JP5760096B2 - 生物学的分析又は他のシステムにおける計量線量照明のためのシステム及び方法 - Google Patents
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Description
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定量分析における具体的な使用の実施形態によれば、システムは、色チャネルの集積を含むことができ、ここで各色チャネルは、タグの蛍光吸収によって定められるように特定の蛍光分子を励起するために必要とされる特定の波長帯を与えるために用いられる。実施形態によれば、各色チャネルは、固体光源(例えば、LED、レーザ、ライトパイプ又は他の光源)、単一帯域フィルタ、及び光源に給電する電子回路を含むことができる。システム内で、これらチャネルは、例えば落射蛍光測定の場合に必要とされるように各光源からの光が同じ光路を通るように、例えばダイクロイックミラーを用いて組み合わせることができる。
時間的高速分析における個々の使用の実施形態によれば、光源及び回路は、LED、レーザ及びライトパイプではよくあるように、高速切換用に実装することができる。例えば、これらの実施形態によれば、全ての切換は、機械式動作を用いることなく電子的に行うことができる。これにより、10ns乃至1msの範囲の変調を容易に達成することが可能になる。さらに、カメラと照明サブシステムとを直接接続することにより、著しい速度向上を達成することができる。この実施形態によれば、ホストコンピュータがカメラをトリガして、分析を開始させることができる。このカメラが次に照明サブシステムにトリガを送って、励起光をオンにすることができる。線量カウントが基準カウントに等しくなったときに、光はゲート・オフされ、信号がカメラに送られて露光を終了させる。この構成は、非実時間動作システムに付随するタイミングの変動を排除する。
別の実施形態によれば、光線量を正確に計量して照明を正確にオン・オフする能力は、照明器の励起光に対する生物学的試料の全体としての曝露を最小化することができる。そうすることで、光毒性効果が低減し、生存細胞分析のための試料の生存度が延長され、測定に対して照明が負わせるアーチファクトが少なくなる。そのような線量最適化の複合的な利益は、精度が高められ持続時間がより長い定量蛍光分析である。
上述のように、実施形態により、計量線量技術を用いて、パルス間繰返し精度、及びダイナミックレンジの増大が得られる。この技術は、各カメラ露光期間中に要求線量に合わせて光をゲーティングしてオン・オフすることを伴う。他の変調技術、例えばフェルスター(又は蛍光)共鳴エネルギー移動(FRET)、又は蛍光寿命イメージング顕微鏡法(FLIM)を用いることができ、蛍光寿命イメージング顕微鏡法(FLIM)では、照明が変調され、蛍光寿命は、照明信号に対する蛍光信号の位相のずれ及び変調深さによって決定される。図4は、実施形態により、蛍光寿命イメージング顕微鏡法(FLIM)技術146の例を示す。
上述のように、実施形態により、ホストコンピュータを用いて、複数の色の各々についての線量を提供すること及びカメラからのフィードバックデータを受け取ることを含む分析プロトコルを生成することができ、一方、マイクロプロセッサ・ベースのカウンタは、パルス列をカウントし、進行中のカウントを色ごとの基準カウント又は事前設定線量と比較する。他の実施形態により、アナログ測定技術のような代替的な測定技術を用いることができる。図5に示すように、光ダイオード(PD)154の電流出力をトランスインピーダンス増幅器(TIA)156に供給することができ、これが電圧に変換される。この電圧信号は、積分演算増幅器(∫)158によって積分される。比較器(=)160は、積分器出力を所望の線量に等しい目標基準レベルと比較する。2つの値が等しいとき、比較器は、光エンジンをオフにする信号162を生成することができる。
実施形態により、光エンジンは、個々の使用事例を満足させるように、異なるモードで動作させることができ、すなわち、光エンジンの出力を種々の異なる機構で制御することができる。これにより、光エンジンは、例えば品質制御、分析、又はアセスメントに基づく環境において特に有用なものとなる。
実施形態によれば、定電流モードでは、光エンジンの回路は、各光源を通る電流を監視してそれを一定に保つ。電流の量は、較正された抵抗の両端間の電圧降下を測定することによって検知することができる。一旦、熱化されると、パワー出力は、一定の周囲温度及び圧力に対して一定となり、パルス間の再現性は99%を上回る。これは、熱変化又はウォームアップ時間のない良く制御された環境には適した選択肢である。しかしながら、出力は、ウォームアップ、デューティサイクル、パワーレベル及び雰囲気条件によって変動することがある。
実施形態によれば、計量線量モードでは、システムは、上述のものと同様の光−周波数変換器又は回路を用いて、光エンジンの内部で光エンジン出力ビームの一部を監視する。この回路の出力は、カウンタに供給されるパルス列である。カウンタが所望のカウント又は線量に達したときに、露光が停止される。総計の積算光束又は線量は、各々のカメラ露光又は定められた検出期間ごとに同じになるように調節することができる。これは、光源がオンである時間はわずかに変化することがあっても、カウント数は変化しないことを意味する。出力は、光子数でロックすることができ、結果として得られる線量は、ウォームアップ時間、デューティサイクル、パワーレベル又は雰囲気条件の変化の影響を受けにくい。
実施形態によれば、定強度モードでは、光エンジンは、光出力を監視して強度レベルを実時間で調整する回路を含むことができる。このモードは、巻き上げシャッター式カメラ用途に特に有用である。例えば上述の計量線量手法と対比したこの手法の限界としては、予期される変動を相殺するために幾らかのヘッドルームが必要とされるので、送達可能な最大パワー又は強度には妥協が必要な場合があること、露光時間が一般により長くなること、及び、最終的な機器のダイナミックレンジが計量線量で制御される機器の場合よりも小さくなること、が挙げられる。センサ応答は雰囲気条件により変動するので、光エンジン較正の精度もまた計量線量の場合よりもいくぶん低くなる。
142、144、:グラフィカルユーザインタフェース(GUI)
146:蛍光寿命イメージング顕微鏡法(FLIM)
154:光ダイオード
156:トランスインピーダンス増幅器
158:積分演算増幅器
160:比較器
Claims (12)
- 計量線量照明を提供するための照明システムであって、該照明システムは、
複数の異なる色の光を光出力として提供することができる光エンジンと、
前記光出力における光束の指標を生成することができる光検出器と、
前記光検出器で生成された前記光束の指標をパルス列に変換することができ、前記パルス列の周波数が前記光束に比例する、光−周波数変換器と、
前記パルス列によって示される進行中のカウントを、前記複数の異なる色の光における各々の特定の色に対して、事前設定された基準と比較することができるカウンタと、
を備え、
動作中に、前記複数の異なる色の光における各々の特定の色に対して、前記照明システムは、
前記特定の色ごとの基準カウントを決定し、
前記光エンジンをイネーブルにして、露光期間の間、前記特定の色をオンにし、
前記光検出器によって検出され、前記カウンタによってカウントされる前記パルス列に変換された、前記光出力における前記光束の指標を監視し、
前記カウンタが前記基準カウントに達したときに、前記光エンジンによって現時点で提供されている前記特定の色をディスエーブルにする、
ことを特徴とする照明システム。 - 前記光エンジンによって発生した光の一部を、前記光検出器に振り向けるように構成されたビームスプリッタをさらに備え、
前記光検出器は、前記光の一部を受け取り、前記光出力における前記光束の指標を生成する光ダイオードを備えることを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。 - 前記照明システムは、カメラをさらに備え、
前記カウンタが前記基準カウントに達したときに、前記照明システムは信号を前記カメラに送り、前記カメラの露光を終了することを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。 - 前記照明システムは、蛍光を測定するためのカメラをさらに備え、該カメラは、前記照明をゲート・オンし、光−周波数検出器カウントが前記基準カウントに等しくなったときにゲート・オフされることを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。
- 前記照明システムは、イメージングのためのカメラをさらに備え、該システムは、周波数検出器カウントが前記基準カウンタ内の規定量に等しくなったときに前記カメラをゲート・オフすることを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。
- ホストコンピュータ及び生物学的分析システムと組み合わせ、
前記生物学的分析システムは、カメラを備え、
前記生物学的分析システムは、前記照明システムからの前記光出力を試料に向けるように構成され、
前記カメラは、前記照明システムからの前記光出力による蛍光に応じて、前記試料によって発せられた光を受け取るように構成され、
前記ホストコンピュータは、前記露光期間の開始時に前記カメラの露光を駆動するように構成され、
前記照明システムの前記カウンタが前記基準カウントに達したときに、前記照明システムは、信号を前記カメラに送り、前記カメラの露光を終了することを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。 - 生物学的試料内の蛍光タグ又は蛍光体を検出するために用いられることを特徴とする、請求項6に記載の照明システム。
- 蛍光イメージング、高解像度蛍光顕微鏡法、蛍光寿命測定、及び、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)顕微鏡法の1つ又はそれ以上のために用いられることを特徴とする、請求項7に記載の照明システム。
- 前記照明システムは、定量分析のために用いられることを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。
- 前記光エンジンは、計量線量モードで動作するように構成され、前記照明システムは、光−周波数変換器又は回路を用いて、光エンジンの内部で、前記光エンジン出力ビームの一部を監視して、前記光出力が、各々のカメラ露光又は定められた検出期間ごとに、同じカウントになるように調節し、その結果、光源がオンである時間がわずかに変化することがあっても前記カウントが変化しないようにすることを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。
- 前記光エンジンは、定強度モードで動作するように構成され、光強度監視/調整回路が、前記光出力を監視して、前記光エンジンの強度レベルを実時間で調整することを特徴とする、請求項1に記載の照明システム。
- 計量線量照明を提供するための方法であって、
複数の異なる色の光を光出力として提供することができる光エンジンを準備するステップと、
前記光出力における光束の指標を生成することができる光検出器を準備するステップと、
前記光検出器で生成された前記光束の指標をパルス列に変換することができ、前記パルス列の周波数が前記光束に比例する、光−周波数変換器を準備するステップと、
前記パルス列によって示される進行中のカウントを、前記複数の異なる色の光における各々の特定の色に対して、事前設定された基準と比較することができるカウンタを準備するステップと、
を含み、
前記照明システムの動作中に、
前記特定の色ごとの基準カウントを決定するステップと、
露光期間ごとに、前記光エンジンをイネーブルにして前記特定の色をオンにするステップと、
前記光検出器によって検出され、前記カウンタによってカウントされる前記パルス列に変換された、前記光出力における前記光束の指標を監視するステップと、
前記カウンタが前記基準カウントに達したときに、前記光エンジンによって現時点で提供されている前記特定の色をディスエーブルにするステップと、
を含むことを特徴とする方法。
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