JP4818441B2 - 蛍光測定装置及び蛍光測定方法 - Google Patents
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Description
蛍光測定装置を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、DNA、RNA、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素は蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を測定することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
しかし、光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値であるかどうかの判別は、必ずしも全てのユーザにとって容易であるとは限らない。そのため、光電子増倍管やアンプのゲインが適正な値であるかどうかをユーザが判別するのが困難である場合、蛍光測定装置により求められた蛍光寿命の測定精度が低下する可能性がある。
<第1の実施形態>
(フローサイトメータの構成)
まず、図1を参照して、本実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図1は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された測定対象物が発する蛍光を受光することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
図1に示されるように、本実施形態のフローサイトメータは、フローセル10と、レーザ光源20と、第1受光部30と、第2受光部32と、制御部40と、信号処理部50と、判別部70と、出力部80と、ゲイン調整部90と、を備える。また、フローセル10の下流には、測定対象物を回収する容器16が配置される。以下、各構成について詳細に説明する。
レーザ光源20が照射するレーザ光の強度は、後述する制御部40から出力される変調信号によって変調される。
第1受光部30によって変換された電気信号は信号処理部50へ出力され、フローセル10にレーザ光が照射される位置を測定対象物が通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
光電子増倍管34によって変換された電気信号は信号処理部50へ出力され、フローセル10にレーザ光が照射される位置を通過する測定対象物の情報として用いられる。また、光電子増倍管34のゲインは、ゲイン調整部90によって調整される。
発振器42から出力された所定の周波数の正弦波信号(変調信号)は、パワースプリッタ44により、2つのアンプ46,48に分配される。アンプ46で増幅された変調信号は、レーザ光源20へ出力される。また、アンプ48で増幅された変調信号は、信号処理部50へ出力される。アンプ48で増幅された変調信号を信号処理部50へ出力するのは、後述するように、第2受光部32から出力される信号を検波するための参照信号として用いるためである。
IQミキサ52は、蛍光信号と参照信号とを乗算することにより、蛍光信号のcos成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。また、IQミキサ52は、蛍光信号と、参照信号の位相を90度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のsin成分と、高周波成分とを含む信号を生成する。この信号に基づいて、変調信号(参照信号)と蛍光信号との位相差を求めることができる。
なお、アンプ54のゲインは、ゲイン調整部90によって調整される。
演算部60が演算した結果は、判別部70へ出力される。
また、判別部70は、蛍光寿命のばらつきの大きさを求める。判別部70が行う詳細な処理については、後述する。
判別部70は、判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを、出力部80とゲイン調整部90に出力する。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
次に、信号処理部50による信号処理の流れを説明する。
まず、レーザ光の強度を変調するための変調信号が、制御部40から信号処理部50へ参照信号として出力される。信号処理部50に入力される参照信号は、例えば、所定の周波数の正弦波信号である。
また、測定対象物にレーザ光が照射されたときに発せられる蛍光を第2受光部32が受光する。第2受光部32は、受光した蛍光信号を信号処理部50へ出力する。
また、IQミキサ52は、蛍光信号と、参照信号の位相を90度シフトさせた信号と、を乗算することにより、蛍光信号のsin成分と高周波成分とを含む信号を生成する。その後、ローパスフィルタ56によって高周波成分が除去される。
演算部60は、複数(例えば、N個)の測定対象物に対して、時間平均された蛍光信号のcos成分、sin成分をプロットする。また、演算部60は、時間平均された蛍光信号のcos成分、sin成分の複数のプロットから、参照信号に対する蛍光信号の位相差を求める。例えば、図5に示される複数のプロットを、原点を通る直線で近似した直線の傾きから、演算部60は参照信号に対する蛍光信号の位相差θを求めることができる。
演算部60は、求めた位相差θを用いて、上記式(1)に基づいて、蛍光寿命を求める。
次に、演算部60が求めた蛍光寿命が、第2受光部32、又は、信号処理部50が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが所定の値より大きい状況で求められたものか否かを、判別部70が判別する。以下、第2受光部32、又は、信号処理部50が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別部70が判別する方法について説明する。光電子増倍管34やアンプ54のゲインが適正な値である場合、演算部60により求められた蛍光信号のcos成分、sin成分は、図5に示されるように、原点を通る直線L1に沿ってプロットされる。直線L1は、例えば、最小二乗法によって求められる。
また、図6に示されるように、アンプ54のゲインが適正な値ではない場合の直線L2に対する各プロットの分散は、図5に示されるアンプ54のゲインが適正な値である場合の直線L1に対する各プロットの分散よりも大きくなる。
また、図7に示されるように、光電子増倍管34のゲインが適正な値ではない場合の直線L3に対する各プロットの分散は、図5に示される光電子増倍管34のゲインが適正な値である場合の直線L1に対する各プロットの分散よりも大きくなる。
分散が所定の値より大きい場合、判別部70は、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも大きいことを示す信号を、判別結果として、出力部80とゲイン調整部90に出力する。また、分散が所定の値より小さい場合、判別部70は、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも小さいことを示す信号を、判別結果として、出力部80とゲイン調整部90に出力する。
また、判別部70は、蛍光寿命のばらつきの大きさ(分散)、蛍光寿命などを、出力部80とゲイン調整部90に出力する。
次に、ゲイン調整部90が光電子増倍管34やアンプ54のゲインを調整する方法について説明する。
ゲイン調整部90は、判別部70から出力された判別結果に基づいて、光電子増倍管34やアンプ54のゲインを調整する。本実施形態では、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも大きいことを示す信号が、判別結果としてゲイン調整部90に入力されると、ゲイン調整部90は、光電子増倍管34とアンプ54の両方のゲインを低下させるように、ゲインを調整する。
なお、蛍光寿命のばらつきが所定の値よりも小さいことを示す信号が、判別結果としてゲイン調整部90に入力された場合は、ゲイン調整部90は、光電子増倍管34とアンプ54のゲインをそのままの値に保つ。
第1の実施形態においては、演算部60により求められた蛍光信号のcos成分、sin成分を、判別部70が原点を通る直線で近似した際の分散によって、第2受光部32、又は、信号処理部50が蛍光信号を増幅することに起因する蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別する方法について説明した。本変形例においては、判別部70による判別方法が第1の実施形態とは異なる。
本変形例の判別部70は、演算部60により求められた蛍光信号のcos成分、sin成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさが所定の値より大きいか否かを判別する。
また、判別部70は、蛍光寿命のばらつきの大きさ(二次の係数)、蛍光寿命などを、出力部80とゲイン調整部90に出力する。
しかし、図6に示される例のように、アンプ54のゲインが適正な値ではない場合や、図7に示される例のように、光電子増倍管34のゲインが適正な値ではない場合は、演算部60により求められた蛍光信号のcos成分、sin成分を、原点を通る二次関数で近似した際の二次の係数の大きさは所定の値より大きくなる。
本変形例の蛍光測定装置は、判別部70による判別方法が第1の実施形態とは異なる。
本変形例の判別部70は、演算部60により求められた蛍光信号のcos成分の最大値と最小値との間を5つの区間に分ける。また、判別部70は、演算部60により求められた蛍光信号のcos成分、sin成分を、各区間において直線で近似する。また、判別部70は、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きいか否かを判別する。また、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きい場合、判別部70は、直線の傾きが変化した区間を特定する。
また、図7に示される例のように、光電子増倍管34のゲインが適正な値ではない場合、演算部60により求められた蛍光信号のcos成分、sin成分は、各区間において近似した直線は図8(c)のように示される。図8(c)においては、例えば、原点に近い区間から2つ目までの区間における直線の傾きは、4つ目と5つ目の区間における直線の傾きとは異なる。そのため、各区間において近似した直線の傾きの大きさの差が所定の値より大きくなる。
本変形例のゲイン調整部90は、判別部70が判別した結果に基づいて、光電子増倍管34、又は、アンプ54のいずれか一方のゲインを低下させるように、ゲインを調整する。
なお、本変形例では5つの区間に分ける構成を説明したが、区間の数はこれに限定されるものではない。
上述した実施形態や変形例のフローサイトメータでは、光電子増倍管34やアンプ54のゲインが適正な値でない場合、ゲイン調整部90が光電子増倍管34やアンプ54のゲインの調整を行うことができる。しかし、熟練したユーザの場合、光電子増倍管34やアンプ54のゲインの調整はユーザ自身が行うことが望ましい場合がある。本実施形態のフローサイトメータは、光電子増倍管34やアンプ54のゲインの調整はユーザ自身が行うことを前提とし、光電子増倍管34やアンプ54のゲインが適正な値でないことをユーザが見落とすのを防ぐことを目的とする。
第2受光部32が備える光電子増倍管34のゲインは、ユーザによって調整される。また、アンプ54のゲインは、ユーザによって調整される。
判別部70は、判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを、出力部80に出力する。
また、出力部80は、判別部70が判別した結果、蛍光寿命のばらつきの大きさ、蛍光寿命などを出力する。
12 細胞
14 蛍光色素
16 容器
20 レーザ光源
30 第1受光部
32 第2受光部
34 光電子増倍管
40 制御部
42 発振器
44 パワースプリッタ
46,48 アンプ
50 信号処理部
52 IQミキサ
54 アンプ
56 ローパスフィルタ
58 A/D変換器
60 演算部
70 判別部
80 出力部
90 ゲイン調整部
Claims (10)
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定装置であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源と、
光電子増倍管を備え、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を受光する受光部と、
前記受光部が受光した前記蛍光の信号を増幅するアンプを備え、前記受光部が受光した前記蛍光の信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理部と、
前記光電子増倍管、又は、前記アンプが前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別し、かつ、前記ばらつきが前記所定の値より大きい場合、前記光電子増倍管と前記アンプのいずれのゲインが適正ではないかを判別する判別部と、
を備えることを特徴とする蛍光測定装置。 - 前記判別部が判別した結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整部を備える、請求項1に記載の蛍光測定装置。
- 前記判別部が判別した結果を出力する出力部を備える、請求項1又は2に記載の蛍光測定装置。
- 前記出力部は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力する、請求項3に記載の蛍光測定装置。
- 前記信号処理部は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光部が受光した前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求める、請求項1乃至4のいずれかに記載の蛍光測定装置。
- 測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を測定する蛍光測定方法であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射する工程と、
前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときの蛍光を光電子増倍管によって受光する受光工程と、
前記受光工程で受光された前記蛍光の信号をアンプによって増幅した信号を用いて、蛍光寿命を求める信号処理工程と、
前記光電子増倍管、又は、前記アンプが前記蛍光の信号を増幅することに起因する前記蛍光寿命のばらつきが、所定の値より大きいか否かを判別し、かつ、前記ばらつきが前記所定の値より大きい場合、前記光電子増倍管と前記アンプのいずれのゲインが適正ではないかを判別する判別工程と、
を有することを特徴とする蛍光測定方法。 - 前記判別工程で判別された結果に基づいて、前記光電子増倍管、又は、前記アンプのゲインを調整するゲイン調整工程を有する、請求項6に記載の蛍光測定方法。
- 前記判別工程で判別された結果を出力する出力工程を有する、請求項6又は7に記載の蛍光測定方法。
- 前記出力工程は、前記蛍光寿命のばらつきの大きさを出力する、請求項8に記載の蛍光測定方法。
- 前記信号処理工程は、前記レーザ光の強度を変調する変調信号と、前記受光工程で受光された前記蛍光の信号と、の位相差に基づいて、前記蛍光寿命を求める、請求項6乃至9のいずれかに記載の蛍光測定方法。
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