JP2021097648A - 核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法 - Google Patents

核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法 Download PDF

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Abstract

【課題】サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法を提供する。【解決手段】核酸配列計測装置は、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの添加によって蛍光を発する核酸配列計測用デバイスから発せられる蛍光を検出する検出部と、検出部の検出結果に基づいて、核酸配列計測用デバイスに対するサンプルの添加前又は添加直後の第１時点で、核酸配列計測用デバイスの予め規定された計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第１光量と、核酸配列計測用デバイスに対するサンプルの添加から予め規定された時間が経過した後の第２時点で、同じ計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第２光量との差に基づいてターゲットを計測する演算部と、を備える。【選択図】図３

Description

本発明は、核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法に関する。
サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する方法として、ＤＮＡチップ（上記特定の核酸配列の相補配列を有する検出プローブが基板等の固相面に設けられたもの）を用いる方法が広く知られている。この方法は、ＤＮＡチップに添加されたサンプルに含まれるターゲットが、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡチップの検出プローブに捕集される性質を利用してターゲットを計測する方法である。この方法では、ターゲットがサンプルに含まれるか否かに加えて、サンプルに含まれるターゲットの量を計測することができる。
以下の特許文献１には、上記の検出プローブとして、蛍光分子が付加された蛍光プローブと、蛍光分子の蛍光を消光する消光分子が付加された消光プローブとが設けられた核酸配列計測用デバイス（ＤＮＡチップ）を用いてターゲットを計測する方法が開示されている。この方法では、ターゲットに対する蛍光分子の付加、及びＤＮＡチップの洗浄（捕集されていないターゲット等を除去するための洗浄）を行うことなくターゲットを計測することが可能である。
特開２０１５−４３７０２号公報
ところで、上述した特許文献１に開示された核酸配列計測用デバイスを用いてターゲットを計測する方法では、消光分子による消光の不完全性や、蛍光のムラ(光量バラツキ）等が原因で、計測精度が悪化するという問題がある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲット（ＴＧ）を計測する核酸配列計測装置（１）において、前記ターゲットの添加によって蛍光を発する核酸配列計測用デバイス（ＤＶ）から発せられる蛍光を検出する検出部（１２）と、前記検出部の検出結果に基づいて、前記核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加前又は添加直後の第１時点で、前記核酸配列計測用デバイスの予め規定された計測領域（ＳＰ）から発せられる蛍光の光量を示す第１光量と、前記核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加から予め規定された時間が経過した後の第２時点で、前記計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第２光量との差に基づいて前記ターゲットを計測する演算部（２５）と、を備える。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記検出部が、少なくとも前記計測領域が含まれる画像取得領域（ＢＫ）の画像を取得する画像取得部（１２ａ）を備え、前記演算部が、前記第１時点で取得された前記画像取得領域の画像である第１画像及び前記第２時点で取得された前記画像取得領域の画像である第２画像の画像処理を行って、前記第１光量及び前記第２光量をそれぞれ求める。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記演算部が、前記画像処理として、前記第１画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の平均階調値を前記第１光量として求める処理（Ｓ１３）と、前記第２画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の平均階調値を前記第２光量として求める処理（Ｓ１４）とを行う。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記演算部が、前記第１画像と前記第２画像との画素毎の階調値の差が予め規定された第１閾値を超える画素を抽出し、前記第１画像の抽出した画素の平均階調値を前記第１光量として求める処理（Ｓ２６）と、前記第２画像の抽出した画素の平均階調値を前記第２光量として求める処理（Ｓ２７）とを行う。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記演算部が、前記第１画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の階調値の標準偏差を求め、前記標準偏差に基づいて前記第１閾値を設定する。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記演算部が、前記画像処理として、前記第１画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の各々の階調値と、前記第２画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の各々の階調値との差を、前記第１光量と前記第２光量との差として求める処理（Ｓ３３）を行う。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記演算部が、前記第１光量と前記第２光量との差が予め規定された第２閾値を超える画素を抽出し、抽出した画素の数に基づいて前記ターゲットを計測する。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記演算部が、前記第１画像に含まれる前記計測領域以外の領域の画像をなす画素の階調値の標準偏差を求め、前記標準偏差に基づいて前記第２閾値を設定する。
また、本発明の一態様による核酸配列計測装置は、前記画像取得部が、前記画像取得領域の画像を、異なる解像度で取得可能である。
本発明の一態様による核酸配列計測方法は、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲット（ＴＧ）を計測する核酸配列計測方法であって、前記ターゲットの添加によって蛍光を発する核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加前又は添加直後の第１時点で、前記核酸配列計測用デバイスの予め規定された計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第１光量と、前記核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加から予め規定された時間が経過した後の第２時点で、前記計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第２光量との差を求める第１ステップ（Ｓ１５、Ｓ２８、Ｓ３３）と、前記第１光量と前記第２光量との差に基づいて前記ターゲットを計測する第２ステップ（Ｓ１６、Ｓ２９、Ｓ３６）と、を有する。
本発明によれば、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる、という効果がある。
本発明の実施形態で用いられる核酸配列計測用デバイスの外観を模式的に示す斜視図である。 本発明の実施形態で用いられる核酸配列計測用デバイスの検出プローブを模式的に示す図である。 本発明の実施形態による核酸配列計測装置の要部構成を示すブロック図である。 第１核酸配列計測方法を示すフローチャートである。 第１核酸配列計測方法で取得される画像の一例を示す図である。 第２核酸配列計測方法を示すフローチャートである。 第２核酸配列計測方法で取得される画像の一例を示す図である。 ハイブリダイゼーション前後におけるスポット領域内の画素の階調値のバラツキ分布の一例を示す図である。 ハイブリダイゼーション前後におけるスポット領域内の画素の平均階調値及び標準偏差の一例を示す図である。 第３核酸配列計測方法を示すフローチャートである。 第３核酸配列計測方法で取得される画像の一例を示す図である。 変形例に係る核酸配列計測装置で取得される画像の一例を示す図である。 高解像度で撮影した場合の、ハイブリダイゼーション前後におけるスポット領域内の画素の階調値のバラツキ分布の一例を示す図である。
以下、図面を参照して本発明の実施形態による核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法について詳細に説明する。以下では、まず本発明の実施形態の概要について説明し、続いて本発明の実施形態の詳細について説明する。
〔概要〕
本発明の実施形態は、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させるようにするものである。例えば、サンプルに含まれるターゲットがごく僅かであっても、ターゲットの計測を可能にするものである。具体的には、サンプルが添加されてない場合でも核酸配列計測用デバイスから発せられる微弱な蛍光（オフセット光）や、蛍光のムラ(光量バラツキ）等の影響を極力排除することによって、高い計測精度を実現するものである。
上述の特許文献１に開示された核酸配列計測用デバイスは、蛍光分子が付加された蛍光プローブと、消光分子が付加された消光プローブとを有し、蛍光分子の蛍光が消光分子によって消光されるように蛍光プローブと消光プローブとが結合されたものである。この核酸配列計測用デバイスは、計測対象であるターゲットが添加されると、ハイブリダイゼーションにより、蛍光プローブと消光プローブとの結合が解消されて蛍光が発せられるようにされている。
このため、ターゲットが核酸配列計測用デバイスに添加されなければ、蛍光プローブに付加された蛍光分子の蛍光が、消光プローブに付加された消光分子によって消光されるため、核酸配列計測用デバイスからは蛍光が発せられない筈である。しかしながら、消光分子による蛍光の消光が不完全な場合には、核酸配列計測用デバイスからオフセット光が発せられてしまう。このようなオフセット光は、ノイズとなることから計測精度を悪化させてしまう。例えば、ターゲットが僅かである場合には、核酸配列計測用デバイスから発せられる蛍光も微弱なものとなるところ、この微弱な蛍光が、オフセット光に埋もれてしまうとターゲットの計測を行うことができない。
また、核酸配列計測用デバイスを用いてターゲットを計測する場合には、ハイブリダイゼーション前後において核酸配列計測用デバイスから発せられる蛍光の光量を比較する処理が行われる。つまり、ハイブリダイゼーション前に核酸配列計測用デバイスから発せられるオフセット光の光量と、ハイブリダイゼーション後に核酸配列計測用デバイスから発せられる蛍光の光量とを比較する処理が行われる。
従来は、ターゲットが含まれるサンプルが添加されるブロック（第１ブロック）以外に、ターゲットが含まれないサンプルが添加されるブロック（第２ブロック）が用意された核酸配列計測用デバイスを用いて上記の処理を行っていた。つまり、第２ブロックから発せられる蛍光（オフセット光）の光量と、第１ブロックから発せられる蛍光（ハイブリダイゼーション後に発せられる蛍光）の光量とを比較するようにしていた。
或いは、ターゲットが含まれるサンプルが添加される核酸配列計測用デバイスと、ターゲットが含まれないサンプルが添加される核酸配列計測用デバイスとを用いて上記の処理を行っていた。つまり、後者の核酸配列計測用デバイスから発せられる蛍光（オフセット光）の光量と、前者の核酸配列計測用デバイスから発せられる蛍光（ハイブリダイゼーション後に発せられる蛍光）の光量とを比較するようにしていた。
しかしながら、核酸配列計測用デバイスの製造バラツキ等が原因で、オフセット光の光量は、ブロック間、核酸配列計測用デバイス間でバラツキがある。このため、オフセット光の光量が相対的に少なければターゲットを計測することができるが、オフセット光の光量が相対的に大きくなるとターゲットを計測することができなくなるといったことが起こり得る。このように、ブロック間、核酸配列計測用デバイス間でのオフセット光の光量バラツキの大きさに応じて計測精度が悪化してしまう。
また、上述の特許文献１に開示された核酸配列計測用デバイスでは、スポット（上述した結合状態にある蛍光プローブ及び消光プローブが基板上に固定されている領域）から発せられる蛍光の光量バラツキもある。これは、スポット内におけるプローブの固定量や反応のムラ等が原因である。このようなスポット内における光量バラツキも、計測精度を悪化させる原因となる。
本発明の実施形態では、まず、核酸配列計測用デバイスに対するサンプルの添加前又は添加直後の第１時点で、核酸配列計測用デバイスの予め規定された計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第１光量と、核酸配列計測用デバイスに対するサンプルの添加から予め規定された時間が経過した後の第２時点で、計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第２光量との差を求める。そして、第１光量と第２光量との差に基づいてターゲットを計測するようにしている。
このように、本発明の実施形態では、第１時点で、ある計測領域から発せられる蛍光の第１光量と、第２時点で、上記と同じ計測領域から発せられる蛍光の第２光量との差を求めている。そして、第１光量と第２光量との差に基づいてターゲットを計測するようにしている。このため、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる。
〔実施形態〕
以下では、まず、核酸配列の計測に用いられる核酸配列計測用デバイスについて説明する。続いて、上記核酸配列計測用デバイスを用いて核酸配列を計測する核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法について順に説明する。
〈核酸配列計測用デバイス〉
図１は、本発明の実施形態で用いられる核酸配列計測用デバイスの外観を模式的に示す斜視図である。図１に示す通り、核酸配列計測用デバイスＤＶは、例えば、基板ＳＢ上に複数のスポットＳＰ（計測領域）が形成されたものである。基板ＳＢとしては、例えば、平面視形状が矩形形状に形成された板状のガラス、シリコン、フッ化カルシウム及びサファイア等の単結晶、セラミックス、及び樹脂材料等を用いることができる。樹脂材料としては、光学的特性、化学的及び熱的安定性に優れたＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）をはじめ、ＣＯＣ（環状オレフィンコポリマー）、ポリカーボネイト、アクリル系樹脂、ポリエチレン樹脂等が挙げられる。尚、基板ＳＢの平面視形状は任意の形状であって良い。
スポットＳＰは、計測対象であるターゲットの検出に用いられる検出プローブが固定されている領域である。このスポットＳＰは、予め規定された数を単位としたブロックＢＫ毎に区分けされている。核酸配列計測用デバイスＤＶに対するサンプルの添加は、ブロックＢＫ毎に行われる。また、核酸配列計測用デバイスＤＶの画像取得は、ブロックＢＫ毎に行われることが多い。つまり、ブロックＢＫは、画像取得領域であるということができる。
図２は、本発明の実施形態で用いられる核酸配列計測用デバイスの検出プローブを模式的に示す図である。図２に示す通り、検出プローブは、基板ＳＢ上に固定された蛍光プローブＰＢ１と消光プローブＰＢ２とからなる。蛍光プローブＰＢ１は、計測対象であるターゲットＴＧの相補配列に蛍光分子ＦＭを付加したものである。消光プローブＰＢ２は、蛍光プローブＰＢ１の上記相補配列と少なくとも一部が相補的な配列に消光分子ＱＭを付加したものである。
蛍光プローブＰＢ１と消光プローブＰＢ２とは、蛍光分子ＦＭの蛍光が、消光分子ＱＭによって消光されるように結合されている。図２に示す例では、蛍光プローブＰＢ１と消光プローブＰＢ２とは、結合部ＣＮで結合されている。ここで、蛍光分子ＦＭの蛍光は、蛍光共鳴エネルギー転移による消光の原理により、消光分子ＱＭによって消光される。
ターゲットＴＧが存在しない場合には、蛍光プローブＰＢ１と消光プローブＰＢ２とは結合部ＣＮで結合されており、蛍光分子ＦＭと消光分子ＱＭとは接近した状態にある。この状態では、励起光が照射されても蛍光分子ＦＭの蛍光が消光分子ＱＭによって消光されるため、蛍光は発せられない。
これに対し、ターゲットＴＧが存在する場合には、図２に示す通り、ターゲットＴＧの相補配列を有する蛍光プローブＰＢ１は、消光プローブＰＢ２と解離し、ターゲットＴＧと結合する。ターゲットＴＧが蛍光プローブＰＢ１と結合すると、蛍光プローブＰＢ１と消光プローブＰＢ２の結合が解消されて、蛍光分子ＦＭと消光分子ＱＭとが離間した状態になる。この状態になると、励起光の照射によって蛍光分子ＦＭから蛍光が発せられることになる。
尚、ターゲットＴＧの相補配列は、消光プローブＰＢ２に設けられていても良い。つまり、消光プローブＰＢ２は、ターゲットＴＧの相補配列に消光分子ＱＭを付加したものであり、蛍光プローブＰＢ１は、消光プローブＰＢ２の上記相補配列と少なくとも一部が相補的な配列に蛍光分子ＦＭを付加したものであっても良い。
〈核酸配列計測装置〉
図３は、本発明の実施形態による核酸配列計測装置の要部構成を示すブロック図である。図３に示す通り、本実施形態による核酸配列計測装置１は、検出装置１０及び演算装置２０を備えており、図１，２を用いて説明した核酸配列計測用デバイスＤＶを用いて、サンプルに含まれるターゲットの計測を行う。
検出装置１０は、温調ステージ１１及び検出部１２を備えており、核酸配列計測用デバイスＤＶから発せられる蛍光を検出する。温調ステージ１１は、核酸配列計測用デバイスＤＶを載置可能に構成されており、載置された核酸配列計測用デバイスＤＶの温度調整を行う。この温調ステージ１１は、核酸配列計測用デバイスＤＶの温度を常温に調整するために設けられる。これは、温度によって蛍光分子ＦＭの光量が変わることがあるためである。尚、温調ステージ１１は、ハイブリゼーション反応を促進するために、核酸配列計測用デバイスＤＶを振動又は回転等させることで、サンプルの撹拌が可能に構成されているのが望ましい。
検出部１２は、核酸配列計測用デバイスＤＶに励起光を照射して、核酸配列計測用デバイスＤＶから発せられる蛍光を検出する。この検出部１２は、励起光源（図示省略）と画像取得部１２ａとを備える。不図示の励起光源は、核酸配列計測用デバイスＤＶに照射する励起光を射出する。励起光源から射出される励起光は、例えば、図１に示すブロックＢＫ毎に照射される。不図示の励起光源としては、例えば、単波長のレーザ光又はそのエキスパンド光を射出するレーザ光源、ＬＥＤ（Light Emitting Diode：発光ダイオード）、白色光を放出するランプ、ＬＥＤと波長フィルタとの組合せからなる光源等を用いることができる。
画像取得部１２ａは、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device：電荷結合素子）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor：相補型金属酸化膜半導体）等の固体撮像素子を備えており、核酸配列計測用デバイスＤＶの画像（二次元画像）を取得する。画像取得部１２ａは、例えば、図１に示すブロックＢＫ毎に画像を取得する。
演算装置２０は、検出装置１０の検出結果に基づいて、ターゲットＴＧの計測を行う。具体的に、演算装置２０は、核酸配列計測用デバイスＤＶに添加されたサンプルにターゲットＴＧが含まれるか否かに加えて、サンプルに含まれるターゲットの量を計測する。この演算装置２０は、操作部２１、表示部２２、入出力部２３、格納部２４、及び演算部２５を備える。
操作部２１は、例えばキーボードやポインティングデバイス等の入力装置を備えており、演算装置２０を使用するユーザの操作に応じた指示（演算装置２０に対する指示）を演算部２５に出力する。表示部２２は、例えば液晶表示装置等の表示装置を備えており、演算部２５から出力される各種情報を表示する。尚、操作部２１及び表示部２２は、物理的に分離されたものであっても良く、表示機能と操作機能とを兼ね備えるタッチパネル式の液晶表示装置のように物理的に一体化されたものであっても良い。
入出力部２３は、検出装置１０の検出部１２に接続されており、検出部１２との間で各種データの入出力を行う。例えば、入出力部２３は、検出部１２に対して、不図示の励起光源から励起光を射出させるための制御データを出力する。また、入出力部２３は、検出部１２の検出結果（画像取得部１２ａで取得された画像のデータ）を入力して、演算部２５に出力する。尚、入出力部２３を温調ステージ１１に接続し、核酸配列計測用デバイスＤＶの温度調節を演算装置２０が行うようにしても良い。
格納部２４は、例えばＨＤＤ（ハードディスクドライブ）やＳＳＤ（ソリッドステートドライブ）等の補助記憶装置を備えており、各種データを格納する。例えば、格納部２４は、検出部１２から出力された画像データ、演算部２５の演算で必要となる各種データ、演算部２５の演算結果を示すデータ、その他のデータを格納する。尚、格納部２４は、例えば演算部２５の機能を実現するプログラムを格納しても良い。
演算部２５は、入出力部２３から出力される画像データを格納部２４に格納させる。また、演算部２５は、格納部２４に格納した画像データを読み出し、画像データの画像処理を行って、核酸配列計測用デバイスＤＶに添加されたサンプルに含まれるターゲットＴＧの計測を行う。具体的に、演算部２５は、ハイブリダイゼーション前後において、同じスポットＳＰから発せられる蛍光の光量変化量に基づいて、ターゲットＴＧの計測を行う。また、演算部２５は、検出部１２に対する制御データ（例えば、不図示の励起光源から励起光を射出させるための制御データ）を入出力部２３に出力する。尚、演算部２５で行われる処理の詳細は後述する。
演算部２５の機能は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit：中央処理装置）又はＭＰＵ（Micro Processing Unit：マイクロプロセッサ）が、格納部２４に格納されたプログラムを読み出して実行することによりソフトウェア的に実現されるものであっても良い。或いは、演算部２５の機能は、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）、ＬＳＩ（Large Scale Integration：大規模集積回路）、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit：特定用途向け集積回路）等のハードウェアを用いて実現されてもよい。
〈核酸配列計測方法〉
次に、本発明の実施形態による核酸配列計測方法について説明する。以下では、まず、スポットＳＰ内の蛍光のムラ(光量バラツキ）を考慮しない計測方法（以下、「第１核酸配列計測方法」という）について説明する。次に、スポットＳＰ内の蛍光のムラ(光量バラツキ）を考慮する２つの計測方法（以下、各々を「第２核酸配列計測方法」，「第３核酸配列計測方法」という）について説明する。
《第１核酸配列計測方法》
図４は、第１核酸配列計測方法を示すフローチャートである。尚、図４に示すフローチャートの処理が開始される前に、ターゲットＴＧが含まれるサンプルの調整が行われる。また、図１，２を用いて説明した核酸配列計測用デバイスＤＶを、核酸配列計測装置１の温調ステージ１１に準備する作業が行われる。以上の調整及び作業が終了すると、例えば、核酸配列計測用デバイスＤＶの複数のブロックＢＫのうちの１つ（以下、「対象ブロックＢＫ０」という）にサンプルが添加される。
核酸配列計測用デバイスＤＶにサンプルが添加されると、まず、サンプル添加直後の時点（第１時点）の画像（第１画像）を取得する処理が検出部１２で行われる（ステップＳ１１）。この処理では、演算装置２０の演算部２５から出力された制御データが、入出力部２３を介して検出部１２に入力される。これにより、検出部１２に設けられた不図示の励起光源から励起光が射出され、対象ブロックＢＫ０に照射される。そして、励起光が照射されている対象ブロックＢＫ０の画像を画像取得部１２ａで取得する処理が行われる。
ここで、サンプル添加直後とは、サンプルが添加されてからハイブリダイゼーションが殆ど進行していないとみなすことができる期間をいう。この期間は、サンプルが添加されても、核酸配列計測用デバイスＤＶから発せられる蛍光の光量が殆ど変化しない期間であるということもできる。尚、この期間は、核酸配列計測用デバイスＤＶの性質（蛍光プローブＰＢ１及び消光プローブＰＢ２の性質）やサンプルに含まれるターゲットＴＧの量に応じて変化する。このため、第１画像を取得するタイミングは、サンプル添加時点に極力時点であることが望ましい。
次に、サンプル添加から所定時間経過後の時点（第２時点）の画像（第２画像）を取得する処理が検出部１２で行われる（ステップＳ１２）。具体的には、温調ステージ１１によって核酸配列計測用デバイスＤＶの温度を上昇させてから、ハイブリダイゼーションが十分進行したと考えられる時間が経過した後に、対象ブロックＢＫ０の画像を画像取得部１２ａで取得する処理が行われる。
ここで、ハイブリダイゼーションが十分進行したと考えられる時間は、核酸配列計測用デバイスＤＶの性質（蛍光プローブＰＢ１及び消光プローブＰＢ２の性質）やサンプルに含まれるターゲットＴＧの量に応じて変化する。このため、例えば、予め実験を行って上記の時間を予め定めておくのが望ましい。
ステップＳ１１，Ｓ１２で取得された画像は、検出部１２から演算装置２０に出力される。尚、検出部１２は、ステップＳ１１，Ｓ１２で取得された画像を、各ステップが終了する度に個別に、演算装置２０に出力するようにしても良い。或いは、検出部１２は、ステップＳ１１で取得された画像を一時的に記憶しておき、ステップＳ１２の終了後に、ステップＳ１２で取得された画像とともに演算装置２０に出力するようにしても良い。検出部１２から演算装置２０に出力された画像は、演算装置２０の格納部２４に格納される。
次いで、格納部２４に格納された第１画像を読み出して画像処理し、スポットＳＰの各々から発せられる蛍光の光量（第１光量）を算出する処理が、演算装置２０の演算部２５で行われる（ステップＳ１３）。具体的には、ステップＳ１１で取得された画像（対象ブロックＢＫ０の画像）に対して画像処理を行って、スポット領域（スポットＳＰの画像であると推定される領域）を抽出する処理が行われる。そして、抽出したスポット領域の各々について、スポットＳＰの画像をなす各画素の平均階調値を第１光量として求める処理が行われる。
続いて、格納部２４に格納された第２画像を読み出して画像処理し、スポットＳＰの各々から発せられる蛍光の光量（第２光量）を算出する処理が、演算装置２０の演算部２５で行われる（ステップＳ１４）。具体的には、ステップＳ１２で取得された画像（対象ブロックＢＫ０の画像）に対して画像処理を行って、スポット領域を抽出する処理が行われる。そして、抽出したスポット領域の各々について、スポットＳＰの画像をなす各画素の平均階調値を第２光量として求める処理が行われる。
そして、ステップＳ１３で算出された平均階調値（第１光量）と、ステップＳ１４で算出された平均階調値（第２光量）との差（光量変化量）である光量変化量を算出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ１５）。つまり、ハイブリダイゼーション前後において、同じスポットＳＰから発せられる蛍光の光量変化量を算出する処理が行われる。
以上の処理が終了すると、サンプルに含まれるターゲットＴＧを計測する処理が演算装置２０の演算部２５で行われる（ステップＳ１６）。具体的には、核酸配列計測用デバイスＤＶに添加されたサンプルにターゲットＴＧが含まれるか否かが演算部２５によって判定される。また、サンプルに含まれるターゲットの量が演算部２５によって計測される。このようにして、サンプルに含まれるターゲットＴＧの計測が行われる。
図５は、第１核酸配列計測方法で取得される画像の一例を示す図である。図５（ａ）は、例えば、ハイブリダイゼーション前における対象ブロックＢＫ０の画像（第１画像）であり、図５（ｂ）は、例えば、ハイブリダイゼーション後における対象ブロックＢＫ０の画像（第２画像）である。
図５（ａ），（ｂ）において二次元状に配列されている円形領域は、対象ブロックＢＫ０内に設けられたスポットＳＰの画像（スポット領域）を示している。このスポット領域の色は、スポットＳＰから発せられる蛍光の光量が少ないほど階調値が小さくなり（黒色に近くなり）、スポットＳＰから発せられる蛍光の光量が多いほど階調値が大きく（白色に近くなる）。
図５（ａ）に示す通り、ハイブリダイゼーション前においては、スポット領域の各々の色はグレーになっている。これは、消光プローブＰＢ２に設けられた消光分子ＱＭによる消光の不完全性が原因で、スポットＳＰの各々からオフセット光が発せられていることを意味する。図５（ｂ）に示す通り、ハイブリダイゼーション後においては、破線で囲まれた領域Ｒ内におけるスポット領域の色が白色になっている。これは、領域Ｒ内におけるスポットＳＰでは、ターゲットＴＧが検出プローブによって捕集されて強い蛍光が発せられたことを意味する。
前述したステップＳ１３の処理では、図５（ａ）に示すスポット領域の各々について、平均階調値を第１光量として算出する処理が行われる。前述したステップＳ１４の処理では、図５（ｂ）に示すスポット領域の各々について平均階調値を第２光量として算出する処理が行われる。そして、前述したステップＳ１５の処理では、スポット領域の各々について、第１光量と第２光量との差である光量変化量を算出する処理が行われる。
図５（ａ），（ｂ）に示す例において、領域Ｒ内には、縦２列横５列に配列された計１０個のスポット領域が存在しているが、これら１０個のスポット領域の光量変化量は、他のスポット領域の光量変化量に比べて大きい。このため、前述したステップＳ１６の処理では、領域Ｒ内の１０個のスポット領域における光量変化量を用いて、サンプルに含まれるターゲットＴＧの計測が行われる。
以上の通り、第１核酸配列計測方法では、サンプル添加直後の時点（第１時点）で、あるスポットＳＰから発せられる蛍光の第１光量と、サンプル添加から所定時間後の時点（第２時点）で、上記と同じスポットＳＰから発せられる蛍光の第２光量との差を求めている。そして、第１光量と第２光量との差に基づいてターゲットを計測するようにしている。これにより、オフセット光の影響を効果的に排除することができることから、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる。
《第２核酸配列計測方法》
図６は、第２核酸配列計測方法を示すフローチャートである。尚、図６においては、図４中に示したステップと同様のステップについては、同じ符号を付してある。尚、本計測方法においても、図６に示すフローチャートの処理が開始される前に、ターゲットＴＧが含まれるサンプルの調整等が行われ、その後に、対象ブロックＢＫ０にサンプルが添加される。
核酸配列計測用デバイスＤＶにサンプルが添加されると、まず、サンプル添加直後の時点（第１時点）の画像（第１画像）を取得する処理が検出部１２で行われる（ステップＳ１１）。次に、サンプル添加から所定時間経過後の時点（第２時点）の画像（第２画像）を取得する処理が検出部１２で行われる（ステップＳ１２）。尚、ステップＳ１１，Ｓ１２の処理は、図４を用いて説明した処理と同様であるため、詳細な説明は省略する。
次いで、第１画像及び第２画像を画像処理し、第１画像及び第２画像の各々からスポット領域を抽出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２１）。続いて、第１画像から抽出したスポット領域の各々について、階調値標準偏差を算出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２２）。具体的には、第１画像から抽出したスポット領域毎に、スポットＳＰの画像をなす画素の階調値の標準偏差を算出する処理が行われる。そして、ステップＳ２２で算出された階調値標準偏差を用いて、スポット領域の各々の信頼区間（第１閾値）を設定する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２３）。
ここで、ステップＳ２２の処理を行うのは、スポット領域の各々において、蛍光のムラ（光量のバラツキ）がどの程度生じているかを求めるためである。ステップＳ２３の処理を行うのは、後述するステップＳ２５の処理において、スポット領域の各々について、ハイブリダイゼーション前後の光量変化量がある程度大きな画素（階調値の差がある程度大きな画素）の抽出を行うためである。尚、信頼区間の設定の仕方は任意であるが、例えば、信頼係数が０．９５の信頼区間を設定することができる。
続いて、ステップＳ２１の処理で抽出したスポット領域毎に、スポットＳＰの画像をなす各画素の階調値変化量を算出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２４）。そして、ステップＳ２１の処理で抽出したスポット領域毎に、ステップＳ２３で設定された信頼区間以上の階調値変化がある画素を抽出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２５）。
以上の処理が終了すると、ステップＳ２１の処理で第１画像から抽出されたスポット領域毎に、ステップＳ２５の処理で抽出した画素の平均階調値（第１光量）及び階調値標準偏差を算出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２６）。同様に、ステップＳ２１の処理で第２画像から抽出されたスポット領域毎に、ステップＳ２５の処理で抽出した画素の平均階調値（第２光量）及び階調値標準偏差を算出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２７）。
続いて、ステップＳ２６で算出された平均階調値（第１光量）と、ステップＳ２７で算出された平均階調値（第２光量）との差（光量変化量）を検定する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２８）。具体的には、ステップＳ２６，Ｓ２７で算出された階調値標準偏差を用いて、上記の平均階調値の差（光量変化量）を検定する処理が行われる。最後に、ステップＳ２８の検定結果に基づいて、サンプルに含まれるターゲットＴＧが計測される（ステップＳ２９）。このようにして、サンプルに含まれるターゲットＴＧの計測が行われる。
図７は、第２核酸配列計測方法で取得される画像の一例を示す図である。図７（ａ）は、例えば、ハイブリダイゼーション前に取得された対象ブロックＢＫ０の画像（第１画像）の一部である。図７（ｂ）は、ハイブリダイゼーション前後において取得された画像（第１画像、第２画像）の１つのスポット領域を拡大したものある。尚、図７（ｂ）において、画像Ｇ１は、ハイブリダイゼーション前のものであり、画像Ｇ２は、ハイブリダイゼーション後のものである。
図７（ａ）を参照すると、３つのスポット領域が示されている。これら３つのスポット領域の内部は、階調値が同一ではなく斑模様となっている。また、これら３つのスポット領域の斑模様は、同じではなく互いに異なっている。これにより、オフセット光の光量バラツキは、スポット領域内のみならず、スポット領域間においてもあることが分かる。
図７（ｂ）を参照すると、画像Ｇ１よりも画像Ｇ２の方が全体的に白っぽい（階調値が大きい）ことが分かる。これは、ハイブリダイゼーション後の方がハイブリダイゼーション前よりも全体的な光量が増していることを意味する。また、図７（ｂ）を参照すると、画像Ｇ１，Ｇ２の何れも、階調値が同一ではなく斑模様になっている。これにより、スポット領域内における蛍光の光量バラツキは、ハイブリダイゼーション前のみならず、ハイブリダイゼーション後においても生ずることが分かる。
図８は、ハイブリダイゼーション前後におけるスポット領域内の画素の階調値のバラツキ分布の一例を示す図である。図８（ａ）は、図７（ｂ）に示す画像Ｇ１，Ｇ２についての階調値のバラツキ分布をヒストグラムで示したものである。これに対し、図８（ｂ）は、図７（ｂ）に示す画像Ｇ１，Ｇ２から抽出された画素（階調変化量の大きな画素）の階調値のバラツキ分布をヒストグラムで示したものである。つまり、図８（ｂ）は、図６に示すステップＳ２５の処理が行われた後のものについて、階調値のバラツキ分布をヒストグラムで示したものである。
図８を参照すると、ハイブリダイゼーション前においては、画素の階調値の分布は「２００００」付近であり、ハイブリダイゼーション後においては、画素の階調値の分布は「４００００」付近であることが分かる。また、図８（ａ）と図８（ｂ）とを比較すると、図８（ａ）に比べて図８（ｂ）の方が、バラツキが小さく平均的な階調値が大きくなることが分かる。
図９は、ハイブリダイゼーション前後におけるスポット領域内の画素の平均階調値及び標準偏差の一例を示す図である。図９において、「画素の抽出無し」と付記されているものは、図７（ｂ）に示す画像Ｇ１，Ｇ２についての平均階調値及び標準偏差であり、「画素の抽出あり」と付記されているものは、図７（ｂ）に示す画像Ｇ１，Ｇ２から抽出された画素（階調変化量の大きな画素）の平均階調値及び標準偏差である。図９では、平均階調値を棒グラフで示しており、標準偏差をエラーバーで示している。
図９を参照すると、ハイブリダイゼーション前であっても、ハイブリダイゼーション後であっても、「画素の抽出あり」と付記されたものの平均階調値が、「画素の抽出無し」と付記されたものの平均階調値よりも大きくなっていることが分かる。また、ハイブリダイゼーション前であっても、ハイブリダイゼーション後であっても、「画素の抽出あり」と付記されたものの標準偏差は、「画素の抽出無し」と付記されたものの標準偏差の三分の一程度に減少していることが分かる。
図６に示すステップＳ２８の処理では、ハイブリダイゼーション前の平均階調値と、ハイブリダイゼーション後の平均階調値との差である光量変化量を、ハイブリダイゼーション前後の標準偏差を用いて検定している。図６に示すステップＳ２５の処理を行うことで、標準偏差を三分の一程度に減少することができるため、ターゲットの計測精度を向上させることができる。
以上の通り、第２核酸配列計測方法では、まず、第１画像から抽出したスポット領域の階調値標準偏差から信頼区間を設定し、信頼区間以上の階調値変化がある画素を抽出している。次に、第１画像のスポット領域毎に、抽出した画素の平均階調値（第１光量）を求め、第１画像のスポット領域毎に、抽出した画素の平均階調値（第２光量）を求め、これらの差である光量変化量を検定している。そして、検定結果に基づいてターゲットを計測するようにしている。これにより、スポット領域内の光量ムラの影響を効果的に排除することができることから、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる。
《第３核酸配列計測方法》
図１０は、第３核酸配列計測方法を示すフローチャートである。尚、図１０においては、図４，図６中に示したステップと同様のステップについては、同じ符号を付してある。尚、本計測方法においても、図１０に示すフローチャートの処理が開始される前に、ターゲットＴＧが含まれるサンプルの調整等が行われ、その後に、対象ブロックＢＫ０にサンプルが添加される。
核酸配列計測用デバイスＤＶにサンプルが添加されると、まず、サンプル添加直後の時点（第１時点）の画像（第１画像）を取得する処理が検出部１２で行われる（ステップＳ１１）。次に、サンプル添加から所定時間経過後の時点（第２時点）の画像（第２画像）を取得する処理が検出部１２で行われる（ステップＳ１２）。次いで、第１画像及び第２画像を画像処理し、第１画像及び第２画像の各々からスポット領域を抽出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ２１）。
続いて、第１画像から抽出したスポット領域外の階調値標準偏差を算出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ３１）。具体的には、第１画像から抽出したスポット領域以外の任意の領域における画像をなす画素の階調値の標準偏差を算出する処理が行われる。そして、ステップＳ３１で算出された階調値標準偏差を用いて、信頼区間（第２閾値）を設定する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ３２）。
ここで、ステップＳ３１の処理を行うのは、例えば、核酸配列計測用デバイスＤＶの特性に起因するノイズや、画像取得部１２ａに設けられた固体撮像素子に起因するノイズによる光量のバラツキがどの程度生じているかを求めるためである。ステップＳ３２の処理を行うのは、後述するステップＳ３４の処理において、スポット領域の各々について、ハイブリダイゼーション前後の光量変化量がある程度大きな画素（階調値の差がある程度大きな画素）の抽出を行うためである。尚、信頼区間の設定の仕方は任意であるが、例えば、信頼係数が０．９５の信頼区間を設定することができる。
続いて、ステップＳ２１の処理で抽出したスポット領域毎に、スポットＳＰの画像をなす各画素の階調値変化量を算出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ３３）。そして、ステップＳ２１の処理で抽出したスポット領域毎に、ステップＳ３２で設定された信頼区間以上の階調値変化がある画素を抽出する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ３４）。
以上の処理が終了すると、ステップＳ２１の処理で抽出したスポット領域毎に、抽出した画素の数を計数する処理が演算部２５で行われる（ステップＳ３５）。最後に、ステップＳ３５の計数結果に基づいて、サンプルに含まれるターゲットＴＧが計測される（ステップＳ３６）。このようにして、サンプルに含まれるターゲットＴＧの計測が行われる。
図１１は、第３核酸配列計測方法で取得される画像の一例を示す図である。尚、図３では、ターゲットＴＧの濃度が異なる３つのサンプルを核酸配列計測用デバイスＤＶに添加した場合に取得されるハイブリダイゼーション前後のスポットの画像を示している。まず、ターゲットＴＧの濃度が低い場合には、ハイブリダイゼーション前後において、画像の階調値変化は僅かである。このため、図１０のステップＳ３４の処理で抽出される画素は殆ど無い。
次に、ターゲットＴＧの濃度が高くなるにつれて、ハイブリダイゼーション前後において、大きな階調値変化を示す画素の数は増えていく。このため、図１０のステップＳ３４の処理で抽出される画素は、ターゲットＴＧの濃度が高くなるにつれて増えていく。このようにして、抽出された画素の数を計数することによって、サンプルに含まれるターゲットＴＧを計測することができる。
以上の通り、第３核酸配列計測方法では、まず、第１画像から抽出したスポット領域外の階調値標準偏差から信頼区間を設定している。次に、抽出したスポット領域毎に各画素の階調値変化量を算出し、信頼区間以上の階調値変化がある画素を抽出している。そして、抽出したスポット領域毎に、抽出した画素の数を計数し、その計数結果に基づいてターゲットを計測するようにしている。これにより、スポット領域内の光量ムラの影響を効果的に排除することができることから、サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットの計測精度を従来よりも向上させることができる。
〈変形例〉
本発明の実施形態による核酸配列計測装置１は、核酸配列計測用デバイスＤＶの画像（ブロックＢＫ又はスポットＳＰの画像）を、異なる解像度で取得可能にしても良い。例えば、図３に示す画像取得部１２ａと温調ステージ１１（核酸配列計測用デバイスＤＶ）との間に、光学倍率を変えることができる光学系を設けた構成にしても良い。或いは、画素数が異なる複数の固体撮像素子を図３に示す画像取得部１２ａに設け、解像度に応じて固体撮像素子を切り替え可能に構成しても良い。このようにするのは、スポットＳＰを高解像度で撮影することにより、ターゲットの計測精度を更に向上させるためである。
例えば、スポットＳＰの直径が１００［μｍ］であるとし、固体撮像素子の１画素の大きさが１０［μｍ］四方（１０×１０［μｍ］）であるとする。固体撮像素子が等倍でスポットＳＰを撮影する場合には、スポットＳＰを撮影している画素は７８．５画素（５×５×π画素）程度しかない。
これに対し、例えば、上記の光学系によってスポットＳＰの像が１０倍に拡大されたとすると、１画素が撮影する範囲は１［μｍ］四方（１×１［μｍ］）となる。すると、スポットＳＰを撮影している画素は、７８５０画素（５０×５０×π画素）程度になり拡大倍率の二乗の解像度となる。このように、核酸配列計測用デバイスＤＶの画像を、低解像度（等倍）以外に高解像度で取得可能にすることで、スポット領域内の階調値のバラツキをより正確に捉えることが可能になる。
図１２は、変形例に係る核酸配列計測装置で取得される画像の一例を示す図である。図１２（ａ）は、あるスポットＳＰを等倍で撮影した場合に取得される画像である。図１２（ｂ）は、図１２（ａ）と同一のスポットＳＰを１０倍の倍率で撮影した場合に取得される画像であり、図１２（ｃ）は、図１２（ａ）と同一のスポットＳＰを４０倍の倍率で撮影した場合に取得される画像である。
図１２（ａ）を参照すると、等倍で撮影した場合には、目の粗いモザイクをかけたような画像が得られることが分かる。図１２（ｂ）を参照すると、１０倍の倍率で撮影した場合には、図１２（ａ）に示す画像に比べると目の粗さは小さくなっているものの、やはりモザイクをかけたような画像が得られることが分かる。これに対し、図１２（ｃ）を参照すると、階調値が滑らかに変化している画像が得られることが分かる。
図１３は、高解像度で撮影した場合の、ハイブリダイゼーション前後におけるスポット領域内の画素の階調値のバラツキ分布の一例を示す図である。図１３と図８（ａ）とを比較すると、高解像度で撮影した場合には、階調値のバラツキ分布を正確に得ることができることが分かる。
以上、本発明の実施形態による核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法について説明したが、本発明は上記実施形態に制限されることなく、本発明の範囲内で自由に変更が可能である。例えば、上述した実施形態で説明した画像取得部１２ａは、モノクロの二次元画像を取得するものであっても良く、カラーの二次元画像を取得するものであっても良い。
また、画像取得部１２ａは、ＣＣＤ、ＣＯＭＳ以外に、感度が高いＥＭＣＣＤ（Electron Multiplying ＣＣＤ：電子増倍ＣＣＤ）やディジタルＣＭＯＳを備えていても良い。また、検出部１２は、画像取得部１２ａに代えて（又は、画像取得部１２ａとともに）、スポットＳＰと１対１で配置されるフォトダイオードを備えていても良い。
また、上述した実施形態では、サンプル添加直後の画像（対象ブロックＢＫ０の画像）を第１画像として取得する例について説明した。しかしながら、サンプル添加前の画像（対象ブロックＢＫ０の画像）を第１画像として取得しても良い。つまり、第１画像は、サンプルの添加前又は添加直後の第１時点で取得すれば良い。但し、サンプル添加前の画像を第１画像として取得する場合には、サンプル添加前に得られる光量と、ターゲットが含まれていなサンプルが添加された後に得られる光量との差を予め求めておき、その差を第１画像の光量に与える必要がある。また、ターゲットが含まれているサンプルを添加する前に、ターゲットが含まれてないサンプルが添加された画像（対象ブロックＢＫ０の画像）を第１画像として取得しても良い。
また、上述した第１〜第３核酸配列計測方法では、説明を簡単にするために、最初にまとめて第１画像及び第２画像を取得し、その後に、第１画像及び第２画像の画像処理等を行う例にせついて説明した。しかしながら、第１画像を取得してから第２画像を取得するまでの間に、第１画像の画像処理等を行っても良い。
また、上述した第３核酸配列計測方法における信頼区間の設定方法を上述した第２核酸配列計測方法で用いても良く、逆に、上述した第２核酸配列計測方法における信頼区間の設定方法を上述した第３核酸配列計測方法で用いても良い。具体的には、図６のステップＳ２２，Ｓ２３の処理を図１０のステップＳ３１，Ｓ３２の処理に置き換えても良く、図１０のステップＳ３１，Ｓ３２の処理を図６のステップＳ２２，Ｓ２３の処理に置き換えても良い。
また、本発明の実施形態による核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法は、蛍光分子光量計測におけるドライ画像測定、バイオチップの蛍光分子光量の液中観察、及び連続反応におけるリアルタイム観察等に使用することができる。具体的には、例えば、遺伝子・高分子分析による菌種判別、がん遺伝子、動植物判別、腸内細菌の検査等に用いることができる。
また、本発明の実施形態による核酸配列計測装置及び核酸配列計測方法は、臨床検査等に使用される標識抗体法等の次のような固相法にも応用される。例えば、組織や細胞内の特定の染色体や遺伝子の発現を、蛍光物質を用いて蛍光測定するＦＩＳＨ法（蛍光 in situ ハイブリダイゼーション）が一例として挙げられる。この他にも、以下のような各種の手法への応用が一例として挙げられる。即ち、ユーロピウム等の蛍光発光物質を標識として抗原抗体反応を測定するＦＩＡ法（蛍光免疫測定法）や、抗原となる病原体等に蛍光物質をラベルした血清（抗体）反応を測定するＩＦＡ法（間接蛍光抗体法）が挙げられる。
１ 核酸配列計測装置
１２ 検出部
１２ａ 画像取得部
２５ 演算部
ＢＫ ブロック
ＤＶ 核酸配列計測用デバイス
ＳＰ スポット
ＴＧ ターゲット

Claims (10)

  1. サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測装置において、
    前記ターゲットの添加によって蛍光を発する核酸配列計測用デバイスから発せられる蛍光を検出する検出部と、
    前記検出部の検出結果に基づいて、前記核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加前又は添加直後の第１時点で、前記核酸配列計測用デバイスの予め規定された計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第１光量と、前記核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加から予め規定された時間が経過した後の第２時点で、前記計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第２光量との差に基づいて前記ターゲットを計測する演算部と、
    を備える核酸配列計測装置。
  2. 前記検出部は、少なくとも前記計測領域が含まれる画像取得領域の画像を取得する画像取得部を備え、
    前記演算部は、前記第１時点で取得された前記画像取得領域の画像である第１画像及び前記第２時点で取得された前記画像取得領域の画像である第２画像の画像処理を行って、前記第１光量及び前記第２光量をそれぞれ求める、
    請求項１記載の核酸配列計測装置。
  3. 前記演算部は、前記画像処理として、前記第１画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の平均階調値を前記第１光量として求める処理と、前記第２画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の平均階調値を前記第２光量として求める処理とを行う、請求項２記載の核酸配列計測装置。
  4. 前記演算部は、前記第１画像と前記第２画像との画素毎の階調値の差が予め規定された第１閾値を超える画素を抽出し、前記第１画像の抽出した画素の平均階調値を前記第１光量として求める処理と、前記第２画像の抽出した画素の平均階調値を前記第２光量として求める処理とを行う、請求項３記載の核酸配列計測装置。
  5. 前記演算部は、前記第１画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の階調値の標準偏差を求め、前記標準偏差に基づいて前記第１閾値を設定する、請求項４記載の核酸配列計測装置。
  6. 前記演算部は、前記画像処理として、前記第１画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の各々の階調値と、前記第２画像に含まれる前記計測領域の画像をなす画素の各々の階調値との差を、前記第１光量と前記第２光量との差として求める処理を行う、請求項２記載の核酸配列計測装置。
  7. 前記演算部は、前記第１光量と前記第２光量との差が予め規定された第２閾値を超える画素を抽出し、抽出した画素の数に基づいて前記ターゲットを計測する、請求項６記載の核酸配列計測装置。
  8. 前記演算部は、前記第１画像に含まれる前記計測領域以外の領域の画像をなす画素の階調値の標準偏差を求め、前記標準偏差に基づいて前記第２閾値を設定する、請求項７記載の核酸配列計測装置。
  9. 前記画像取得部は、前記画像取得領域の画像を、異なる解像度で取得可能である、請求項２から請求項８の何れか一項に記載の核酸配列計測装置。
  10. サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法であって、
    前記ターゲットの添加によって蛍光を発する核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加前又は添加直後の第１時点で、前記核酸配列計測用デバイスの予め規定された計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第１光量と、前記核酸配列計測用デバイスに対する前記サンプルの添加から予め規定された時間が経過した後の第２時点で、前記計測領域から発せられる蛍光の光量を示す第２光量との差を求める第１ステップと、
    前記第１光量と前記第２光量との差に基づいて前記ターゲットを計測する第２ステップと、
    を有する核酸配列計測方法。
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