JPWO2010084719A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents
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Abstract
蛍光検出装置は、ｎ種類の測定対象物が発する蛍光の各々に対して、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１〜ｎの整数)で、蛍光を受光し、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を取得する。この蛍光信号のそれぞれを、波長帯域ＦＬｋの少なくとも１つに対応したレーザ光Ｌｋ（ｋ＝１）を強度変調する変調信号とミキシングし周波数下方変換することにより、蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する。この蛍光データに対して補正を行って位相遅れを算出し、この位相遅れを用いて、蛍光緩和時間を算出する。
Description
本発明は、分析対象物に蛍光色素が付いた測定対象物がレーザ光の照射を受けることにより発する蛍光を受光し、この蛍光の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。
医療、生物分野では、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光をフォトマルチプライヤやアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の測定対象物の種類や頻度や特性を分析するフローサイトメータが広く用いられている。
具体的には、フローサイトメータは、混濁液中の細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等の分析対象物を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してラミナーシースフローを形成する。フローサイトメータは、このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで分析対象物を特定する。
このフローサイトメータは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
これの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
これの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
下記特許文献１には、レーザ光の照射による測定対象物から発せられる蛍光の蛍光寿命（蛍光緩和時間）を算出することで、多くの測定対象物を、短時間に正確に特定することができる蛍光検出装置および方法が記載されている。
当該文献によると、レーザ光を強度変調して測定対象物に照射し、測定対象物からの蛍光の蛍光信号の、レーザ光の強度変調に用いた変調信号に対する位相遅れを求め、この位相遅れから、蛍光緩和時間を算出することが記載されている。
当該文献によると、レーザ光を強度変調して測定対象物に照射し、測定対象物からの蛍光の蛍光信号の、レーザ光の強度変調に用いた変調信号に対する位相遅れを求め、この位相遅れから、蛍光緩和時間を算出することが記載されている。
しかし、測定対象物が発する蛍光が複数種類あり、これらを効果的に識別するには、以下のような問題がある。
すなわち、複数種類の蛍光を発する測定対象物を測定するとき、各蛍光の波長に対応するようにフィルタ等を用いて複数の波長帯域に分けた光電変換器を用いる。しかし、レーザ光により励起されて発する蛍光の波長帯域はブロードであるため、複数の光電変換器に跨って蛍光は受光される。すなわち、１つの光電変換器で生成される蛍光信号は、かならずしも１種類の蛍光の信号ではなく、他の種類の蛍光が混在した信号となっている。
したがって、このような他の種類の蛍光が混在した蛍光信号を用いて、蛍光信号から位相遅れを求めて、蛍光緩和時間を算出しても、精度の高い蛍光緩和時間は得られない。
すなわち、複数種類の蛍光を発する測定対象物を測定するとき、各蛍光の波長に対応するようにフィルタ等を用いて複数の波長帯域に分けた光電変換器を用いる。しかし、レーザ光により励起されて発する蛍光の波長帯域はブロードであるため、複数の光電変換器に跨って蛍光は受光される。すなわち、１つの光電変換器で生成される蛍光信号は、かならずしも１種類の蛍光の信号ではなく、他の種類の蛍光が混在した信号となっている。
したがって、このような他の種類の蛍光が混在した蛍光信号を用いて、蛍光信号から位相遅れを求めて、蛍光緩和時間を算出しても、精度の高い蛍光緩和時間は得られない。
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、ｎ種類（ｎは２以上の整数）の測定対象物がレーザ光の照射を受けることにより発する蛍光を受光し、受光した蛍光の複数の蛍光信号の信号処理を行うとき、精度の高い蛍光緩和時間の算出を行うことのできる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
本発明の一態様は、測定対象物にレーザ光を照射することによりｎ種類（ｎは２以上の整数）の測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる複数の蛍光信号の信号処理を行う、以下に記載する蛍光検出装置である。
すなわち、蛍光検出装置は、
（Ａ）前記ｎ種類の測定対象物のそれぞれに対して、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収特性が、他の種類の測定対象物の光吸収特性と異なるように、測定対象物ｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する光源部と、
（Ｂ）照射光に照射されたｎ種類の測定対象物が発する蛍光のそれぞれに対して、測定対象物ｋの発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と異なるように、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応して設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１〜ｎの整数)で受光して、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を出力する複数の受光素子を備える受光部と、
（Ｃ）前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の少なくとも１つに対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を第１の参照信号として用いて、出力した前記蛍光信号のそれぞれとミキシングして周波数下方変換を行うことにより、前記蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、
（Ｄ）生成した前記蛍光データの補正を行い、補正後の蛍光データを用いて前記蛍光信号の位相遅れを求め、この位相遅れを用いて蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有する。
すなわち、蛍光検出装置は、
（Ａ）前記ｎ種類の測定対象物のそれぞれに対して、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収特性が、他の種類の測定対象物の光吸収特性と異なるように、測定対象物ｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する光源部と、
（Ｂ）照射光に照射されたｎ種類の測定対象物が発する蛍光のそれぞれに対して、測定対象物ｋの発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と異なるように、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応して設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１〜ｎの整数)で受光して、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を出力する複数の受光素子を備える受光部と、
（Ｃ）前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の少なくとも１つに対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を第１の参照信号として用いて、出力した前記蛍光信号のそれぞれとミキシングして周波数下方変換を行うことにより、前記蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、
（Ｄ）生成した前記蛍光データの補正を行い、補正後の蛍光データを用いて前記蛍光信号の位相遅れを求め、この位相遅れを用いて蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有する。
また、本発明の別の態様は、測定対象物にレーザ光を照射することによりｎ種類（ｎは２以上の整数）の測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる複数の蛍光信号の信号処理を行う、以下に記載する蛍光検出方法である。
すなわち、蛍光検出方法は、
（Ｅ）前記ｎ種類の測定対象物のそれぞれに対して、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収特性が、他の種類の測定対象物の光吸収特性と異なるように、測定対象物ｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する第１のステップと、
（Ｆ）照射光に照射されたｎ種類の測定対象物が発する蛍光のそれぞれに対して、測定対象物ｋの発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と異なるように、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応して設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１〜ｎの整数)で受光して、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を出力する第２のステップと、
（Ｇ）前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の少なくとも１つに対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を第１の参照信号として用いて、出力した前記蛍光信号のそれぞれとミキシングして周波数下方変換を行うことにより、前記蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する第３のステップと、
（Ｈ）生成した前記蛍光データの補正を行い、補正後の蛍光データを用いて前記蛍光信号の位相遅れを求め、この位相遅れを用いて、蛍光緩和時間を算出する第４のステップと、を有する。
すなわち、蛍光検出方法は、
（Ｅ）前記ｎ種類の測定対象物のそれぞれに対して、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収特性が、他の種類の測定対象物の光吸収特性と異なるように、測定対象物ｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する第１のステップと、
（Ｆ）照射光に照射されたｎ種類の測定対象物が発する蛍光のそれぞれに対して、測定対象物ｋの発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と異なるように、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応して設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１〜ｎの整数)で受光して、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を出力する第２のステップと、
（Ｇ）前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の少なくとも１つに対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を第１の参照信号として用いて、出力した前記蛍光信号のそれぞれとミキシングして周波数下方変換を行うことにより、前記蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する第３のステップと、
（Ｈ）生成した前記蛍光データの補正を行い、補正後の蛍光データを用いて前記蛍光信号の位相遅れを求め、この位相遅れを用いて、蛍光緩和時間を算出する第４のステップと、を有する。
上記態様の蛍光検出装置及び蛍光検出方法では、蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データの補正を行い、補正後の蛍光データを用いて蛍光信号の位相遅れを求め、この位相遅れを用いて、蛍光緩和時間を算出するので、蛍光強度と蛍光緩和時間を同時に補正でき、かつ、受光の際、他の蛍光の混在による影響を除くことができる。このため、精度の高い蛍光緩和時間の算出を短時間に行うことができる。
特に、２つの蛍光波長帯域の蛍光強度を縦軸及び横軸にとった散布図の中で、蛍光信号がプロットされる位置に応じて、蛍光データの選択、非選択を行うので、より精度の高い補正を行うことができる。
特に、２つの蛍光波長帯域の蛍光強度を縦軸及び横軸にとった散布図の中で、蛍光信号がプロットされる位置に応じて、蛍光データの選択、非選択を行うので、より精度の高い補正を行うことができる。
以下、本発明の蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、一実施形態の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と、分析装置（コンピュータ）８０とを有する。信号処理装置２０は、レーザ光を測定対象とする試料１２に照射し、試料１２が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する。分析装置（コンピュータ）８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光強度や蛍光緩和時間を算出する。試料１２として、２つの細胞（測定対象粒子）が生体結合し、それぞれの細胞内に取り込まれた蛍光蛋白（分子）がＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を引き起こす程度に近距離に位置する試料を用いて、以降説明する。ＦＲＥＴとは、第１の分子のエネルギーが発光を経ることなく第２の分子に移動する現象である。試料１２は、一方の細胞に蛍光蛋白Ｘ1が、他方の細胞に蛍光蛋白Ｘ2が取り込まれて構成され、細胞同士が生体結合している。
図１は、一実施形態の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、信号処理装置２０と、分析装置（コンピュータ）８０とを有する。信号処理装置２０は、レーザ光を測定対象とする試料１２に照射し、試料１２が発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する。分析装置（コンピュータ）８０は、信号処理装置２０で得られた処理結果から蛍光強度や蛍光緩和時間を算出する。試料１２として、２つの細胞（測定対象粒子）が生体結合し、それぞれの細胞内に取り込まれた蛍光蛋白（分子）がＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を引き起こす程度に近距離に位置する試料を用いて、以降説明する。ＦＲＥＴとは、第１の分子のエネルギーが発光を経ることなく第２の分子に移動する現象である。試料１２は、一方の細胞に蛍光蛋白Ｘ1が、他方の細胞に蛍光蛋白Ｘ2が取り込まれて構成され、細胞同士が生体結合している。
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、制御・処理部２８と、管路３０と、を有する。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料１２からの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。
管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してラミナーシースフローを形成する。管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０は、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
制御・処理部２８は、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び試料１２からの蛍光信号を処理する信号処理部を含む。
管路３０は、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してラミナーシースフローを形成する。管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０は、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
レーザ光源部２２は、波長の異なる２つのレーザ光、例えばλ1＝４０８ｎｍ、λ2＝４７３ｎｍのレーザ光を出射する部分である。レーザ光は管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点が形成される。
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する。レーザ光源部２２は、レーザダイオードである光源２２ａとレーザダイオードである光源２２ｂを有する。光源２２ａは、波長４０８ｎｍのレーザ光Ｌ1をＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光Ｌ1の強度を所定の周波数で強度変調しながら出射する。光源２２ｂは、波長４７３ｎｍのレーザ光Ｌ2をＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で強度変調する。さらに、レーザ光源部２２は、ダイクロイックミラー２３ａと、レンズ系２３ｂと、レーザドライバ３４ａおよび３４ｂと、を有する。
ダイクロイックミラー２３ａは、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。レンズ系２３ｂは、レーザ光Ｌ1およびＬ2からなるレーザ光Ｌ1＋Ｌ2を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４ａおよび３４ｂは、光源２２ａおよび光源２２ｂそれぞれを駆動する。
レーザ光源部２２は、可視光帯域の波長を有し、強度変調したレーザ光を出射する。レーザ光源部２２は、レーザダイオードである光源２２ａとレーザダイオードである光源２２ｂを有する。光源２２ａは、波長４０８ｎｍのレーザ光Ｌ1をＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光Ｌ1の強度を所定の周波数で強度変調しながら出射する。光源２２ｂは、波長４７３ｎｍのレーザ光Ｌ2をＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で強度変調する。さらに、レーザ光源部２２は、ダイクロイックミラー２３ａと、レンズ系２３ｂと、レーザドライバ３４ａおよび３４ｂと、を有する。
ダイクロイックミラー２３ａは、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。レンズ系２３ｂは、レーザ光Ｌ1およびＬ2からなるレーザ光Ｌ1＋Ｌ2を管路３０中の測定点に集束させる。レーザドライバ３４ａおよび３４ｂは、光源２２ａおよび光源２２ｂそれぞれを駆動する。
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。これらのレーザ光は、試料１２の２つの蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2のうち、一方の蛍光蛋白の光吸収特性（光吸収率）が、他方の蛍光蛋白の光吸収特性（光吸収率）に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2のそれぞれに対応して用意されている。なお、本実施形態では、レーザ光の波長は、一方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）が、他方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）に比べて高くなるように設定されているが、レーザ光の波長は、一方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）が、他方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）と異なるように設定されてもよい。
一方、レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調に用いる周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調の周波数は異なる。これは、レーザ光で励起された試料１２が発する蛍光の周波数を互いに異なる周波数とすることにより、受光した蛍光がどのレーザ光で励起した蛍光かを知り、蛍光の情報を分離するためである。
ダイクロイックミラー２３ａは、レーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光Ｌ2を反射するミラーである。この構成によりレーザ光Ｌ1およびＬ2が合成されて、測定点の試料１２を照射する１つの照射光となる。
レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。これらのレーザ光は、試料１２の２つの蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2のうち、一方の蛍光蛋白の光吸収特性（光吸収率）が、他方の蛍光蛋白の光吸収特性（光吸収率）に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2のそれぞれに対応して用意されている。なお、本実施形態では、レーザ光の波長は、一方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）が、他方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）に比べて高くなるように設定されているが、レーザ光の波長は、一方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）が、他方の蛍光蛋白の光吸収（光吸収率）と異なるように設定されてもよい。
一方、レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調に用いる周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。レーザ光Ｌ1およびＬ2の強度変調の周波数は異なる。これは、レーザ光で励起された試料１２が発する蛍光の周波数を互いに異なる周波数とすることにより、受光した蛍光がどのレーザ光で励起した蛍光かを知り、蛍光の情報を分離するためである。
ダイクロイックミラー２３ａは、レーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光Ｌ2を反射するミラーである。この構成によりレーザ光Ｌ1およびＬ2が合成されて、測定点の試料１２を照射する１つの照射光となる。
光源２２ａ，２２ｂは、レーザ光Ｌ1，Ｌ2が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｌ1，Ｌ2によって励起される蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2は細胞内に取り込まれて付着しており、この細胞同士が生体結合した状態となって試料１２が構成されている。この試料１２が管路３０の測定点を通過する際、測定点でレーザ光Ｌ1，Ｌ2の照射を受けて特定の波長で、蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2が蛍光を発する。
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されている。受光部２４は、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより、試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される検出信号は、分析装置８０に供給され、試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号、処理開始のＯＮ信号、ＯＦＦ信号として用いられる。
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されている。受光部２６は、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する複数の光電変換器を備える。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
図３に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２と、光電子増倍管等の光電変換器（受光素子）２７ａ,２７ｂと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面に集束させる。
ダイクロイックミラー２６ｂは、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂの反射波長帯域およびバンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２の透過波長帯域が設定されている。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面に集束させる。
ダイクロイックミラー２６ｂは、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂの反射波長帯域およびバンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２の透過波長帯域が設定されている。
バンドパスフィルタ２６ｃ１，２６ｃ２は、各光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。波長帯域は、例えば光源２２ａから出射した４０８ｎｍのレーザ光Ｌ1の照射によって発する蛍光を主に受光するための４９４ｎｍ〜５３５ｎｍの波長帯域ＦＬ1である。また、光源２２ｂから出射した４７３ｎｍのレーザ光Ｌ2の照射によって発する蛍光を主に受光する５４０ｎｍ〜５７０ｎｍの波長帯域ＦＬ2である。
波長帯域ＦＬ1は、レーザ光Ｌ1で照射された試料１２のうち、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光に対応して設定されている。同様に、波長帯域ＦＬ2は、レーザ光Ｌ2で照射された試料１２のうち、蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光に対応して設定されている。
なお、本実施形態では、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度と異なるように、蛍光蛋白Ｘ1に対応して波長帯域が設定され、蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度と異なるように、蛍光蛋白Ｘ2に対応して波長帯域が設定されているとよい。
波長帯域ＦＬ1は、レーザ光Ｌ1で照射された試料１２のうち、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光に対応して設定されている。同様に、波長帯域ＦＬ2は、レーザ光Ｌ2で照射された試料１２のうち、蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光に対応して設定されている。
なお、本実施形態では、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光の蛍光強度と異なるように、蛍光蛋白Ｘ1に対応して波長帯域が設定され、蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光の蛍光強度が、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光の蛍光強度と異なるように、蛍光蛋白Ｘ2に対応して波長帯域が設定されているとよい。
光電変換器２７ａ，２７ｂは、例えば光電子増倍管のセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換する受光素子である。ここで、受光する蛍光は、所定の周波数で強度変調を受けたレーザ光の励起により基づくものなので、出力される蛍光信号も所定の周波数で強度が変動する信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給される。
制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、制御部であるコントローラ４４と、を有して構成される。
信号生成部４０は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度を所定の周波数で変調するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６ａ，４６ｂ、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂ、アンプ５０ａ，５０ｂ，５２、ＩＱミキサ４７、及びローパスフィルタ４９を有する。信号生成部４０は、生成される周波数ｆ1，ｆ2(ｆ2＞ｆ1)の各変調信号を、アンプ５０ａ，５０ｂで増幅してレーザ光源部２２のレーザドライバ３４ａ，３４ｂに供給するとともに、周波数ｆ1の変調信号をアンプ５２で増幅して信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に周波数ｆ1の変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を検波するための第１の参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。発振器４６ａと発振器４６ｂは、互いに異なる周波数ｆ1，ｆ2の信号を発振し、異なる周波数の変調信号を生成する。
また、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂで分配された周波数ｆ1，ｆ2の変調信号は、ＩＱミキサ４７に供給され、ローパスフィルタ４９で低周波成分をろ過することにより、周波数ｆ1の変調信号に対する周波数ｆ2の変調信号の差分信号を生成する。この差分信号は、差分周波数（ｆ2−ｆ1）の周波数を有する。この差分信号は、後述する分析部８３で周波数下方変換時に第２の参照信号として用いるために分析装置８０に供給される。
信号生成部４０は、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度を所定の周波数で変調するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６ａ，４６ｂ、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂ、アンプ５０ａ，５０ｂ，５２、ＩＱミキサ４７、及びローパスフィルタ４９を有する。信号生成部４０は、生成される周波数ｆ1，ｆ2(ｆ2＞ｆ1)の各変調信号を、アンプ５０ａ，５０ｂで増幅してレーザ光源部２２のレーザドライバ３４ａ，３４ｂに供給するとともに、周波数ｆ1の変調信号をアンプ５２で増幅して信号処理部４２に供給する。信号処理部４２に周波数ｆ1の変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を検波するための第１の参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。発振器４６ａと発振器４６ｂは、互いに異なる周波数ｆ1，ｆ2の信号を発振し、異なる周波数の変調信号を生成する。
また、パワースプリッタ４８ａ，４８ｂで分配された周波数ｆ1，ｆ2の変調信号は、ＩＱミキサ４７に供給され、ローパスフィルタ４９で低周波成分をろ過することにより、周波数ｆ1の変調信号に対する周波数ｆ2の変調信号の差分信号を生成する。この差分信号は、差分周波数（ｆ2−ｆ1）の周波数を有する。この差分信号は、後述する分析部８３で周波数下方変換時に第２の参照信号として用いるために分析装置８０に供給される。
信号処理部４２は、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により２つの蛍光蛋白が発する蛍光の位相遅れに関する情報を抽出する部分である。信号処理部４２は、アンプ５４ａ，５４ｂと、ＩＱミキサ５８ａ、５８ｂと、ローパスフィルタ６２と、アンプ６４と、を有する。
アンプ５４ａ，５４ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を増幅する。ＩＱミキサ５８ａ、５８ｂは、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を第１の参照信号として、蛍光信号とミキシングする。
アンプ５４ａ，５４ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を増幅する。ＩＱミキサ５８ａ、５８ｂは、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を第１の参照信号として、蛍光信号とミキシングする。
ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号とミキシングする。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂのそれぞれは、第１の参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号の、変調信号と同相の成分を含む信号と、蛍光信号の、変調信号に対して９０度位相のシフトした成分を含む信号とを生成する。同相の成分を含む信号は、変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成され、９０度位相のシフトした成分を含む信号は、９０度位相のシフトした変調信号と蛍光信号をミキシングすることにより生成される。
ローパスフィルタ６２は、ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂで生成された信号の低周波信号をろ過する部分である。このろ過により、蛍光信号の、周波数ｆ1の第１の参照信号と同相の成分（Ｒｅ成分）と、蛍光信号の、周波数ｆ1の第１の参照信号に対して９０度位相のシフトした成分（Ｉｍ成分）が、蛍光データとして取り出され、アンプ６４で所定のゲインで増幅されてＡＤ変換器６６に送られる。取り出された蛍光データは、ＤＣ成分と、周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分とを主に有する。
Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、光電変換器２７ａ，２７ｂに設定された波長帯域ＦＬ1および波長帯域ＦＬ2毎に得られるので、波長帯域ＦＬ1のＲｅ成分およびＩｍ成分の組と、波長帯域ＦＬ2のＲｅ成分およびＩｍ成分の組とがＡＤ変換器６６に送られる。上記Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、それぞれ、ＤＣ成分と周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分とを有する。
Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、光電変換器２７ａ，２７ｂに設定された波長帯域ＦＬ1および波長帯域ＦＬ2毎に得られるので、波長帯域ＦＬ1のＲｅ成分およびＩｍ成分の組と、波長帯域ＦＬ2のＲｅ成分およびＩｍ成分の組とがＡＤ変換器６６に送られる。上記Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、それぞれ、ＤＣ成分と周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分とを有する。
コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の変調信号を生成させるように制御するとともに、さらに、分析装置８０におけるＡＤ変換の開始および終了の指示をする。
具体的には、コントローラ４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理する。さらに、コントローラ４４は、信号処理部４２で生成されたＲｅ成分およびＩｍ成分をサンプリングするＡＤ変換器６６の開始と終了の指示をする。ＡＤ変換器６６の開始と終了の指示は、受光部２４から受信する受光信号を、ＡＤ変換の処理開始のＯＮ信号、処理終了のＯＦＦ信号として用いて行われる。コントローラ４４は、さらに、レーザ光の強度変調のために、発振器４６ａ，４６ｂの発振周波数を定める。
分析装置８０は、ＡＤ変換器６６と、ＡＤ変換されたＲｅ成分、Ｉｍ成分から、蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求め、さらに、この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）及び蛍光強度を求める分析部８３と、を有する。
ＡＤ変換器６６は、信号処理部４２から供給されたＲｅ成分、Ｉｍ成分をデジタルデータに変換するとともに、信号生成部４０から供給された差分信号をデジタルデータに変換する。これらのデジタルデータは、分析部８３に供給される。
ＡＤ変換器６６は、信号処理部４２から供給されたＲｅ成分、Ｉｍ成分をデジタルデータに変換するとともに、信号生成部４０から供給された差分信号をデジタルデータに変換する。これらのデジタルデータは、分析部８３に供給される。
図５は、分析装置８０の分析部８３の概略の構成を示す図である。
分析部８３は、周波数分析部８４と、自家蛍光除去部８６と、蛍光データ補正部８８と、蛍光強度算出部９０と、位相遅れ算出部９２と、蛍光緩和時間算出部９４とを有する。これらの各部分は、ＣＰＵ８１とメモリ８２とを有するコンピュータ上でソフトウェアを起動させることにより、機能を発揮するソフトウェアモジュールである。勿論、これらの部分を専用回路で構成することもできる。
分析部８３は、周波数分析部８４と、自家蛍光除去部８６と、蛍光データ補正部８８と、蛍光強度算出部９０と、位相遅れ算出部９２と、蛍光緩和時間算出部９４とを有する。これらの各部分は、ＣＰＵ８１とメモリ８２とを有するコンピュータ上でソフトウェアを起動させることにより、機能を発揮するソフトウェアモジュールである。勿論、これらの部分を専用回路で構成することもできる。
周波数分析部８４は、信号処理部４２から供給されＡＤ変換されたＲｅ成分及びＩｍ成分を、ＤＣ成分と差分周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分に分離する部分である。周波数分析部８４は、信号処理部４２とともに、本発明における周波数下方変換を行う第１の処理部を形成する。
周波数分析部８４は、信号処理部４２から供給されＡＤ変換されたＲｅ成分及びＩｍ成分の信号をそれぞれＦＦＴ（Fast Fourier Transformation）処理を行ってＲｅ成分及びＩｍ成分のＤＣ成分を求めることにより、周波数ｆ1における蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データ（Ｒｅ成分、Ｉｍ成分）を抽出する。さらに、周波数分析部８４は、信号生成部４０から供給された周波数（ｆ2−ｆ1）の差分信号を第２の参照信号として用い、信号処理部４２から供給されＡＤ変換されたＲｅ成分及びＩｍ成分の信号に対して周波数下方変換を施すことにより、周波数ｆ2における蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データ（Ｒｅ成分、Ｉｍ成分）を抽出する。
周波数分析部８４は、信号処理部４２から供給されＡＤ変換されたＲｅ成分及びＩｍ成分の信号をそれぞれＦＦＴ（Fast Fourier Transformation）処理を行ってＲｅ成分及びＩｍ成分のＤＣ成分を求めることにより、周波数ｆ1における蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データ（Ｒｅ成分、Ｉｍ成分）を抽出する。さらに、周波数分析部８４は、信号生成部４０から供給された周波数（ｆ2−ｆ1）の差分信号を第２の参照信号として用い、信号処理部４２から供給されＡＤ変換されたＲｅ成分及びＩｍ成分の信号に対して周波数下方変換を施すことにより、周波数ｆ2における蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データ（Ｒｅ成分、Ｉｍ成分）を抽出する。
信号処理部４２から供給されたＲｅ成分及びＩｍ成分は、周波数ｆ1を用いて、蛍光信号に周波数下方変換を施して得られた信号であるので、上記ＤＣ成分は、周波数ｆ1の変調信号に対する、蛍光信号の周波数ｆ1における位相遅れと、周波数ｆ1における強度振幅を含んでいる。一方、周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分は、周波数ｆ2の変調信号に対する、蛍光信号の周波数ｆ2における位相遅れと、周波数ｆ2における強度振幅を含んでいる。
したがって、周波数分析部８４は、ＦＦＴ処理によりＤＣ成分を抽出することにより、周波数ｆ1で強度変調されたレーザ光Ｌ1の照射で発する蛍光の、位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを得る。さらに、周波数（ｆ2−ｆ1）の差分信号を第２の参照信号として用いて、周波数下方変換をソフトウェア処理で行い、周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分を抽出することにより、周波数ｆ2で強度変調されたレーザ光Ｌ２の照射で発する蛍光の、位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを得る。得られた蛍光データは自家蛍光除去部８６に供給される。
したがって、周波数分析部８４は、ＦＦＴ処理によりＤＣ成分を抽出することにより、周波数ｆ1で強度変調されたレーザ光Ｌ1の照射で発する蛍光の、位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを得る。さらに、周波数（ｆ2−ｆ1）の差分信号を第２の参照信号として用いて、周波数下方変換をソフトウェア処理で行い、周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分を抽出することにより、周波数ｆ2で強度変調されたレーザ光Ｌ２の照射で発する蛍光の、位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを得る。得られた蛍光データは自家蛍光除去部８６に供給される。
自家蛍光除去部８６は、供給されたＲｅ成分、Ｉｍ成分からなる蛍光データを用いて、受光した蛍光が、自家蛍光か否かを判断し、一定の条件を満たすＲｅ成分、Ｉｍ成分は、自家蛍光の蛍光データとして、以降の処理を実施しないように除去する部分である。具体的には、波長帯域ＦＬ1および波長帯域ＦＬ2毎の蛍光信号のＲｅ成分、Ｉｍ成分を用いて蛍光強度を求め、この２つの波長帯域の蛍光強度を縦軸及び横軸にとった２次元座標中の散布図の中にプロットする。このプロットが、予め設定された自家蛍光の範囲に位置しないとき、Ｒｅ成分、Ｉｍ成分を以降の補正処理を含む処理の対象として選択し、散布図中の自家蛍光の範囲に位置するとき、Ｒｅ成分、Ｉｍ成分を以降の処理の対象から除去する、すなわち選択しない。
このような自家蛍光の範囲は、蛍光蛋白が測定対象粒子である細胞内に取り込まれていない状態で、細胞等の試料１２をフローサイトメータ１０で測定し、信号処理装置２０から出力されるＲｅ成分およびＩｍ成分を用いて得られる蛍光強度を、散布図にプロットすることにより得られる。
以降の処理で自家蛍光を除去したものを用いるのは、この除去により、蛍光蛋白の発する蛍光の蛍光データを用いてより精度の高い補正を行うことができるからである。
このような自家蛍光の範囲は、蛍光蛋白が測定対象粒子である細胞内に取り込まれていない状態で、細胞等の試料１２をフローサイトメータ１０で測定し、信号処理装置２０から出力されるＲｅ成分およびＩｍ成分を用いて得られる蛍光強度を、散布図にプロットすることにより得られる。
以降の処理で自家蛍光を除去したものを用いるのは、この除去により、蛍光蛋白の発する蛍光の蛍光データを用いてより精度の高い補正を行うことができるからである。
図６は、上記散布図の一例を示す図である。図６に示される散布図では、横軸に波長帯域ＦＬ1における蛍光強度が定められ、縦軸に波長帯域ＦＬ2における蛍光強度が定められている。ここで、予め測定されて設定される自家蛍光の範囲は、領域Ｒ1である。この領域Ｒ1にプロットが入る蛍光データは、自家蛍光の蛍光データと判別されて、除去される。領域Ｒ2にプロットのある蛍光データは、以降の処理の対象とされる。
蛍光データ補正部８８は、自家蛍光の蛍光データが除去された蛍光データを用いて、蛍光データの補正を行う部分である。
図７（ａ）は、レーザ光Ｌ1による蛍光蛋白Ｘ1の吸収特性と、レーザ光Ｌ2による蛍光蛋白Ｘ2の吸収特性とを示している。これらの吸収特性によると、吸収特性はブロードな分布を持つため、レーザ光Ｌ1により蛍光蛋白Ｘ1のみならず蛍光蛋白Ｘ2も吸収し励起する。同様に、レーザ光Ｌ2により蛍光蛋白Ｘ2のみならず蛍光蛋白Ｘ1も吸収し励起する。
図７（ｂ）は、励起した蛍光蛋白Ｘ1と蛍光蛋白Ｘ2の蛍光特性を示している。これらの蛍光特性によると、蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光Ｙ1を主に受光する波長帯域ＦＬ1で、レーザ光Ｌ1で励起した蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光Ｙ2の一部が受光される。また、蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光Ｙ2を主に受光する波長帯域ＦＬ2で、レーザ光Ｌ2で励起した蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光Ｙ1の一部が受光される。
したがって、波長帯域ＦＬ1で受光されて得られる蛍光データは、レーザ光Ｌ1で励起した蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光Ｙ1の他に、レーザ光Ｌ1で励起した蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光Ｙ2の蛍光データも含む。同様に、波長帯域ＦＬ2で受光されて得られる蛍光データは、レーザ光Ｌ2で励起した蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光Ｙ2の他に、レーザ光Ｌ2で励起した蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光Ｙ1の蛍光データも含む。この波長帯域ＦＬ1に含まれる蛍光Ｙ2の蛍光データおよび、波長帯域ＦＬ2に含まれる蛍光Ｙ1の蛍光データは、励起するレーザ光が同じであるため、レーザ光Ｌ1,Ｌ2の強度変調の周波数の違いを用いて分離することはできない。このため、蛍光データ補正部８８は、蛍光データの補正を行う。
したがって、波長帯域ＦＬ1で受光されて得られる蛍光データは、レーザ光Ｌ1で励起した蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光Ｙ1の他に、レーザ光Ｌ1で励起した蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光Ｙ2の蛍光データも含む。同様に、波長帯域ＦＬ2で受光されて得られる蛍光データは、レーザ光Ｌ2で励起した蛍光蛋白Ｘ2の発する蛍光Ｙ2の他に、レーザ光Ｌ2で励起した蛍光蛋白Ｘ1の発する蛍光Ｙ1の蛍光データも含む。この波長帯域ＦＬ1に含まれる蛍光Ｙ2の蛍光データおよび、波長帯域ＦＬ2に含まれる蛍光Ｙ1の蛍光データは、励起するレーザ光が同じであるため、レーザ光Ｌ1,Ｌ2の強度変調の周波数の違いを用いて分離することはできない。このため、蛍光データ補正部８８は、蛍光データの補正を行う。
蛍光データ補正部８８は、以下のように補正を行う。
すなわち、光源部２２、受光部２４，２６および制御・処理部２８を有する信号処理装置２０を用いて、蛍光蛋白Ｘ1および蛍光蛋白Ｘ2をそれぞれ単独に測定して得られる、基準となる位相遅れと基準となる強度振幅を含む基準蛍光データを予め記憶し、この基準蛍光データ用いて構成される補正行列を用いて、蛍光データを補正する。
具体的には、基準蛍光データを、波長帯域ＦＬｍ（ｍ＝１〜ｎの整数）の光電変換器が出力する蛍光蛋白ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の蛍光信号から生成される情報として、ａｋｍ・ｅ（−ｉθｋｍ）（ａｋｍは蛍光信号の基準強度振幅、θｋｍは蛍光信号の基準位相遅れ）と表すとき、波長帯域ＦＬｍにおける蛍光データをＡs’(ｓ＝１〜ｎの整数)とし、補正後の蛍光データをＡｓ(ｓ＝１〜ｎ)としたとき（Ａs’及びＡｓは、（Ｒｅ成分）＋ｉ(Ｉｍ成分)で表した複素数表示）、下記式（１）に従って、Ａs’からＡｓを算出することで補正を行う。ここで、蛍光データＡs’，Ａｓは、蛍光強度と位相遅れの情報を有する複素数である。
例えば、波長帯域ＦＬ1において測定された蛍光データＡ1’は、蛍光蛋白１の蛍光成分の他に、蛍光蛋白２〜ｎの蛍光の成分も含んでいる。蛍光蛍白２〜ｎの発する蛍光の蛍光データが、波長帯域ＦＬ1において含まれる比率は、ａ21／ａ22・ｅ−ｉ(θ21-θ22）〜ａn1／ａnn・ｅ−ｉ(θ21-θnn）と表される。したがって、波長帯域ＦＬ1において測定された蛍光データＡ1’は、本来の求めるべき蛍光データＡ1, Ａ2〜Ａnとａ21／ａ22・ｅ−ｉ(θ21-θ22）〜ａn1／ａnn・ｅ−ｉ(θ21-θnn）の係数を用いて、以下の式のように表される。
Ａ1’＝ Ａ1＋ａ21／ａ22・ｅ−ｉ(θ21-θ22）・Ａ2＋・・・・
＋ａn1／ａnn・ｅ−ｉ(θ21-θnn）・Ａn
上記式をＡ1’〜Ａn’について表したものが下記式（１）となる。したがって、波長帯域ＦＬ1〜ＦＬnについて測定された蛍光データＡ1’〜Ａｎ’を、式（１）の右辺の逆行列の各要素、すなわち、基準蛍光データを用いて構成された係数を用いて補正することにより、本来の求めるべき蛍光データＡ1〜Ａnを求めることができる。
すなわち、光源部２２、受光部２４，２６および制御・処理部２８を有する信号処理装置２０を用いて、蛍光蛋白Ｘ1および蛍光蛋白Ｘ2をそれぞれ単独に測定して得られる、基準となる位相遅れと基準となる強度振幅を含む基準蛍光データを予め記憶し、この基準蛍光データ用いて構成される補正行列を用いて、蛍光データを補正する。
具体的には、基準蛍光データを、波長帯域ＦＬｍ（ｍ＝１〜ｎの整数）の光電変換器が出力する蛍光蛋白ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の蛍光信号から生成される情報として、ａｋｍ・ｅ（−ｉθｋｍ）（ａｋｍは蛍光信号の基準強度振幅、θｋｍは蛍光信号の基準位相遅れ）と表すとき、波長帯域ＦＬｍにおける蛍光データをＡs’(ｓ＝１〜ｎの整数)とし、補正後の蛍光データをＡｓ(ｓ＝１〜ｎ)としたとき（Ａs’及びＡｓは、（Ｒｅ成分）＋ｉ(Ｉｍ成分)で表した複素数表示）、下記式（１）に従って、Ａs’からＡｓを算出することで補正を行う。ここで、蛍光データＡs’，Ａｓは、蛍光強度と位相遅れの情報を有する複素数である。
例えば、波長帯域ＦＬ1において測定された蛍光データＡ1’は、蛍光蛋白１の蛍光成分の他に、蛍光蛋白２〜ｎの蛍光の成分も含んでいる。蛍光蛍白２〜ｎの発する蛍光の蛍光データが、波長帯域ＦＬ1において含まれる比率は、ａ21／ａ22・ｅ−ｉ(θ21-θ22）〜ａn1／ａnn・ｅ−ｉ(θ21-θnn）と表される。したがって、波長帯域ＦＬ1において測定された蛍光データＡ1’は、本来の求めるべき蛍光データＡ1, Ａ2〜Ａnとａ21／ａ22・ｅ−ｉ(θ21-θ22）〜ａn1／ａnn・ｅ−ｉ(θ21-θnn）の係数を用いて、以下の式のように表される。
Ａ1’＝ Ａ1＋ａ21／ａ22・ｅ−ｉ(θ21-θ22）・Ａ2＋・・・・
＋ａn1／ａnn・ｅ−ｉ(θ21-θnn）・Ａn
上記式をＡ1’〜Ａn’について表したものが下記式（１）となる。したがって、波長帯域ＦＬ1〜ＦＬnについて測定された蛍光データＡ1’〜Ａｎ’を、式（１）の右辺の逆行列の各要素、すなわち、基準蛍光データを用いて構成された係数を用いて補正することにより、本来の求めるべき蛍光データＡ1〜Ａnを求めることができる。
蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2をレーザ光Ｌ1，Ｌ2で照射し、波長帯域ＦＬ1，ＦＬ2で蛍光を受光する場合、下記式（２）、（３）のように表すことができる。
こうして、波長帯域ＦＬ1における補正後の蛍光データＡ1は、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光Ｙ1からなる蛍光データとなり、波長帯域ＦＬ2における補正後の蛍光データＡ2は、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光Ｙ2からなる蛍光データとなる。補正後の蛍光データＡ1，Ａ2は、蛍光強度算出部９０および位相遅れ算出部９２に送られる。
こうして、波長帯域ＦＬ1における補正後の蛍光データＡ1は、蛍光蛋白Ｘ1が発する蛍光Ｙ1からなる蛍光データとなり、波長帯域ＦＬ2における補正後の蛍光データＡ2は、蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光Ｙ2からなる蛍光データとなる。補正後の蛍光データＡ1，Ａ2は、蛍光強度算出部９０および位相遅れ算出部９２に送られる。
蛍光強度算出部９０は、補正後の蛍光データＡ1，Ａ2のそれぞれについて、複素数の絶対値を求めることで、蛍光強度を算出する部分である。
位相遅れ算出部９２は、補正後の蛍光データＡ1，Ａ2のそれぞれについて、複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相遅れθとして算出する部分である。
蛍光緩和時間算出部９４は、位相遅れ算出部９２で算出されたθを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出する部分である。ここで、ｆは、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
算出された蛍光強度、位相遅れθおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイに結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料１２が管路３０の測定点を通過する度に測定される結果として、統計処理の対象とされる。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
位相遅れ算出部９２は、補正後の蛍光データＡ1，Ａ2のそれぞれについて、複素数の偏角（ｔａｎ-1（蛍光データのＩｍ成分／蛍光データのＲｅ成分)）を、位相遅れθとして算出する部分である。
蛍光緩和時間算出部９４は、位相遅れ算出部９２で算出されたθを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出する部分である。ここで、ｆは、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の強度変調に用いた周波数である。蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎ（θ）の式にしたがって算出することができるのは、蛍光現象が、１次の緩和過程に沿った変化を示すからである。
算出された蛍光強度、位相遅れθおよび蛍光緩和時間τは、図示されないプリンタやディスプレイに結果情報として出力される。また、この結果情報は、試料１２が管路３０の測定点を通過する度に測定される結果として、統計処理の対象とされる。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
次に、フローサイトメータ１０で行われる蛍光検出方法について説明する。
まず、光源部２２は、蛍光蛋白Ｘ1および蛍光蛋白Ｘ2のそれぞれに対して、蛍光蛋白Ｘｋ（ｋ＝１または２）の光吸収が、他方の蛍光蛋白の光吸収に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する。
まず、光源部２２は、蛍光蛋白Ｘ1および蛍光蛋白Ｘ2のそれぞれに対して、蛍光蛋白Ｘｋ（ｋ＝１または２）の光吸収が、他方の蛍光蛋白の光吸収に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する。
次に、照射光に照射された蛍光蛋白Ｘ1および蛍光蛋白Ｘ2が発する蛍光のそれぞれに対して、蛍光蛋白Ｘｋの発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度に比べて高くなるように、蛍光蛋白Ｘｋに対応して設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１または２)を有する受光部２６は受光して、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を出力する。
制御・処理部２８は、出力した蛍光信号のそれぞれを、波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１）に対応したレーザ光Ｌｋ（ｋ＝１）を強度変調する変調信号とミキシングして周波数下方変換することにより、この変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含むＲｅ成分とＩｍ成分のデータを生成する。
分析装置８０の分析部８３は、生成したＲｅ成分とＩｍ成分のデータを、さらに、ＤＣ成分と周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分に分離する。周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分は、信号生成部４０から供給される差分周波数（ｆ2−ｆ1）の差分信号を用いて周波数下方変換を行うことにより抽出される。ＤＣ成分は、ＦＦＴ処理を行うことにより抽出される。
これにより、周波数ｆ1における蛍光信号の位相遅れ（周波数ｆ1の変調信号に対する位相遅れ）と強度振幅を含み、Ｒｅ成分とＩｍ成分からなる蛍光データＡ1’が得られる。さらに、周波数ｆ2における蛍光信号の位相遅れ（周波数ｆ2の変調信号に対する位相遅れ）と強度振幅を含み、Ｒｅ成分とＩｍ成分からなる蛍光データＡ2’が得られる。得られた蛍光データＡ1’，Ａ2’は、上記式（３）に従って補正が施される。さらに、この補正後の蛍光データＡ1，Ａ2を用いて、蛍光強度、位相遅れθおよび蛍光緩和時間τが算出される。
制御・処理部２８は、出力した蛍光信号のそれぞれを、波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１）に対応したレーザ光Ｌｋ（ｋ＝１）を強度変調する変調信号とミキシングして周波数下方変換することにより、この変調信号に対する蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含むＲｅ成分とＩｍ成分のデータを生成する。
分析装置８０の分析部８３は、生成したＲｅ成分とＩｍ成分のデータを、さらに、ＤＣ成分と周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分に分離する。周波数（ｆ2−ｆ1）の信号成分は、信号生成部４０から供給される差分周波数（ｆ2−ｆ1）の差分信号を用いて周波数下方変換を行うことにより抽出される。ＤＣ成分は、ＦＦＴ処理を行うことにより抽出される。
これにより、周波数ｆ1における蛍光信号の位相遅れ（周波数ｆ1の変調信号に対する位相遅れ）と強度振幅を含み、Ｒｅ成分とＩｍ成分からなる蛍光データＡ1’が得られる。さらに、周波数ｆ2における蛍光信号の位相遅れ（周波数ｆ2の変調信号に対する位相遅れ）と強度振幅を含み、Ｒｅ成分とＩｍ成分からなる蛍光データＡ2’が得られる。得られた蛍光データＡ1’，Ａ2’は、上記式（３）に従って補正が施される。さらに、この補正後の蛍光データＡ1，Ａ2を用いて、蛍光強度、位相遅れθおよび蛍光緩和時間τが算出される。
なお、フローサイトメータ１０は、蛍光蛋白Ｘ1，Ｘ2それぞれについて、予め、フローサイトメータ１０を用いて単独に測定して得られる、基準となる位相遅れと基準となる強度振幅を含む基準蛍光データを記憶し、この基準蛍光データ用いて構成される補正行列を用いて上記式（３）に従った補正を行う。
このように、分析装置８０の分析部８３は、蛍光緩和時間τを算出する前、波長帯域ＦＬ1、ＦＬ2に含まれる不要な蛍光の蛍光データを除去することができるので、算出される蛍光緩和時間τは精度が高くなる。
フローサイトメータ１０では、試料１２を、１組のＦＲＥＴが発生する生体結合した細胞を例に用いて説明したが、ｎ種類（ｎは２以上の整数）の測定対象物が発する蛍光であれば、特に制限されない。例えば、ＦＲＥＴが発生する第１の分子と第２の分子を組として、この組が複数種類用意されてｎ種類の測定対象物が構成されてもよい。また、ＦＲＥＴが発生する測定対象物には限定されず、測定点を蛍光色素が同時に通過するような測定対象物であればよい。
また、制御・処理部２８は、周波数ｆ1の変調信号を第１の参照信号として用いてミキシング処理により周波数下方変換をした後、分析装置８０は、差分周波数（ｆ2‐ｆ1）の差分信号を第２の参照信号として用いて周波数下方変換を行ったが、上記ミキシング処理において、第１の参照信号として、周波数ｆ1，ｆ2の２つの変調信号を用いて別々のミキシング処理を行って周波数下方変換を行ってもよい。この場合、信号処理部４２のＩＱミキサ５８ａでは、周波数ｆ1の変調信号を第１の参照信号として用い、ＩＱミキサ５８ｂでは、周波数ｆ2の変調信号を第１の参照信号として用いるように、信号処理部４２を構成するとよい。これにより、ＩＱミキサ５８ａとＩＱミキサ５８ｂとを用いて、一度に、周波数ｆ1，ｆ2における位相遅れと強度振幅を含むＲｅ成分、Ｉｍ成分を求めることができる。
以上、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
１０ フローサイトメータ
１２ 試料
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２２ａ，２２ｂ 光源
２３ａ，２６ｂ ダイクロイックミラー
２３ｂ．２６ａ レンズ系
２４，２６ 受光部
２６ｃ1，２６ｃ2 バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
３４ａ，３４ｂ レーザドライバ
４８ａ，４８ｂ パワースプリッタ
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ コントローラ
４６ａ，４６ｂ 発振器
４９，６２ ローパスフィルタ
５０ａ，５０ｂ，５２，５４ａ，５４ｂ，６４ アンプ
５８ａ，５８ｂ，４７ ＩＱミキサ
６０ システムコントローラ
６６ ＡＤ変換器
８０ 分析装置
８１ ＣＰＵ
８２ メモリ
８３ 分析部
８４ 周波数分析部
８６ 自家蛍光除去部
８８ 蛍光データ補正部
９０ 蛍光強度算出部
９２ 位相遅れ算出部
９４ 蛍光緩和時間算出部
１２ 試料
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２２ａ，２２ｂ 光源
２３ａ，２６ｂ ダイクロイックミラー
２３ｂ．２６ａ レンズ系
２４，２６ 受光部
２６ｃ1，２６ｃ2 バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
３４ａ，３４ｂ レーザドライバ
４８ａ，４８ｂ パワースプリッタ
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ コントローラ
４６ａ，４６ｂ 発振器
４９，６２ ローパスフィルタ
５０ａ，５０ｂ，５２，５４ａ，５４ｂ，６４ アンプ
５８ａ，５８ｂ，４７ ＩＱミキサ
６０ システムコントローラ
６６ ＡＤ変換器
８０ 分析装置
８１ ＣＰＵ
８２ メモリ
８３ 分析部
８４ 周波数分析部
８６ 自家蛍光除去部
８８ 蛍光データ補正部
９０ 蛍光強度算出部
９２ 位相遅れ算出部
９４ 蛍光緩和時間算出部
Claims (15)
- レーザ光の照射を受けることによりｎ種類（ｎは２以上の整数）の測定対象物が発する蛍光を受光し、受光した蛍光の複数の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
前記ｎ種類の測定対象物のそれぞれに対して、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収特性が、他の種類の測定対象物の光吸収特性と異なるように、測定対象物ｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する光源部と、
照射光に照射されたｎ種類の測定対象物が発する蛍光のそれぞれに対して、測定対象物の発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と異なるように、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応して設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１〜ｎの整数)で受光して、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を出力する複数の受光素子を備える受光部と、
前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の少なくとも１つに対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を第１の参照信号として用いて、出力した前記蛍光信号のそれぞれとミキシングして周波数下方変換を行うことにより、前記蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する第１の処理部と、
生成した前記蛍光データの補正を行い、補正後の蛍光データを用いて前記蛍光信号の位相遅れを求め、この位相遅れを用いて蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記第２の処理部は、前記光源部、前記受光部および前記第１の処理部を用いて、ｎ種類の測定対象物をそれぞれ単独に測定して得られる、基準位相遅れと基準強度振幅を含む基準蛍光データを記憶し、この基準蛍光データを用いて構成される係数を用いて、前記第１の処理部で得られた蛍光データを補正する、請求項１に記載の蛍光検出装置。
- 前記レーザ光Ｌｋは、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収が、他の種類の測定対象物の光吸収に対して高くなるように、波長が設定されている、請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
- 前記受光部における前記複数の波長帯域ＦＬｋは、測定対象物の発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度に対して高くなるように設定されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
- 波長帯域ＦＬｍ（ｍ＝１〜ｎの整数）の受光素子が出力する測定対象物ｋの蛍光信号から前記基準蛍光データが生成され、前記基準蛍光データが、ａｋｍ・ｅ（−ｉθｋｍ）（ａｋｍは前記基準強度振幅、θｋｍは前記基準位相遅れ）と表されるとき、
前記第１の処理部が生成する波長帯域ＦＬｍにおける前記蛍光データを複素数表示でＡs’(ｓ＝１〜ｎの整数)とし、補正後の蛍光データを複素数表示でＡｓ(ｓ＝１〜ｎの整数)としたとき、下記式（１）に従って、Ａs’からＡｓを算出する、請求項４に記載の蛍光検出装置。
- 前記第１の処理部で生成された前記蛍光データが、異なる２つの蛍光波長帯域の蛍光強度を縦軸及び横軸にとった散布図の中で所定の範囲に位置しないとき、前記第２の処理部は、前記蛍光データを前記補正の対象として選択し、前記所定の範囲に位置するとき、前記蛍光データを前記補正の対象として選択しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
- 前記測定対象物は、測定対象粒子に蛍光色素が付着して構成され、
前記所定の範囲は、前記測定対象粒子が、前記蛍光色素と付着していない状態で、前記蛍光検出装置を用いて測定された、前記測定対象粒子の発する自家蛍光の範囲である、請求項６に記載の蛍光検出装置。 - 前記測定対象物は、第１の分子のエネルギーがＦＲＥＴ（Fluorescence
Resonance Energy Transfer）により第２の分子に移動する、前記第１の分子と前記第２に分子を含み、前記第１の分子と前記第２の分子を組として、この組が複数種類用意されて前記ｎ種類の測定対象物が構成されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。 - 前記第１の処理部は、前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の１つを第１の波長帯域とし、この波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を前記第１の参照信号として定めて、前記蛍光信号の周波数下方変換を行い、前記第１の参照信号の周波数と異なる周波数を持つ変調信号の、前記第１の参照信号に対する差分信号を第２の参照信号として用いて、前記周波数下方変換の結果を、さらに、周波数下方変換することにより、前記位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
- レーザ光の照射を受けることによりｎ種類（ｎは２以上の整数）の測定対象物が発する蛍光を受光し、受光した蛍光の複数の蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
前記ｎ種類の測定対象物のそれぞれに対して、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収特性が、他の種類の測定対象物の光吸収特性と異なるように、測定対象物ｋに対応して用意した複数の波長のレーザ光Ｌｋを、異なる複数の周波数で強度変調して、１つの照射光として出射する第１のステップと、
照射光に照射されたｎ種類の測定対象物が発する蛍光のそれぞれに対して、測定対象物ｋの発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と異なるように、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応して設定された複数の波長帯域ＦＬｋ(ｋ＝１〜ｎの整数)で受光して、波長帯域ＦＬｋに対応した蛍光信号を出力する第２のステップと、
前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の少なくとも１つに対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を第１の参照信号として用いて、出力した前記蛍光信号のそれぞれとミキシングして周波数下方変換を行うことにより、前記蛍光信号の位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する第３のステップと、
生成した前記蛍光データの補正を行い、補正後の蛍光データを用いて前記蛍光信号の位相遅れを求め、この位相遅れを用いて、蛍光緩和時間を算出する第４のステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。 - 予め、前記第１のステップ、前記第２のステップおよび前記第３のステップを用いて、ｎ種類の測定対象物をそれぞれ単独に測定して得られる、基準位相遅れと基準強度振幅を含む基準蛍光データを記憶し、この基準蛍光データを用いて構成される行列を用いて、前記第４のステップの補正を行う、請求項１０に記載の蛍光検出方法。
- 前記レーザ光Ｌｋは、測定対象物ｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の光吸収が、他の種類の測定対象物の光吸収に対して高くなるように、波長が設定されている、請求項１０または１１に記載の蛍光検出方法。
- 前記複数の波長帯域ＦＬｋは、測定対象物の発する蛍光の蛍光強度が他の測定対象物の発する蛍光の蛍光強度に対して高くなるように設定されている、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
- 波長帯域ＦＬｍ（ｍ＝１〜ｎの整数）の受光素子が出力する測定対象物ｋの蛍光信号から前記基準蛍光データが生成され、前記基準蛍光データが、ａｋｍ・ｅ（−ｉθｋｍ）（ａｋｍは前記基準強度振幅、θｋｍは前記基準位相遅れ）と表されるとき、
前記第３のステップで生成される波長帯域ＦＬｍにおける前記蛍光データを複素数表示でＡs’(ｓ＝１〜ｎの整数)とし、補正後の蛍光データを複素数表示でＡｓ(ｓ＝１〜ｎ)としたとき、下記式（１）に従って、Ａs’からＡｓを算出する、請求項１３に記載の蛍光検出方法。
- 前記第３のステップでは、前記波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）の１つを第１の波長帯域とし、この波長帯域ＦＬｋ（ｋ＝１〜ｎの整数）に対応したレーザ光Ｌｋを強度変調する変調信号を前記第１の参照信号として定めて前記蛍光信号の周波数下方変換を行うとともに、前記第１の参照信号の周波数と異なる周波数を持つ変調信号の、前記第１の参照信号に対する差分信号を第２の参照信号として用いて、前記周波数下方変換の結果を、さらに、周波数下方変換することにより、前記位相遅れと強度振幅を含む蛍光データを生成する請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
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| WO2012070414A1 (ja) * | 2010-11-25 | 2012-05-31 | オリンパス株式会社 | 単一発光粒子の光の波長特性を用いた光分析装置及び光分析方法 |
| DE102011055294B4 (de) * | 2011-11-11 | 2013-11-07 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Mikroskopische Einrichtung und Verfahren zur dreidimensionalen Lokalisierung von punktförmigen Objekten in einer Probe |
| CN104089881A (zh) * | 2013-12-17 | 2014-10-08 | 浙江工商大学 | 大黄鱼存储时间检测方法 |
| EP3163287B1 (en) * | 2015-10-30 | 2022-03-23 | Sysmex Corporation | Cell information obtaining method and cell information obtaining apparatus |
| FI20165148A (fi) * | 2016-02-25 | 2017-08-26 | Arcdia Int Oy Ltd | Kaksoisfotoniviritteistä fluoresenssia hyödyntävä bioaffiniteettimääritysmenetelmä |
| EP3430376A1 (en) * | 2016-03-17 | 2019-01-23 | BD Biosciences | Cell sorting using a high throughput fluorescence flow cytometer |
| US10337993B2 (en) * | 2016-04-15 | 2019-07-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and apparatus for fluorescence lifetime imaging with periodically modulated light |
| KR101847334B1 (ko) | 2017-02-02 | 2018-04-10 | 한국기초과학지원연구원 | 형광 이미지 획득 장치 및 방법 |
| JP7010293B2 (ja) | 2017-08-08 | 2022-01-26 | ソニーグループ株式会社 | 情報処理装置、情報処理方法及びプログラム |
| JP7026337B2 (ja) * | 2017-08-29 | 2022-02-28 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 光観測装置 |
| WO2020139848A1 (en) * | 2018-12-28 | 2020-07-02 | Becton, Dickinson And Company | Methods for spectrally resolving fluorophores of a sample and systems for same |
| CN110530793B (zh) * | 2019-08-21 | 2022-06-28 | 荧飒光学科技（上海）有限公司 | 一体化傅里叶变换光致发光光谱仪 |
| CN111077306B (zh) * | 2019-12-30 | 2023-08-25 | 长沙协大生物科技有限公司 | 一种针对荧光免疫试剂的定量检测分析仪及其检测方法 |
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Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5418371A (en) * | 1993-02-01 | 1995-05-23 | Aslund; Nils R. D. | Apparatus for quantitative imaging of multiple fluorophores using dual detectors |
| DE19511869B4 (de) * | 1995-03-31 | 2004-02-26 | Geiler, Hans-Dieter, Dr. | Verfahren und Anordnung zur Responseanalyse von Halbleitermaterialien mit optischer Anregung |
| US6157037A (en) * | 1998-12-04 | 2000-12-05 | Photosense, Llc | Sensing device and method for measuring emission time delay during irradiation of targeted samples |
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| JP2004251814A (ja) | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Optoquest Co Ltd | 蛍光分析方法および蛍光分析装置 |
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| JP4384064B2 (ja) | 2005-02-15 | 2009-12-16 | 三井造船株式会社 | 強度変調したレーザ光による蛍光検出装置 |
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