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、前記試料中の前記核酸標的のコピー数を決定することを含む、請求項9または10に記載の方法。
- 核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含み、
前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、前記複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含み、および/または
前記試料中の前記核酸標的のコピー数の決定は、前記複数の核酸標的の各々の配列を含む前記第2の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する前記分子標識の数に基づき、前記試料中の前記複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む、
請求項9~11のいずれか1項に記載の方法。 - 前記複数の核酸標的の各々の配列は、前記複数の核酸標的の各々の部分配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記第2の複数のバーコード化アンプリコン中の前記核酸標的の配列は、前記核酸標的の部分配列を含む、請求項9~13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード化アンプリコンおよび/または前記第2の複数のバーコード化アンプリコンの1つ1つは、前記第1のユニバーサル配列、前記第2のユニバーサル配列、または両方の少なくとも一部分を含む、請求項2~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のユニバーサル配列および前記第2のユニバーサル配列は同じである、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のユニバーサル配列および前記第2のユニバーサル配列は異なる、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1のユニバーサル配列および/または前記第2のユニバーサル配列は、配列決定プライマーおよび/もしくは配列決定アダプターの結合部位、それらの相補配列、ならびに/またはそれらの一部を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記配列決定アダプターは、P5配列、P7配列、それらの相補配列、および/またはそれらの一部を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記配列決定プライマーは、リード1配列決定プライマー、リード2配列決定プライマー、それらの相補配列、および/またはそれらの一部を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、逆転写酵素を使用して、前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含む、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性および3’から5’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも1つを欠如するDNAポリメラーゼを使用して、前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーの伸長は、5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性および3’から5’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも1つを欠如するDNAポリメラーゼを使用して、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長することを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼは、Klenow断片を含む、請求項22~24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード化アンプリコンおよび/または前記第2の複数のバーコード化アンプリコンは、全トランスクリプトーム増幅(WTA)産物を含む、請求項2~25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード化アンプリコンおよび/または前記第2の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のmRNAの少なくとも10%に相当する、請求項2~26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の複数のバーコード化アンプリコンおよび/または前記第2の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のmRNAの少なくとも50%または少なくとも90%に相当する、請求項2~26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の核酸標的の1つまたは複数は、低発現遺伝子のmRNAを含む、請求項1~28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含み、前記ヌクレオチドのランダム配列は、約4~約30ヌクレオチド長であってもよく、さらに前記ヌクレオチドのランダム配列は、6または9ヌクレオチド長であってもよい、請求項1~29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的結合性領域は、オリゴdT配列、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの組合せを含む、請求項1~30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含み、前記核酸標的は、ポリ(dA)領域を含む、請求項1~31のいずれか1項に記載の方法。
- ランダムプライマーを、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させるステップ、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長するステップ、および前記複数の伸長産物を増幅するステップを繰り返すことを含む、請求項1~32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを第3の複数のバーコード化アンプリコンを生成するための鋳型として使用して、第3の複数のバーコード化アンプリコンを合成することを含む、請求項1~33のいずれか1項に記載の方法。
- 第3の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を実施することを含む、請求項34に記載の方法。
- 第3の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、前記第1のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および標的特異的プライマーを使用するPCR増幅を含む、請求項34または35に記載の方法。
- 前記第3の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物の配列情報を得ることを含み、前記配列情報の取得は、配列決定アダプターを、前記第3の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付着させることを含んでいてもよい、請求項34~36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的特異的プライマーは、免疫受容体に特異的にハイブリダイズし、前記免疫受容体は、T細胞受容体(TCR)および/またはB細胞受容体(BCR)受容体であってもよい、請求項36または37に記載の方法。
- 前記試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項1~38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料は、末梢血単核細胞または免疫細胞を含み、前記免疫細胞は、B細胞、T細胞、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項1~39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の伸長産物の増幅は、固体支持体の存在下では実施されない、請求項2~40のいずれか1項に記載の方法。
- RNaseH誘導性プライミング、末端修復、および/またはアダプターライゲーションを含まない、請求項1~41のいずれか1項に記載の方法。
- 断片化、タグ付け、または両方を含まない、請求項1~42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドは、バーコード化デオキシリボ核酸(DNA)分子、バーコード化リボ核酸(RNA)分子、または両方を含む、請求項1~43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸標的は核酸分子を含み、前記核酸分子は、リボ核酸(RNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、マイクロRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、RNA分解産物、ポリ(A)テイルを含むRNA、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい、請求項1~44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記mRNAは免疫受容体をコードする、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸標的は細胞成分結合性試薬を含む、請求項45または46のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸分子は、前記細胞成分結合性試薬に付随している、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸分子および前記細胞成分結合性試薬を解離させることを含む、請求項48に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも10個は、異なる分子標識配列を含む、請求項1~49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも6個のヌクレオチドを含む、請求項1~50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、個体支持体に付随している、請求項1~51のいずれか1項に記載の方法。
- 同じ固体支持体に付随している前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、同一の試料標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも6個のヌクレオチドを含む、請求項52に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、細胞標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも6個のヌクレオチドを含んでいてもよい、請求項1~53のいずれか1項に記載の方法。
- 同じ固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含む、請求項54に記載の方法。
- 異なる固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含む、請求項54または55に記載の方法。
- 前記固体支持体は、合成粒子、平面状表面、またはそれらの組合せを含む、請求項52~56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料は単一細胞を含み、本方法は、前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、前記試料中の前記単一細胞に付随させることを含む、請求項1~57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記合成粒子を前記単一細胞に付随させた後で前記単一細胞を溶解することを含み、前記単一細胞の溶解は、前記試料を加熱すること、前記試料を界面活性剤と接触させること、前記試料のpHを変化させること、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい、請求項58に記載の方法。
- 前記合成粒子および前記単一細胞は同じ区画に存在し、前記区画は、ウェルまたは液滴であってもよい、請求項58または59に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも1つは、前記合成粒子上に固定化されているかまたは部分的に固定化されている、請求項58~60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも1つは、前記合成粒子内に封入されているかまたは部分的に封入されている、請求項58~61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記合成粒子は破壊可能であり、前記合成粒子は、破壊可能なヒドロゲル粒子であってもよい、請求項58~62のいずれか1項に記載の方法。
- 前記合成粒子はビーズを含み、前記ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインAコンジュゲートビーズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA/Gコンジュゲートビーズ、プロテインLコンジュゲートビーズ、オリゴ(dT)コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、ヒドロゲルビーズ、ゲルビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい、請求項58~63のいずれか1項に記載の方法。
- 前記合成粒子は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項58~64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各々は、リンカー官能基を含み、
前記合成粒子は、固体支持体官能基を含み、および/または
前記支持体官能基および前記リンカー官能基は互いに付随している、
請求項58~65のいずれか1項に記載の方法。 - 前記リンカー官能基および前記支持体官能基は、C6、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組合せからなる群から個々に選択される、請求項66に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862757757P | 2018-11-08 | 2018-11-08 | |
US62/757,757 | 2018-11-08 | ||
PCT/US2019/060243 WO2020097315A1 (en) | 2018-11-08 | 2019-11-07 | Whole transcriptome analysis of single cells using random priming |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022506546A true JP2022506546A (ja) | 2022-01-17 |
JPWO2020097315A5 JPWO2020097315A5 (ja) | 2022-11-14 |
Family
ID=69160073
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021523956A Pending JP2022506546A (ja) | 2018-11-08 | 2019-11-07 | ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11932849B2 (ja) |
EP (1) | EP3877520A1 (ja) |
JP (1) | JP2022506546A (ja) |
CN (1) | CN112969789A (ja) |
WO (1) | WO2020097315A1 (ja) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
GB2513024B (en) | 2012-02-27 | 2016-08-31 | Cellular Res Inc | A clonal amplification method |
GB2525104B (en) | 2013-08-28 | 2016-09-28 | Cellular Res Inc | Massively Parallel Single Cell Nucleic Acid Analysis |
WO2016138496A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Cellular Research, Inc. | Spatially addressable molecular barcoding |
US11535882B2 (en) | 2015-03-30 | 2022-12-27 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for combinatorial barcoding |
WO2016172373A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for whole transcriptome amplification |
EP3347465B1 (en) | 2015-09-11 | 2019-06-26 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid library normalization |
US10301677B2 (en) | 2016-05-25 | 2019-05-28 | Cellular Research, Inc. | Normalization of nucleic acid libraries |
US10640763B2 (en) | 2016-05-31 | 2020-05-05 | Cellular Research, Inc. | Molecular indexing of internal sequences |
US10202641B2 (en) | 2016-05-31 | 2019-02-12 | Cellular Research, Inc. | Error correction in amplification of samples |
CA3034924A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Cellular Research, Inc. | Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences |
US11319583B2 (en) | 2017-02-01 | 2022-05-03 | Becton, Dickinson And Company | Selective amplification using blocking oligonucleotides |
AU2018281745B2 (en) | 2017-06-05 | 2022-05-19 | Becton, Dickinson And Company | Sample indexing for single cells |
US11773441B2 (en) | 2018-05-03 | 2023-10-03 | Becton, Dickinson And Company | High throughput multiomics sample analysis |
WO2019213237A1 (en) | 2018-05-03 | 2019-11-07 | Becton, Dickinson And Company | Molecular barcoding on opposite transcript ends |
WO2020072380A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | Cellular Research, Inc. | Determining 5' transcript sequences |
US11932849B2 (en) | 2018-11-08 | 2024-03-19 | Becton, Dickinson And Company | Whole transcriptome analysis of single cells using random priming |
CN113195717A (zh) | 2018-12-13 | 2021-07-30 | 贝克顿迪金森公司 | 单细胞全转录组分析中的选择性延伸 |
ES2945227T3 (es) | 2019-01-23 | 2023-06-29 | Becton Dickinson Co | Oligonucleótidos asociados con anticuerpos |
US12071617B2 (en) | 2019-02-14 | 2024-08-27 | Becton, Dickinson And Company | Hybrid targeted and whole transcriptome amplification |
CN114051534A (zh) | 2019-07-22 | 2022-02-15 | 贝克顿迪金森公司 | 单细胞染色质免疫沉淀测序测定 |
JP7522189B2 (ja) | 2019-11-08 | 2024-07-24 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長v(d)j情報を得るためのランダムプライミングの使用 |
EP4090763A1 (en) | 2020-01-13 | 2022-11-23 | Becton Dickinson and Company | Methods and compositions for quantitation of proteins and rna |
EP4150118A1 (en) | 2020-05-14 | 2023-03-22 | Becton Dickinson and Company | Primers for immune repertoire profiling |
US11932901B2 (en) * | 2020-07-13 | 2024-03-19 | Becton, Dickinson And Company | Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq |
WO2022108946A1 (en) | 2020-11-17 | 2022-05-27 | Becton, Dickinson And Company | Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics |
EP4247967A1 (en) | 2020-11-20 | 2023-09-27 | Becton, Dickinson and Company | Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins |
WO2022109339A1 (en) | 2020-11-20 | 2022-05-27 | Becton, Dickinson And Company | Use of dextramer in single cell analysis |
EP4248447A4 (en) * | 2020-11-23 | 2024-08-07 | Pleno Inc | CODED DOSAGES |
WO2023044307A1 (en) | 2021-09-14 | 2023-03-23 | Becton, Dickinson And Company | Full length single cell rna sequencing |
WO2023096674A1 (en) * | 2021-11-23 | 2023-06-01 | Pleno, Inc. | Encoded assays |
EP4419666A1 (en) * | 2021-11-23 | 2024-08-28 | Pleno, Inc. | Encoded nucleic acid methylation assays |
CN118647719A (zh) | 2022-02-07 | 2024-09-13 | 贝克顿迪金森公司 | 通过流动分选含有mRNA和ABSEQ的条形码化珠 |
AU2022443462A1 (en) * | 2022-02-24 | 2024-09-12 | Zhejiang University | Single-cell transcriptome sequencing method and use thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010117620A2 (en) * | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Illumina, Inc. | Gene expression analysis in single cells |
JP2016533187A (ja) * | 2013-08-28 | 2016-10-27 | セルラー リサーチ, インコーポレイテッド | 大規模並列単一細胞分析 |
Family Cites Families (516)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4510244A (en) | 1980-04-17 | 1985-04-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Cell labeling with antigen-coupled microspheres |
US4725536A (en) | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Genetics Institute, Inc. | Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods |
US6150517A (en) | 1986-11-24 | 2000-11-21 | Gen-Probe | Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
IE72468B1 (en) | 1987-07-31 | 1997-04-09 | Univ Leland Stanford Junior | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
US5149625A (en) | 1987-08-11 | 1992-09-22 | President And Fellows Of Harvard College | Multiplex analysis of DNA |
US5124246A (en) | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
US5656731A (en) | 1987-10-15 | 1997-08-12 | Chiron Corporation | Nucleic acid-amplified immunoassay probes |
EP0426756A4 (en) | 1988-07-26 | 1991-11-21 | Genelabs Incorporated | Rna and dna amplification techniques |
US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
US5925525A (en) | 1989-06-07 | 1999-07-20 | Affymetrix, Inc. | Method of identifying nucleotide differences |
US6309822B1 (en) | 1989-06-07 | 2001-10-30 | Affymetrix, Inc. | Method for comparing copy number of nucleic acid sequences |
US6040138A (en) | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
US6551784B2 (en) | 1989-06-07 | 2003-04-22 | Affymetrix Inc | Method of comparing nucleic acid sequences |
US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
US5871928A (en) | 1989-06-07 | 1999-02-16 | Fodor; Stephen P. A. | Methods for nucleic acid analysis |
US5200314A (en) | 1990-03-23 | 1993-04-06 | Chiron Corporation | Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification |
JP3164814B2 (ja) | 1990-08-27 | 2001-05-14 | 科学技術振興事業団 | 均一化cDNAライブラリーの作製法 |
DE69132843T2 (de) | 1990-12-06 | 2002-09-12 | Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) | Identifizierung von Nukleinsäuren in Proben |
JPH04337446A (ja) | 1991-05-15 | 1992-11-25 | Hitachi Ltd | 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置 |
US5981179A (en) | 1991-11-14 | 1999-11-09 | Digene Diagnostics, Inc. | Continuous amplification reaction |
US5424413A (en) | 1992-01-22 | 1995-06-13 | Gen-Probe Incorporated | Branched nucleic acid probes |
US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
US5981176A (en) | 1992-06-17 | 1999-11-09 | City Of Hope | Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences |
JP3954092B2 (ja) | 1993-06-25 | 2007-08-08 | アフィメトリックス インコーポレイテッド | 核酸配列のハイブリダイゼーションと配列決定 |
US6087186A (en) | 1993-07-16 | 2000-07-11 | Irori | Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries |
US5500356A (en) | 1993-08-10 | 1996-03-19 | Life Technologies, Inc. | Method of nucleic acid sequence selection |
US6309823B1 (en) | 1993-10-26 | 2001-10-30 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same |
US5681697A (en) | 1993-12-08 | 1997-10-28 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor |
US5714330A (en) | 1994-04-04 | 1998-02-03 | Lynx Therapeutics, Inc. | DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage |
US6495518B1 (en) | 1994-06-13 | 2002-12-17 | Vanderbilt University | Method for importing biologically active molecules into cells |
GB2293238A (en) | 1994-09-13 | 1996-03-20 | Inceltec Ltd | Primers for replication and/or amplification reactions |
US5604097A (en) | 1994-10-13 | 1997-02-18 | Spectragen, Inc. | Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags |
US6013445A (en) | 1996-06-06 | 2000-01-11 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors |
US5695934A (en) | 1994-10-13 | 1997-12-09 | Lynx Therapeutics, Inc. | Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides |
US5846719A (en) | 1994-10-13 | 1998-12-08 | Lynx Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide tags for sorting and identification |
US6600996B2 (en) | 1994-10-21 | 2003-07-29 | Affymetrix, Inc. | Computer-aided techniques for analyzing biological sequences |
EP0709466B1 (en) | 1994-10-28 | 2006-09-27 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for the simultaneous detection and quantification of multiple specific nucleic acid sequences |
KR19990008052A (ko) | 1995-04-25 | 1999-01-25 | 마이클 피 노바 | 기억 장치를 갖는 원격적으로 프로그램 가능한 매트릭스 및 이의 용도 |
US5648245A (en) | 1995-05-09 | 1997-07-15 | Carnegie Institution Of Washington | Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication |
US5968740A (en) | 1995-07-24 | 1999-10-19 | Affymetrix, Inc. | Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid |
US5763175A (en) | 1995-11-17 | 1998-06-09 | Lynx Therapeutics, Inc. | Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides |
US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
US6613544B1 (en) | 1995-12-22 | 2003-09-02 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
US5962271A (en) | 1996-01-03 | 1999-10-05 | Cloutech Laboratories, Inc. | Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end |
US5830712A (en) | 1996-02-06 | 1998-11-03 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Selective template deletion method |
US6458530B1 (en) | 1996-04-04 | 2002-10-01 | Affymetrix Inc. | Selecting tag nucleic acids |
EP1736554B1 (en) | 1996-05-29 | 2013-10-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
JPH1021373A (ja) | 1996-07-05 | 1998-01-23 | Fuji Photo Film Co Ltd | 画像解析装置 |
US20020172953A1 (en) | 1996-07-29 | 2002-11-21 | Mirkin Chad A. | Movement of biomolecule-coated nanoparticles in an electric field |
US7169556B2 (en) | 1996-07-29 | 2007-01-30 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US6984491B2 (en) | 1996-07-29 | 2006-01-10 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US6100029A (en) | 1996-08-14 | 2000-08-08 | Exact Laboratories, Inc. | Methods for the detection of chromosomal aberrations |
US5935793A (en) | 1996-09-27 | 1999-08-10 | The Chinese University Of Hong Kong | Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers |
US6124092A (en) | 1996-10-04 | 2000-09-26 | The Perkin-Elmer Corporation | Multiplex polynucleotide capture methods and compositions |
US6117631A (en) | 1996-10-29 | 2000-09-12 | Polyprobe, Inc. | Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates |
US6046005A (en) | 1997-01-15 | 2000-04-04 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group |
CA2291180A1 (en) | 1997-05-23 | 1998-11-26 | Lynx Therapeutics, Inc. | System and apparatus for sequential processing of analytes |
US6974669B2 (en) | 2000-03-28 | 2005-12-13 | Nanosphere, Inc. | Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles |
US6399334B1 (en) | 1997-09-24 | 2002-06-04 | Invitrogen Corporation | Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof |
WO1999028505A1 (en) | 1997-12-03 | 1999-06-10 | Curagen Corporation | Methods and devices for measuring differential gene expression |
US6265163B1 (en) | 1998-01-09 | 2001-07-24 | Lynx Therapeutics, Inc. | Solid phase selection of differentially expressed genes |
US6787308B2 (en) | 1998-07-30 | 2004-09-07 | Solexa Ltd. | Arrayed biomolecules and their use in sequencing |
WO2000014282A1 (en) | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Lynx Therapeutics, Inc. | Method of screening for genetic polymorphism |
US6480791B1 (en) | 1998-10-28 | 2002-11-12 | Michael P. Strathmann | Parallel methods for genomic analysis |
US6197554B1 (en) | 1998-11-20 | 2001-03-06 | Shi-Lung Lin | Method for generating full-length cDNA library from single cells |
US6436675B1 (en) | 1999-09-28 | 2002-08-20 | Maxygen, Inc. | Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling |
US20020019005A1 (en) | 1999-02-18 | 2002-02-14 | Arcaris, Inc. | Process for identification of genes encoding proteins having cell proliferation-promoting activity |
US6629040B1 (en) | 1999-03-19 | 2003-09-30 | University Of Washington | Isotope distribution encoded tags for protein identification |
JP2002539849A (ja) | 1999-03-26 | 2002-11-26 | ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ | ユニバーサルアレイ |
US6355431B1 (en) | 1999-04-20 | 2002-03-12 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays |
EP1046717B1 (en) | 1999-04-20 | 2010-10-06 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Method and probes for determining a concentration of target nucleic acid molecules and method for analyzing data obtained by the method |
US6372813B1 (en) | 1999-06-25 | 2002-04-16 | Motorola | Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays |
US6326148B1 (en) | 1999-07-12 | 2001-12-04 | The Regents Of The University Of California | Detection of copy number changes in colon cancer |
US6440706B1 (en) | 1999-08-02 | 2002-08-27 | Johns Hopkins University | Digital amplification |
JP2001078768A (ja) | 1999-09-16 | 2001-03-27 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 遺伝子発現の測定法 |
SE9903988D0 (sv) | 1999-11-03 | 1999-11-03 | Amersham Pharm Biotech Ab | Method of analysis |
US6489114B2 (en) | 1999-12-17 | 2002-12-03 | Bio Merieux | Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby |
CN1500150A (zh) | 1999-12-29 | 2004-05-26 | ��Ĭ���� | 在固相载体上扩增和检测多个多核苷酸的方法 |
US7022479B2 (en) | 2000-01-24 | 2006-04-04 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
CA2396810A1 (en) | 2000-01-24 | 2001-07-26 | Phylos, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
US6235483B1 (en) | 2000-01-31 | 2001-05-22 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids |
US20050214825A1 (en) | 2000-02-07 | 2005-09-29 | John Stuelpnagel | Multiplex sample analysis on universal arrays |
DK1259643T3 (da) | 2000-02-07 | 2009-02-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming |
GB2364054B (en) | 2000-03-24 | 2002-05-29 | Smithkline Beecham Corp | Method of amplifying quinolone-resistance-determining-regions and identifying polymorphic variants thereof |
DK1715063T3 (da) | 2000-03-29 | 2011-05-16 | Lgc Ltd | Hydridiseringsbeacon og fremgangsmåde til hurtig sekvensdetektion og distinktion |
DK2278029T3 (en) | 2000-04-10 | 2016-10-03 | Taxon Biosciences Inc | Methods of study and genetic analysis of populations |
US20030207300A1 (en) | 2000-04-28 | 2003-11-06 | Matray Tracy J. | Multiplex analytical platform using molecular tags |
US7630063B2 (en) | 2000-08-02 | 2009-12-08 | Honeywell International Inc. | Miniaturized cytometer for detecting multiple species in a sample |
US6511809B2 (en) | 2000-06-13 | 2003-01-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter |
US6531283B1 (en) | 2000-06-20 | 2003-03-11 | Molecular Staging, Inc. | Protein expression profiling |
AU2001282881B2 (en) | 2000-07-07 | 2007-06-14 | Visigen Biotechnologies, Inc. | Real-time sequence determination |
CA2418502A1 (en) | 2000-08-11 | 2002-03-07 | Nanosphere Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US6934408B2 (en) | 2000-08-25 | 2005-08-23 | Amnis Corporation | Method and apparatus for reading reporter labeled beads |
CA2356123A1 (en) | 2000-08-25 | 2002-02-25 | Riken | Method of preparing normalized and/or subtracted cdna |
ATE380883T1 (de) | 2000-10-24 | 2007-12-15 | Univ Leland Stanford Junior | Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna |
WO2002046472A2 (en) | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Nanosphere, Inc. | Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor |
US20020142345A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-10-03 | Nelsen Anita J. | Methods for encoding and decoding complex mixtures in arrayed assays |
US20030049616A1 (en) | 2001-01-08 | 2003-03-13 | Sydney Brenner | Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags |
WO2002070684A2 (en) | 2001-01-11 | 2002-09-12 | Lion Bioscience Ag | Gene library for screening methods |
CA2435612C (en) | 2001-01-25 | 2014-12-23 | Tm Bioscience Corporation | Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof |
KR20030082535A (ko) | 2001-03-09 | 2003-10-22 | 뉴젠 테크놀로지스 인코포레이티드 | Rna 서열의 증폭을 위한 방법 및 조성물 |
US7027932B2 (en) | 2001-03-21 | 2006-04-11 | Olympus Optical Co., Ltd. | Biochemical examination method |
JP2005233974A (ja) | 2001-03-21 | 2005-09-02 | Olympus Corp | 生化学的検査方法 |
WO2002079490A2 (en) | 2001-03-28 | 2002-10-10 | Nanosphere, Inc. | Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified particles |
WO2002083922A2 (en) | 2001-04-11 | 2002-10-24 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Modified random primers for probe labeling |
US20030170675A1 (en) | 2001-04-11 | 2003-09-11 | The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. | Methods of manipulating nucleic acids |
AUPR480901A0 (en) | 2001-05-04 | 2001-05-31 | Genomics Research Partners Pty Ltd | Diagnostic method for assessing a condition of a performance animal |
CA2344599C (en) | 2001-05-07 | 2011-07-12 | Bioneer Corporation | Selective polymerase chain reaction of dna of which base sequence is completely unknown |
US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
WO2002101358A2 (en) | 2001-06-11 | 2002-12-19 | Illumina, Inc. | Multiplexed detection methods |
JP4244534B2 (ja) | 2001-06-12 | 2009-03-25 | 横河電機株式会社 | バイオチップ |
US7473767B2 (en) | 2001-07-03 | 2009-01-06 | The Institute For Systems Biology | Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures |
US6830931B2 (en) | 2001-07-12 | 2004-12-14 | Automated Cell, Inc. | Method and apparatus for monitoring of proteins and cells |
EP1478774A4 (en) | 2001-10-09 | 2006-11-29 | Nanosphere Inc | ELECTRONIC DETECTION OF DNA BASED ON AN ASSEMBLY AND IMPLEMENTING NANOPARTICLE-LIKE PROBES |
US20030077611A1 (en) | 2001-10-24 | 2003-04-24 | Sention | Methods and systems for dynamic gene expression profiling |
EP2196544A1 (en) | 2001-11-21 | 2010-06-16 | Applied Biosystems, LLC | Kit for ligation detection assays using codeable labels |
US20030175749A1 (en) | 2001-12-08 | 2003-09-18 | Jong-Yoon Chun | Annealing control primer and its uses |
US8110351B2 (en) | 2002-01-16 | 2012-02-07 | Invitrogen Dynal As | Method for isolating nucleic acids and protein from a single sample |
JP2005515792A (ja) | 2002-01-29 | 2005-06-02 | グローバル ジェノミクス アクティエボラーグ | 核酸を操作するための方法および手段 |
CA2474509C (en) | 2002-02-14 | 2012-01-31 | Immunivest Corporation | Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer |
US20030186251A1 (en) | 2002-04-01 | 2003-10-02 | Brookhaven Science Associates, Llc | Genome sequence tags |
US20050175993A1 (en) | 2002-04-12 | 2005-08-11 | Chia-Lin Wei | Method for making full-length coding sequence cDNA libraries |
US20070178478A1 (en) | 2002-05-08 | 2007-08-02 | Dhallan Ravinder S | Methods for detection of genetic disorders |
US6808906B2 (en) | 2002-05-08 | 2004-10-26 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use |
GB0212391D0 (en) | 2002-05-29 | 2002-07-10 | Axis Shield Asa | Assay |
US20040096368A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-05-20 | Igen International, Inc. | Assay systems and components |
US20050019776A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-01-27 | Callow Matthew James | Universal selective genome amplification and universal genotyping system |
US7192700B2 (en) | 2002-12-20 | 2007-03-20 | Orchid Cellmark Inc. | Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions |
WO2004018623A2 (en) | 2002-08-16 | 2004-03-04 | Clinical Microarrays, Inc. | Substrates for isolating, reacting and microscopically analyzing materials |
CA2497420C (en) | 2002-09-03 | 2016-04-19 | Quanta Biosciences, Inc. | Improved compositions and methods for cdna synthesis |
US7361821B2 (en) | 2002-09-20 | 2008-04-22 | Intel Corporation | Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading |
EP1546376B9 (en) | 2002-09-30 | 2009-08-12 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene |
WO2004040001A2 (en) | 2002-10-02 | 2004-05-13 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
CA2505472A1 (en) | 2002-11-11 | 2004-05-27 | Affymetrix, Inc. | Methods for identifying dna copy number changes |
US7822555B2 (en) | 2002-11-11 | 2010-10-26 | Affymetrix, Inc. | Methods for identifying DNA copy number changes |
US7704687B2 (en) | 2002-11-15 | 2010-04-27 | The Johns Hopkins University | Digital karyotyping |
US20040224325A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-11-11 | Caliper Life Sciences, Inc. | Single molecule amplification and detection of DNA |
JP2006520463A (ja) | 2003-01-23 | 2006-09-07 | ユー.エス. ジェノミクス, インコーポレイテッド | ポリマー集団を解析するための方法 |
US7575865B2 (en) | 2003-01-29 | 2009-08-18 | 454 Life Sciences Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
US8206913B1 (en) | 2003-03-07 | 2012-06-26 | Rubicon Genomics, Inc. | Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a DNA polymerization process |
DE602004029560D1 (de) | 2003-03-07 | 2010-11-25 | Rubicon Genomics Inc | Amplifikation und analyse von gesamtgenom- und gesamttranskriptom- bibliotheken, die durch ein dns-polymerisierungsverfahren produziert wurden |
US7269518B2 (en) | 2003-04-30 | 2007-09-11 | Agilent Technologies, Inc. | Chemical array reading |
US20040259118A1 (en) | 2003-06-23 | 2004-12-23 | Macevicz Stephen C. | Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis |
EP1641809B2 (en) | 2003-07-05 | 2018-10-03 | The Johns Hopkins University | Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations |
EP1651776A2 (de) | 2003-07-24 | 2006-05-03 | Qiagen GmbH | Verfahren zur reversen transkription und/oder amplifikation von nukleinsäuren |
JP2007502116A (ja) | 2003-08-13 | 2007-02-08 | アフィメトリックス インコーポレイテッド | 核酸サンプルを調製するための方法およびキット |
GB0319332D0 (en) | 2003-08-16 | 2003-09-17 | Astrazeneca Ab | Amplification |
US20050048498A1 (en) | 2003-08-29 | 2005-03-03 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for assembling probes |
US7341837B2 (en) | 2003-09-02 | 2008-03-11 | Lawton Robert L | Soluble analyte detection and amplification |
US7354706B2 (en) | 2003-09-09 | 2008-04-08 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event |
CA2536565A1 (en) | 2003-09-10 | 2005-05-12 | Althea Technologies, Inc. | Expression profiling using microarrays |
JP2007512811A (ja) | 2003-11-10 | 2007-05-24 | インベスチゲン, インコーポレイテッド | 検出のための核酸を調製する方法 |
EP1709203A2 (en) | 2004-01-23 | 2006-10-11 | Lingvitae AS | Improving polynucleotide ligation reactions |
ATE451478T1 (de) | 2004-02-12 | 2009-12-15 | Population Genetics Technologi | Genetische analyse mittels sequenzspezifischem sortieren |
US20100216153A1 (en) | 2004-02-27 | 2010-08-26 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities |
US7432055B2 (en) | 2004-03-05 | 2008-10-07 | Uchicago Argonne Llc | Dual phase multiplex polymerase chain reaction |
US7294466B2 (en) | 2004-05-07 | 2007-11-13 | Cepheid | Multiplexed detection of biological agents |
US20050250147A1 (en) | 2004-05-10 | 2005-11-10 | Macevicz Stephen C | Digital profiling of polynucleotide populations |
JP2008505345A (ja) | 2004-06-07 | 2008-02-21 | アイアールエム エルエルシー | 分注システム、ソフトウェア、および関連する方法 |
US20060035258A1 (en) | 2004-08-06 | 2006-02-16 | Affymetrix, Inc. | Methods for identifying DNA copy number changes |
US20060041385A1 (en) | 2004-08-18 | 2006-02-23 | Bauer Kenneth D | Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization |
US7713697B2 (en) | 2004-08-27 | 2010-05-11 | Gen-Probe Incorporated | Methods and kits for amplifying DNA |
CN101056883B (zh) | 2004-09-10 | 2012-10-10 | 人类遗传标记控股有限公司 | 包括含有嵌入性假核苷酸(ipn)的嵌入性核酸(ina)的扩增阻断剂 |
EP1647600A3 (en) | 2004-09-17 | 2006-06-28 | Affymetrix, Inc. (A US Entity) | Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags |
US7435084B2 (en) | 2004-12-14 | 2008-10-14 | Align Technology, Inc. | System and methods for casting physical tooth model |
KR20070105967A (ko) | 2004-11-03 | 2007-10-31 | 아이리스 몰레큘라 다이아그노스틱스, 인코오포레이티드 | 균질 분석물 탐지 |
EP1836302B1 (en) | 2004-12-23 | 2010-04-14 | Amersham Biosciences Corp. | Ligation-based rna amplification |
EP2418018B1 (en) | 2004-12-23 | 2013-05-22 | Abbott Point of Care Inc. | Methods for the separation nucleic acids |
US7407757B2 (en) | 2005-02-10 | 2008-08-05 | Population Genetics Technologies | Genetic analysis by sequence-specific sorting |
US7393665B2 (en) | 2005-02-10 | 2008-07-01 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
US9222129B2 (en) | 2005-02-10 | 2015-12-29 | Riken | Method for amplification of nucleotide sequence |
EP1856293A2 (en) | 2005-03-16 | 2007-11-21 | Compass Genetics, Llc | Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms |
EP2518161A1 (en) | 2005-03-18 | 2012-10-31 | Fluidigm Corporation | Method for detection of mutant alleles |
US20090264635A1 (en) | 2005-03-25 | 2009-10-22 | Applera Corporation | Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts |
US7695886B2 (en) | 2005-05-19 | 2010-04-13 | Fuji Xerox Co., Ltd. | Process for producing resin particle liquid dispersion for electrostatic image developing toner, electrostatic image developing toner and production process thereof |
US20060263789A1 (en) | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Robert Kincaid | Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using |
US8407013B2 (en) | 2005-06-07 | 2013-03-26 | Peter K. Rogan | AB initio generation of single copy genomic probes |
US20070065844A1 (en) | 2005-06-08 | 2007-03-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Solution-based methods for RNA expression profiling |
US7796815B2 (en) | 2005-06-10 | 2010-09-14 | The Cleveland Clinic Foundation | Image analysis of biological objects |
US20070020640A1 (en) | 2005-07-21 | 2007-01-25 | Mccloskey Megan L | Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis |
US8486621B2 (en) | 2005-08-11 | 2013-07-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Nucleic acid-based matrixes |
US20070117121A1 (en) | 2005-09-16 | 2007-05-24 | Hutchison Stephen K | cDNA library preparation |
US8831887B2 (en) | 2005-10-12 | 2014-09-09 | The Research Foundation For The State University Of New York | Absolute PCR quantification |
US8313711B2 (en) | 2005-11-01 | 2012-11-20 | Freeslate, Inc. | Liquid dispensing for high-throughput experimentation |
US7375211B2 (en) | 2005-11-18 | 2008-05-20 | Kou Zhong C | Method for detection and quantification of T-cell receptor Vβ repertoire |
US20080070303A1 (en) | 2005-11-21 | 2008-03-20 | West Michael D | Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby |
US7636465B2 (en) | 2005-12-09 | 2009-12-22 | Cytyc Corporation | Cross-frame object reconstruction for image-based cytology applications |
US7544473B2 (en) | 2006-01-23 | 2009-06-09 | Population Genetics Technologies Ltd. | Nucleic acid analysis using sequence tokens |
US7537897B2 (en) | 2006-01-23 | 2009-05-26 | Population Genetics Technologies, Ltd. | Molecular counting |
US8492098B2 (en) | 2006-02-21 | 2013-07-23 | The Trustees Of Tufts College | Methods and arrays for target analyte detection and determination of reaction components that affect a reaction |
US20080038727A1 (en) | 2006-03-10 | 2008-02-14 | Applera Corporation | MicroRNA and Messenger RNA Detection on Arrays |
US7880142B2 (en) | 2006-04-04 | 2011-02-01 | Sidec Technologies Ab | Extended electron tomography |
US20080194414A1 (en) | 2006-04-24 | 2008-08-14 | Albert Thomas J | Enrichment and sequence analysis of genomic regions |
US9074242B2 (en) | 2010-02-12 | 2015-07-07 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
WO2007136874A2 (en) | 2006-05-18 | 2007-11-29 | President And Fellows Of Harvard College | Genomic library construction |
US7833716B2 (en) | 2006-06-06 | 2010-11-16 | Gen-Probe Incorporated | Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods |
WO2007147079A2 (en) | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Living Microsystems, Inc. | Rare cell analysis using sample splitting and dna tags |
WO2008021123A1 (en) | 2006-08-07 | 2008-02-21 | President And Fellows Of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
US8586006B2 (en) | 2006-08-09 | 2013-11-19 | Institute For Systems Biology | Organ-specific proteins and methods of their use |
EP2069472A4 (en) | 2006-10-05 | 2012-06-20 | Nanopoint Inc | SYSTEMS AND METHODS FOR ACTIVE MICROFLUIDIC CELL MANIPULATION |
WO2008057163A2 (en) | 2006-10-09 | 2008-05-15 | Carnegie Mellon University | Preparation of functional gel particles with a dual crosslink network |
WO2008047428A1 (fr) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | Osaki Electric Co., Ltd. | COMPTEUR ÉLECTRONIQUE DE kWh |
WO2008051928A2 (en) | 2006-10-23 | 2008-05-02 | The Salk Institute For Biological Studies | Target-oriented whole genome amplification of nucliec acids |
US8603749B2 (en) | 2006-11-15 | 2013-12-10 | Biospherex, LLC | Multitag sequencing ecogenomics analysis-US |
US8050476B2 (en) | 2006-11-22 | 2011-11-01 | General Electric Company | Heart rate demodulation of periodic movement in ultrasound data for object identification |
EP2677308B1 (en) | 2006-12-14 | 2017-04-26 | Life Technologies Corporation | Method for fabricating large scale FET arrays |
JP5489469B2 (ja) | 2007-01-16 | 2014-05-14 | オリンパス株式会社 | 蛍光信号解析装置および蛍光信号解析方法 |
US9063133B2 (en) | 2007-01-30 | 2015-06-23 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for biomolecular arrays |
US20080269068A1 (en) | 2007-02-06 | 2008-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | Multiplex decoding of sequence tags in barcodes |
WO2008096318A2 (en) | 2007-02-09 | 2008-08-14 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Identification system |
US8003312B2 (en) | 2007-02-16 | 2011-08-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Multiplex cellular assays using detectable cell barcodes |
SI2472264T1 (sl) | 2007-02-27 | 2016-06-30 | SentoClone International AB Karolinska Institute Science Park | Multipleksna detekcija tumorskih celic z uporabo plošč vezavnih sredstev na zunajcelične markerje |
WO2008109176A2 (en) | 2007-03-07 | 2008-09-12 | President And Fellows Of Harvard College | Assays and other reactions involving droplets |
KR100882711B1 (ko) | 2007-03-12 | 2009-02-06 | 성균관대학교산학협력단 | 사이크로박터 스피시스 hj147 균주 유래의 우라실-dna글리코실라제 및 이의 용도 |
JP2008256428A (ja) | 2007-04-03 | 2008-10-23 | Intec Systems Institute Inc | マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法 |
US20080268508A1 (en) | 2007-04-30 | 2008-10-30 | Sowlay Mohankumar R | Methods and kits for negative selection of desired nucleic acid sequences |
US20080274458A1 (en) | 2007-05-01 | 2008-11-06 | Latham Gary J | Nucleic acid quantitation methods |
US20090061513A1 (en) | 2007-05-15 | 2009-03-05 | Picovitro Ab | Cell sorting and cell cultivation methods |
CN101720359A (zh) | 2007-06-01 | 2010-06-02 | 454生命科学公司 | 从多重混合物中识别个别样本的系统和方法 |
US7635566B2 (en) | 2007-06-29 | 2009-12-22 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants |
DK2036989T3 (da) | 2007-09-12 | 2012-10-22 | Pasteur Institut | Polynukleotid, der er egnet til enkeltcellebaseret reporterassay tilovervågning af genekspressionsmønstre med høj spatiotemporalopløsning |
EP2203749B1 (en) | 2007-10-05 | 2012-08-29 | Affymetrix, Inc. | Highly multiplexed particle-based assays |
US10300482B2 (en) | 2010-12-09 | 2019-05-28 | Akonni Biosystems, Inc. | Sample analysis system |
US20090253586A1 (en) | 2008-02-21 | 2009-10-08 | Gentel Biosciences, Inc. | Substrates for multiplexed assays and uses thereof |
US8687189B2 (en) | 2008-03-03 | 2014-04-01 | Ajjer, Llc | Analysis of arrays by laser induced breakdown spectroscopy |
US8206925B2 (en) | 2008-04-14 | 2012-06-26 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Splice variants of human IL-23 receptor (IL-23R) mRNA and use of a delta 9 isoform in predicting inflammatory bowel diseases |
DE102008025656B4 (de) | 2008-05-28 | 2016-07-28 | Genxpro Gmbh | Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung |
US20090298709A1 (en) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Affymetrix, Inc. | Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number |
US20100120097A1 (en) | 2008-05-30 | 2010-05-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
US20100069250A1 (en) | 2008-08-16 | 2010-03-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Digital PCR Calibration for High Throughput Sequencing |
US8476013B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-07-02 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses |
US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
WO2010053980A2 (en) | 2008-11-04 | 2010-05-14 | The Johns Hopkins University | Dna integrity assay (dia) for cancer diagnostics, using confocal fluorescence spectroscopy |
CA2744003C (en) | 2008-11-21 | 2016-03-15 | Mediomics Llc | Biosensor for detecting multiple epitopes on a target |
US20100159533A1 (en) | 2008-11-24 | 2010-06-24 | Helicos Biosciences Corporation | Simplified sample preparation for rna analysis |
US8492096B2 (en) | 2008-12-24 | 2013-07-23 | Boris Pasche | TGFBR1 expression modifies risk for colorectal cancer |
AU2010206843B2 (en) | 2009-01-20 | 2015-01-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Single cell gene expression for diagnosis, prognosis and identification of drug targets |
US20100323348A1 (en) | 2009-01-31 | 2010-12-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process |
CA2754446A1 (en) | 2009-03-05 | 2010-09-10 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Pyridine derivative |
EP2230312A1 (en) | 2009-03-19 | 2010-09-22 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same |
AU2010232439C1 (en) | 2009-04-02 | 2017-07-13 | Fluidigm Corporation | Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids |
WO2010127186A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
FR2945545B1 (fr) | 2009-05-14 | 2011-08-05 | Univ Aix Marseille Ii | Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles |
US20120058520A1 (en) | 2009-05-14 | 2012-03-08 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for synthesis of double-stranded dna corresponding to rna, and method for amplification of the dna |
US8673627B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-03-18 | Life Technologies Corporation | Apparatus and methods for performing electrochemical reactions |
GB0909923D0 (en) | 2009-06-09 | 2009-07-22 | Oxford Gene Tech Ip Ltd | Picowell capture devices for analysing single cells or other particles |
US20120058902A1 (en) | 2009-06-25 | 2012-03-08 | Livingston Robert J | Method of measuring adaptive immunity |
CN102686728B (zh) | 2009-06-29 | 2018-09-18 | 卢米耐克斯公司 | 具有发夹构象的嵌合引物及其使用方法 |
US8330957B2 (en) | 2009-06-29 | 2012-12-11 | Hager Enviromental and Atmospheric Technologies, LLC | Device and method for quantification of gases in plumes by remote sensing |
CN102482668A (zh) | 2009-08-20 | 2012-05-30 | 群体遗传学科技有限公司 | 分子内核酸重排的组合物和方法 |
EP2473625B1 (en) | 2009-09-01 | 2018-03-07 | Koninklijke Philips N.V. | Devices and methods for microarray selection |
WO2011028818A2 (en) | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Trustees Of Boston University | High throughput multichannel reader and uses thereof |
US9625454B2 (en) | 2009-09-04 | 2017-04-18 | The Research Foundation For The State University Of New York | Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices |
WO2011041308A1 (en) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Bcr-abl truncation mutations |
US9315857B2 (en) | 2009-12-15 | 2016-04-19 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags |
US8835358B2 (en) | 2009-12-15 | 2014-09-16 | Cellular Research, Inc. | Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels |
AU2011207544A1 (en) | 2010-01-19 | 2012-09-06 | Verinata Health, Inc. | Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic DNA by whole genome sequencing |
EP2848704B1 (en) | 2010-01-19 | 2018-08-29 | Verinata Health, Inc | Sequencing methods for prenatal diagnoses |
EP2529026B1 (en) | 2010-01-25 | 2013-11-13 | Rd Biosciences Inc. | Self-folding amplification of target nucleic acid |
JP5901046B2 (ja) | 2010-02-19 | 2016-04-06 | 国立大学法人 千葉大学 | OATP1B3mRNAの新規な選択的スプライシングバリアント |
WO2011106738A2 (en) | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Use of tcr clonotypes as biomarkers for disease |
US8951940B2 (en) | 2010-04-01 | 2015-02-10 | Illumina, Inc. | Solid-phase clonal amplification and related methods |
AU2011237729B2 (en) | 2010-04-05 | 2014-04-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
SG185544A1 (en) | 2010-05-14 | 2012-12-28 | Fluidigm Corp | Nucleic acid isolation methods |
US8828688B2 (en) | 2010-05-27 | 2014-09-09 | Affymetrix, Inc. | Multiplex amplification methods |
EP2580351B1 (en) | 2010-06-09 | 2018-08-29 | Keygene N.V. | Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening |
US20120004132A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-05 | Affymetrix, Inc. | Detection of Nucleic Acids and Proteins |
WO2012004834A1 (ja) | 2010-07-07 | 2012-01-12 | 株式会社アドバンテスト | 試験装置および試験方法 |
EP2407242A1 (en) | 2010-07-13 | 2012-01-18 | Dublin City University | Direct clone analysis and selection technology |
US20120040843A1 (en) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Dublin City University | Centrifugal capture system |
EP2623613B8 (en) | 2010-09-21 | 2016-09-07 | Population Genetics Technologies Ltd. | Increasing confidence of allele calls with molecular counting |
EP2436766A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-04 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Means and methods for improved protein interaction screening |
WO2012042374A2 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Anssi Jussi Nikolai Taipale | Method of determining number or concentration of molecules |
WO2012048341A1 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | High-throughput single cell barcoding |
US20120088691A1 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Gao Chen | Highly multiplexed real-time pcr using encoded microbeads |
US20130225623A1 (en) | 2010-10-27 | 2013-08-29 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists |
AU2011336707A1 (en) | 2010-11-29 | 2013-07-04 | Dako Denmark A/S | Methods and systems for analyzing images of specimens processed by a programmable quantitative assay |
US9394511B2 (en) | 2010-12-05 | 2016-07-19 | Wenbin Jiang | Rapid single cell based parallel biological cell sorter |
ES2615733T3 (es) | 2010-12-16 | 2017-06-08 | Gigagen, Inc. | Métodos para el análisis masivo paralelo de ácidos nucleicos en células individuales |
JP6328934B2 (ja) | 2010-12-22 | 2018-05-23 | ナテラ, インコーポレイテッド | 非侵襲性出生前親子鑑定法 |
WO2012092515A2 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing |
EP3567121B1 (en) | 2011-01-17 | 2023-08-30 | Life Technologies Corporation | Workflow for detection of ligands using nucleic acids |
WO2012103154A1 (en) | 2011-01-24 | 2012-08-02 | Nugen Technologies, Inc. | Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations |
US20120190021A1 (en) | 2011-01-25 | 2012-07-26 | Aria Diagnostics, Inc. | Detection of genetic abnormalities |
WO2012108864A1 (en) | 2011-02-08 | 2012-08-16 | Illumina, Inc. | Selective enrichment of nucleic acids |
US9150852B2 (en) | 2011-02-18 | 2015-10-06 | Raindance Technologies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
SG192870A1 (en) | 2011-02-23 | 2013-09-30 | Regents Board Of | Use of template switching for dna synthesis |
WO2012129363A2 (en) | 2011-03-24 | 2012-09-27 | President And Fellows Of Harvard College | Single cell nucleic acid detection and analysis |
KR20120110431A (ko) | 2011-03-29 | 2012-10-10 | 에스케이하이닉스 주식회사 | 반도체 메모리 장치 |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
DK3246416T3 (da) | 2011-04-15 | 2024-09-02 | Univ Johns Hopkins | Sikkert sekventeringssystem |
WO2012149042A2 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid analysis |
DK3415619T3 (da) | 2011-04-28 | 2021-03-08 | Univ Leland Stanford Junior | Identifikation af polynukleotider forbundet med en prøve |
GB201108259D0 (en) | 2011-05-17 | 2011-06-29 | Cambridge Entpr Ltd | Gel beads in microfluidic droplets |
SG10201605049QA (en) | 2011-05-20 | 2016-07-28 | Fluidigm Corp | Nucleic acid encoding reactions |
HUE062102T2 (hu) | 2011-05-24 | 2023-09-28 | BioNTech SE | Individualizált vakcinák a rák ellen |
WO2012162621A1 (en) | 2011-05-26 | 2012-11-29 | Brandeis University | Methods for suppression pcr |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
US9752176B2 (en) | 2011-06-15 | 2017-09-05 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Methods for preparative in vitro cloning |
WO2012177639A2 (en) | 2011-06-22 | 2012-12-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines |
WO2013003498A2 (en) | 2011-06-27 | 2013-01-03 | Life Technologies Corporation | Acoustic cytometry methods and protocols |
WO2013019075A2 (ko) | 2011-08-01 | 2013-02-07 | 연세대학교산학협력단 | 핵산분자의 제조방법 |
WO2013022961A1 (en) | 2011-08-08 | 2013-02-14 | 3The Broad Institute | Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence |
JP5816486B2 (ja) | 2011-08-18 | 2015-11-18 | オリンパス株式会社 | 蛍光観察装置および蛍光観察システム並びに蛍光観察装置の蛍光画像処理方法 |
EP3263718A1 (en) | 2011-09-16 | 2018-01-03 | Lexogen GmbH | Nucleic acid transcription method |
WO2013062931A2 (en) | 2011-10-24 | 2013-05-02 | Furchak Jennifer | A molecular beacon based assay for the detection of biomarkers of breast cancer metastasis |
US9777338B2 (en) | 2011-11-11 | 2017-10-03 | Meso Scale Technologies, Llc. | Co-binder assisted assay methods |
KR101337094B1 (ko) | 2011-11-30 | 2013-12-05 | 삼성에스디에스 주식회사 | 염기 서열 정렬 장치 및 그 방법 |
WO2013096802A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplification primers and methods |
WO2013117595A2 (en) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Illumina Cambridge Limited | Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support |
EP2823303A4 (en) | 2012-02-10 | 2015-09-30 | Raindance Technologies Inc | MOLECULAR DIAGNOSTIC SCREEN TYPE ASSAY |
WO2013123125A1 (en) | 2012-02-17 | 2013-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Assembly of nucleic acid sequences in emulsions |
EP3309262B1 (en) | 2012-02-24 | 2019-09-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Labeling and sample preparation for sequencing |
US11177020B2 (en) | 2012-02-27 | 2021-11-16 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and uses for molecular tags |
GB2513024B (en) | 2012-02-27 | 2016-08-31 | Cellular Res Inc | A clonal amplification method |
WO2013137737A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Flexgen B.V. | Methods of creating and screening of dna encoded combinatorial libraries of chemical antibodies |
US9803239B2 (en) | 2012-03-29 | 2017-10-31 | Complete Genomics, Inc. | Flow cells for high density array chips |
EP2647426A1 (en) | 2012-04-03 | 2013-10-09 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Replication of distributed nucleic acid molecules with preservation of their relative distribution through hybridization-based binding |
HUE029357T2 (en) | 2012-05-08 | 2017-02-28 | Adaptive Biotechnologies Corp | Preparations and devices for measuring and calibrating amplification distortion in multiplex PCR reactions |
US20150132754A1 (en) | 2012-05-14 | 2015-05-14 | Cb Biotechnologies, Inc. | Method for increasing accuracy in quantitative detection of polynucleotides |
SG11201407901PA (en) | 2012-05-21 | 2015-01-29 | Fluidigm Corp | Single-particle analysis of particle populations |
CN104508492B (zh) | 2012-05-25 | 2018-07-27 | 北卡罗来纳-查佩尔山大学 | 微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法 |
EP2861761A1 (en) | 2012-06-15 | 2015-04-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set |
AU2013273953B2 (en) | 2012-06-15 | 2018-12-13 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | High throughput sequencing of multiple transcripts of a single cell |
EP2861787B1 (en) | 2012-06-18 | 2017-09-20 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
JP6285929B2 (ja) | 2012-07-17 | 2018-02-28 | カウンシル,インコーポレーテッド | 遺伝的変異を検出するためのシステムおよび方法 |
WO2014015098A1 (en) | 2012-07-18 | 2014-01-23 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | A method of normalizing biological samples |
SG11201500313YA (en) | 2012-07-24 | 2015-02-27 | Sequenta Inc | Single cell analysis using sequence tags |
US10870099B2 (en) | 2012-07-26 | 2020-12-22 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for the amplification of nucleic acids |
EP3578669B1 (en) | 2012-08-08 | 2024-07-10 | F. Hoffmann-La Roche AG | Increasing dynamic range for identifying multiple epitopes in cells |
US20140378349A1 (en) | 2012-08-14 | 2014-12-25 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US20150005200A1 (en) | 2012-08-14 | 2015-01-01 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US20140378345A1 (en) | 2012-08-14 | 2014-12-25 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US10221442B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-03-05 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
CN113528634A (zh) | 2012-08-14 | 2021-10-22 | 10X基因组学有限公司 | 微胶囊组合物及方法 |
US10752949B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-08-25 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US20140378322A1 (en) | 2012-08-14 | 2014-12-25 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US20150005199A1 (en) | 2012-08-14 | 2015-01-01 | 10X Technologies, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10273541B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-04-30 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US9951386B2 (en) | 2014-06-26 | 2018-04-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
CN104884605B (zh) | 2012-08-24 | 2018-05-18 | 耶鲁大学 | 用于高通量多重检测的系统、装置和方法 |
EP3901280A1 (en) | 2012-10-17 | 2021-10-27 | Spatial Transcriptomics AB | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
GB201218909D0 (en) | 2012-10-22 | 2012-12-05 | Univ Singapore | Assay for the parallel detection of biological material based on PCR |
CN107090491A (zh) | 2012-11-05 | 2017-08-25 | 鲁比康基因组学公司 | 条形编码核酸 |
EP3567116A1 (en) | 2012-12-14 | 2019-11-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
WO2014108850A2 (en) | 2013-01-09 | 2014-07-17 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | High throughput transcriptome analysis |
US9683230B2 (en) | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
WO2014116729A2 (en) | 2013-01-22 | 2014-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Haplotying of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing |
EP2948252A1 (en) | 2013-01-24 | 2015-12-02 | SABIC Global Technologies B.V. | Microwell plate made from a polyester-polycarbonate |
US10017761B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-07-10 | Yale University | Methods for preparing cDNA from low quantities of cells |
EP2951557B1 (en) | 2013-02-01 | 2022-10-05 | Becton Dickinson and Company | Methods and systems for assessing sample behavior in a flow cytometer |
WO2014124046A1 (en) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Affinity-based partition assay for detection of target molecules |
KR102190198B1 (ko) | 2013-02-08 | 2020-12-14 | 10엑스 제노믹스, 인크. | 폴리뉴클레오티드 바코드 생성 |
WO2014126937A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Suspension arrays and multiplexed assays based thereon |
US9621600B2 (en) | 2013-02-26 | 2017-04-11 | PortAura Group | Method and system for providing recommendations using location information |
US20140274811A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Lyle J. Arnold | Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome |
US9328382B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-03 | Complete Genomics, Inc. | Multiple tagging of individual long DNA fragments |
US9255265B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-09 | Illumina, Inc. | Methods for producing stranded cDNA libraries |
WO2014145458A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Nucleic acid-tagged compositions and methods for multiplexed protein-protein interaction profiling |
EP3611262B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-11-11 | Lineage Biosciences, Inc. | Methods of sequencing the immune repertoire |
GB2584364A (en) | 2013-03-15 | 2020-12-02 | Abvitro Llc | Single cell bar-coding for antibody discovery |
WO2014165762A1 (en) | 2013-04-05 | 2014-10-09 | Raindance Technologies, Inc. | Rare cell analysis after negative selection |
CA2909861C (en) | 2013-04-25 | 2022-12-06 | Firefly Bioworks, Inc. | Multiplexed analysis of target nucleic acids |
US10822605B2 (en) | 2013-05-03 | 2020-11-03 | Gensinta, Inc. | Method and apparatus for producing sequence verified DNA |
EP2805769A1 (en) | 2013-05-24 | 2014-11-26 | European Molecular Biology Laboratory | Methods for nano-scale single cell analysis |
WO2014201273A1 (en) | 2013-06-12 | 2014-12-18 | The Broad Institute, Inc. | High-throughput rna-seq |
EP3008201B1 (en) | 2013-06-12 | 2019-08-07 | The General Hospital Corporation | Methods for multiplexed detection of target molecules and uses thereof |
WO2014204939A2 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Kim Lewis | Methods for quantitative determination of protein-nucleic acid interactions in complex mixtures |
EP4234716A3 (en) | 2013-06-25 | 2023-12-06 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
CA2915499A1 (en) | 2013-06-27 | 2014-12-31 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
US20160153973A1 (en) | 2013-07-09 | 2016-06-02 | Lucas David Smith | Device and method of rapid linker mediated label-based immunoassays |
US10395758B2 (en) | 2013-08-30 | 2019-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Sequencing methods |
EP3041957A4 (en) | 2013-09-04 | 2017-03-29 | Fluidigm Corporation | Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell |
ES2875998T3 (es) | 2013-09-30 | 2021-11-11 | Vesicode Ab | Procedimientos de perfilado de complejos moleculares mediante el uso de códigos de barras dependientes de la proximidad |
GB201317301D0 (en) | 2013-09-30 | 2013-11-13 | Linnarsson Sten | Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells |
JP2017504307A (ja) | 2013-10-07 | 2017-02-09 | セルラー リサーチ, インコーポレイテッド | アレイ上のフィーチャーをデジタルカウントするための方法およびシステム |
EP3058092B1 (en) | 2013-10-17 | 2019-05-22 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries |
US9709479B2 (en) | 2013-10-25 | 2017-07-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Method and apparatus for tracking cell identity |
WO2015061844A1 (en) | 2013-10-30 | 2015-05-07 | The University Of Sydney | Assay to stratify cancer patients |
WO2015070037A2 (en) | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection |
SG10201807112XA (en) | 2013-12-30 | 2018-09-27 | Atreca Inc | Analysis of nucleic acids associated with single cells using nucleic acid barcodes |
EP3099820A4 (en) | 2014-01-27 | 2018-01-03 | The General Hospital Corporation | Methods of preparing nucleic acids for sequencing |
US20150218620A1 (en) | 2014-02-03 | 2015-08-06 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods to capture and/or remove highly abundant rnas from a heterogenous rna sample |
ES2741740T3 (es) | 2014-03-05 | 2020-02-12 | Adaptive Biotechnologies Corp | Métodos que usan moléculas sintéticas que contienen segmentos de nucleótidos aleatorios |
EP3132059B1 (en) | 2014-04-17 | 2020-01-08 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
US20150298091A1 (en) | 2014-04-21 | 2015-10-22 | President And Fellows Of Harvard College | Systems and methods for barcoding nucleic acids |
US10975371B2 (en) | 2014-04-29 | 2021-04-13 | Illumina, Inc. | Nucleic acid sequence analysis from single cells |
CA2947426C (en) | 2014-04-29 | 2020-01-07 | Illumina, Inc. | Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation |
EP3901278A1 (en) | 2014-05-19 | 2021-10-27 | William Marsh Rice University | Allele-specific amplification using a composition of overlapping non-allele-specific primer and allele-specific blocker oligonucleotides |
EP3161157B1 (en) | 2014-06-24 | 2024-03-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital pcr barcoding |
WO2015200869A1 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | 10X Genomics, Inc. | Analysis of nucleic acid sequences |
EP3161160B1 (en) | 2014-06-26 | 2021-10-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations |
EP3626834B1 (en) | 2014-07-15 | 2022-09-21 | Qiagen Sciences, LLC | Semi-random barcodes for nucleic acid analysis |
WO2016040446A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
SG11201702060VA (en) | 2014-09-15 | 2017-04-27 | Abvitro Inc | High-throughput nucleotide library sequencing |
US9529672B2 (en) | 2014-09-25 | 2016-12-27 | Everspin Technologies Inc. | ECC word configuration for system-level ECC compatibility |
IL299976B1 (en) | 2014-10-17 | 2024-07-01 | Illumina Cambridge Ltd | Continuity-preserving transposition |
US20180320241A1 (en) | 2014-12-19 | 2018-11-08 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Methods for identifying multiple epitopes in selected sub-populations of cells |
EP3248018B1 (en) | 2015-01-22 | 2020-01-08 | Becton, Dickinson and Company | Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells |
US10760120B2 (en) | 2015-01-23 | 2020-09-01 | Qiagen Sciences, Llc | High multiplex PCR with molecular barcoding |
WO2016130578A1 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-18 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data |
EP3259371B1 (en) | 2015-02-19 | 2020-09-02 | Becton, Dickinson and Company | High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information |
ES2906221T3 (es) | 2015-02-27 | 2022-04-13 | Becton Dickinson Co | Métodos para el marcado con códigos de barras de ácidos nucleicos para secuenciación |
WO2016138496A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Cellular Research, Inc. | Spatially addressable molecular barcoding |
CN107614700A (zh) | 2015-03-11 | 2018-01-19 | 布罗德研究所有限公司 | 基因型和表型偶联 |
US20160266094A1 (en) | 2015-03-13 | 2016-09-15 | University Of Iowa Research Foundation | Cellular barcode |
WO2016149418A1 (en) | 2015-03-18 | 2016-09-22 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for labeling targets and haplotype phasing |
US11535882B2 (en) | 2015-03-30 | 2022-12-27 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for combinatorial barcoding |
WO2016160965A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Rubicon Genomics, Inc. | Methods and compositions for repair of dna ends by multiple enzymatic activities |
WO2016168825A1 (en) | 2015-04-17 | 2016-10-20 | Centrillion Technology Holdings Corporation | Methods for performing spatial profiling of biological molecules |
WO2016172373A1 (en) * | 2015-04-23 | 2016-10-27 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for whole transcriptome amplification |
US9618871B2 (en) | 2015-04-28 | 2017-04-11 | Kyocera Document Solutions Inc. | Image forming apparatus |
JP2018516569A (ja) | 2015-05-22 | 2018-06-28 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーSigma−Aldrich Co., LLC | 次世代ゲノムウォーキングのための方法ならびに関連する組成物およびキット |
EP3303587A4 (en) | 2015-05-28 | 2018-11-21 | Kaarel Krjutskov | Blocking oligonucleotides |
US11124823B2 (en) | 2015-06-01 | 2021-09-21 | Becton, Dickinson And Company | Methods for RNA quantification |
US11248262B2 (en) | 2015-08-24 | 2022-02-15 | Qiagen Gmbh | Method for generating a RNA-sequencing library |
CN115928221A (zh) | 2015-08-28 | 2023-04-07 | Illumina公司 | 单细胞核酸序列分析 |
EP3347465B1 (en) | 2015-09-11 | 2019-06-26 | Cellular Research, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid library normalization |
US11156611B2 (en) | 2015-09-24 | 2021-10-26 | Abvitro Llc | Single cell characterization using affinity-oligonucleotide conjugates and vessel barcoded polynucleotides |
US11092607B2 (en) | 2015-10-28 | 2021-08-17 | The Board Institute, Inc. | Multiplex analysis of single cell constituents |
CA3004310A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Atreca, Inc. | Combinatorial sets of nucleic acid barcodes for analysis of nucleic acids associated with single cells |
US20170136458A1 (en) | 2015-11-18 | 2017-05-18 | Wafergen, Inc. | Systems and methods for pooling samples from multi-well devices |
US20190040381A1 (en) | 2015-12-04 | 2019-02-07 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Cloning and expression system for t-cell receptors |
EP3397764A4 (en) | 2015-12-30 | 2019-05-22 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | DIGITAL QUANTIFICATION OF PROTEINS |
US20170205404A1 (en) | 2016-01-19 | 2017-07-20 | General Electric Company | Multifunctional beads and methods of use for capturing rare cells |
WO2017139690A1 (en) | 2016-02-11 | 2017-08-17 | 10X Genomics, Inc. | Cell population analysis using single nucleotide polymorphisms from single cell transcriptomes |
WO2017164936A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | The Broad Institute, Inc. | Methods for determining spatial and temporal gene expression dynamics in single cells |
CN109312331B (zh) | 2016-04-01 | 2022-08-02 | 贝勒医学院 | 全转录组扩增的方法 |
EP3452614B1 (en) | 2016-05-02 | 2023-06-28 | Becton, Dickinson and Company | Accurate molecular barcoding |
US20190161743A1 (en) | 2016-05-09 | 2019-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Self-Targeting Guide RNAs in CRISPR System |
US10301677B2 (en) | 2016-05-25 | 2019-05-28 | Cellular Research, Inc. | Normalization of nucleic acid libraries |
WO2017205691A1 (en) | 2016-05-26 | 2017-11-30 | Cellular Research, Inc. | Molecular label counting adjustment methods |
TWI600309B (zh) | 2016-05-28 | 2017-09-21 | Hon Hai Prec Ind Co Ltd | 角度調整機構 |
US10202641B2 (en) | 2016-05-31 | 2019-02-12 | Cellular Research, Inc. | Error correction in amplification of samples |
US10640763B2 (en) | 2016-05-31 | 2020-05-05 | Cellular Research, Inc. | Molecular indexing of internal sequences |
LT3263715T (lt) | 2016-06-28 | 2020-06-25 | Hifibio | Pavienių ląstelių transkriptomo analizės būdas |
WO2018017949A1 (en) | 2016-07-22 | 2018-01-25 | Verily Life Sciences Llc | Quantitative massively parallel proteomics |
WO2018020489A1 (en) | 2016-07-24 | 2018-02-01 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods and kits for analyzing dna binding moieties attached to dna |
US20180037942A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | Cellular Research, Inc. | Enzyme-independent molecular indexing |
CA3033506A1 (en) | 2016-08-10 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of de novo assembly of barcoded genomic dna fragments |
CA3034924A1 (en) | 2016-09-26 | 2018-03-29 | Cellular Research, Inc. | Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences |
JPWO2018061699A1 (ja) | 2016-09-29 | 2019-06-24 | 富士フイルム株式会社 | マルチプレックスpcrに供するプライマーの設計方法 |
WO2018061695A1 (ja) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | 富士フイルム株式会社 | マルチプレックスpcrに供するプライマーの設計方法 |
KR102650753B1 (ko) | 2016-10-01 | 2024-03-26 | 버클리 라잇츠, 인크. | 미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 dna 바코드 조성물 및 방법 |
WO2018075693A1 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for barcoding nucleic acid molecules from individual cells or cell populations |
CN108473975A (zh) | 2016-11-17 | 2018-08-31 | 领星生物科技(上海)有限公司 | 检测肿瘤发展的系统和方法 |
EP3551768B1 (en) | 2016-12-12 | 2024-03-06 | Grail, LLC | Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries |
US10011872B1 (en) | 2016-12-22 | 2018-07-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
MX2019007444A (es) | 2016-12-22 | 2019-08-16 | Guardant Health Inc | Metodos y sistemas para analisis de moleculas de acido nucleico. |
US20190177800A1 (en) | 2017-12-08 | 2019-06-13 | 10X Genomics, Inc. | Methods and compositions for labeling cells |
US10550429B2 (en) | 2016-12-22 | 2020-02-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
GB201622222D0 (en) | 2016-12-23 | 2017-02-08 | Cs Genetics Ltd | Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells |
WO2018132635A1 (en) | 2017-01-12 | 2018-07-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for analyzing t cell receptors and b cell receptors |
US20180208975A1 (en) | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Assay for simultaneous genomic and proteomic analysis |
CN117512066A (zh) | 2017-01-30 | 2024-02-06 | 10X基因组学有限公司 | 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统 |
US11319583B2 (en) | 2017-02-01 | 2022-05-03 | Becton, Dickinson And Company | Selective amplification using blocking oligonucleotides |
FI3583214T3 (fi) | 2017-02-02 | 2023-12-19 | New York Genome Center Inc | Menetelmiä ja koostumuksia biologisen näytteen sisältämien kohteiden tunnistamiseksi tai kvantifioimiseksi |
JP2020513826A (ja) | 2017-03-24 | 2020-05-21 | ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール | 分子の多重検出方法 |
JP7169290B2 (ja) | 2017-03-24 | 2022-11-10 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | マルチプレットを決定するための合成マルチプレット |
CN111051526A (zh) | 2017-05-23 | 2020-04-21 | 生捷科技控股公司 | 用于实施生物分子空间分布分析的方法 |
US10400235B2 (en) | 2017-05-26 | 2019-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Single cell analysis of transposase accessible chromatin |
KR102550778B1 (ko) | 2017-05-26 | 2023-07-03 | 에이비비트로 엘엘씨 | 고-처리량 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 시퀀싱 및 전사체 분석 |
AU2018277019A1 (en) | 2017-05-29 | 2019-12-19 | President And Fellows Of Harvard College | A method of amplifying single cell transcriptome |
AU2018281745B2 (en) | 2017-06-05 | 2022-05-19 | Becton, Dickinson And Company | Sample indexing for single cells |
WO2019055852A1 (en) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Apton Biosystems, Inc. | PROFILING OF HETEROGENEOUS UNICELLULAR ORGANISMS USING MOLECULAR BARCODE CODING |
ES2969957T3 (es) | 2017-09-25 | 2024-05-23 | Becton Dickinson Co | Corrección de errores del código de barras del receptor inmunitario |
WO2019076768A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus As | METHOD AND KIT FOR PREPARING DNA BANK |
WO2019084046A1 (en) | 2017-10-23 | 2019-05-02 | The Broad Institute, Inc. | ENRICHING SINGLE CELL CELLULAR CONSTITUENT OF BARCODE SEQUENCING LIBRARY |
WO2019099906A1 (en) | 2017-11-16 | 2019-05-23 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods to measure functional heterogeneity among single cells |
WO2019113499A1 (en) | 2017-12-07 | 2019-06-13 | The Broad Institute, Inc. | High-throughput methods for identifying gene interactions and networks |
EP3720605A1 (en) | 2017-12-07 | 2020-10-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Single cell analyses |
WO2019113506A1 (en) | 2017-12-07 | 2019-06-13 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing |
CN110462060B (zh) | 2017-12-08 | 2022-05-03 | 10X基因组学有限公司 | 用于标记细胞的方法和组合物 |
WO2019118355A1 (en) | 2017-12-12 | 2019-06-20 | 10X Genomics, Inc. | Systems and methods for single cell processing |
CN118547046A (zh) | 2017-12-22 | 2024-08-27 | 10X基因组学有限公司 | 用于处理来自一个或多个细胞的核酸分子的系统和方法 |
PT3735470T (pt) | 2018-01-05 | 2024-01-31 | Billiontoone Inc | Modelos de controlo de qualidade para garantir a validade dos ensaios baseados em sequenciamento |
CN112005115A (zh) | 2018-02-12 | 2020-11-27 | 10X基因组学有限公司 | 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法 |
US20210046482A1 (en) | 2018-03-12 | 2021-02-18 | Silicon Valley Scientific, Inc. | Method and apparatus for processing tissue and other samples encoding cellular spatial position information |
CN113383083A (zh) | 2018-04-27 | 2021-09-10 | 埃克斯基因美国公司 | 用于制备多核苷酸的方法和组合物 |
US11773441B2 (en) | 2018-05-03 | 2023-10-03 | Becton, Dickinson And Company | High throughput multiomics sample analysis |
WO2019213237A1 (en) | 2018-05-03 | 2019-11-07 | Becton, Dickinson And Company | Molecular barcoding on opposite transcript ends |
CN110499251A (zh) | 2018-05-17 | 2019-11-26 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用 |
US20200040379A1 (en) | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Cellular Research, Inc. | Nuclei barcoding and capture in single cells |
WO2020033164A1 (en) | 2018-08-08 | 2020-02-13 | Vanderbilt University | Systems and methods for simultaneous detection of antigens and antigen specific antibodies |
EP3837378B1 (en) | 2018-08-17 | 2023-04-05 | Becton, Dickinson and Company | Aptamer barcoding |
EP3844299A1 (en) | 2018-08-28 | 2021-07-07 | Becton Dickinson and Company | Sample multiplexing using carbohydrate-binding and membrane-permeable reagents |
WO2020072380A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | Cellular Research, Inc. | Determining 5' transcript sequences |
US11932849B2 (en) | 2018-11-08 | 2024-03-19 | Becton, Dickinson And Company | Whole transcriptome analysis of single cells using random priming |
CN113195717A (zh) | 2018-12-13 | 2021-07-30 | 贝克顿迪金森公司 | 单细胞全转录组分析中的选择性延伸 |
EP3899030A2 (en) | 2018-12-17 | 2021-10-27 | Natera, Inc. | Methods for analysis of circulating cells |
ES2945227T3 (es) | 2019-01-23 | 2023-06-29 | Becton Dickinson Co | Oligonucleótidos asociados con anticuerpos |
US12071617B2 (en) | 2019-02-14 | 2024-08-27 | Becton, Dickinson And Company | Hybrid targeted and whole transcriptome amplification |
US11965208B2 (en) | 2019-04-19 | 2024-04-23 | Becton, Dickinson And Company | Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data |
EP4090763A1 (en) | 2020-01-13 | 2022-11-23 | Becton Dickinson and Company | Methods and compositions for quantitation of proteins and rna |
EP4090764A1 (en) | 2020-01-13 | 2022-11-23 | Becton, Dickinson and Company | Cell capture using du-containing oligonucleotides |
EP4090762A1 (en) | 2020-01-17 | 2022-11-23 | Becton, Dickinson and Company | Methods and compositions for single cell secretomics |
US20210230583A1 (en) | 2020-01-29 | 2021-07-29 | Becton, Dickinson And Company | Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing |
WO2021155284A1 (en) | 2020-01-31 | 2021-08-05 | Becton Dickinson And Company | Mesophilic dna polymerase extension blockers |
CN115087746A (zh) | 2020-02-12 | 2022-09-20 | 贝克顿迪金森公司 | 细胞内AbSeq |
WO2021173719A1 (en) | 2020-02-25 | 2021-09-02 | Becton, Dickinson And Company | Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control |
EP4150118A1 (en) | 2020-05-14 | 2023-03-22 | Becton Dickinson and Company | Primers for immune repertoire profiling |
WO2021247593A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | Becton, Dickinson And Company | Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay |
US11932901B2 (en) | 2020-07-13 | 2024-03-19 | Becton, Dickinson And Company | Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq |
EP4179110A1 (en) | 2020-07-13 | 2023-05-17 | Becton, Dickinson and Company | Cdna spike-in control for single cell analysis |
WO2022026909A1 (en) | 2020-07-31 | 2022-02-03 | Becton, Dickinson And Company | Single cell assay for transposase-accessible chromatin |
CN116529389A (zh) | 2020-08-20 | 2023-08-01 | 贝克顿迪金森公司 | 用于从血培养物中分离细菌的血细胞裂解剂 |
WO2022108946A1 (en) | 2020-11-17 | 2022-05-27 | Becton, Dickinson And Company | Combined analysis of cell-free nucleic acids and single cells for oncology diagnostics |
WO2022109339A1 (en) | 2020-11-20 | 2022-05-27 | Becton, Dickinson And Company | Use of dextramer in single cell analysis |
EP4247967A1 (en) | 2020-11-20 | 2023-09-27 | Becton, Dickinson and Company | Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins |
US20220178909A1 (en) | 2020-12-09 | 2022-06-09 | Becton, Dickinson And Company | Multiplexed single cell immunoassay |
-
2019
- 2019-11-07 US US16/677,012 patent/US11932849B2/en active Active
- 2019-11-07 EP EP19836036.4A patent/EP3877520A1/en active Pending
- 2019-11-07 JP JP2021523956A patent/JP2022506546A/ja active Pending
- 2019-11-07 WO PCT/US2019/060243 patent/WO2020097315A1/en unknown
- 2019-11-07 CN CN201980073850.5A patent/CN112969789A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010117620A2 (en) * | 2009-03-30 | 2010-10-14 | Illumina, Inc. | Gene expression analysis in single cells |
JP2016533187A (ja) * | 2013-08-28 | 2016-10-27 | セルラー リサーチ, インコーポレイテッド | 大規模並列単一細胞分析 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FOX-WALSH, KRISTI ET AL.: ""A multiplex RNA-seq strategy to profile poly(A+) RNA: Application to analysis of transcription res", GENOMICS, vol. 98, no. 4, JPN6023044145, October 2011 (2011-10-01), pages 266 - 271, XP028304080, ISSN: 0005184635, DOI: 10.1016/j.ygeno.2011.04.003 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20200149037A1 (en) | 2020-05-14 |
WO2020097315A1 (en) | 2020-05-14 |
US11932849B2 (en) | 2024-03-19 |
CN112969789A (zh) | 2021-06-15 |
EP3877520A1 (en) | 2021-09-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11932849B2 (en) | Whole transcriptome analysis of single cells using random priming | |
EP3837378B1 (en) | Aptamer barcoding | |
US11661631B2 (en) | Oligonucleotides associated with antibodies | |
EP4158055B1 (en) | Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay | |
US11649497B2 (en) | Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA | |
US20210214770A1 (en) | Cell capture using du-containing oligonucleotides | |
US12071617B2 (en) | Hybrid targeted and whole transcriptome amplification | |
US20220010362A1 (en) | cDNA SPIKE-IN CONTROL FOR SINGLE CELL ANALYSIS | |
US20230109336A1 (en) | Selective extension in single cell whole transcriptome analysis | |
US20220010361A1 (en) | TARGET ENRICHMENT USING NUCLEIC ACID PROBES FOR scRNAseq | |
EP3861134A1 (en) | Determining 5' transcript sequences | |
KR20200014370A (ko) | 단일 세포를 위한 샘플 인덱싱 | |
EP4396369A1 (en) | Template switch oligonucleotide (tso) for mrna 5' analysis | |
US11371076B2 (en) | Polymerase chain reaction normalization through primer titration | |
WO2024097718A1 (en) | Polymerase mediated end modification of abseq | |
WO2024097719A1 (en) | Application for peptide nucleic acid (pna) blocker | |
WO2024137527A1 (en) | Sorting method using barcoded chambers for single cell workflow |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221104 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221104 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20231017 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231030 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240325 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240618 |