JP2004191232A - 光量検出器の校正方法および光量測定装置 - Google Patents
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- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
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Abstract
【課題】絶対光量が測定できる光量検出器の校正方法とその光量検出器を用いた光量測定装置を提供する。
【解決手段】照明用基準光源３を用いて、光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたパワーメータ１により、1次元または２次元状に配列した受光素子アレイを持つ光量検出器の各受光素子の受光光量と光量検出器の出力信号を校正し、光量検出器の出力信号から光源の光量の空間分布と共に国家標準にトレーサビリティがとれた光パワーの値を直接測定することができるようにする。
【選択図】 図１
【解決手段】照明用基準光源３を用いて、光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたパワーメータ１により、1次元または２次元状に配列した受光素子アレイを持つ光量検出器の各受光素子の受光光量と光量検出器の出力信号を校正し、光量検出器の出力信号から光源の光量の空間分布と共に国家標準にトレーサビリティがとれた光パワーの値を直接測定することができるようにする。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光量検出器の校正方法およびその校正方法により校正された光量検出器を用いた光量測定装置に関する。光量検出器としては、例えば、複数の受光素子からなる受光部を持つカメラである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、生体高分子などの同定・分画（例えば、DNAの検出、遺伝子DNAの有無検出）にはDNAチップが使用される。
DNAチップは、例えば数千から数万種類の既知のDNAの断片を基板上のサイトにそれぞれ固定したものである。このようなDNAチップに未知のDNAの断片を流すと、同じ種類のDNA同士がハイブリダイズして結合する。結合しなかった未知のDNAを洗浄により除去した後、残ったDNAに励起光（レーザ光）を照射する。未知のDNAにはあらかじめ蛍光物質が標識されており、励起光の照射により励起された蛍光物質からは蛍光が発生する。その結果、ハイブリダイゼーションが生じたか否かに対応してサイトごとに明暗が現れる。
【０００３】
この明暗観察は、共焦点レーザー光学系による蛍光スキャニング装置などで行われる（例えば、非特許文献１参照）。蛍光観察の検出器としては、高感度検出が可能なフォトマルチプライヤー（Photo multiplier）などが利用される。
なお、検出器としてパワーメータを利用する場合もあるが、パワーメータは零次元の検出しかできないため、DNAチップをはじめとするバイオチップや、プラズマディスプレイなどのような形状を持った試料は計測できない。
【０００４】
【非特許文献１】
牧野徹・狩野恭一、会誌「光学」 ライフサイエンスにおける光技術 「DNA解析と光技術」、第２８巻１０号（１９９９）、（社）応用物理学会分科会 日本光学会、１９９９年、ｐ５４９〜５５２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来のこのような検出器では、絶対光量が測定できないため次のような課題があった。
（１）装置間で検出器の出力信号の値が比較できない。
（２）バイオチップ計測においては遺伝子発現量が不明のため、既知の遺伝子などを混入させて比較測定するしかなく、そのため装置が高価になる。
【０００６】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、絶対光量が測定できる光量検出器の校正方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、その校正方法により校正された光量検出器を用い、蛍光分子の数などを直接推定することのできる光量測定装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、請求項１の発明は、
光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたパワーメータにより、1次元または２次元状に配列した受光素子アレイを持つ光量検出器の各受光素子の受光光量と光量検出器の出力信号を校正し、光量検出器の出力信号から光源の光量の空間分布と共に国家標準にトレーサビリティがとれた光パワーの値を直接測定することができるようにしたことを特徴とする光量検出器の校正方法である。
このような校正方法によれば、光量検出器での絶対光量測定が可能となる。
【０００８】
この場合、前記光量検出器の校正は、請求項２のように、照明用基準光源を前記パワーメータで値付けし、次にその照明用基準光源により光量検出器を値付けする。
また、前記光量検出器としては、請求項３のように複数の受光素子からなる受光部を持つカメラが使用可能である。
【０００９】
請求項４の発明は、
請求項１ないし３のいずれかに記載の光量検出器の校正方法により校正された光量検出器を備え、バイオチップまたは細胞または蛍光塗布体または蛍光性塵埃を測定する光量測定装置である。
【００１０】
また、請求項５の発明は、
請求項１ないし３のいずれかに記載の光量検出器の校正方法により校正された光量検出器と、
蛍光物体からの蛍光光量を検出した光量検出器の出力信号と、蛍光色素から発生する光量の関係式とから、蛍光物体の分子数を算出する手段
を備え、蛍光物体の光量または分子数あるいは光量と分子数を直接推定することができる光量測定装置である。
【００１１】
また、請求項６のように、請求項４または５の光量測定装置において、受光素子としては、１次元アレイ状または２次元アレイ状に配列された受光素子を使用することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る校正方法の原理を説明するための図である。図１（ａ）において、１はパワーメータ、２は光学顕微鏡、３はLEDなどの照明用基準光源である。
パワーメータ１は、光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたものであり、国家標準と互換性のあるものである。このパワーメータ１により顕微鏡２経由の照明用基準光源３の光量を測定し、パワーメータ１を基準にして照明用基準光源３の光量を校正する。
【００１３】
次に、図１（ｂ）に示すように、その校正された照明用基準光源３の光量を顕微鏡２を介して光量検出器（例えばカメラ）４の受光素子（図示せず）で検出する。これによりカメラ４の受光素子の受光光量とカメラの出力信号の関係を校正することができる。
【００１４】
図２にこのような校正方法による校正結果の一例を示す。図は受光素子の単位面積当りの絶対光量とカメラの輝度信号出力の階調との関係を表す。光源３が緑色の光である場合は、Y=2.61E-06X＋2.57E-05、光源３が赤色の光である場合は、Y=1.81E-06X−5.26E-05の関係となる。なお、式中のXは階調、Yは光量である。
【００１５】
このようにして校正されたカメラをバイオチップ読取装置（例えば、本願出願人が提案した特開２００１−３１１６９０号に記載のバイオチップ読取装置など）の受光器に用いると、測定した画像の階調値から直接蛍光光量を測定することができる。
【００１６】
他方、蛍光色素から発生する光量は以下の演算処理により求めることができる。
蛍光色素によって吸収される光のパワーΔＩは、次式で与えられる。
ΔＩ＝2.3×103×α×Io×ｎ／（Na×Ｓ） ［Ｗ］ …（１）
ただし、
α ： モル吸光係数 ８×104［M-1 cm-1］
Io ： 入射光量［W］
ｎ ： 分子数［個］
Na ： アボガドロ数 6×1023
Ｓ ： 面積［cm2］
である。
これに量子効率などを考慮することで蛍光色素から発生する蛍光光量を推定することができる。
【００１７】
したがって、上記校正方法によって校正されたカメラを用いて計測した蛍光光量と上記推定した蛍光光量の値を対応させることにより、バイオチップ上の蛍光分子の数nを直接推定することができる。
【００１８】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、バイオチップに限らず、一般の細胞や、半導体プロセスにおけるゴミ（蛍光性塵埃）、プラズマパネルなどの蛍光塗布体なども計測可能である。
【００１９】
また、受光器としては、受光素子が２次元状に配列されたいわゆる２次元アレイ状のものに限らず、図３に示すように受光素子が１次元状に配列されたラインセンサ4ａも使用可能である。この場合、ステージ（図示せず）を付加して、サンプル５をラインセンサ４ａの配列方向と直交する方向に移動させて、サンプルの２次元画像を検出するようにしてもよい。
【００２０】
また、カメラと光学系の間にイメージインテンシファイアなどの光量増幅系を挿入してもよい。これによって微弱光も測定可能となる。なお、この場合は、イメージインテンシファイアも含めた形で校正を行う必要がある。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）受光素子を並べた受光部を持つカメラを、国家基準からトレーサブルなパワーメータにより各受光素子について受光光量とカメラ出力を校正するため、カメラ出力から絶対光量を直接測定できる。
（２）このように校正されたカメラを用いれば、蛍光測定用の各装置間の光量測定誤差を容易に減らすことができる。
【００２２】
（３）蛍光分子の数も分るため、工程管理指標を明確化し、サンプル処理のプロセスの改善が容易になり、また容易に高精度化もできる。
（４）さらにサンプル自身もリファレンス用に付加するダミーサンプルを減らせるため、容易にコストダウンを図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る校正方法の原理を説明するための説明図である。
【図２】校正結果の一例を示す図である。
【図３】１次元状に配列の受光素子を用いた場合の実施例図である。
【符号の説明】
１ パワーメータ
２ 光学顕微鏡
３ 照明用基準光源
４ 光量検出器
４ａ ラインセンサ
５ サンプル
【発明の属する技術分野】
本発明は、光量検出器の校正方法およびその校正方法により校正された光量検出器を用いた光量測定装置に関する。光量検出器としては、例えば、複数の受光素子からなる受光部を持つカメラである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、生体高分子などの同定・分画（例えば、DNAの検出、遺伝子DNAの有無検出）にはDNAチップが使用される。
DNAチップは、例えば数千から数万種類の既知のDNAの断片を基板上のサイトにそれぞれ固定したものである。このようなDNAチップに未知のDNAの断片を流すと、同じ種類のDNA同士がハイブリダイズして結合する。結合しなかった未知のDNAを洗浄により除去した後、残ったDNAに励起光（レーザ光）を照射する。未知のDNAにはあらかじめ蛍光物質が標識されており、励起光の照射により励起された蛍光物質からは蛍光が発生する。その結果、ハイブリダイゼーションが生じたか否かに対応してサイトごとに明暗が現れる。
【０００３】
この明暗観察は、共焦点レーザー光学系による蛍光スキャニング装置などで行われる（例えば、非特許文献１参照）。蛍光観察の検出器としては、高感度検出が可能なフォトマルチプライヤー（Photo multiplier）などが利用される。
なお、検出器としてパワーメータを利用する場合もあるが、パワーメータは零次元の検出しかできないため、DNAチップをはじめとするバイオチップや、プラズマディスプレイなどのような形状を持った試料は計測できない。
【０００４】
【非特許文献１】
牧野徹・狩野恭一、会誌「光学」 ライフサイエンスにおける光技術 「DNA解析と光技術」、第２８巻１０号（１９９９）、（社）応用物理学会分科会 日本光学会、１９９９年、ｐ５４９〜５５２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、従来のこのような検出器では、絶対光量が測定できないため次のような課題があった。
（１）装置間で検出器の出力信号の値が比較できない。
（２）バイオチップ計測においては遺伝子発現量が不明のため、既知の遺伝子などを混入させて比較測定するしかなく、そのため装置が高価になる。
【０００６】
本発明の目的は、上記の課題を解決するもので、絶対光量が測定できる光量検出器の校正方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、その校正方法により校正された光量検出器を用い、蛍光分子の数などを直接推定することのできる光量測定装置を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、請求項１の発明は、
光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたパワーメータにより、1次元または２次元状に配列した受光素子アレイを持つ光量検出器の各受光素子の受光光量と光量検出器の出力信号を校正し、光量検出器の出力信号から光源の光量の空間分布と共に国家標準にトレーサビリティがとれた光パワーの値を直接測定することができるようにしたことを特徴とする光量検出器の校正方法である。
このような校正方法によれば、光量検出器での絶対光量測定が可能となる。
【０００８】
この場合、前記光量検出器の校正は、請求項２のように、照明用基準光源を前記パワーメータで値付けし、次にその照明用基準光源により光量検出器を値付けする。
また、前記光量検出器としては、請求項３のように複数の受光素子からなる受光部を持つカメラが使用可能である。
【０００９】
請求項４の発明は、
請求項１ないし３のいずれかに記載の光量検出器の校正方法により校正された光量検出器を備え、バイオチップまたは細胞または蛍光塗布体または蛍光性塵埃を測定する光量測定装置である。
【００１０】
また、請求項５の発明は、
請求項１ないし３のいずれかに記載の光量検出器の校正方法により校正された光量検出器と、
蛍光物体からの蛍光光量を検出した光量検出器の出力信号と、蛍光色素から発生する光量の関係式とから、蛍光物体の分子数を算出する手段
を備え、蛍光物体の光量または分子数あるいは光量と分子数を直接推定することができる光量測定装置である。
【００１１】
また、請求項６のように、請求項４または５の光量測定装置において、受光素子としては、１次元アレイ状または２次元アレイ状に配列された受光素子を使用することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る校正方法の原理を説明するための図である。図１（ａ）において、１はパワーメータ、２は光学顕微鏡、３はLEDなどの照明用基準光源である。
パワーメータ１は、光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたものであり、国家標準と互換性のあるものである。このパワーメータ１により顕微鏡２経由の照明用基準光源３の光量を測定し、パワーメータ１を基準にして照明用基準光源３の光量を校正する。
【００１３】
次に、図１（ｂ）に示すように、その校正された照明用基準光源３の光量を顕微鏡２を介して光量検出器（例えばカメラ）４の受光素子（図示せず）で検出する。これによりカメラ４の受光素子の受光光量とカメラの出力信号の関係を校正することができる。
【００１４】
図２にこのような校正方法による校正結果の一例を示す。図は受光素子の単位面積当りの絶対光量とカメラの輝度信号出力の階調との関係を表す。光源３が緑色の光である場合は、Y=2.61E-06X＋2.57E-05、光源３が赤色の光である場合は、Y=1.81E-06X−5.26E-05の関係となる。なお、式中のXは階調、Yは光量である。
【００１５】
このようにして校正されたカメラをバイオチップ読取装置（例えば、本願出願人が提案した特開２００１−３１１６９０号に記載のバイオチップ読取装置など）の受光器に用いると、測定した画像の階調値から直接蛍光光量を測定することができる。
【００１６】
他方、蛍光色素から発生する光量は以下の演算処理により求めることができる。
蛍光色素によって吸収される光のパワーΔＩは、次式で与えられる。
ΔＩ＝2.3×103×α×Io×ｎ／（Na×Ｓ） ［Ｗ］ …（１）
ただし、
α ： モル吸光係数 ８×104［M-1 cm-1］
Io ： 入射光量［W］
ｎ ： 分子数［個］
Na ： アボガドロ数 6×1023
Ｓ ： 面積［cm2］
である。
これに量子効率などを考慮することで蛍光色素から発生する蛍光光量を推定することができる。
【００１７】
したがって、上記校正方法によって校正されたカメラを用いて計測した蛍光光量と上記推定した蛍光光量の値を対応させることにより、バイオチップ上の蛍光分子の数nを直接推定することができる。
【００１８】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、バイオチップに限らず、一般の細胞や、半導体プロセスにおけるゴミ（蛍光性塵埃）、プラズマパネルなどの蛍光塗布体なども計測可能である。
【００１９】
また、受光器としては、受光素子が２次元状に配列されたいわゆる２次元アレイ状のものに限らず、図３に示すように受光素子が１次元状に配列されたラインセンサ4ａも使用可能である。この場合、ステージ（図示せず）を付加して、サンプル５をラインセンサ４ａの配列方向と直交する方向に移動させて、サンプルの２次元画像を検出するようにしてもよい。
【００２０】
また、カメラと光学系の間にイメージインテンシファイアなどの光量増幅系を挿入してもよい。これによって微弱光も測定可能となる。なお、この場合は、イメージインテンシファイアも含めた形で校正を行う必要がある。
【００２１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば次のような効果がある。
（１）受光素子を並べた受光部を持つカメラを、国家基準からトレーサブルなパワーメータにより各受光素子について受光光量とカメラ出力を校正するため、カメラ出力から絶対光量を直接測定できる。
（２）このように校正されたカメラを用いれば、蛍光測定用の各装置間の光量測定誤差を容易に減らすことができる。
【００２２】
（３）蛍光分子の数も分るため、工程管理指標を明確化し、サンプル処理のプロセスの改善が容易になり、また容易に高精度化もできる。
（４）さらにサンプル自身もリファレンス用に付加するダミーサンプルを減らせるため、容易にコストダウンを図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る校正方法の原理を説明するための説明図である。
【図２】校正結果の一例を示す図である。
【図３】１次元状に配列の受光素子を用いた場合の実施例図である。
【符号の説明】
１ パワーメータ
２ 光学顕微鏡
３ 照明用基準光源
４ 光量検出器
４ａ ラインセンサ
５ サンプル
Claims (5)
- 光パワーの国家標準にトレーサビリティがとれたパワーメータにより、1次元または２次元状に配列した受光素子アレイを持つ光量検出器の各受光素子の受光光量と光量検出器の出力信号を校正し、光量検出器の出力信号から光源の光量の空間分布と共に国家標準にトレーサビリティがとれた光パワーの値を直接測定することができるようにした光量検出器の校正方法。
- 前記光量検出器の校正は、照明用基準光源を前記パワーメータで値付けし、次にその照明用基準光源により光量検出器を値付けすることにより行うことを特徴とする請求項１記載の光量検出器の校正方法。
- 前記光量検出器は、複数の受光素子からなる受光部を持つカメラであることを特徴とする請求項１または２記載の光量検出器の校正方法。
- 請求項１ないし３のいずれかに記載の光量検出器の校正方法により校正された光量検出器を備え、バイオチップまたは細胞または蛍光塗布体または蛍光性塵埃を測定する光量測定装置。
- 請求項１ないし３のいずれかに記載の光量検出器の校正方法により校正された光量検出器と、
蛍光物体からの蛍光光量を検出した光量検出器の出力信号と、蛍光色素から発生する光量の関係式とから、蛍光物体の分子数を算出する手段
を備え、蛍光物体の光量または分子数あるいは光量と分子数を直接推定することができる光量測定装置。
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|---|---|
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Country Status (2)
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| JP (1) | JP2004191232A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006337245A (ja) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 蛍光読み取り装置 |
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