WO2007013551A1

WO2007013551A1 - 光強度測定方法および光強度測定装置

Info

Publication number: WO2007013551A1
Application number: PCT/JP2006/314870
Authority: WO
Inventors: Kaneyasu Okawa; Yuko Saida; Takami Shibazaki
Original assignee: Olympus Corporation
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-27
Publication date: 2007-02-01
Also published as: EP1912060A1; US20080181458A1; JPWO2007013551A1

Abstract

　あらかじめ規定された面積を有する検出対象領域が複数配列された検出対象物の画像を取得し、この取得した画像を解析して、各検出対象領域の光強度を測定する方法であって、取得した画像から光強度に基づいて抽出される領域のうち、前記検出対象領域の規定面積よりも小さな面積からなる領域をノイズ領域として抽出し、前記画像から除去する。光強度測定装置は、上記検出対象物に光を照射する光照射手段と、前記光が照射された前記検出対象物の画像を取得する画像撮影手段と、取得した画像を記憶する記憶手段と、記憶した画像から前記検出対象領域の規定面積よりも小さな面積からなる領域をノイズ領域として抽出する抽出手段と、前記ノイズ領域を前記記憶した画像から除去する画像処理手段とを有する。

Description

明細書

光強度測定方法および光強度測定装置

技術分野

[0001] 本発明は、生体関連物質等を検出するためのプローブ分子が固定化された固相担体上で生化学的反応を行い、その反応状態を蛍光等の光強度として検出する際に、信頼性の高!、解析結果を取得する光強度測定方法および光強度測定装置に関する。

本願は、 2005年 7月 29日に出願された特願 2005— 220358号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

背景技術

[0002] 生体関連物質等を検出する方法として、例えば、固相担体に複数のプローブ分子を固定ィ匕した複数の領域 (以下、スポットと略記する）を有するマイクロアレイを用いる方法が知られている。例えば、細胞中の核酸発現量変化を測定する場合には、測定対象の細胞力核酸を取り出し、この核酸を蛍光物質によって標識した後、マイクロアレイ上に固定ィ匕されたオリゴ DNAからなるプローブ分子と反応させ、蛍光物質を励起することができる光を照射してマイクロアレイの画像を取得し、画像を構成する光強度データを解析することによって、スポットごとに蛍光強度を測定する。この蛍光強度を比較することにより、比較対象サンプル間の核酸発現量比を求めることができる。このようにして、遺伝子の発現の状態やゲノム上における特定の遺伝子の有無、遺伝子の変異有無などを調べることが可能である（例えば、特許文献 1、特許文献 2参照)。

[0003] よって、マイクロアレイを用いて生体関連物質等を精度良く検出するためには、スポットの光強度を精度よく検出することが、大切な要素のひとつとなる。

しかし、核酸の標識に蛍光物質を用いる場合には、励起光を反射したり、蛍光を発するような異物が存在すると、マイクロアレイの画像にスポット像以外に、異物からの光の検出によるノイズ像を形成してしまうため、スポットの光強度測定値に誤差を生じてしまう。また、スポット上に光を遮る物体が存在すると、スポットからの光が光検出器に到達しないので、光強度の値に誤差を生じることとなる。（これらのノイズ像を、以下ではノィズ領域と記載する。 )

これに対して特許文献 1および特許文献 2で開示されてヽる発明では、スポットを検出するシステムが開示されている力いずれもスポットの光強度の解析に関してのみ述べられており、その他のノイズ領域による測定誤差の影響については考慮されたものではない。よって、必ずしも精度のよい検出が可能な方法であるとはいえない。

[0004] これに対して、上記のようなノイズ領域による測定誤差の影響を考慮した発明が開示されている (特許文献 3参照)。この発明は、測定対象の蛍光物質を励起する光とは異なる波長の光を照射してノイズ領域の検出を行ヽ、得られた画像力ノイズ領域を除去するという方法である。

特許文献 1 :特開 2000— 121559号公報

特許文献 2 :特開 2002— 181709号公報

特許文献 3：特開 2002— 257730号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] しかし、特許文献 3で開示されて、る発明によれば、測定対象の蛍光物質を励起する光とは異なる波長の光で検出できたノイズ領域に関しては、その測定精度に与える影響を排除できるが、マイクロアレイ上のすべてのノイズ領域を検出できるとは限らず

、十分な測定精度が得られる保証はない。

[0006] 本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、生体関連物質等のマイクロアレィによる検出に際して、マイクロアレイを精度よく解析するために、ノイズ領域の抽出が可能であり、その大きさや光強度から、スポットとノイズ領域との分離を精度良く行うことができる光強度測定方法および光強度測定装置を提供することを課題とする。課題を解決するための手段

[0007] 上記課題を解決するため、本発明は、

あらかじめ規定された面積を有する検出対象領域が複数配列された検出対象物の画像を取得し、この取得した画像を解析して、各検出対象領域の光強度を測定する光強度測定方法であって、

取得した画像力光強度に基づいて抽出される領域のうち、前記検出対象領域の規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出し、前記画像から除去することを特徴とする光強度測定方法を提供する。

[0008] 好適には、前記検出対象領域は、化学発光物質もしくは蛍光物質を含む。

典型例として、前記検出対象物の画像を複数取得し、取得した画像ごとに、前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出し、除去する。

この場合、前記取得した画像に基づいて 2値ィ匕画像を作成して、該 2値化画像から前記ノイズ領域の抽出を行うようにできる。

典型的には、

，前記 2値ィ匕画像上の前記規定面積より小さな面積を有する領域のうち、周囲の光強度よりも明るい領域

，前記 2値ィ匕画像上の前記規定面積より小さな面積を有する領域のうち、周囲の光強度よりも暗い領域

を前記ノイズ領域とする。

好適には、前記複数の取得した画像の中から選択された 1枚の画像を用いて、前記ノイズ領域の抽出を行う。

典型例として、前記ノイズ領域の面積が、前記規定面積の 50%以下であり、また、前記ノイズ領域の個数が、 1000個以下となるように抽出を行う。

前記ノイズ領域を、一定量だけ膨張もしくは収縮させて力除去するようにしても良い。

前記ノイズ領域の光強度を、前記膨張処理もしくは収縮処理を行った後、該領域の外隣接画素の光強度のメディアン値と同等の光強度値に置き換えるようにしても良い

[0009] 典型例として、前記取得した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに、前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出し、除去する好適には、前記取得した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに 2 値化画像を作成して、該 2値化画像を用いて前記ノイズ領域の抽出を行う。

この場合、前記ノイズ領域を、前記 2値化画像上の前記規定面積より小さな面積からなる領域のうち、周囲の光強度よりも明るい領域としても良い。

前記検出対象物の画像を複数取得し、前記ノイズ領域の抽出に用いる画像を、これら取得した画像の中力選択するようにしても良、。

この、ノイズ領域の抽出に用いる画像として、その最大光強度値が、光検出器の A

D変換ビット数力も 2を引いた回数だけ 2を掛け合わせた値よりも大きい画像を採用するようにしても良い。

典型例として、前記ノイズ領域の面積が、前記規定面積の 0. 2倍以下の面積である。

[0010] また、前記ノイズ領域を、一定量だけ膨張させてから除去するようにしても良い。

この場合、前記膨張処理を行った後、膨張された領域の外隣接画素における光強度のメディアン値を算出するようにしても良、。

この場合の好適例として、

前記取得した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに 2値化画像を作成し、

該 2値化画像を生成した光強度閾値と、前記膨張領域の外隣接画素における光強度のメディアン値との差が、画像の取得に用、た光検出器の画素ノイズの標準偏差の 2倍より大きいものを、前記ノイズ領域とする。

また、前記ノイズ領域の除去を、該ノイズ領域の光強度値から、画像の取得に用いた光検出器の画素ノイズの標準偏差の 2倍の値を差し引くことにより行うようにしても良い。

[0011] また、典型例として、前記部分領域ごとに、所定の光強度閾値に基づいて、前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出する。

この場合、前記部分領域ごとに所定の光強度閾値に基づいてノイズ領域を抽出する過程を、該部分領域ごとに光強度閾値を変化させて複数回行うようにしても良い。

[0012] また、好適例として、前記検出対象物の画像を複数取得し、取得した画像ごとに、所定の光強度閾値に基づいて前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出して除去し、

上記ノイズが除去された各画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに、所定の光強度閾値に基づいて前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出し、除去する。

この場合、前記部分領域ごとに所定の光強度閾値に基づいてノイズ領域を抽出する過程を、該部分領域ごとに光強度閾値を変化させて複数回行うようにしても良い。これによれば、初めに画像全体に対して 1つの閾値で抽出できるノイズ領域を除去することにより、高速処理を行った後、部分領域ごとに新たに閾値を設定してノイズ領域を抽出し、ノイズ領域が検出されなくなるまでノイズ処理を繰り返すことが可能である。従って、高速かつ高精度なノイズ領域の除去が可能になる。

[0013] 本発明はまた、あらかじめ規定された面積を有する検出対象領域が複数配列された検出対象物の光強度を測定する光強度測定装置であって、

前記検出対象物に光を照射する光照射手段と、

前記光が照射された前記検出対象物の画像を取得する画像撮影手段と、取得した画像を記憶する記憶手段と、

記憶した画像力前記検出対象領域の規定面積よりも小さな面積力なる領域をノィズ領域として抽出する抽出手段と、

前記ノイズ領域を前記記憶した画像から除去する画像処理手段と、

を有することを特徴とする光強度測定装置を提供する。

典型例として、前記抽出手段が、前記記憶した画像ごとにノイズ領域を抽出する手段であり、前記画像処理手段が、前記記憶した画像ごとにノイズ領域を除去する手段である。

別の典型例として、前記抽出手段が、前記記憶した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとにノイズ領域を抽出する手段であり、前記画像処理手段が、前記部分領域ごとにノイズ領域を除去する手段である。

発明の効果

[0014] 本発明によれば、マイクロアレイの画像中に存在するすべてのノイズ領域に関して、その抽出と除去処理が可能であるため、より精度の高い解析結果を得ることができる。また、本発明の方法によって、自動的にノイズ除去を行うことが可能であるため、ノイズ領域除去を自動化すれば、実験者ごとのデータのばらつきが出ることがなぐ再現性の高いデータ取得が可能であり、同時に実験者が画像処理を手動で行う負荷が軽減できるため、解析効率の大幅な向上が可能である。

図面の簡単な説明

[図 1]本発明の第一の実施形態のフローを示す図である。

[図 2]同様に、第一の実施形態のフローを示す図である。

[図 3]本発明の第二の実施形態のフローを示す図である。

[図 4]同様に、第二の実施形態のフローを示す図である。

[図 5A]所定の露光条件で撮影したマイクロアレイ上の各スポットの画像例を示す平面図である。

[図 5B]図 5Aよりも長い露光時間で撮影した、同じマイクロアレイ上の各スポットの画像例を示す平面図である。

[図 5C]図 5Bよりも長い露光時間で撮影した、同じマイクロアレイ上の各スポットの画像例を示す平面図である。

[図 5D]図 5A〜図 5Cにより得られる、最適露光条件で撮影した、同マイクロアレイ上の各スポットを含む画像例を示す平面図である。

[図 6A]本発明における原画像の例を示す平面図である。

[図 6B]本発明における 2値ィ匕画像の作成例を示す平面図である。

[図 7]本発明で用いるマイクロアレイ上の各スポットの階調プロファイルの一例を示すグラフである。

[図 8A]黒ゾィズの実体例を示す図である。

[図 8B]図 8Aの撮像例と、それに対する収縮処理の原理を説明する図である。

[図 8C]図 8Aの撮像例に対する膨張処理の原理を説明する図である。

[図 9]本発明による光強度測定装置の一構成例を示す図である。

[図 10]第二の実施形態において、解析対象のスポット領域に対して設定される矩形画像の例を示す図である。

符号の説明 [0016] 1…画像選択工程、 2…ノイズ除去判断工程、 3… 2値化画像作成および膨張処理工程、 4· · 'ノイズ除去工程、 5 · · ·張り合わせ画像作成工程、 10· · '検出対象物、 11 · · ·光照射手段、 12· · ·光学系、 13 · · ·光検出器、 14· · ·記憶手段、 15 · "ソフトウェア (抽出手段、画像処理手段）、 16 · · -CPU, 17· "コンピュータ

発明を実施するための最良の形態

[0017] 以下、本発明を詳しく説明するが、本発明は、ここに示す例に何ら限定されるものではない。

(実施の形態における装置）

実施の形態における光強度測定装置（図 9参照）は、検出対象物であるマイクロアレイ（10)に光を照射する光照射手段（11)として、アークランプを備え、検出対象物の画像を取得する画像撮影手段として、光検出器である CCDカメラ（13)および検出対象物の像を CCD上に結像させるための光学系（12)を備えるとともに、取得画像を記憶する記憶手段（14)として、ランダムアクセスメモリ、ハードディスク等を備え、記憶した画像カゝらノイズ領域を抽出する抽出手順と、記憶した画像カゝらノイズ領域を除去する画像処理手順とを記述したソフトウェア（15 :本発明の抽出手段、画像処理手段として機能する）と、該ソフトウェアを実行する CPU (16：中央演算装置)を含んでなるコンピュータ（ 17)を備える。

したがって、該光強度測定装置を使用することによって、マイクロアレイの空間的な光強度分布を CCDカメラによって検出し、その画素ごとにアナログ—デジタル変換したデジタルデータ力なるデジタル画像としてマイクロアレイの画像を取得することができる。

すなわち、 CCDカメラを用いて光強度を測定する時には、光強度を AD変換し、階調として出力すること〖こなる。したがって、階調は光強度を示すこととなる。

[0018] (最適な露光条件で撮影された画像の取得）

生体関連物質は、一般にその種類によって、生体中での存在量に大きな差がある。例えば、遺伝子の発現量を解析する場合であれば、高発現から低発現までの遺伝子の存在量を正確に測定する必要がある。

[0019] したがって、マイクロアレイを用いた生体関連物質の存在量測定においては、 1つの基板上の異なる部分にスポット状に複数固定ィ匕したプローブ分子との反応を介して、光強度に変換して測定を行うため、生体関連物質の存在量に比例した高光強度のスポットと低光強度のスポットとが 1つのマイクロアレイ上に存在することになる。また、生体関連物質の存在量のダイナミックレンジは、一般的に CCDのダイナミックレンジよりも大き!、ので、一定の露光条件では光強度の測定に適切な（高光強度のスポットが飽和せず、低光強度のスポットが検出できる）画像を得ることは難しい。そこで、露光条件を変化させて、これらのスポットごとに最適な露光条件で撮影した画像を取得する必要性が出てくる。また、スポットの画像を表示する場合も、それぞれのスポットが、最適な露光条件で撮影された画像を表示することが望ましヽ。

[0020] その方法を、図 5A〜5Dに基づいて説明する。図 5A〜5Dは、一例として九つのスポットが載っているマイクロアレイの画像を示したものである。

一つのマイクロアレイ上のすべてのスポットについて、各々が、最適な露光条件で撮影された画像を取得するためには、露光時間を順次変化させながらマイクロアレイの画像を複数撮影し、各々のスポットについて、適切に撮影されている画像を選択する方法が考えられる。

[0021] 例えば、露光時間を順次倍にして撮影する方法について説明する。符号 11は、露光時間 1秒の画像、符号 12は露光時間 2秒の画像、符号 13は露光時間 4秒の画像である。

ここで、最適な露光条件とは、 CCDが飽和せず、スポットがなるべく明るく撮影される条件のことである。したがって、露光時間 1秒の画像 11の中から、最適な露光条件で撮影されたスポットとして抽出されるものは、四角で囲った第二スポット 15a、第六スポット 15bおよび第七スポット 15cの三つである。同様に、露光時間 2秒の画像 12の中から、最適な露光条件で撮影されたスポットとして抽出されるものは、第一スポット 1 6a、第五スポット 16b、第八スポット 16cおよび第九スポット 16dの四つである。さらに、露光時間 4秒の画像 13の中から、最適な露光条件で撮影されたスポットとして抽出されるものは、第四スポット 17aおよび第三スポット 17bの二つである。

すなわち、三通りの露光条件によって、マイクロアレイ上の九つすベてのスポットが、適切に撮影されたことになる。 [0022] このように、それぞれの露光条件で撮影された複数の画像から、スポットごとに露光状態を評価し、最適な露光条件で撮影された画像を使用して、スポットごとに光強度測定を行う。また、スポットの画像を表示する場合には、スポットごとに選択された画像からスポット像を抽出し、 1つにまとめた張り合わせ画像 14を表示する。このようにすることで、露光時間 1秒の画像 11では、 B音すぎて見えていなかったスポットがあり、露光時間 4秒の画像 13では、明る過ぎるスポットがあるが、張り合わせ画像 14のようにまとめることで、マイクロアレイ上のすべてのスポットが、最適な条件で観察できる画像が作成される。

このようにして、それぞれのスポットが最適な露光条件で撮影された複数枚の画像を用いて、解析を行う。

[0023] さら〖こ、取得した画像には、 CCDの電気的ノイズなどにより、スパイクノイズが多数存在する。このようなノイズが存在すると、ノイズ領域の抽出処理に時間を要してしまうため、ノイズ領域除去に先立ち、撮影した複数枚の全画像について、処理対象画素の近傍 8画素の階調平均値で処理対象画素の階調を置き換える平滑ィ匕処理を行うのが好ましい。

[0024] (化学発光物質、蛍光物質）

なお、本発明の光強度測定法および光強度測定装置においては、検出対象領域中に含まれる化学発光物質あるいは蛍光物質の発する光強度を測定するが、ここで言う化学発光物質としては、ルシフェラーゼ等のタンパク質あるいはルミノール等の非タンパク質を挙げることができ、また、蛍光物質としては、フルォレセイン、ローダミン、ァクリフラビン等を挙げることができる。

[0025] 以下、本実施形態では、このような撮影方法で複数枚得られたマイクロアレイ画像から、ノイズ領域を除去する方法について述べる。なお、露光時間条件は、 t

0を最小露光時間、撮影回数に一致する画像番号 nを変数として、 2^n_1t (sec)とする。

0

[0026] (リファレンス画像を用いたマイクロアレイ画像の補正）

また、本実施形態で用いるリファレンス画像とは、取得したマイクロアレイ画像の背景画像のことを示している。具体的には、本実施形態のリファレンス画像である背景画像は、マイクロアレイの画像に対して画像処理を施し、スポットを除いた画像を生成したものである。なお、このリファレンス画像の詳しい生成方法については、特開 200 4- 101354号公報に記載されて、る。

標識として蛍光物質を用いる場合には、蛍光物質を励起するために照明光が必要となるが、照明光が空間的にむらを有している可能性があり、リファレンス画像はこの照明のむらを反映した画像となる。よって、リファレンス画像を用いてマイクロアレイ画像に対して補正を施すことにより、励起照明光のむらを排除した画像を得ることが可能である。

[0027] なお、本実施形態では、マイクロアレイの画像から生成したリファレンス画像を用いて説明しているが、これに限らず、マイクロアレイ画像の背景を反映した画像を対象とすれば、どのようにして取得された画像を用いてもょ、。

[0028] [第一の実施形態]

第一の実施形態として、画像全体カゝらノイズ領域を抽出し、一度にノイズ領域を除去する方法にっ、て述べる。

はじめに、検出対象スポットの規定面積よりも小さい面積を有し、かつ周囲よりも明るヽ領域として存在するノイズ領域 (以下、白いノイズと呼ぶ）の処理方法にっヽて説明する。

[0029] (白いノイズの抽出に用いる 2値ィ匕画像の作成）

白いノイズを抽出するために、まず、 2値化画像を作成する。例えば、図 6Aに示すような取得した原画像 21に対して、光強度に相当する階調値が 500以上の領域を白とし、それ以外の領域を黒で示した画像が、 2値ィ匕画像 22である。原画像 21中の、線 21aを引いたスポットの列に関する、光強度プロファイルを図 7に示す。なお、図 7 の縦軸は検出領域の階調、横軸は検出領域の位置を示す。破線が、取得した原画像 21の光強度プロファイルを示し、実線が 2値ィ匕画像 22における同一部分の光強度プロファイルを示す。なお、図 7での 2値ィ匕画像 22の光強度プロファイルは、取得した原画像 21の光強度プロファイルと比較しやすいように、 500階調以上のレベルを 500階調で、それ以外のレベルを 0階調として表現して、る。

[0030] (白いノイズの抽出）

前記のように白いノイズとは、スポットの規定面積よりも小さい面積を有し、かつ周囲よりも明るい領域のことであり、例えば、図 7においては、領域面積がスポットよりも小さぐかつ階調が閾値である 500以上の領域を探せば良い。すると、白いノイズとして、第一領域 31および第二領域 32が抽出される。

このように 2値ィ匕画像を用いることで、検出対象スポットと白いノイズとを明確に区別することが可能となる。

[0031] (白いノイズの抽出に用いる画像の選択）

ただし、前記の通り、各検出対象スポットを最適の露光条件で撮影するために、露光時間の異なる複数枚の画像を撮影しており、これらのうちのどの画像を用いて、 2 値ィ匕画像の作成および白いノイズの抽出を行うか決める必要がある。

具体的には、原画像からスポットを除くことで生成したリファレンス画像の最大階調値よりもわずかに大きな値を閾値として 2値ィ匕画像を生成することによって、対象画像上のノイズ領域を検出する。この時、露光時間が長い方が有利である力露光時間が長すぎるとノイズ領域がスポットからの光の影響によって認識できなくなる可能性があるため、適切な露光条件の画像を選択する必要がある。

また、検出器自体のノイズを検出しな、ようにする必要がある。

[0032] そこでまず、 2値化画像の作成に用いる画像を決定するために、複数枚ある画像の中から、一番露光時間の長い画像から、

[0033] [数 1]

[0034] を満たすかどうかを判定する。ここで、 R はリファレンス画像の階調ヒストグラムにお max

いて、階調上位からの累積画素数が、全画素数の 0. 5%を越えない階調値、 nはリ

R

ファレンス画像作成のために使用した画像番号、 σは CCDカメラの画素のノイズの階調（レベル)の標準偏差、 Bは CCDの AD (アナログ—デジタル)変換分解能である変換ビット数、 nは撮影画像番号である。

すなわち、 Lは、背景部分の階調レベルと、検出器である CCDカメラのノイズ分と

G

を足し合わせたもので規定されている。また、ここでは、一番露光時間の長い画像について判定するので、 nは終了画像番号となる。算出された L の値が 2^B_3以下であれば、この画像を白いノイズの抽出に使用する

G

[0035] もし、前記条件で式（1)を満たさな!/、場合は、 nの値を順次小さくして、き、終了画像番号から開始画像番号まで、すなわち、露光時間が長い画像カゝら短い画像まで、式（1)の条件を満たす力どうか判定を行う。

このようにして、式（1)の条件を満たした画像を

[0036] [数 2]

! n(x- y) (2)

[0037] として、白いノイズを抽出するために用いる画像とする。もし、いずれの画像も条件を満たさない場合には、 nが最も小さい画像、すなわち開始画像を、白いノイズを抽出するために用いる画像とする。

[0038] (2値化画像の作成）

上記のように選択した画像 (2)から、階調 Lを閾値として 2値ィ匕画像

G

[0039] [数 3]

T' (x, y) (3)

[0040] を作成し、この 2値ィ匕画像（3)を用いて、白いノイズを抽出する。

[0041] (選択した画像からの白いノイズの抽出）

2値ィ匕画像（3)上の白い部分は、スポット領域か白いノイズのいずれかである。そこで、スポット領域の規定面積 Sは予め既知であるので、 2値ィ匕画像（3)上において、

0

Sの 50%以下の面積を有する白い部分を白いノイズとし、それ以外の白い部分をス

0

ポット領域として、選別を行う。この処理により、白いノイズの抽出が完了する。なお、抽出された白いノイズの個数を m個とする。

G

[0042] ただしこの時、白いノイズが 1000個以上抽出されると、この後のノイズ処理に長時間を要してしまうことなどが懸念される。よって、 1000個以上の白いノイズが抽出された場合には、閾値とする階調 Lを 16階調ずつ上げて 2値化画像の作成を行い、白

G

V、ノイズが 1000個以上抽出されな、閾値として階調 Lを決定するようにしてもよ!、。

G

また、階調 L (16階調ずつ 2値ィ匕レベルを上げた Lも含む）により、白いノイズがひとつも抽出されない場合も考えられ、この場合は、以降の白いノイズの除去処理は行わない。

[0043] (白いノイズの膨張処理）

次に、白いノイズの処理を行う準備として、階調 Lで抽出された白いノイズに対して

G

膨張処理を行う。

膨張処理とは、 2値ィ匕画像上の白い部分に対して白い部分を拡大し、その近傍も白ヽ部分とすることにより、元の白、部分の形をできるだけ維持したまま周囲を膨張させ、白い部分の面積を大きくする処理のことである。前記近傍は、元の白い部分の画素の一辺を共有する隣接した画素とする場合は 4近傍であり、元の白い部分の頂点を共有する隣接した画素とする場合は 8近傍であるが、前記膨張処理においては、 4近傍および 8近傍のいずれを用いてもよい。

この膨張処理を行うことで、ノイズ領域の境界検出の誤差を排除できるため、画像上力もノイズ領域に関する上記誤差の影響を完全に排除することが可能である。前記 2値化画像 (3)上の、 k番目の白いノイズを

[0044] [数 4] i k (x. y)

[0045] として、この k番目の白いノイズ (4)に対して膨張処理を行、、膨張処理を行った後の k番目の白いノイズを

[0046] [数 5]

[0047] として、（4)と置き換える。またこの時、膨張処理は、下記の式 (6)により算出される回数程度行うとよい。

[0048] [数 6]

[0049] ここで、 wは最小点像半径、 Δは光学系のデフォーカス量の絶対値、 Aは光学系の検出開口数、 Pは CCDカメラの画素ピッチ、 m はアレイ画像の平滑ィ匕回数であ

I AS

る。また Roundupは、数値を切り上げて整数にすることを表す。

すなわち、 m は、最小点像半径 (即ち、点像として認識可能な最小半径)および

Gd

デフォーカスに起因する光学的なボケと、画像の平滑ィ匕処理に伴うボケとを足し合わせたもので規定されており、この分だけノイズ領域を膨張させることで、光学的ボケ分が与える影響を考慮して、白いノイズを決定することが可能となる。

この処理を、すべての膨張処理後の k番目の白いノイズ（5)に対して、すなわち、 k =mとなるまで行った後、白いノイズの除去処理に移る。

G

[0050] (白いノイズの除去）

白いノイズの除去処理は、膨張処理後の k番目の白いノイズ (5)および該領域の外隣接画素の双方を、外隣接画素の階調のメディアン値で置き換えた画像

[0051] [数 7] ΐ ή'(χ. y) (7)

[0052] を作成することで行う。この処理により、白いノイズ部分の光強度が周囲と同等の光強度に処理されて、白いノイズが除去される。

[0053] 以上のような、前記白ノイズの除去操作を、解析に用いる複数枚すベての画像に対して行う。よって、撮影画像番号 nおよび白いノイズの番号 kを変数として、画像番号 n の画像中の膨張処理後の k番目の白いノイズ（5)のすべてに対して、前記除去処理を行う。即ち、選択した 1枚の画像力も抽出された全ての白いノイズ領域力全ての画像力除去される。

以上により、撮影画像すベての白いノイズの除去が完了する。

[0054] (黒いノイズの抽出に用いる画像の選択）

次に、検出対象スポットの規定面積よりも小さい面積を有し、かつ、周囲よりも暗い領域として存在するノイズ領域 (以下、黒、ノイズと呼ぶ）の処理方法にっ、て示す。黒いノイズを抽出するために、白いノイズの処理と同様に 2値ィ匕画像を作成する。まず、複数枚の画像を撮影しているので、そのうちのどの画像を用いて、黒いノイズを抽出するべきかを決める。この場合、 2値ィ匕画像の作成は、リファレンス画像の最大光強度よりわずかに小さい値を閾値として行い、また、検出器自体のノイズを検出しないようにする。

そこでまず、複数枚ある画像の中から、一番露光時間の短い画像に対して、

[0055] [数 8] ： -^{5 2 B}- ⁴

[0056] を満たす力どうかを判定する。ここで、式 (8)中の各パラメータ一は、前記式（1)で用いたものと同じである。即ち、 Lが 2^B_4以上である画像を選択する。

G

もし、前記条件で式 (8)を満たさない場合は、 nの値を順次大きくしていき、開始画像番号から終了画像番号まで、すなわち、露光時間が短い画像カゝら長い画像まで、式 (8)の条件を満たす力どうか判定を行う。

このようにして、式 (8)の条件を満たした画像を

[0057] [数 9] (x, y) (9)

[0058] とし、黒いノイズを抽出するために用いる画像とする。もしもいずれの画像も式 (8)の条件を満たさない場合には、 nが最も大きい画像、すなわち、終了画像を黒いノイズを抽出するために用いる画像とする。

[0059] (2値化画像の作成）

次に、上記のように選択した画像 (9)から、階調 Lを閾値とした 2値化画像

G

[0060] [数 10]

T' {x, y) (10)

[0061] を作成し、この 2値ィ匕画像（10)を用いて、黒いノイズを抽出する。

[0062] (選択した画像力の黒いノイズの抽出）

2値化画像（10)上での黒、部分は、スポット領域か黒ゾィズの、ずれかである。そこで、スポット領域の規定面積 Sは予め既知であるので、 2値ィ匕画像（10)におい

0

て、 Sの 50%以下の面積を有する黒い部分を黒いノイズとし、それ以外の黒い部分

0

をスポット領域として、選別を行う。この処理により、処理するべき黒いノイズの抽出が完了する。なお、抽出された黒いノイズの個数を m個とする。

G

[0063] ただしこの時、黒いノイズが 1000個以上抽出されると、この後のノイズ処理に長時間を要してしまうことなどが懸念される。よって、 1000個以上の黒いノイズが抽出された場合には、階調 Lを 16階調ずつ下げて 2値化画像の作成を行い、黒いノイズが 1

G

000個以上抽出されない閾値階調 Lを決定するようにしてもよい。また、階調 L (16

G G

階調ずつ 2値ィ匕レベルを下げた Lも含む）により、黒いノイズがひとつも抽出されない

G

場合も考えられ、この場合は、以降の黒いノイズの除去処理は行わなくてよい。

[0064] (黒いノイズの収縮処理）

次に、黒いノイズの処理を行う準備として、階調 Lで抽出された黒いノイズに対して

G

収縮処理を行う。

収縮処理とは、 2値ィ匕画像上の黒い部分に対して、その近傍を白い部分とすることにより、元の黒い部分の形をできるだけ維持したまま領域を縮小させ、黒い部分の面積を小さくする処理のことである。前記近傍は、元の黒い部分の画素の一辺を共有する隣接した画素とする場合は 4近傍であり、元の黒い部分の頂点を共有する隣接した画素とする場合は 8近傍であるが、前記収縮処理においては、 4近傍および 8近傍の!/、ずれを用いてもよ！、。

この収縮処理を行うことで、ノイズ領域の境界検出の誤差を排除できるため、画像上力もノイズ領域に関する上記誤差の影響を完全に排除することが可能である。前記 2値ィ匕画像（10)上の、 k番目の黒、ノイズを

[0065] [数 11]

Tk(x, y) (11 )

[0066] として、この k番目の黒ゾィズ（11)に対して収縮処理を行、、収縮処理を行った後の k番目の黒いノイズを

[0067] [数 12]

Tk(x, y) (12)

[0068] として、（11)と置き換える。またこの時、収縮処理は、前記式 (6)により算出される回数程度行うとよい。また、その理由は、前記白いノイズの膨張処理の場合と同様であり、これにより、光学的ボケ分が与える影響を考慮して、黒いノイズを決定することが可能となる。

この処理を、すべての収縮処理後の k番目の黒いノイズに対して、すなわち、 k=m となるまで行った後、黒いノイズの除去処理に移る。

G

[0069] (黒いノイズの除去）

黒いノイズの除去処理は、収縮処理後の k番目の黒いノイズ（12)および該領域の外隣接画素の双方を、外隣接画素の階調のメディアン値で置き換えた画像

[0070] [数 13]

! n (x, y) (13)

[0071] を作成することで行う。この処理により、黒いノイズ部分の階調が周囲と同等の階調に処理される。このような処理を全ての収縮処理後の黒いノイズに対して行うことにより、一つの画像にっ、て、黒、ノイズがすべて除去されたことになる。

[0072] なお、黒いノイズの除去にあたり、上記収縮処理に代えて、上述した白いノイズに適用したのと同様の膨張処理を行うことも可能である。

図 8Aは黒いノイズの実体、図 8Bは、それに対して得られる像と、収縮処理の原理を階調 (光強度）図により示したものである。図 8Cは、膨張処理の原理を階調 (光強度）図により示したものである。

図 8Bに示すように、収縮処理の場合、黒いノイズ領域は Aの領域力 Bの領域に狭められ、光学的ボケの影響で境界周辺で広がった光のデータが全て生力されるような処理が行われる。

また、図 8Cに示すように、膨張処理の場合、黒いノイズ領域は Aの領域力 Cの領域に広げられ、黒いノイズ領域が拡大されるが、これを外隣接画素の階調メディアン値で置き換えることによつても、黒いノイズを除去して同様の効果を得ることができる。

[0073] 以上のような、前記黒ノイズの除去操作を、解析に用いる複数枚すベての画像に対して行う。よって、撮影画像番号 nおよび黒いノイズの番号 kを変数として、収縮処理後の k番目の黒いノイズ（12)のすべてに対して、前記除去処理を行う。即ち、即ち、選択した 1枚の画像カゝら抽出された全ての黒いノイズ領域が、全ての画像から除去される。

以上により、撮影画像すベての黒いノイズの除去が完了し、これにより、すべてのノィズ領域除去操作が終了する。

以上、第一の実施形態におけるノイズ除去の方法を示すフローを図 1および図 2に示す（黒ゾィズにつ、ては、収縮処理の場合を示して、る）。

[0074] [第二の実施形態]

本実施形態は、マイクロアレイ上の各スポットに対して、個々のスポット領域ごとに閾値を変えながらノイズ領域を抽出し、その都度、ノイズ除去処理を繰り返して行うものである。

また、本実施形態では、黒いノイズが測定結果に与える影響は軽微であるので、処理時間短縮のためノイズ除去処理は、白いノイズに対してのみ行う。

[0075] 第一の実施形態で示したノイズの除去方法では、ノイズ領域は、スポット領域力も離間した領域であり、且つ、ある一つの閾値で抽出されるノイズしか除去することができず、例えば、図 7に示す、白いノイズの第三領域 33のように、スポット上に乗っているノイズ領域や、設定した閾値とは異なる閾値にぉヽてノイズ領域として抽出される領域については、除去することができない。よって本実施形態では、解析に影響を及ぼす可能性の高、白いノイズにっ、て、さらに精密に除去を行う方法を示す。

[0076] 具体的には、本実施形態では、マイクロアレイ上の各スポット領域に対して、複数枚の画像の中カゝら解析を行うのに最適な画像を抽出し、各スポット領域の画像において抽出されたノイズ領域に対して、スポットよりも十分に微小でスポット以外の領域を抽出し、抽出された領域が検出器の持つ光検出ノイズよりも大きな光強度であると判断された場合に、白いノイズとして除去を行うことを大まカゝな手順とする。

[0077] (白いノイズの抽出に用いる画像の選択）

まず、マイクロアレイ上のある一つのスポット領域について、複数枚の画像の中から解析を行うのに最適な一枚の画像を抽出する。解析を行うスポット領域の、図 10に示したような矩形画像を

[0078] [数 14]

「 04) [0079] とし、この画像における最大階調値を I とする。ここで、 iは、元の全体画像上に X— y

max

平面をとつた場合の χ方向のスポット位置、 jは y方向のスポット位置、 nは撮影画像番号を示している。また、 iの最大値を m、； jの最大値を mとする。

このスポット領域の、複数枚ある画像の中から、一番露光時間の短い画像 (即ち、 n が最小値の画像）に対して、

[0080] [数 15]

I maxz2 (15)

[0081] を満たす力どうかを判定する。ここで、 Bは CCDカメラの AD変換ビット数である。もしも満たした場合には、この時の nを撮影画像番号として解析に用いる画像に決定する満たさな力た場合には、条件を満たすまで nを大きくしていき、解析に用いる画像を決定する（画像選択工程)。なお、 nを最大にしても上記式（15)が満たされない場合には、 nが最大値の画像を解析に使用することとし、解析に用いる画像が決定したら nを n'に設定する。

[0082] (選択した画像における白いノイズの除去必要性の判定）

次に、前記式（15)を満たした画像は、白いノイズを除去する必要がある画像力どうかを検討する必要がある。そのためには、下記の式（16)および（17)で算出される値力解析に用、る画像の撮影画像番号 n ( = n ' )を用いて式（ 18)を満たすかどうかの判定を行う（ノイズ除去判断工程)。

[0083] [数 16]

^^ -^- \ ⁺2 a (16)

[0084] [数 17]

「L二 I —2 σ— （1 7)

[0085] [数 18]

「し〉 L_Gn (18) [0086] 式（18)を満たした場合のみ、白いノイズの除去を行えばよい。ここで、 R はリファ max レンス画像の階調ヒストグラムにおいて、階調上位からの累積画素数が、全画素数の 0. 5%を越えない階調、 nはリファレンス画像作成のために用いた画像番号、 tは最

R 0 小露光時間、 I は基本バックグランド値、 σは CCDカメラ自体の階調値の標準偏差

MB

、 Γ は初期値を 0とする変数である。ここで、基本バックグランド値とは、対象画像（即ち、選択した画像)の階調下位からの累積画素数が、全画素数の 0. 5%を越えな V、階調値を、対象画像を取得した時の露光時間で割った値である。

[0087] よって、式（16)は、光検出器 (即ち、 CCDカメラ）の光検出のばらつきを含めたバックグランド値を示しており、式（17)は、光検出器の光検出のばらつきを考慮したスポットおよび白いノイズの光強度を示している。そして、解析画像 (即ち、選択した画像）に関して、最大光強度値から Γ ずつ閾値を下げてスポットおよび白いノイズを探索し、その都度式（18)の判定を行い、この式が満たされた場合、即ち、スポットおよび白いノイズ力ノックグランドレベルに埋もれていないと判断された場合のみ、白いノィズの除去を行う。

[0088] (2値化画像の作成）

白いノイズの除去を行う必要があると判断されたら、階調 Γ において画像（14)の 2

し

値化画像を作成し (即ち、階調 Γ を 2値化の階調閾値とする）、

L

[0089] [数 19]

T _u 09)

[0090] とする（2値化画像作成工程)。白いノイズの面積は、検出対象スポットの面積よりも十分に小さいので、白いノイズの条件を 0. 2S以下とする。ここで、 Sは検出対象スポ

0 0

ットの規定面積である。前記 2値ィ匕画像（19)での 0. 2S以下の 2値化粒子画像を

0

[0091] [数 20]

T u (²⁰)

[0092] とし、前記 2値化画像 ( 19)と置き換える。

[0093] (白いノイズの膨張処理および除去必要性の判断）

このように抽出された白いノイズは、その光強度が、光検出器のばらつきよりも大きい場合にのみ、除去されればよいので、次にその判断を行う。

2値化粒子画像（20)において、（1〜複数個の）白いノイズのすべてに関して膨張処理を行う (膨張処理工程)。この膨張処理は、前記第一の実施形態で述べたものと同じであり、詳細な説明はここでは省略する。なお膨張処理は、下記の式（21)により算出される回数程度行うとよ！/ヽ。

[0094] [数 21]

[0095] ここで、 wは最小点像半径 (即ち、点像として認識可能な最小半径）、 Δは光学系

0

のデフォーカス量の絶対値、 Aは光学系の検出開口数、 Pは CCDカメラの画素ピッ

S I

チ、 m はアレイ画像の平滑ィ匕回数である。式 (21)により算出される回数程度の膨

AS

張処理を行うことにより、白いノイズ部分の光学的ボケ分をも考慮して、除去が必要な白いノイズを決定することが可能となる。

[0096] 前記膨張処理を行った領域の外隣接画素群において、その画素群の Γ におけるメディアン値を Mとする。そして、白いノイズの 2値化粒子画像（20)が、

[0097] [数 22]

「し— Μ_η>2 σ (22)

[0098] の条件を満たす時、除去処理が必要な白ゾィズと判断する。

この判定を行うことにより、 Γ において抽出した白いノイズの光強度力除去すべきノイズレベル以上力どうかを判定して、除去処理を行うこととなる。

[0099] (白いノイズの除去）

以上の処理で、除去すべき白いノイズが抽出された場合には、この白いノイズを除去する処理を行う（ノイズ除去工程)。この除去処理は、個々の除去対象の白いノイズを含む領域 Γ 内で、

[0100] [数 23]

「υ， _η→「υ, _η-2 σ (23) [0101] と画像を置き換えることで行う。この処理は、白いノイズを含む領域として抽出された領域を 2 σだけ暗くするものであり、これにより白いノイズ領域を周囲の光強度に近づけることができる。

[0102] ここでノイズ処理を行った画像が最終画像ではな、場合 (η≠η )は、最終画像 (η

max

=n )まで式（23)の処理を nを増加させながら繰り返す。これは、ノイズ領域処理を max

行うことではじめに設定した式（15)の条件を満たす解析対象画像が、すべてのノィズ処理を終了したときには変わる可能性があることを考慮し、はじめに抽出した画像よりも露光時間の長いすベての画像に対して処理を行うためである

[0103] (白いノイズの除去の繰返し）

n=n となり、 2値化粒子画像（20)上の白いノイズの除去処理がすべて終了した max

ら、引き続き、 2値ィ匕画像の閾値を 2 σ階調だけ下げて、再度前記操作をおこなう。そして、以降、同様の操作を繰返す。

このように、 2値ィ匕画像の閾値を 2 σ階調ずつ下げて、解析に用いるのに最適な画像の抽出、白いノイズの抽出および除去処理とを繰り返していくと、式（18)を満たさないレベルに到達する。これは、光検出器のノイズレベルまで白いノイズの除去が終了したことを意味するので、対象としたスポット領域に対するノイズ領域処理が完了したことになる。

[0104] 以上の処理で、対象としたスポット領域の白いノイズの除去が終了し、白いノイズがすべて除去された画像 Γ が得られる。

，

最終的には図 5の張り合わせ画像 14に示すような各スポット領域を貼り合わせた画像を作成した、ので、この貼り合わせた画像を I (χ' , y， )として、

HM

[0105] [数 24]

Ι ϋΜ (Χ' , Υ' ) l HM (X，. y' ) ⁺「i . j. n (24)

[0106] を作成する。

ここまでの操作で、対象としたスポット領域に対するすべての白いノイズの除去処理が終了する。ここで説明したノイズ除去をすベてのスポット領域に対して実行すればよい。

以上、第二の実施形態におけるノイズ除去の方法を示すフローを図 3および図 4に示す。

[0107] なお、前記の通り、本実施形態では、白いノイズの除去処理のみを行っているが、処理時間を問題にしない場合などは、第一の実施形態同様、黒いノイズの除去処理を追カ卩して行っても良い。

[0108] [第三の実施形態]

ここでは、上記の 2つの実施形態例に示した 2つのノイズ処理方法を組み合わせて適用することの効果について説明する。

第一の実施形態では、画像全体カゝらノイズ領域を抽出し、一度にノイズ領域を除去する方法について説明した。第二の実施形態においては、マイクロアレイ上の各スポットに対して、個々のスポット領域ごとに閾値を変えながらノイズ領域を抽出し、その都度、ノイズ除去処理を繰り返して実施する方法に関して説明を行った。

[0109] 第一の実施形態で示したノイズ除去方法では、ノイズ領域は、スポット領域力ゝら離間した領域であり、且つ、ある 1つの閾値で抽出されるノイズが除去される。この方法は、画像全体に対して、 1つの閾値で抽出できるノイズ領域を除去するので、高速での処理が可能である。一方、第二の実施形態で示したノイズ除去方法は、スポットごとに閾値を設定して、ノイズ領域を抽出し、ノイズ領域が検出されなくなるまでノイズ処理を繰り返すことによって、精密なノイズ領域の除去を可能にしている。

[0110] つまり、第一の実施形態で説明したノイズ除去方法は、高速処理に適しており、第二の実施形態は、精密処理に適している、といえる。このことから、ノイズ領域の除去に際して、第一の実施形態で示した方法によって、ノイズ領域の処理をした後、続いて第二の実施形態で示した方法によって、ノイズ除去を行えば、高速且つ、高精度なノイズ領域の除去が可能になる。

[0111] [光強度検出]

前記のようにノイズ領域を処理することによって、ノイズ領域を含まなヽマイクロアレィ画像を得ることができるので、得られた画像に対して特開 2002— 257730号公報に開示されているような方法によって、スポット領域の光強度を測定すればよい。

[0112] [光強度測定装置]

ここでは、光検出器として CCDを用いた光強度測定装置を用いた場合にっ、て説明したが、本発明はこれに限定されるものではなぐ CMD (チャージモジュレーションデバイス）、 PMT (フォトマルチプライヤ）、 PD (フォトダイオード)等を用いた場合にも適用することが可能である。例えば、レーザを光源に持ち PMTを光検出器として用いている市販の走査型顕微鏡を用いた場合についても、本発明を適用することが可能である。

[0113] 以上述べた通り、本発明の光強度測定方法により、マイクロアレイ上のノイズを高い精度で除去できるため、生体関連物質等の検出をより精密に行うことができ、また、一連の解析を自動で行うことができるので、高い再現性が得られると同時に、高い効率で解析を行うことが可能となる。

産業上の利用可能性

[0114] 本発明は、マイクロアレイ上で生体関連物質等を高い精度で検出する方法を提供するものであり、例えば、遺伝子の発現の状態やゲノム上における特定の遺伝子の有無、遺伝子の変異の有無等を効率的かつ精密に調べることが可能であるため、医療産業等において極めて有用なものである。

Claims

請求の範囲

[1] あらかじめ規定された面積を有する検出対象領域が複数配列された検出対象物の画像を取得し、この取得した画像を解析して、各検出対象領域の光強度を測定する光強度測定方法であって、

取得した画像力光強度に基づいて抽出される領域のうち、前記検出対象領域の規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出し、前記画像から除去することを特徴とする光強度測定方法。

[2] 前記検出対象領域が、化学発光物質を含むことを特徴とする請求項 1に記載の光強度測定方法。

[3] 前記検出対象領域が、蛍光物質を含むことを特徴とする請求項 1に記載の光強度測定方法。

[4] 前記検出対象物の画像を複数取得し、取得した画像ごとに、前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出し、除去することを特徴とする請求項 1 に記載の光強度測定方法。

[5] 前記取得した画像に基づいて 2値ィ匕画像を作成して、該 2値化画像から前記ノイズ領域の抽出を行うことを特徴とする請求項 4に記載の光強度測定方法。

[6] 前記 2値ィ匕画像上の前記規定面積より小さな面積を有する領域のうち、周囲の光強度よりも明るい領域を前記ノイズ領域とすることを特徴とする請求項 5に記載の光強度測定方法。

[7] 前記 2値ィ匕画像上の前記規定面積より小さな面積を有する領域のうち、周囲の光強度よりも暗い領域を前記ノイズ領域とすることを特徴とする請求項 5に記載の光強度測定方法。

[8] 前記複数の取得した画像の中から選択された 1枚の画像を用いて、前記ノイズ領域の抽出を行い、この抽出結果に基づき、前記取得した画像ごとのノイズ領域の抽出及び除去を行うことを特徴とする請求項 4に記載の光強度測定方法。

[9] 前記ノイズ領域の面積が、前記規定面積の 50%以下であることを特徴とする請求項 4に記載の光強度測定方法。

[10] 前記ノイズ領域の個数力 1000個以下となるように抽出することを特徴とする請求項 4に記載の光強度測定方法。

[11] 前記ノイズ領域を、一定量だけ膨張させて力除去することを特徴とする請求項 4に記載の光強度測定方法。

[12] 前記ノイズ領域を、一定量だけ収縮させて力除去することを特徴とする請求項 4に記載の光強度測定方法。

[13] 前記ノイズ領域の光強度を、前記膨張処理を行った後、該領域の外隣接画素の光強度のメディアン値と同等の光強度値に置き換えることを特徴とする請求項 11に記載の光強度測定方法。

[14] 前記ノイズ領域の光強度を、前記収縮処理を行った後、該領域の外隣接画素の光強度のメディアン値と同等の光強度値に置き換えることを特徴とする請求項 12に記載の光強度測定方法。

[15] 前記取得した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに、前記規定面積よりも小さな面積カゝらなる領域をノイズ領域として抽出し、除去することを特徴とする請求項 1に記載の光強度測定方法。

[16] 前記取得した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに 2値化画像を作成して、該 2値ィ匕画像を用いて前記ノイズ領域の抽出を行うことを特徴とする請求項 15に記載の光強度測定方法。

[17] 前記ノイズ領域を、前記 2値ィ匕画像上の前記規定面積より小さな面積力もなる領域のうち、周囲の光強度よりも明るい領域とすることを特徴とする請求項 16に記載の光強度測定方法。

[18] 前記検出対象物の画像を複数取得し、前記ノイズ領域の抽出に用いる画像を、これら取得した画像の中から選択することを特徴とする請求項 17に記載の光強度測定方法。

[19] 前記ノイズ領域の抽出に用いる画像として、その最大光強度値が、光検出器の AD 変換ビット数力 2を引いた回数だけ 2を掛け合わせた値よりも大きい画像を採用することを特徴とする請求項 18に記載の光強度測定方法。

[20] 前記ノイズ領域の面積が、前記規定面積の 0. 2倍以下の面積であることを特徴とする請求項 15に記載の光強度測定方法。

[21] 前記ノイズ領域を、一定量だけ膨張させて力も除去することを特徴とする請求項 15 に記載の光強度測定方法。

[22] 前記膨張処理を行った後、膨張された領域の外隣接画素における光強度のメディアン値を算出することを特徴とする請求項 21に記載の光強度測定方法。

[23] 前記取得した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに 2値化画像を作成し、

該 2値化画像を生成した光強度閾値と、前記膨張領域の外隣接画素における光強度のメディアン値との差が、画像の取得に用、た光検出器の画素ノイズの標準偏差の 2倍より大きいものを、前記ノイズ領域とする

ことを特徴とする請求項 22に記載の光強度測定方法。

[24] 前記ノイズ領域の除去を、該ノイズ領域の光強度値から、画像の取得に用いた光検出器の画素ノイズの標準偏差の 2倍の値を差し引くことにより行うことを特徴とする請求項 15に記載の光強度測定方法。

[25] 前記部分領域ごとに、所定の光強度閾値に基づいて、前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出することを特徴とする請求項 15に記載の光強度測定方法。

[26] 前記部分領域ごとに所定の光強度閾値に基づいてノイズ領域を抽出する過程を、該部分領域ごとに光強度閾値を変化させて複数回行うことを特徴とする請求項 25〖こ記載の光強度測定方法。

[27] 前記検出対象物の画像を複数取得し、取得した画像ごとに、所定の光強度閾値に基づいて前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出して除去し、

上記ノイズが除去された各画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとに、所定の光強度閾値に基づいて前記規定面積よりも小さな面積力なる領域をノイズ領域として抽出し、除去することを特徴とする請求項 1に記載の光強度測定方法。

[28] 前記部分領域ごとに所定の光強度閾値に基づいてノイズ領域を抽出する過程を、該部分領域ごとに光強度閾値を変化させて複数回行うことを特徴とする請求項 27〖こ記載の光強度測定方法。

[29] あらかじめ規定された面積を有する検出対象領域が複数配列された検出対象物の光強度を測定する光強度測定装置であって、

前記検出対象物に光を照射する光照射手段と、

を有することを特徴とする光強度測定装置。

[30] 前記抽出手段が、前記記憶した画像ごとにノイズ領域を抽出する手段であり、前記画像処理手段が、前記記憶した画像ごとにノイズ領域を除去する手段であることを特徴とする請求項 29に記載の光強度測定装置。

[31] 前記抽出手段が、前記記憶した画像中の各検出対象領域を含んでなる部分領域ごとにノイズ領域を抽出する手段であり、前記画像処理手段が、前記部分領域ごとにノイズ領域を除去する手段であることを特徴とする請求項 29に記載の光強度測定装置。