JP2008256428A - マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】マイクロアレイ画像に分布するノイズに影響されずに、信頼性の高いブロック位置を、基準スポット位置等の情報なしに自動的に検出するマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法を提供する。
【解決手段】マイクロアレイ画像１６のデータの各画素を２値化するステップを有する。２値化した画素の値について、ブロック２０の互いに直交する各辺の方向に投影するように累積した投影輝度データ２６を生成するステップを備える。投影輝度データ２６を所定の閾値で２値化し、その閾値以上若しくは以下のデータが連続する区間についてブロック２０の幅を基準に投影輝度データ２６が連続するか否かを判定する。この判定を基に、ブロック２０の範囲を決定するステップを備え、ブロック２０の位置を自動的に検出する。
【選択図】図１

Description

この発明は、ＤＮＡ等のマイクロアレイを撮像した画像データのブロック位置を、画像処理により自動的に検出するマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法に関する。

近年、マイクロアレイを用いた遺伝子解析が実現されている。マイクロアレイとは、１枚のスライドガラス上に数千から数万の遺伝子を、異なるスポットとして固定させたものである。そして、マイクロアレイは、スライドガラス上で、数千から数万のｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡを、異なるスポットとして固定化し、ハイブリダイズ反応させ、蛍光検出により遺伝子の発現パターンを同時に計測できるようにしたものである。また、スライドガラス上に標的タンパク質に反応する抗体などを多数固定化し、種々の標的タンパク質を検出するプロテインマイクロアレイもある。

マイクロアレイを用いた遺伝子解析は、解析すべき未知のＤＮＡ若しくはｍＲＮＡを含むサンプルに光学的に検出可能な蛍光タグを付けて、マイクロアレイ上でハイブリダイズ反応を行わせる。その結果、スポットされたｃＤＮＡと相補的な関係にあるＤＮＡ若しくはｍＲＮＡは結びついて二重鎖を形成し、一方、スポットされたｃＤＮＡと二重鎖を形成しなかったＤＮＡ若しくはｍＲＮＡはその後の工程で洗い流され、その結果を蛍光スキャナーで読みとることで、二重鎖となったｃＤＮＡスポットの状態を画像データとして観察することができる。そして、この画像データを解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかが解析される。この遺伝子解析により、遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。

ここで、蛍光検出としては１波長を測定する方法と２波長を同時に測定する方法があり、前者の場合は１枚のスライドガラスあたり１画像、後者の場合は波長ごとに分けられた２画像が得られる。その蛍光強度（輝度値）は通常、65535階調で得られる。

このマイクロアレイ画像は、スライドガラス上にスポットを固定化するスポッティング装置や蛍光検出の読み取り装置の機械的な精度の限界から、スライドガラスごと（マイクロアレイ画像ごと）にブロック単位での大きな位置ずれが発生しやすい。このため、マイクロアレイ画像からスポット情報を計測する場合、まず図５に示すようなコンピュータ装置１０及び処理用ソフトウェアを用いて、ディスプレイ１２を見ながらポインティングデバイス１４（マウス）を使って、人手によりディスプレイ１２のアレイ画像１６のスポット１８が配置されているブロック２０の位置（矩形領域）を個々に指定する必要がある。ここで云うブロック２０とは、規定数の行と列で構成されるスポット１８の集まりを指す。１枚のスライドガラス上には、複数のブロック２０が行と列で並べられ配置されている。
特開２００５−１７２８４０号公報 特開平１０−３００４２７号公報

上記従来の解析方法の場合、ディスプレイ１２を見ながらポインティングデバイス１４を使って、人手によりディスプレイ１２のアレイ画像１６のブロック２０位置（矩形領域）を指定しているため、手間がかかる上、ミスが発生しやすいという問題がある。

一方、ブロック２０の位置を自動的に判別する手法としては、特許文献1に開示されているように、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準ポット領域を設け、既知の基準スポット位置の蛍光パターンを元に推定していく方法も考案されている。

しかしこの場合、基準となるスポット位置は確実に蛍光検出できなければならないという制約がある。また、マイクロアレイ画像は大域的や局所的に分布するノイズも多く、これらノイズの影響を回避しながら基準スポット位置を自動で探し出すことは難しい。

この他、特許文献２に開示されているような画像位置検出方法も提案されている。この画像位置検出方法は、撮像データを水平方向、垂直方向に投影した値を作成し、その投影データをそれぞれ微分して変化点を検出し、変化点のパターンを既知のパターンと比較してパターン位置を検出するものである。しかし特許文献２には、マイクロアレイ画像のようなスポット群の検出については触れられておらず、これをマイクロアレイ画像の検出に使用しようとしても、ノイズの影響により正確に検出できないものである。

この発明は、上記従来の技術の問題点に鑑みて成されたもので、マイクロアレイ画像に分布するノイズに影響されずに、信頼性の高いブロック位置を、基準スポット位置等の情報なしに自動的に検出するマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法を提供することを目的とする。

この発明は、基板上にマトリクス状にスポットが形成されたマイクロアレイを撮影したマイクロアレイ画像を処理して、ブロック位置を自動的に検出するブロック位置検出方法において、前記マイクロアレイ画像のデータの各画素を２値化するステップと、前記２値化した画素の値について、前記ブロックの互いに直交する各辺の方向に投影するように累積した投影輝度データを生成するステップと、前記投影輝度データを所定の閾値で２値化し、前記閾値以上若しくは以下の前記投影輝度データが連続する区間について前記ブロック幅を基準に前記投影輝度データが連続するか否かを判定し、前記判定を基に前記ブロックの範囲を決定するステップにより前記ブロック位置を自動的に検出するマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法である。

前記マイクロアレイ画像のデータの各画素を２値化するステップは、前記マイクロアレイ画像を互いに直交する複数の区画線により小領域に分割し、前記小領域ごとに閾値を設定し、この閾値に基づいて前記マイクロアレイ画像の各画素の２値化を行うものである。

さらに、前記２値化は、前記小領域をその幅の半分だけ縦方向及び横方向に移動させた他の小領域にも分割し、これら２系統の小領域の群それぞれについて前記閾値を決定し、その閾値に基づいて前記マイクロアレイ画像の２値化を行うとともに、前記２系統の小領域の各閾値のうち、その２値化対象画素の輝度がいずれか一方の閾値以上であった場合、その画素の２値化した値を閾値以上、そうでない場合はその画素の２値化した値を閾値以下とするものである。

また、前記マイクロアレイ画像は、異なる２波長の光により撮像したデータであり、そのデータの各画素のその画素の輝度がいずれか一方でも閾値以上であった場合、その画素の２値化した値を閾値以上とし、そうでない場合はその画素の２値化した値を閾値以下とするものである。

この発明のマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法によれば、マイクロアレイ画像にある大域的、局所的に分布するノイズの影響を受け難く、また、２波長を同時に測定する方法の場合も、２画像の相関を考慮した投影解析を行うことで、信頼性の高いブロック位置検出を自動的に行うことができるものである。

以下、この発明の一実施の形態について図面に基づいて説明する。ここで上述の説明と同様の構成は同一の符号を付して説明する。図１はこの発明のマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法を説明するフローチャートであり、以下に各ステップ（Ｓ２〜Ｓ１０）について説明する。

まず、前処理としてマイクロアレイ画像１６を２値化する（Ｓ２）。その様子を図２のフローチャート（ａ）と模式図（ｂ）、（ｃ）で説明する。マイクロアレイ画像１６は、コンピュータ１０による画像位置検出装置に取り込まれ、複数本の互いに直交する平行及び直角方向の区画線２１により、賽の目状の小領域２２に分割される。この区画線２１の方向は、マイクロアレイ画像１６のスポット１８の行及び列の各配列方向である。小領域２２の幅は、例えばマイクロアレイ画像１６のスポット１８の平均直径の２倍程度の値が好ましい。

さらに、図２（ｃ）に示すように、図２（ｂ）に示す区画線２１による小領域２２に対して、区画線２１の位置を小領域２２の幅の半分だけ縦方向・横方向に移動させた小領域２３にも分割する。これら２系統の小領域２２，２３の群それぞれについて閾値を決定する。この閾値は、例えば小領域２２，２３の輝度の中央値や平均値、これらの値からの標準偏差をプラスマイナスした値などが利用できる。こうして決定した閾値に基づいて、マイクロアレイ画像１６のデータの、各画素の２値化を行う。

２値化は、マイクロアレイ画像１６のデータの注目画素（ピクセル）が所属する２つの系統の小領域２２，２３の各閾値のうち、その画素の輝度がいずれか一方でも閾値以上であった場合値を１、そうでなければその画素の値を０とする。

また、例えば異なる２波長の光で同時に測定する方法では、２つの画像が得られるため、それぞれの画像の各画素について上記と同様の処理を行い、いずれか一方が１であればその画素の値を１とする。

以上の処理により、マイクロアレイ画像１６上に、広域に分布するノイズの影響を無くし、取りこぼしの少ない２値化データ２４を生成することが可能となる。

この後、局所的に分布するノイズを除去するために、２値化データに対しノイズ除去を行う（Ｓ４）。これには収縮やメディアンフィルタなどの既存の手法が利用できる。

次に、マイクロアレイ画像１６の各スポット１８と、ブロック２０の行列の配置に強い相関性があることに着目し、図３（ａ）、（ｂ）に示すように、投影輝度データ２６を生成する（Ｓ６）。投影方向は各スポット１８による行列の行方向と列方向である。ここで言う投影輝度データ２６とは、図３（ｂ）に示すように投影面に対する座標ごとの２値化データ２４の値が１である画素の累積数である。また、２波長を同時に測定する方法では２つの画像が得られ、この２つの画像はブロック２０の位置と輝度値に関して強い相関があるため、２つの画像から１つの水平垂直データを作成する。これにより、より信頼性の高い位置推定が可能となる。

さらに、最初に作成する投影輝度データ２６は、マイクロアレイ画像１６の高さが幅より大きい場合、高さ方向の垂直投影輝度データ、そうではない場合水平投影輝度データとする。これは投影対象数の大きい方向の投影の方がブロック位置特定に対し有意であるためである。

上述のようにして求めた投影輝度データ２６を図４に示すフローチャートのように解析し（Ｓ８）、その投影面方向のブロック位置を特定する。この解析は、まず投影輝度データ２６を適当な初期閾値で２値化する（Ｓ１２）。次に、以下の区間判定処理（Ｓ１４）を行う。まず、２値化データから１が連続する区間を調べ、その長さが一定値、例えばブロック２０の長さより短い一定距離以下であったなら、その区間を０に置き換える。次に２値化データから０が連続する区間を調べ、その長さが一定値、例えば一つのブロック２０の長さより短い一定距離以下ならばその区間を１に置き換える。

さらに、２値化データから１が連続する区間を調べ、その長さが前記１が連続する区間よりも長い一定値、例えばブロック２０の幅以下ならばその区間を０にする。これにより、ブロック２０以外のノイズ成分による２値化データ１を除去することができる。

こうして得られた最終的な投影輝度データ２６の、１が連続する区間をその投影面に対するブロック位置候補とする（Ｓ１６）。ここでの区間判定の各パラメータは、スポット１８の数、ブロック２０の幅、スポット１８の平均径などから決定することができる。最後に、ブロック位置候補の数と各ブロック位置候補の幅から、ブロック位置候補の妥当性を判定する（Ｓ１８）。そして、妥当ではない場合、初期閾値を変更し再び投影輝度データ解析を行う。妥当な場合、ブロック位置候補を、当該投影方向でのブロック位置とする。

同様にして、マイクロアレイ画像１６の高さが幅より大きい場合は、水平投影輝度データ、そうではない場合垂直投影輝度データを作成し、前述と同様に解析を行い、垂直投影輝度データ及び水平投影輝度データについて、ブロック位置候補を決定する。そして、最終的に、水平方向、垂直方向それぞれのブロック位置が得られ、その交差領域がブロック位置と判定できる。

この実施形態のマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法によれば、マイクロアレイ画像にある大域的または局所的に分布するノイズの影響を受け難くいものである。また、２波長を同時に測定する方法の場合も、２画像の相関を考慮した投影解析を行うことで、信頼性の高いブロック位置検出を自動的に行うことができるものである。

この発明の一実施形態のマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法を示すフローチャートである。 この実施形態のブロック位置検出方法による２値化を示すフローチャート(ａ)と模式図（ｂ）、（ｃ）である。 この実施形態のブロック位置検出方法により、２値化データから投影輝度データを得る様子を示すフローチャート(ａ)と模式図（ｂ）である。 この実施形態のブロック位置検出方法による投影輝度データから妥当性を判断するフローチャートである。 マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法に用いるコンピュータとディスプレイを示すものである。

符号の説明

１０ コンピュータ
１２ ディスプレイ
１４ ポインティングデバイス
１６ マイクロアレイ画像
１８ スポット
２０ ブロック
２１ 区画線
２２，２３ 小領域
２４ ２値化データ
２６ 投影輝度データ

Claims (4)

1. 基板上にマトリクス状にスポットが形成されたマイクロアレイを撮影したマイクロアレイ画像を処理して、ブロック位置を自動的に検出するブロック位置検出方法において、前記マイクロアレイ画像のデータの各画素を２値化するステップと、前記２値化した画素の値について、前記ブロックの互いに直交する各辺の方向に投影するように累積した投影輝度データを生成するステップと、前記投影輝度データを所定の閾値で２値化し、前記閾値以上若しくは以下の前記投影輝度データが連続する区間について前記ブロック幅を基準に前記投影輝度データが連続するか否かを判定し、前記判定を基に前記ブロックの範囲を決定するステップにより前記ブロック位置を自動的に検出することを特徴とするマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法。
2. 前記マイクロアレイ画像のデータの各画素を２値化するステップは、前記マイクロアレイ画像を互いに直交する複数の区画線により小領域に分割し、前記小領域ごとに閾値を設定し、この閾値に基づいて前記マイクロアレイ画像の各画素の２値化を行うことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法。
3. 前記２値化は、前記小領域をその幅の半分だけ縦方向及び横方向に移動させた他の小領域にも分割し、これら２系統の小領域の群それぞれについて前記閾値を決定し、その閾値に基づいて前記マイクロアレイ画像の２値化を行うとともに、前記２系統の小領域の各閾値のうち、その２値化対象画素の輝度がいずれか一方の閾値以上であった場合、その画素の２値化した値を閾値以上、そうでない場合はその画素の２値化した値を閾値以下とすることを特徴とする請求項２記載のマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法。
4. 前記マイクロアレイ画像は、異なる２波長の光により撮像したデータであり、そのデータの各画素のその画素の輝度がいずれか一方でも閾値以上であった場合、その画素の２値化した値を閾値以上とし、そうでない場合はその画素の２値化した値を閾値以下とすることを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイ画像のブロック位置検出方法。
   
   

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