JP2007093249A - 光量計測装置および光量計測方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 光量を定量評価できる光量計測装置および光量計測方法を提供する。
【解決手段】 ＣＣＤカメラ１２の無信号状態を作り、ゼロ点調整を行う。このとき、校正用シャッター２３は光路を遮断する実線で示す位置に駆動され、迷光がＣＣＤカメラ１２に入らない状態が確保される。このときのＣＣＤカメラ１２の出力信号は光量算出部５１に送られ、校正部５６は光量算出部５１に対し、この出力信号値を基準（ゼロ点）とする校正を実行する。また、校正用レーザ光源２１から出力された光は光アッテネータ２２により減衰され、可動ミラー９およびリレーレンズ１１を介してＣＣＤカメラ１２に入射する。光アッテネータ２２の減衰量を切り替えることで、正しく値付けされた光をＣＣＤカメラ１２に入射させる。このときのＣＣＤカメラ１２の出力信号は光量算出部５１に送られ、校正部５６は各出力信号値がそれぞれの光量に正しく対応するように、光量算出部５１に対する校正を実行する。
【選択図】図１
【解決手段】 ＣＣＤカメラ１２の無信号状態を作り、ゼロ点調整を行う。このとき、校正用シャッター２３は光路を遮断する実線で示す位置に駆動され、迷光がＣＣＤカメラ１２に入らない状態が確保される。このときのＣＣＤカメラ１２の出力信号は光量算出部５１に送られ、校正部５６は光量算出部５１に対し、この出力信号値を基準（ゼロ点）とする校正を実行する。また、校正用レーザ光源２１から出力された光は光アッテネータ２２により減衰され、可動ミラー９およびリレーレンズ１１を介してＣＣＤカメラ１２に入射する。光アッテネータ２２の減衰量を切り替えることで、正しく値付けされた光をＣＣＤカメラ１２に入射させる。このときのＣＣＤカメラ１２の出力信号は光量算出部５１に送られ、校正部５６は各出力信号値がそれぞれの光量に正しく対応するように、光量算出部５１に対する校正を実行する。
【選択図】図１
Description
本発明は、光量を計測する光量計測装置および光量計測方法に関し、とくに光量を定量評価できる光量計測装置および光量計測方法に関する。
ＤＮＡ等の生体高分子を同定する方法として、マイクロアレイを用いた方法が知られている。例えばＤＮＡを同定する場合、既知の塩基配列を有するＤＮＡプローブをマイクロアレイの各サイトに固定し、ハイブリダイゼーションによって相補的な塩基配列をもつＤＮＡを各サイトに結合させるものである。結合したＤＮＡを蛍光マーカで標識しておくことで、結合量を蛍光の光量として認識できる。
牧野徹・狩野恭一、会誌「光学」 ライフサイエンスにおける光技術 「ＤＮＡ解析と光技術」、第２８巻１０号（１９９９）、（社）応用物理学会分科会 日本光学会、１９９９年、ｐ５４９〜５５２
光量は専用の光量計測装置を用いて計測する。しかし従来の装置では、絶対光量が計測できないため、遺伝子発現量を直接定量評価できない。
本発明の目的は、光量を定量評価できる光量計測装置および光量計測方法を提供することにある。
本発明の光量計測装置は、光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測装置において、前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量算出手段と、前記光検出手段への光の入射を遮断するシャッターと、前記シャッターで光の入射が遮断されたときの前記出力信号の値を、前記光量算出手段により算出される光量のゼロ点として校正する校正手段と、を備えることを特徴とする。
この光量計測装置によれば、シャッターで光の入射が遮断されたときの前記出力信号の値を、前記光量算出手段により算出される光量のゼロ点として校正するので、例えば、背景光に近い、ごく小さなレベルの光量も定量的に正確に評価できる。
この光量計測装置によれば、シャッターで光の入射が遮断されたときの前記出力信号の値を、前記光量算出手段により算出される光量のゼロ点として校正するので、例えば、背景光に近い、ごく小さなレベルの光量も定量的に正確に評価できる。
本発明の光量計測装置は、光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測装置において、前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量算出手段と、前記光検出手段に与える光の光量を制御可能な校正用光源と、前記校正用光源により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正する校正手段と、を備えることを特徴とする。
この光量計測装置によれば、校正用光源により既知の光量の光を光検出手段に与えることで、光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正するので、光量を定量的に評価できる。
この光量計測装置によれば、校正用光源により既知の光量の光を光検出手段に与えることで、光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正するので、光量を定量的に評価できる。
前記校正用光源は、一定光量の光を出力する光源と、値付けされた光アッテネータとにより構成されてもよい。
前記蛍光信号光を発生する対象物に向けて励起光を照射する励起光照射手段を備えてもよい。
本発明の光量計測装置は、光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測装置において、前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量算出手段と、励起光を照射する励起光照射手段と、この励起光を照射することにより、基準となる蛍光信号を発生する基準蛍光信号発生手段と、前記基準となる蛍光信号により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量算出手段により算出される光量を校正する校正手段と、を備えることを特徴とする。
この光量計測装置によれば、別途校正用光源を具備せずに既知の光量の光を光検出手段に与えることができると共に、光量算出手段により算出される光量を校正するので、光量を定量的に評価できる。
この光量計測装置によれば、別途校正用光源を具備せずに既知の光量の光を光検出手段に与えることができると共に、光量算出手段により算出される光量を校正するので、光量を定量的に評価できる。
本発明の光量計測方法は、光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測方法において、前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出するステップと、前記光検出手段への光の入射を遮断するステップと、光の入射が遮断されたときの前記出力信号の値を、前記光量を算出するステップにより算出される光量のゼロ点として校正するステップと、を備えることを特徴とする。
この光量計測方法によれば、光の入射が遮断されたときの出力信号の値を、光量のゼロ点として校正するので、例えば、背景光に近い、ごく小さなレベルの光量も定量的に正確に評価できる。
この光量計測方法によれば、光の入射が遮断されたときの出力信号の値を、光量のゼロ点として校正するので、例えば、背景光に近い、ごく小さなレベルの光量も定量的に正確に評価できる。
本発明の光量計測方法は、光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測方法において、前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出するステップと、前記光検出手段に与える光の光量を制御可能な校正用光源により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量を算出するステップにより算出される光量のリニアリティを校正するステップと、を備えることを特徴とする。
この光量計測方法によれば、校正用光源により既知の光量の光を光検出手段に与えることで、光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正するので、光量を定量的に評価できる。
この光量計測方法によれば、校正用光源により既知の光量の光を光検出手段に与えることで、光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正するので、光量を定量的に評価できる。
前記校正用光源は、一定光量の光を出力する光源と、値付けされた光アッテネータとにより構成されてもよい。
本発明の光量計測方法は、光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測方法において、前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出するステップと、励起光照射手段から基準となる蛍光信号を発生する基準蛍光信号発生手段に励起光を照射するステップと、前記基準となる蛍光信号により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量算出手段により算出される光量を校正するステップと、を備えることを特徴とする光量計測方法。
この光量計測方法によれば、別途校正用光源を具備せずに既知の光量の光を光検出手段に与えることができると共に、光量算出手段により算出される光量を校正するので、光量を定量的に評価できる。
この光量計測方法によれば、別途校正用光源を具備せずに既知の光量の光を光検出手段に与えることができると共に、光量算出手段により算出される光量を校正するので、光量を定量的に評価できる。
本発明の光量計測装置によれば、シャッターで光の入射が遮断されたときの前記出力信号の値を、前記光量算出手段により算出される光量のゼロ点として校正するので、例えば、背景光に近い、ごく小さなレベルの光量も定量的に正確に評価できる。
本発明の光量計測装置によれば、校正用光源により既知の光量の光を光検出手段に与えることで、光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正するので、光量を定量的に評価できる。
本発明の光量計測方法によれば、光の入射が遮断されたときの出力信号の値を、光量のゼロ点として校正するので、例えば、背景光に近い、ごく小さなレベルの光量も定量的に正確に評価できる。
本発明の光量計測方法によれば、校正用光源により既知の光量の光を光検出手段に与えることで、光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正するので、光量を定量的に評価できる。
以下、図１および図２を参照して、本発明による光量計測装置の一実施形態について説明する。
図１は本実施形態の光量計測装置の光学系の構成を示す図である。本実施形態は、ＤＮＡマイクロアレイ（マイクロアレイ上のＤＮＡやＲＮＡサンプル（以下バイオチップという。））に励起光を照射し、ＤＮＡマイクロアレイで発生する蛍光信号光の光量を計測する光量計測装置である。
図１に示すように、本実施形態の光量計測装置は、ＤＮＡマイクロアレイ（バイオチップ）３０に励起光を照射するための光学系として、励起光を発生する緑色レーザ光源１および赤色レーザ光源２と、緑色レーザ光源１からの照射光を折り曲げるミラー３と、それぞれ、緑色レーザ光源１および赤色レーザ光源２からの照射光の光路に配置されるダイクロイックミラー５、マイクロレンズアレイ６、ミラー７、ダイクロイックミラー８および可動ミラー９と、を備える。
緑色レーザ光源１および赤色レーザ光源２の波長は、ｃｙ３やｃｙ５の蛍光色素の励起光に合致するものである。
また、本実施形態の光量計測装置は、ＤＮＡマイクロアレイ３０で発生する蛍光信号光を受けるための光学系として、信号光の光路に配置されたリレーレンズ１１と、リレーレンズ１１を通過した光を受ける高感度のＣＣＤカメラ１２と、を備える。
さらに、本実施形態の光量計測装置は、光量の校正を行うための光学系として、校正のためのレーザ光を出力する校正用レーザ光源２１と、校正用レーザ光源２１から出力されたレーザ光を減衰させる光アッテネータ２２と、を備える。なお、校正用レーザ光源および光アッテネータ２２は、装置に内蔵する代りに校正時に取り付けるようにしてもよい。
また、ＣＣＤカメラ１２の前面側には、ＣＣＤカメラ１２への入射光を遮断する校正用シャッター２３が設けられている。
図１に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ３０はテーブル４１に載置される。
図２は本実施形態の光量計測装置の制御系の構成を示すブロック図である。
図２に示すように、本実施形態の光量計測装置は、ＣＣＤカメラ１２で捉えた光の光量を算出する光量算出部５１と、校正用シャッター２３を駆動する校正用シャッター駆動部５３と、ミラー９を駆動するミラー駆動部５５と、光量算出部５１の校正を行う校正部５６と、緑色レーザ光源１、赤色レーザ光源２、ＣＣＤカメラ１２、光量算出部５１、校正用レーザ光源２１、光アッテネータ２２、校正用シャッター駆動部５３、ミラー駆動部５５および校正部５６を制御する制御部６１と、を備える。
次に、ＤＮＡマイクロアレイ３０の測定時の動作について説明する。
測定時には、可動ミラー９および校正用シャッター２３は、それぞれ光路から退避した破線で示す位置に駆動される（図１）。
緑色レーザ光源１または赤色レーザ光源２で出力されたレーザ光はミラー３、ダイクロイックミラー５、マイクロレンズアレイ６、ミラー７、およびダイクロイックミラー８を介してＤＮＡマイクロアレイ３０に照射される。
レーザ光による励起により発生したＤＮＡマイクロアレイ３０からの蛍光信号光は、ダイクロイックミラー８およびリレーレンズ１１を介してＣＣＤカメラ１２に入射する。ＣＣＤカメラ１２の出力信号は光量算出部５１に送られ、光量算出部５１では信号光の光量が算出される。
なお、バックグラウンドノイズに埋もれるような低レベルの信号光については、繰り返し加算によるアベレージング処理でランダムなノイズを相対的に低減し、Ｓ／Ｎ比を向上させてもよい。
一般に遺伝子発現量は広いレンジに分布するため、遺伝子発現量を定量的に計測するためには、低いレベルまで光量を高精度に算出することが要求される。しかし、低レベルの光量は背景光（バックグラウンドノイズ）に埋もれやすく、とくに低レベルの光量において算出精度が問題となる。
次に、校正時の動作について説明する。
本実施形態では、ＣＣＤカメラ１２の無信号状態を作り、ゼロ点調整を行う。このとき、校正用シャッター２３は光路を遮断する実線で示す位置に駆動される（図１）。これにより、迷光がＣＣＤカメラ１２に入らない状態が確保される。このときのＣＣＤカメラ１２の出力信号は光量算出部５１に送られ、校正部５６は光量算出部５１に対し、この出力信号値を基準（ゼロ点）とする校正を実行する。
また、本実施形態では、ＣＣＤカメラ１２に入射する光量を制御することで、とくに低光量領域での光量算出の校正を行う。このとき、校正用シャッター２３は光路から退避する破線で示す位置に駆動される。また、可動ミラー９は光路に進入した実線で示す位置に駆動される（図１）。
図１に示すように、校正用レーザ光源２１から出力された光は光アッテネータ２２により減衰され、可動ミラー９およびリレーレンズ１１を介してＣＣＤカメラ１２に入射する。校正用レーザ光源２１から出力されるレーザ光の光量、および光アッテネータ２２による減衰量は既知であるため、ＣＣＤカメラ１２に入射される光量も既知である。また、校正用レーザ光源２１から出力されるレーザ光は、例えば、ｃｙ３の蛍光信号光の波長（５７０ｎｍ）に近い波長を有する。
光アッテネータ２２の減衰量を切り替えることで、例えば、０ｄＢｍ、−１０ｄＢｍ、−２０ｄＢｍ等、正しく値付けされた光をＣＣＤカメラ１２に入射させる。このときのＣＣＤカメラ１２の出力信号は光量算出部５１に送られ、校正部５６は各出力信号値がそれぞれの光量に正しく対応するように、光量算出部５１に対する校正を実行する。
このように本実施形態では、校正用シャッター２３を用いてゼロ点の校正を行うとともに、光アッテネータ２２の減衰量を切り替えることで、とくに低レベルの光量のリニアリティ補正を行うことができる。このため背景光に近い低レベルまで、光量を定量的に正確に計測できる。また、背景光の光量を正しく評価できる。
上記実施形態では、校正用レーザ光源２１と光アッテネータ２２とを用いて、既知の光量の光をＣＣＤカメラ１２に与えているが、光量を調整可能な光源をこれらに代えて用いてもよい。例えば、光源としてＬＥＤを用い、駆動電流によって光量を制御してもよい。
また、校正用光源として、レーザ光源に代えて白色光源を用いてもよい。
さらに、校正用光源と光アッテネータの組み合わせではなく、基準となる蛍光信号を発生する対象物（基準蛍光信号発生手段）をバイオチップ３０の代わりに設置し、そこに緑色レーザ光源や赤色レーザ光源（励起用光照射手段）から励起光を照射し、校正用光源として用いても良い。また、異なる基準蛍光信号を発生する対象物を複数用意することにより、リニアリティ校正ができる。
さらに、校正用光源と光アッテネータの組み合わせではなく、基準となる蛍光信号を発生する対象物（基準蛍光信号発生手段）をバイオチップ３０の代わりに設置し、そこに緑色レーザ光源や赤色レーザ光源（励起用光照射手段）から励起光を照射し、校正用光源として用いても良い。また、異なる基準蛍光信号を発生する対象物を複数用意することにより、リニアリティ校正ができる。
上記実施形態では、ＣＣＤカメラ１２に入射する光の光量を正確に制御することで、光量の校正を行っているが、ＣＣＤカメラ１２に入射する光量を正確に測定してもよい。例えば、ＣＣＤカメラ１２の位置に、光量が正確に測定できるパワーメータを取り付けることで、実際にＣＣＤカメラ１２に入射する光量を正確に測定し、同一条件でのＣＣＤカメラ１２の出力信号と、予め測定された光量とを対応付けるように校正することができる。このようなパワーメータを用いた校正方法として、特開２００４−１９１２３２号公報に開示された方法を本発明に適用することができる。
上記実施形態では、校正に用いる校正部を装置に設けているが、校正のための校正部を校正時に取り付けることで、同様の校正方法を実行してもよい。ここで校正部とは、校正用光源２１，光アッテネータ２２および校正用シャッタ２３である。
上記実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイを測定対象とする場合を例示したが、本発明は、タンパク質、糖鎖、メタボローム等、種々の生体物質の検出に対し同様に適用できる。また、本発明はマイクロアレイによる物質検出に止まらず、半導体プロセスにおける蛍光性塵埃、プラズマディスプレイパネルの蛍光面の評価等にも適用できる。
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量計測装置および光量計測方法に対し、広く適用することができる。
１ 緑色レーザ光源（励起光照射手段）
２ 赤色レーザ光源（励起光照射手段）
１２ ＣＣＤカメラ（光検出手段）
２１ 校正用レーザ光源（校正用光源）
２２ 光アッテネータ（校正用光源）
２３ 校正用シャッター
５１ 光量算出部（光量算出手段）
５６ 校正部（校正手段）
２ 赤色レーザ光源（励起光照射手段）
１２ ＣＣＤカメラ（光検出手段）
２１ 校正用レーザ光源（校正用光源）
２２ 光アッテネータ（校正用光源）
２３ 校正用シャッター
５１ 光量算出部（光量算出手段）
５６ 校正部（校正手段）
Claims (9)
- 光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測装置において、
前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量算出手段と、
前記光検出手段への光の入射を遮断するシャッターと、
前記シャッターで光の入射が遮断されたときの前記出力信号の値を、前記光量算出手段により算出される光量のゼロ点として校正する校正手段と、
を備えることを特徴とする光量計測装置。 - 光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測装置において、
前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量算出手段と、
前記光検出手段に与える光の光量を制御可能な校正用光源と、
前記校正用光源により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量算出手段により算出される光量のリニアリティを校正する校正手段と、
を備えることを特徴とする光量計測装置。 - 前記校正用光源は、一定光量の光を出力する光源と、値付けされた光アッテネータとにより構成されることを特徴とする請求項２に記載の光量計測装置。
- 前記蛍光信号光を発生する対象物に向けて励起光を照射する励起光照射手段を備えることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の光量計測装置。
- 光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測装置において、
前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出する光量算出手段と、
励起光を照射する励起光照射手段と、
この励起光を照射することにより、基準となる蛍光信号を発生する基準蛍光信号発生手段と、
前記基準となる蛍光信号により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量算出手段により算出される光量を校正する校正手段と、
を備えることを特徴とする光量計測装置。 - 光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測方法において、
前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出するステップと、
前記光検出手段への光の入射を遮断するステップと、
光の入射が遮断されたときの前記出力信号の値を、前記光量を算出するステップにより算出される光量のゼロ点として校正するステップと、
を備えることを特徴とする光量計測方法。 - 光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測方法において、
前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出するステップと、
前記光検出手段に与える光の光量を制御可能な校正用光源により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量を算出するステップにより算出される光量のリニアリティを校正するステップと、
を備えることを特徴とする光量計測方法。 - 前記校正用光源は、一定光量の光を出力する光源と、値付けされた光アッテネータとにより構成されることを特徴とする請求項６に記載の光量計測方法。
- 光検出手段で取り込んだ光の光量を計測する光量計測方法において、
前記光検出手段の出力信号に基づいて蛍光信号光の光量を算出するステップと、
励起光照射手段から基準となる蛍光信号を発生する基準蛍光信号発生手段に励起光を照射するステップと、
前記基準となる蛍光信号により既知の光量の光を前記光検出手段に与えることで、前記光量算出手段により算出される光量を校正するステップと、
を備えることを特徴とする光量計測方法。
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