JP5370286B2 - 蛍光検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、検体に励起光を照射することにより検体を励起して蛍光を発生させ、その蛍光の強度から測定対象物の濃度を測定する方法及び装置に関するものである。

例えば核酸増幅プロセス（以下、ＰＣＲ反応）において、増幅生成物の生成量を蛍光検出によって測定することが行なわれている。ＰＣＲ反応を行なう検体に蛍光標識を含ませ、励起光を照射して検体を励起することにより蛍光を発生させる。蛍光標識から発せられる蛍光の強度は増幅生成物の増加に伴なって変化するため、蛍光強度を検出することにより増幅生成物の生成量を追跡することができる。

しかし、蛍光標識の発光強度には温度特性があり、ＰＣＲ反応における温度変化によって蛍光標識からの蛍光の発光強度が変化するため、蛍光の測定値にそのような温度変化による影響を含むことになる。そのため、蛍光標識の発光強度の温度特性に基づいて検出強度の測定値を所定の基準値のものに換算する補正を行なっていた。

しかし、励起光を照射する光源としての発光ダイオード（以下、ＬＥＤ）においても励起光の発光強度に温度特性をもつものがある。そのようなＬＥＤを用いて蛍光検出を行なった場合には、ＰＣＲ反応における温度変化によって発光強度が変化し、検出強度の測定値に蛍光標識の発光強度の温度特性による影響とＬＥＤの発光強度の温度特性による影響が含まれていることになる。そのような場合に、検出強度の測定値を蛍光標識の発光強度の温度依存特性に基づいて補正してもＬＥＤの温度特性による影響が残るため、増幅生成物の生成量に応じて蛍光標識から発せられる正確な蛍光強度の値が得られなかった。

上記問題を解決するために、実際の測定に使用されるＬＥＤと同じ仕様の対照用ＬＥＤを設けてその光量を同時に測定して対照光とすることにより、測定値の補正を行なうことが提案されている（特許文献１参照。）。

特表２００９−５０７５０１号公報 特開２００９−１２２２０３号公報

しかし、温度特性の大きなＬＥＤでは、測定用ＬＥＤと対照用ＬＥＤとが同じ仕様のＬＥＤであっても固体間の温度特性の差が存在するため、同じ温度特性を示すとは限らない。例えば、数ワット級の高輝度ＬＥＤを使用する場合、ＬＥＤとその基板の密着具合によってはＬＥＤ素子自体の温度上昇に差が生じて輝度のばらつきが生じる。したがって、対照用ＬＥＤと測定用ＬＥＤで異なる個体のＬＥＤを使用すると、両者間で輝度に差が生じ、正確な補正を行なうことはできない。

そこで本発明は、検体から発せられる蛍光強度の測定値を光源の発光強度の温度特性による影響を除去したものに補正できるようにすることを目的とするものである。

光源の温度特性による測定結果への影響を除去するための原理について説明する。温度変化による光源の発光強度の変化を調べるために、測定用の励起光を発する測定光源とは別に参照用の励起光を発する参照光源を使用し、これらの光源からの励起光を照射したときの蛍光の強度を測定するために基準物質を使用する。

参照光源としては、例えば分析を行なう環境温度の範囲内では発光強度を一定とみなすことができるもの、例えば青色発光ダイオードを使用する。「一定とみなすことができる」とは、温度によってその発光強度が変化するものの、その変化量が３％以下であることを意味する。例えば青色発光ダイオードは、１０℃〜３５℃の間の環境温度変化においてその発光強度の変化率が１％程度であり、一定とみなすことができるものである。

基準物質としては、測定光源からの測定励起光、参照光源からの参照励起光のいずれの励起光によっても励起されて蛍光を発生させ、その発光効率の温度特性が励起光の波長の違いに影響されない物質である。そのような基準物質としては、例えば硫化カドミウム（ＣｄＳ）とセレン（Ｓｅ）を添加したガラスを用いることができる。「発光効率の温度特性が励起光の波長の違いに影響されない」とは、励起光の波長の違いによる発光効率の差が分析を行なう環境温度の範囲内では±５％以内であり、無視することができる程度に小さいことを意味する。

基準時に基準温度Ｔ₀（例えば２５℃）の条件下で、基準物質に参照励起光を照射したときの基準物質からの蛍光強度をＩ_A（Ｔ₀）、基準物質に測定励起光を照射したときの基準物質からの蛍光強度をＩ_B（Ｔ₀）とする。測定時に測定温度Ｔにおける参照光源の相対輝度をΦ_A（Ｔ）（基準時を１とする）、測定光源の相対輝度をΦ_B（Ｔ）（基準時を１とする）とする。参照光源の輝度は温度変化に影響されないため、Φ_A（Ｔ）＝１とみなすことができる。Φ_B（Ｔ）が測定光源の温度特性による影響を意味するものであり、最終的にΦ_B（Ｔ）に基づいて補正することを目的としている。

測定時に測定温度Ｔの条件下で、基準物質を参照励起光により励起したときの基準物質の発光効率をａ_A（Ｔ）（基準時を１とする）、測定時において測定励起光により基準物質を励起したときの基準物質の発光効率はａ_B（Ｔ）（基準時を１とする）とする。ここで、励起光の波長の違いが基準物質の蛍光強度に与える影響は無視できる程度に小さいため、ａ_A（Ｔ）＝ａ_B（Ｔ）とみなすことができる。

測定時に測定温度Ｔの条件下で、参照励起光により基準物質を励起して得られる蛍光の信号強度Ｉ_A（Ｔ）は次式（１）で表わすことができる。
Ｉ_A（Ｔ）＝Ｉ_A（Ｔ₀）・Φ_A（Ｔ）・ａ_A（Ｔ）＝Ｉ_A（Ｔ₀）・ａ_A（Ｔ） （１）
同様に、測定時における測定励起光により基準物質を励起して得られる蛍光の信号強度Ｉ_B（Ｔ）は次式（２）で表わすことができる。
Ｉ_B（Ｔ）＝Ｉ_B（Ｔ₀）・Φ_B（Ｔ）・ａ_B（Ｔ） （２）

上記（１），（２）式より、
Φ_B（Ｔ）＝Ｉ_A（Ｔ₀）／Ｉ_B（Ｔ₀）・Ｉ_B（Ｔ）／Ｉ_A（Ｔ） （３）
となる。測定時に測定された検体からの蛍光強度の測定値Ｉ（Ｔ）から測定励起光の温度変化に温度変化分を除去するためにはＩ（Ｔ）をΦ_B（Ｔ）で割ればよい。したがって、補正値Ｉ'（Ｔ）は、次式（４）で表わすことができる。
Ｉ'（Ｔ）＝Ｉ（Ｔ）・Ｉ_B（Ｔ₀）／Ｉ_A（Ｔ₀）・Ｉ_A（Ｔ）／Ｉ_B（Ｔ） （４）

本発明の蛍光測定方法は上記理論を用いたものである。すなわち、光源として参照光源と測定光源とを用い、基準時に基準温度Ｔ₀の条件下で基準物質に対して参照励起光と測定励起光をそれぞれ照射したときに得られる蛍光強度Ｉ_A（Ｔ₀），Ｉ_B（Ｔ₀）を測定する基準時補正要素測定工程と、測定時に測定温度Ｔの条件下で検体に測定励起光を照射して得られる蛍光強度Ｉ（Ｔ）を測定する検体測定工程と、測定時に測定温度Ｔの条件下で基準物質に参照励起光と測定励起光をそれぞれ照射して得られる蛍光強度Ｉ_A（Ｔ），Ｉ_B（Ｔ）を測定する測定時補正要素測定工程と、次式により得られるＩ'（Ｔ）に基づいて測定対象物の濃度を求める演算処理工程と、を行なう方法である。
Ｉ'（Ｔ）＝Ｉ（Ｔ）・Ｉ_A（Ｔ）／Ｉ_B（Ｔ）・Ｉ_B（Ｔ₀）／Ｉ_A（Ｔ₀）

本発明の蛍光検出装置は、上記蛍光測定方法を実行するための構成及び機能を備えた装置である。具体的には、参照励起光を発生させその発光強度を測定温度範囲においては温度に拘わらず一定とみなすことができる参照光源と、参照励起光とは異なる波長をもつ測定励起光を発生させその発光強度に温度特性を有する測定光源と、検体を配置するための検体配置部と、参照励起光と測定励起光のそれぞれにより励起されて蛍光を発生させ、その発光効率の温度特性が励起光の波長の違いに影響されない基準物質を配置するための基準物質配置部と、入射した光の強度を検出する光検出器と、参照光源からの参照励起光を検体配置部又は基準物質配置部に導く参照光学系と、測定光源からの測定励起光を検体配置部又は基準物質配置部に導く測定光学系と、検体又は基準物質から発せられた蛍光を光検出器に導く蛍光光学系と、参照光源、測定光源及び光検出器を制御する制御部と、光検出器の信号強度に基づいて測定対象物の濃度を求める演算処理部と、基準物質に対し、基準温度Ｔ₀の条件下で参照励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_A（Ｔ₀）及び基準温度Ｔ₀の条件下で測定励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ₀）を保持する補正要素保持部と、を備えている。そして、制御部は、測定対象の検体に対し、測定温度Ｔの条件下で測定励起光を照射したときの検体からの蛍光強度Ｉ（Ｔ）を測定するように構成された検体測定手段と、基準物質に対し、測定温度Ｔの条件下で参照励起光を照射したときの基準物質からの蛍光強度Ｉ_A（Ｔ）及び測定励起光を照射したときの基準物質からの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ）を測定するように構成された測定温度時補正要素測定手段と、を備えている。演算処理部は次式により得られるＩ'（Ｔ）に基づいて測定対象物の濃度を求めるように構成されているものである。
Ｉ'（Ｔ）＝Ｉ（Ｔ）・Ｉ_A（Ｔ）／Ｉ_B（Ｔ）・Ｉ_B（Ｔ₀）／Ｉ_A（Ｔ₀）

以上のように、本発明の蛍光測定方法及び蛍光検出装置は、基準物質に対し、基準温度Ｔ₀の条件下で参照励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_A（Ｔ₀）、基準温度Ｔ₀の条件下で測定励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ₀）、測定温度Ｔの条件下で参照励起光を照射したときの基準物質からの蛍光強度Ｉ_A（Ｔ）及び測定励起光を照射したときの基準物質からの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ）を用い、測定対象の検体に対して測定温度Ｔの条件下で測定励起光を照射したときの検体からの蛍光強度Ｉ（Ｔ）を補正するので、光源の温度特性による影響を除去した測定値を得ることができる。

蛍光検出装置の一実施例を示すブロック図である。 同実施例の概略構成図であり、（Ａ）は検体測定時、（Ｂ）は基準物質測定時を示す図である。 同実施例における蛍光検出の測定値の補正方法を示すフローチャートである。 発光ダイオードの発光強度と温度との関係を示すグラフである。

図１のブロック図を用いて蛍光検出装置の一実施例について説明する。
所定の位置に配置された検体３ａを励起させて蛍光を発生させるための測定用の励起光（測定励起光）を発生させる測定光源装置２ｂ及び測定励起光とは異なる波長の光（参照励起光）を発生させる参照光源装置２ａを備えている。検体３ａとは別の位置に基準物質３ｂが配置されている。基準物質３ｂは測定光源装置２ｂからの測定励起光によって励起され蛍光を発生させるとともに、参照光源装置２ａからの参照励起光によっても励起され蛍光を発生させるものである。

検体３ａからの蛍光及び基準物質３ｂからの蛍光を検出するための検出器４が設けられている。この蛍光検出器を制御する制御部５には、検体３ａの測定を行なうための検体測定手段６及び検体測定値の補正に用いられる補正要素を測定するための補正要素測定手段７が設けられている。

検体測定手段６は、実際に検体の測定を行なうためのものである。すなわち、所定の温度条件（Ｔ℃とする）下で測定光源装置２ｂから検体３ａに励起光を照射し、励起した検体３ａから発せられる蛍光を検出することにより得られる検出器４の信号強度Ｉ（Ｔ）を測定するように構成されている。補正要素測定手段７は、検体の測定時と同じ温度Ｔの条件下で、参照光源装置２ａから基準物質３ｂに励起光を照射し、励起した基準物質３ｂから発せられる蛍光を検出することにより得られる検出器４の信号強度Ｉ_A（Ｔ）を測定する工程と、同じ条件で、測定光源装置２ｂから基準物質３ｂに励起光を照射し、励起した基準物質３ｂから発せられる蛍光を検出することにより得られる検出器４の信号強度Ｉ_B（Ｔ）を測定する工程を実行するように構成されている。

補正要素を保持しておくための補正要素保持部８が設けられている。補正要素保持部８は、測定されたＩ_A（Ｔ）及びＩ_B（Ｔ）を測定温度時補正要素として保持する。また、補正要素保持部８は基準温度時補正要素Ｉ_A（Ｔ₀）、Ｉ_B（Ｔ₀）を保持している。Ｉ_A（Ｔ₀）は基準温度Ｔ₀（例えば２５℃）の条件下で参照励起光を基準物質に照射したときに得られる検出器４の信号強度（蛍光強度）、Ｉ_B（Ｔ₀）は基準温度Ｔ₀の条件下で測定励起光を基準物質に照射したときに得られる検出器４の信号強度である。

演算処理部９は、以下の式により検体測定値Ｉ（Ｔ）の補正処理を行なって補正後の測定値Ｉ'（Ｔ）を求めるように構成されている。
Ｉ'（Ｔ）＝Ｉ（Ｔ）・Ｉ_A（Ｔ）／Ｉ_B（Ｔ）・Ｉ_B（Ｔ₀）／Ｉ_A（Ｔ₀）

同実施例の具体的な構成の一例について図２（Ａ）を用いて説明する。
この実施例では、光源、検出器及び光学系を１つの光学ユニット１２とし、光学ユニット１２を移動させる移動機構（図示は省略）を備えている。光学ユニット１２の下部に、検体３ａを収容するための複数のウエル４０（検体配置部）と基準物質３ｂを配置するための基準物質配置部４２が同一平面内に設けられている。

光学ユニット１２は互いに発生させる光の波長帯が異なる２つのＬＥＤ１４，１６を備えている。ＬＥＤ１４は測定用光源であり、５８０ｎｍ〜６００ｎｍの波長の光を発生させる。ＬＥＤ１６は参照用光源であり、４５０ｎｍ〜４７０ｎｍの波長の光を発生させる。ＬＥＤ１４としては例えばオレンジ色のＬＥＤを用いることができ、ＬＥＤ１６としては青色のＬＥＤを用いることができる。図４に示されているように、青色ＬＥＤの発光強度は他色のＬＥＤに比べて温度変化による影響を受けにくく、一定とみなすことができる。ＬＥＤ１４からの光から抽出される励起光を測定励起光、ＬＥＤ１６からの光から抽出される励起光を参照励起光と呼ぶ。

ウエル４０に収容される検体３ａは、例えば５７５ｎｍ〜６１０ｎｍの波長の光（測定励起光）の照射により励起して５９８ｎｍ〜６３７ｎｍの蛍光を発生させる蛍光標識が入れられたＰＣＲ反応用検体である。基準物質３ｂは例えば硫化カドミウムとセレンの添加によって赤色に着色された色ガラスフィルタであり、例えば５６５ｎｍ〜５７８ｎｍの波長の光の照射により励起して蛍光を発するが、４５０ｎｍ〜４８８ｎｍの波長の光の照射によっても励起して蛍光を発するものである。すなわち、基準物質３ｂは測定励起光と参照励起光のいずれによっても励起して蛍光を発し、その発光効率の温度特性が照射された励起光の波長の違いに影響されないものである。影響されないとは、励起光の波長の違いによる発光効率の差が分析を行なう環境温度の範囲内では±５％以内であり、無視することができる程度に小さいことを意味する。

ＬＥＤ１４は水平横向きに配置され、ＬＥＤ１６は鉛直下向きに配置されている。ＬＥＤ１４から発せられた光を照射対照の位置に導くための測定光学系はレンズ１８、ダイクロイックミラー２０、フィルタ２４、ダイクロイックミラー２６及びレンズ２８により構成され、ＬＥＤ１６から発せられた光を照射対照の位置に導くための参照光学系はレンズ２２、ダイクロイックミラー２０、フィルタ２４、ダイクロイックミラー２６及びレンズ２８により構成されている。図１における測定光源装置２ｂはＬＥＤ１４及び測定光学系によって構成され、参照光源装置２ａはＬＥＤ１６及び参照光学系によって構成されている。

レンズ１８、ダイクロイックミラー２０、フィルタ２４及びダイクロイックミラー２６はＬＥＤ１４からの光の光軸上に並んで配置されている。ＬＥＤ１６及びレンズ２２は光をダイクロイックミラー２０に照射させる位置に配置されており、ダイクロイックミラー２０はＬＥＤ１４からの光の光軸方向に対して傾斜して配置されている。

ダイクロイックミラー２０は４５度の角度で光が入射したときに５６０ｎｍ〜５９０ｎｍの波長の光を透過させ、４６０ｎｍ〜４９０ｎｍの波長の光を反射させるものである。すなわち、ダイクロイックミラー２０では、ＬＥＤ１４からの光は透過し、ＬＥＤ１６からの光は反射される。ダイクロイックミラー２０で反射されるＬＥＤ１６からの光がＬＥＤ１４からの光と同じ光路をとるようにＬＥＤ１４およびレンズ１８の位置とＬＥＤ１６およびレンズ２２の位置が調整されている。

フィルタ２４は、ダイクロイックミラー２０によって導かれるＬＥＤ１４又はＬＥＤ１６からの光から所定の波長帯域の光を抽出するために設けられている。フィルタ２４は互いに異なる２つの波長帯域の光のみを通過させる２バンドフィルタである。フィルタ２４が通過させる波長帯域は、検体を励起させる測定励起光として用いられる５６５ｎｍ〜５７８ｎｍの波長帯域と、参照励起光として用いられる４５０ｎｍ〜４８８ｎｍの波長帯域である。このような２バンドフィルタとして、例えば特許文献２に開示されている光学フィルタを用いることができる。このフィルタ２４により、ＬＥＤ１４で発せられた光から測定励起光が抽出され、ＬＥＤ１６で発せられた光から参照励起光が抽出される。

ダイクロイックミラー２６はフィルタ２４を透過した光を鉛直下向きに反射させるように傾斜して配置されている。ダイクロイックミラー２６の下方にレンズ２８が配置されており、ダイクロイックミラー２６で反射された光がレンズ２８によって集光されて光学ユニット１２の外部の検体又は基準物質３ｂに照射される。ダイクロイックミラー２６は４５度の角度で光が入射したときに４５０ｎｍ〜５００ｎｍおよび５６５ｎｍ〜５９５ｎｍの波長の光を反射させ、５３０ｎｍ〜５３６ｎｍおよび６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長の光を通過させるものである。すなわち、フィルタ２４によって抽出された測定励起光及び参照励起光はダイクロイックミラー２６で反射されてレンズ２８側へ導かれるように構成されている。一方で、レンズ２８を介して入ってきた光のうち５３０ｎｍ〜５３６ｎｍおよび６２５ｎｍ〜６５０ｎｍの波長の光はダイクロイックミラー２６を通過する。検体又は基準物質３ｂから発せられる蛍光は５３０ｎｍ〜５３６ｎｍおよび６３０ｎｍ〜６５０ｎｍの波長をもち、ダイクロイックミラー２６を通過する。

ダイクロイックミラー２６の上方にフィルタ３０が配置され、さらにその上方にレンズ３２及び光検出器４が配置されている。フィルタ３０は互いに異なる２つの波長帯域の光のみを通過させる２バンドフィルタである。フィルタ３０が通過させる波長帯域は、検体３ａ又は基準物質３ｂから発せられる蛍光の５３０ｎｍ〜５３６ｎｍおよび６３０ｎｍ〜６５０ｎｍの波長帯域である。このような２バンドフィルタとして、例えば特許文献２に開示されている光学フィルタを用いることができる。フィルタ３０へ導かれた光のうち蛍光に相当する波長をもつ成分がレンズ３２によって光検出器４に集光されて検出される。光検出器４は例えばフォトダイオードである。

この蛍光検出装置の動作について図２及び図３を用いて説明する。この蛍光検出装置は、図２（Ａ）に示されているように光学ユニット１２が所定のウエル４０の位置へ移動して検体３ａの測定を行なう検体測定工程と、（Ｂ）に示されているように光学ユニット１２が基準物質配置部４２の位置へ移動して検体測定工程と同じ温度条件下で基準物質３ｂの測定を行なう補正要素測定工程を実行する。なお、この実施例では、基準温度Ｔ₀時における基準物質３ｂの測定値Ｉ_A（Ｔ₀），Ｉ_B（Ｔ₀）は予め測定されて装置内部の記録媒体（補正要素保持部）に記憶されている。検体測定工程と補正要素測定工程はどちらを先に実行してもよいが、この例では検体測定工程を先に行なう場合について説明する。

まず、測定対象の検体３ａが収容されたウエル４０上の位置にレンズ２８がくる位置に光学ユニット１２を移動させる（ステップＳ１）。ＬＥＤ１４を点灯させて測定励起光を検体３ａに照射し励起した検体３ａからの蛍光強度Ｉ（Ｔ）を光検出器４で測定する（ステップＳ２）。次に、基準物質３ｂ上にレンズ２８がくる位置に光学ユニット１２を移動させる（ステップＳ３）。

Ｉ（Ｔ）の測定と同じ温度で、ＬＥＤ１４を点灯させて測定励起光を基準物質３ｂに照射して得られる検出器４の信号強度Ｉ_B（Ｔ）及びＬＥＤ１６を点灯させて参照励起光を基準物質３ｂに照射して得られる検出器４の信号強度Ｉ_A（Ｔ）を検出器４で測定する（ステップＳ４）。Ｉ_A（Ｔ₀），Ｉ_B（Ｔ₀），Ｉ_A（Ｔ），Ｉ_B（Ｔ）に基づいてＩ（Ｔ）からＬＥＤ１４の発光強度の温度特性の影響を除去した補正値Ｉ'（Ｔ）を求める（ステップＳ５）。

なお、同じ温度で複数の検体３ａについて測定を行なう場合には、その温度下で測定した補正要素Ｉ_A（Ｔ），Ｉ_B（Ｔ）を複数の検体３ａの測定値の補正に用いることができるため、補正要素Ｉ_A（Ｔ），Ｉ_B（Ｔ）を検体３ａごとに行なう必要はない。

２ａ 参照光源装置
２ｂ 測定光源装置
３ａ 検体
３ｂ 基準物質
４ 検出器
５ 制御部
６ 検体測定手段
７ 補正要素測定手段
８ 補正要素保持部
９ 演算処理部
１２ 光学ユニット
１４，１６ ＬＥＤ
１８，２２，２８，３２ レンズ
２０，２６ ダイクロイックミラー
２４，３０ ２バンドフィルタ
４０ 検体ウエル
４２ 基準物質配置部

Claims (3)

1. 参照励起光を発生させその発光強度を測定温度範囲においては温度に拘わらず一定とみなすことができる参照光源と、参照励起光とは異なる波長をもつ測定励起光を発生させその発光強度に温度特性を有する測定光源と、測定対象の検体とは別途設けられ、前記参照励起光と測定励起光のそれぞれにより励起されて蛍光を発生させ、その発光効率の温度特性が励起光の波長の違いに影響されない基準物質を用い、
   前記基準物質に対し、基準温度Ｔ₀の条件下で基準時に参照励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_A（Ｔ₀）及び基準温度Ｔ₀の条件下で基準時に測定励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ₀）を測定する基準時補正要素測定工程と、
   測定対象の検体に対し、測定温度Ｔの条件下で測定時に測定励起光を照射したときの前記検体からの蛍光強度Ｉ（Ｔ）を測定する検体測定工程と、
   前記基準物質に対し、測定温度Ｔの条件下で測定時に参照励起光を照射したときの前記基準物質からの前記蛍光強度Ｉ_A（Ｔ）及び測定励起光を照射したときの前記基準物質からの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ）を測定する測定時補正要素測定工程と、
   次式により得られるＩ'（Ｔ）に基づいて測定対象物の濃度を求める演算処理工程と、を備えた蛍光測定方法。
   Ｉ'（Ｔ）＝Ｉ（Ｔ）・Ｉ_A（Ｔ）／Ｉ_B（Ｔ）・Ｉ_B（Ｔ₀）／Ｉ_A（Ｔ₀）
2. 参照励起光を発生させその発光強度を測定温度範囲においては温度に拘わらず一定とみなすことができる参照光源と、
   参照励起光とは異なる波長をもつ測定励起光を発生させその発光強度に温度特性を有する測定光源と、
   検体を配置するための検体配置部と、
   前記参照励起光と測定励起光のそれぞれにより励起されて蛍光を発生させ、その発光効率の温度特性が励起光の波長の違いに影響されない基準物質を配置するための基準物質配置部と、
   入射した光の強度を検出する光検出器と、
   前記参照光源からの参照励起光を前記検体配置部又は基準物質配置部に導く参照光学系と、
   前記測定光源からの測定励起光を前記検体配置部又は基準物質配置部に導く測定光学系と、
   検体又は基準物質から発せられた蛍光を前記光検出器に導く蛍光光学系と、
   前記参照光源、測定光源及び光検出器を制御する制御部と、
   前記光検出器の信号強度に基づいて測定対象物の濃度を求める演算処理部と、
   前記基準物質に対し、基準温度Ｔ₀の条件下で参照励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_A（Ｔ₀）及び基準温度Ｔ₀の条件下で基準時に測定励起光を照射したときの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ₀）を保持する補正要素保持部と、を備え、
   前記制御部は、測定対象の検体に対し、測定温度Ｔの条件下で測定時に測定励起光を照射したときの前記検体からの蛍光強度Ｉ（Ｔ）を測定するように構成された検体測定手段と、前記基準物質に対し、測定温度Ｔの条件下で測定時に参照励起光を照射したときの前記基準物質からの前記蛍光強度Ｉ_A（Ｔ）及び測定励起光を照射したときの前記基準物質からの蛍光強度Ｉ_B（Ｔ）を測定するように構成された測定時補正要素測定手段と、を備え、
   前記演算処理部は次式により得られるＩ'（Ｔ）に基づいて測定対象物の濃度を求めるように構成されている蛍光検出装置。
   Ｉ'（Ｔ）＝Ｉ（Ｔ）・Ｉ_A（Ｔ）／Ｉ_B（Ｔ）・Ｉ_B（Ｔ₀）／Ｉ_A（Ｔ₀）
3. 前記参照光源は青色発光ダイオードである請求項２に記載の蛍光検出装置。

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