JP2005308504A - バイオチップ測定方法およびバイオチップ読取装置 - Google Patents

Abstract

【課題】広いダイナミックレンジのサイトを持つバイオチップを正確に短時間で測定でき、バイオチップ全体の把握や比較が容易にできるバイオチップ測定方法およびバイオチップ読取装置を提供する。
【解決手段】バイオチップ測定方法では、多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置において、１つのバイオチップに対して、測定条件を変えて測定された明るさの異なる多数の測定画像を、各画像内のサイトの光量値により判定して、サイトごとの画像またはサイトごとの数値を組み合わせて編集し、前記バイオチップに対応する１つの合成データを得る。
バイオチップ読取装置は、多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置であって、上記バイオチップ測定方法を用いて合成画像を得るための処理を行う画像処理装置を備える。

【選択図】 図４

Description

本発明は、多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置に係り、ＤＮＡマイクロアレイなどのバイオチップを、広い測定領域にわたって広いダイナミックレンジで画像を測定するためのバイオチップ測定方法および装置の改良に関するものである。

バイオチップの広い測定領域全体にわたって画像を測定する装置に係る先行技術文献としては、例えば次のようなものがある。

特開２００１−３１１６９０号公報

図５および図６は、特許文献１に記載のバイオチップ読取装置の一例を示す要部構成図である。図５はスキャンレス型のバイオチップ読取装置、図６はＤＮＡチップが横方向（光軸に対して直角な方向）に走査されるスキャン型のバイオチップ読取装置である。

図５において、光源１０１から発生した励起光（例えば、レーザ光）はレンズ１０２により平行光となり、マイクロレンズアレイＭＡおよびアパーチャＡＰを介してレンズＬに入射して平行光となり、ダイクロイックミラー１０３に入射する。なお、マイクロレンズＭＬを有するマイクロレンズアレイＭＡは光量を増加させるために用いるものであり、なくても構わない。
ダイクロイックミラー１０３で反射した励起光は、対物レンズ１０６により集光され、ＤＮＡチップ８の試料面を照射する。

この照射光により試料は蛍光（励起光とは波長が異なる）を発する。その蛍光は再び対物レンズ１０６に逆戻りしダイクロイックミラー１０３に入射する。ダイクロイックミラー１０３を透過した試料からの蛍光は、蛍光以外の光を遮断するフィルタ５を通ってレンズ１０８に入る。このレンズ１０８によりＤＮＡチップ８の試料面の蛍光像が受光器１１１上に結像される。なお、受光器１１１としては例えばカメラ等が使用される。

図６に示すスキャン型のバイオチップ読取装置は、図５と同等の原理構成であるが、ＤＮＡチップ８を励起光の入射方向に対して直角方向（矢印ＭＶ方向）に走査する点、およびＤＮＡチップ８の基板として蛍光が透過できるガラスやプラスチック等で形成された基板を用い、ＤＮＡをこの基板上に（図では下側に）配置する点に違いがある。

このようなスキャンレス型またはスキャン型のバイオチップ読取装置を用いてＤＮＡチップ上の複数サイトの画像を読取ることができる。ただし、暗いサイトと明るいサイトが同一ＤＮＡチップ上にある場合は、励起光のパワーや、受光器のゲイン、受光器の受光時間などを変更して、飽和せずかつノイズに埋もれない画像が得られるように適宜調整している。

しかしながら、上記のような従来のバイオチップ読取装置では次のような課題があった。
（１）明るさのダイナミックレンジが広い場合、明る過ぎず暗過ぎず、適切な明るさの画像を得ることは困難である。
（２）励起光のパワーや、受光器のゲイン、受光器の受光時間を変更した場合、複数枚の画像間の相関関係を求めることが困難である。例えば、受光器にホトマルを使用すると、ゲインに非線形性があるため、同一試料を異なる条件で測定し、そのデータを用いてその都度画像間の関係を回帰計算等で求める必要がある。これは時間と精度の点で不利である。また、１つのサイトについて条件を変えて多数のデータが得られた場合には、どのデータを採用するのかが不明確である。

（３）さらに、画像から数値化しなくてはならないが、複数枚の画像から数値化の処理を行うため、時間がかかる。サイト数がＭ、１サイト当りＮ枚の画像の場合は、Ｍ×Ｎの処理となる。
（４）複数枚の画像を見比べる必要があり、１つのバイオチップとしての把握や比較がし難い。

本発明の目的は、このような課題を解決するもので、広いダイナミックレンジのサイトを持つバイオチップを正確に短時間で測定でき、バイオチップ全体の把握や比較が容易にできるバイオチップ測定方法およびバイオチップ読取装置を提供することにある。

このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１に記載のバイオチップ測定方法は、
多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置において、
１つのバイオチップに対して、
測定条件を変えて測定された明るさの異なる多数の測定画像を、各画像内のサイトの光量値により判定して、サイトごとの画像またはサイトごとの数値を組み合わせて編集し、前記バイオチップに対応する１つの合成データを得るようにしたことを特徴とする。
これにより、広いダイナミックレンジのサイトを正確に短時間で測定でき、かつバイオチップ全体の把握を容易にする。

この場合、請求項２のように、前記処理は、サイトごとの光量の飽和値またはノイズとの比較により判定し編集するようにしたことを特徴とする。
また、請求項３のように、前記編集は、光量の飽和値の比較により判定し編集する場合においては、サイトの光量値が飽和しているサイトを、より暗く測定された画像の当該サイトの画像と置換え、ノイズの比較により判定し編集する場合においては、サイトの明るさがノイズと同等と判定されるときは、より明るく測定した画像の当該サイトの画像に置き換えることを特徴とする。

また、請求項４のように、前記ノイズの判定に光量の分散値を用いることを特徴とする。
また、請求項５のように、前記処理は、先にサイトごとの画像の光量値に基づいて画像を編集し、その画像を数値化して、前記バイオチップに対応する一つの合成データとすることを特徴とする。
また、請求項６のように、前記処理は、先に多数の測定画像をすべて数値化した後に、そのサイトごとの数値に基づいて、サイトごとに数値の編集を行い、前記バイオチップに対応する一つのデータとすることを特徴とする。

また、請求項７のように、請求項６の前記処理は、数値を編集後に、サイトごとの画像編集を行って１枚の画像に再構成することを特徴とする。
また、請求項８のように、前記測定条件と画像の明るさの関係を測定前に校正しておくことを特徴とする。
また、請求項９のように、前記測定条件と画像の明るさの関係は、測定時に試料に混合したマーカ用の物質の明るさに基づいて校正することを特徴とする。

また、請求項１０のように、前記多数の画像の測定条件は、測定される多数の明るさが、等倍、または２のべき乗、または指数、または対数、または等比数列となるように選ぶことを特徴とする。
また、請求項１１のように、前記多数の測定画像としては、その多数の測定画像を相互に加減算を行って作成した中間合成画像を用いることを特徴とする。
また、請求項１２のように、前記測定条件を変えて測定された明るさの異なる測定画像とは、照射光パワーまたは受光器のゲインまたは測定時間の条件を変えて測定された測定画像であることであることを特徴とする。
また、請求項１３のように、前記バイオチップは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはタンパクまたは糖鎖またはメタボロームの、チップあるいはマクロアレイであることを特徴とする。

請求項１４に記載のバイオチップ読取装置は、
多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置であって、
前記請求項１ないし１３のいずれかに記載のバイオチップ測定方法を用いて合成画像を得るための処理を行う画像処理装置を備えたことを特徴とする。

以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）広いダイナミックレンジのサイトを正確に短時間で測定できる。
（２）同一チップ内のサイト全体の把握を容易にする。

以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。本発明は多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置およびバイオチップ測定方法に関するものである。

まず、本発明のバイオチップ測定方法について説明する。本発明では、測定条件を変えて測定された明るさの異なる多数の測定画像を、各画像内のサイトの光量値自身の値により判定して、サイトごとの画像またはサイトごとの数値を組み合わせて編集し、前記バイオチップに対応する１つの合成データとする。

以下測定の手順について説明する。
（１）バイオチップ読取装置のＤＮＡチップの搭載位置を動かさずに、条件（例えば撮像時間）を変えて複数枚の画像の測定を行う。
（２）ＤＮＡチップアレイ上のサイトの場所（局所位置）に関する既知の情報を用いて、各画像のサイト（励起光のスポット）の位置を確定しておく。

（３）各画像ごとに、すべてのサイトの光量を調べながら、下記の置き換えを行う。
（３．１）まず、最も明るく撮影された画像、例えば受光器としてCCDカメラを使用し、そのCCDカメラにより撮像時間T１秒（例えば30秒）で測定した画像、を用意する。
（３．２）その中で、光量が飽和したサイトを探し、当該サイトの画像（画像データ、あるいは単にデータともいう。以下同様）を、１段階暗く撮影された画像、例えば、撮像時間T2秒（例えば、１０秒）で測定した画像の同一サイトの画像と、サイト単位で、置換える。このとき、置換えたサイトおよび撮像時間（T1とT2）の情報をそれぞれ別途記録しておく。

（３．３）再び、光量が飽和したサイトを探す。すなわち、上記置換えを行ってもなお光量が飽和しているサイトを探す。光量飽和サイトについては、さらに１段階暗く撮影された画像、例えば撮像時間T3秒（例えば１秒）で測定した画像の同一サイトの画像と、サイト単位で、置換える。このとき、その情報（置換えたサイト、時間T1とT3）を別途記録しておく。
（３．４）これを繰り返し、すべてのサイトが飽和していない状態にする。必要なら、より暗くなる条件で再測定する。

（４）次に、上記の置換え画像と、記録しておいた情報を用いて、下記の処理を行う。
（４．１）所定の画像のダイナミックレンジ（例えば、１６bit）を勘案して、最も明るいサイトがこの最大階調（この場合は、65535）を超えないように変換率K1を決める。例えば、K1=0.9。
（４．２）この変換率k1と、各サイトの持つ時間情報（T1〜T3）を用いて、置き換え画像の各サイトの明るさを変換し、最終合成画像を作成する。
例えば、次のように明るさを減ずる。
T1で撮影して飽和しているサイトは、明るさを、k1×（T3÷T1）=0.9÷30倍にする。
T2で撮影して飽和しているサイトは、明るさを、k1×（T3÷T2）=0.9÷10倍にする。
T3で撮影されたサイトは、明るさを、k1倍にする。

これによって、T3などの暗く撮影されたときに撮像できなかった暗いサイトが、最終合成画像の画面では、確認できるようになる。これは、T3では大きかった背景ノイズが、T1のサイトにおいては小さく表現されるようになるためである。またT1などで飽和して比較できなかったサイトが最終合成画像の画面では、容易に光量比較ができるようになる。
さらに、この画像は１枚だけなので、数値化するための画像解析も１度行うだけで良く、また検量（校正）のための回帰計算等も不要である。

これによって、T3などの暗く撮像したときに撮像できなかった暗いサイトが、最終合成画像の画面では、確認できるようになる。これは、T3では大きかった背景ノイズが、T1のサイトにおいては小さく表現されるようになるためである。またT1などで飽和して比較できなかったサイトが最終合成画像の画面では、容易に光量比較ができるようになる。
なお、この最終合成画像は１枚だけなので、数値化するための画像解析は１度行うだけで済む。この場合、検量（校正）のための回帰計算等は全く不要である。

図１ないし図３に撮像画像および最終合成画像の具体例を示す。図１（ａ）は短時間撮像（T1）の画像である。図１（ｂ）は図１（ａ）中の丸囲みのサイトＡ、Ｂ、Ｃの明るさのレベル表示である。サイトＡとＢの明るさはノイズレベルと飽和光量レベルの間にあり、画像は観察でき、２つのサイトの明るさの差も分る。しかし、Ｃサイトの明るさはノイズレベル以下であるため画像は観察できない。

図２は長時間撮像（T2）の画像である。サイトＡ、Ｂ、Ｃの明るさは、図２（ｂ）に示すように、サイトＡとＢは共に飽和し、明るさの差は分らない。しかし、サイトＣは飽和光量とノイズの中間レベルであり、画像を観察できる。

このような２つの撮像画像を本発明の方法により画像処理すると、図３に示す合成画像が得られる。すなわち、最も明るく撮影された図２の画像において、光量が飽和したサイトＡ、Ｂの画像を、１段階暗く撮像した図１の画像の当該サイトの画像と置換える。図２（ａ）における他のサイトは飽和していないので、置換えはしない。その後、上述のように変換率K1を求め、この変換率K1と各サイトの持つ時間情報に基づいて置換え画像の各サイトの明るさを変換することにより図３（ａ）に示すような合成画像が得られる。
この場合、ノイズレベルは図３（ｂ）に示すようにサイトＡ、Ｂが大きく、サイトＣは小さくなっている。
なお、図３（ａ）中の円囲みＤの部分については後述する他の実施例で利用する部分であり、ここではその説明を省略する。

図４は本発明の方法を実現するためのバイオチップ読取装置の一実施例を示す要部構成図である。本実施例は、多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定する、図５に示すようなスキャンレス型のバイオチップ読取装置を用いた場合の実施例である。図５と異なる点は、受光器１１１としてカメラ１２０を用いた点と、画像処理装置２００を新たに付加した点である。

カメラ１２０は、試料面の蛍光像を設定された撮像時間で撮影することができるように構成されている。画像処理装置２００は、カメラ１２０の撮像時間を予め設定しておくと共に設定した時間で撮影できるようにカメラを駆動する制御手段と、撮像時間を順次変えて撮像したカメラ１２０の各画像を保存する記憶手段（図示せず）と、既知の情報に基づいて各画像のサイトの位置を検出するサイト位置検出手段（図示せず）と、保存した各画像を読み出して本発明の方法により合成画像を得るための処理を行う画像処理手段（図示せず）を有する。

このような構成における動作を次に説明する。光源１０１からの励起光が試料面に照射され、カメラ１２０で試料面の画像が撮影されるまでの間の動作については、図５に示す読取装置と同じであるので、その説明は省略する。以下本発明特有の動作についてのみ説明する。

試料面の画像の撮影に当っては、試料の位置を固定したままで行う。設定された撮像時間で次々と試料面の画像を撮影し、その画像を画像処理装置２００内に順次保存する。
また、画像処理装置２００では、バイオチップのサイトの場所についての既知の情報を用いて、各画像のサイトの位置を検出し確定しておく。
撮影後、各撮像画像ごとにすべてのサイトの光量を調べ、その内で最も明るく撮像された撮像画像を選び出す。そして、当該画像において、光量が飽和したサイトを探す。光量が飽和したサイトがあれば、当該サイトの画像を、１段階暗く撮像された画像の同一サイトの画像と置換える。置換えたときは置換え前後の画像の各撮像時間を当該サイトに関連付けて画像処理装置２００内に記憶しておく。

画像置換え後、画像処理装置２００はその置換え画像について再び光量が飽和したサイトがあるか探索する。なおも光量が飽和したサイトがあれば、上記と同様に１段階暗く撮影された画像の同一サイトの画像と置換える。置換え前後の画像の撮像時間を当該サイトに関連付けて記憶しておく。
このような置換え処理を、光量の飽和したサイトがなくなるまで繰返し行う。

次に画像処理装置２００は、置換え画像と、記録しておいた情報とを用いて、次の処理を行い、合成画像を作成する。
まず、所定の画像のダイナミックレンジを勘案して、最も明るいサイトが最大階調を越えないような変換率を決める。そして、この変換率と、各サイトの持つ時間情報を用いて、置換え画像の各サイトの明るさを変換し、合成画像を作成する。

なお、本発明の測定方法および読取装置では、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。以下列挙する。
（１）撮影した画像の明るさの違いは、撮像時間だけでなく、励起光（レーザ）のパワーやカメラ（受光器）のゲイン調整により実現しても良い。ただし、読取装置の測定条件の違いと明るさ（階調）の関係は事前に求めておく。

（２）画像の置換えは、実施例のように、明るく撮影された画像（例えば、撮像時間30秒の画像）から始めるのではなく、暗く撮影された画像(例えば、撮影時間１秒）から始めても良い。
その場合は、あるべき所にサイトが見あたらない、すなわちそのサイトの光量の平均値が試料のない場所で測定されるバックグラウンド（背景光）と同程度である場合、ノイズに埋もれていると考えられるため、そのサイトを一段階明るいサイトで置き換える。なお、ノイズに埋もれているかどうかの判定は、光量の標準偏差等のばらつきを用いて分散分析等を行うと、より正確に判定できる。

なお、背景光は、サイト以外の場所（図３（ａ）のＤ）を利用する以外に、サンプルと結合しないことが既知であるサイト（スポットをしていないサイト、あるいは明らかにサンプルには存在していない遺伝子等をスポットしてあるサイト）を利用しても良い。

（３）明るく撮影された画像（以下明るい画像という）と暗く撮影された画像（以下暗い画像という）の作り方は下記でも良い。
（３．１）画像の明暗を変化させるパラメータ（例えば、積算時間、レーザパワーなど）の数値を同一条件で複数回測定し、最も暗い画像はそのうちの１枚（例えば、撮像時間１秒で撮影した画像）を使用し、明るい画像としては、その画像を加算したものを順次使用する（例えば、１秒の画像を２枚加算したもの、１秒の画像を１０枚加算したものなど）。

（３．２）明るさを変えるパラメータを、明るさが２のべき乗となる条件のもとに選ぶ（例えば、１秒、２秒、４秒、８秒、１６秒など）。これらの系列で作られた画像は、明るさが２のべき乗のため、合成画面を作成するときの割算で、ビットシフト演算を利用できる（例えば、４で割ることは、16bit→14bitへの変換となる）。CPUを用いてこの演算を行うと、演算処理が高速で、かつ演算誤差も出にくい利点がある。
（３．３）上記パラメータ系列を、対数系列、指数系列、等比級数とすると、少ない画像枚数で広いダイナミックッレンジが得られる。

（３．４）上記の多数の画像間の加算を行って、新しい中間合成画像を作成してから判定を行っても良い。たとえば、２のべき乗や対数で測定した画像群の明るいサイトは、それまでに測定した暗いサイトの加算（加減算）を用いても良い。加算画像を使用しないと、最も明るい測定画像を採用した場合、暗い測定画像は捨てられることになるが、加算を行うことで余すところなく測定データを有効に用いることができる。
例えば、１秒、１０秒、３０秒の３つの測定画像がある場合は、
１秒、１０秒、１１秒（＝1秒+10秒）、３０秒、３１秒（＝30秒+1秒）、４０秒（＝30秒+10秒）、４１秒（＝30秒+11秒）という系列を作ることができる。なお、これに、９秒（＝10秒-1秒）などの減算画像を加えることも可能である。

（４）演算の順序については次のようにしても良い。
上記の方法では、画像を合成した後に数値化の処理を行っている。これによってサイトごとの数値化処理はＮ（枚）×Ｍ（サイト）回よりも大幅に激減できる。しかし、演算を先に行って、その演算結果に基づいて画像を再合成しても良い。この場合、演算の時間はかかるが、全体を１枚の画像によって把握しやすいという利点は生きる。

（５）読取装置の校正について
前記方法では測定前に測定条件と画像の明るさの関係を校正しておくが、測定サンプル液に測定前にマーカ分子等を混合し、そのマーカ分子により、測定時に測定条件の校正を行っても良い。

本発明に係る短時間撮像の画像の一具体例を示す図である。 本発明に係る長時間撮像の画像の一具体例を示す図である。 本発明の方法により作成された合成画像の一具体例を示す図である。 本発明の方法を実現するためのバイオチップ読取装置の一実施例を示す要部構成図である。 従来のスキャンレス型のバイオチップ読取装置の一例を示す要部構成図である。 従来のスキャン型のバイオチップ読取装置の一例を示す要部構成図である。

符号の説明

５ フィルタ
８ ＤＮＡチップ
１０１ 光源
１０２ レンズ
１０３ ダイクロイックミラー
１０６ 対物レンズ
１０８ レンズ
１２０ カメラ
２００ 画像処理装置
ＡＰ アパーチャ
Ｌ レンズ
ＭＡ マイクロレンズアレイ
ＭＬ レンズ

Claims (14)

1. 多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置において、
   １つのバイオチップに対して、
   測定条件を変えて測定された明るさの異なる多数の測定画像を、各画像内のサイトの光量値により判定して、サイトごとの画像またはサイトごとの数値を組み合わせて編集し、前記バイオチップに対応する１つの合成データを得るようにしたことを特徴とするバイオチップ測定方法。
2. 前記処理は、サイトごとの光量の飽和値またはノイズとの比較により判定し編集することを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
3. 前記編集は、光量の飽和値の比較により判定し編集する場合においては、サイトの光量値が飽和しているサイトを、より暗く測定された画像の当該サイトの画像と置換え、ノイズの比較により判定し編集する場合においては、サイトの明るさがノイズと同等と判定されるときは、より明るく測定した画像の当該サイトの画像に置き換えることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
4. 前記ノイズの判定に光量の分散値を用いることを特徴とする請求項３に記載のバイオチップ測定方法。
5. 前記処理は、先にサイトごとの画像の光量値に基づいて画像を編集し、その画像を数値化して、前記バイオチップに対応する一つの合成データとすることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
6. 前記処理は、先に多数の測定画像をすべて数値化した後に、そのサイトごとの数値に基づいて、サイトごとに数値の編集を行い、前記バイオチップに対応する一つのデータとすることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
7. 前記処理は、数値を編集後に、サイトごとの画像編集を行って１枚の画像に再構成することを特徴とする請求項６に記載のバイオチップ測定方法。
8. 前記測定条件と画像の明るさの関係を測定前に校正しておくことを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
9. 前記測定条件と画像の明るさの関係は、測定時に試料に混合したマーカ用の物質の明るさに基づいて校正することを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
10. 前記多数の画像の測定条件は、測定される多数の明るさが、等倍、または２のべき乗、または指数、または対数、または等比数列となるように選ぶことを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
11. 前記多数の測定画像としては、その多数の測定画像を相互に加減算を行って作成した中間合成画像を用いることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
12. 前記測定条件を変えて測定された明るさの異なる測定画像とは、照射光パワーまたは受光器のゲインまたは測定時間の条件を変えて測定された測定画像であることであることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
13. 前記バイオチップは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはタンパクまたは糖鎖またはメタボロームの、チップあるいはマクロアレイであることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ測定方法。
14. 多数のサイトを持つバイオチップのデータを画像によって測定するバイオチップ読取装置であって、
    前記請求項１ないし１３のいずれかに記載のバイオチップ測定方法を用いて合成画像を得るための処理を行う画像処理装置を備えたバイオチップ読取装置。