JP4540579B2 - 蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置 - Google Patents

Description

本発明は、フローサイトメータ等を利用して、複数の標識サンプルに同時にレーザ光を照射することによって発する複数の標識サンプルの蛍光の検出値を用いて各蛍光強度を求める蛍光強度算出方法及びその装置に関する。

医療、生物分野では、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光をフォトマルチプライヤやアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の測定対象物の種類や頻度や特性を分析するフローサイトメータが広く用いられている。

フローサイトメータは、具体的には、抗原抗体反応等の結合を利用して、蛍光色素が標識された細胞やマイクロビーズ等のサンプルを生理食塩水等に混濁させてサンプル液を作り、シース液と呼ばれる別の溶液でサンプル液を包み込むように流すことにより、標識されたサンプル１つ１つが流れるラミナーシースフローを形成させ、このシースフローにレーザ光を照射し、１サンプル毎の蛍光や散乱光を計測する装置である。例えば、蛍光強度を計測して、分析対象である多種類のサンプルのうち、どの蛍光特性をもつサンプルが通過したかを識別する場合、多種類のサンプルに対して種類別に異なる蛍光色素を付着させた標識サンプルが用いられる。この標識サンプルにレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光の計測を行う。このとき、多種類の蛍光色素が発する各蛍光と、細胞やマイクロビーズ等のサンプルが発する自家蛍光とを同時に計測し識別することが必要である。このため、フローサイトメータには、受光波長帯域を異ならせた複数個の光電変換器が備えられ、この受光波長帯域に合致した蛍光色素がそれぞれ選択されて使用される。その際、複数の光電変換器で得られた計測値は各蛍光色素における蛍光強度を表すものとされている。しかし、複数の蛍光が光電変換器の受光波長範囲において同時に受光されることにより、蛍光強度の計測結果が実際の蛍光強度に対してずれが生じる。このずれを補正するために、検出値の補正が一般に行われる。
このような補正として、例えば下記特許文献１に開示される蛍光値補正方法が挙げられる。

特開２００３−８３８９４号公報

上記特許文献１では、複数の光電変換器にて得られた計測値をベクトルとして表し、一方、予め設定した補正行列の逆行列を作成し、この逆行列を上記ベクトルに作用させることで、真の蛍光強度を算出することができるとされている。この場合、補正行列は、当該文献１の図８（Ｂ）、図９（Ｂ）に示すように、二次元相関図（スキャッタグラム）における位置関係を修正する幾何学変換の行列である。このため、補正行列から逆行列を作り、この逆行列を、計測値を要素とするベクトルに作用させるには、補正行列が正方行列であることが必要となる。この補正行列の行列サイズは、計測値を出力する光電変換器の数と、マイクロビーズや細胞等のサンプルの発する自家蛍光及びこのサンプルに付着した蛍光色素の発する蛍光の種類の合計数とによって定まることから、補正行列が正方行列であるためには、光電変換器の数と受光する蛍光の数が等しくなければならない。すなわち、マイクロビーズや細胞等のサンプルに付着させる蛍光色素を４種類とすると、１種類の自家蛍光と合わせた数、すなわち５個の光電変換器による計測が必要となる。光電変換器を多数用いて計測することは、光電変換器の配置する個数は増える他、計測値に処理を施す処理回路も増大するため、フローサイトメータ及びその処理装置のコストは増大する。
このため、同時に計測される識別可能な蛍光の種類は、光電変換器の配置数に応じて制限されるといった問題が生じる。

そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、複数の蛍光色素が標識された標識サンプルにレーザ光を照射することによって発する蛍光の検出値を用いて各蛍光強度を求める際、同時に計測される識別可能な蛍光色素の種類を従来に比べて多くすることができる蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、複数の蛍光色素により標識された標識サンプルにレーザ光を照射することによって発する蛍光の検出値から各蛍光強度を求める蛍光強度算出方法であって、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集するステップと、レーザ光を照射した標識サンプルの各蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列の行列要素を設定して前記補正変換行列を作成するステップと、各検出センサから収集された前記位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このベクトルに前記補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルの各々が発する蛍光の蛍光強度を求めるステップと、を有することを特徴とする蛍光強度算出方法を提供する。
なお、標識サンプルとは、例えば、蛍光色素により標識された細胞やマイクロビーズである。

なお、前記標識サンプルは、互いに異なる種類の蛍光色素が、レーザ光の照射により自家蛍光を発するサンプルへ付着することにより、異なる複数の種類を有し、前記標識サンプルへのレーザ光の照射により、前記蛍光色素のうち少なくとも１種類の蛍光色素から発する蛍光と前記サンプルから発する自家蛍光とは、波長スペクトラムが波長領域で部分的に互いに重なっていてもよい。この場合、検出される検出値を前記標識サンプルの発する各蛍光強度とすることは困難であるが、前記蛍光強度算出方法を用いて各蛍光強度を求めることができる。なお、蛍光色素のサンプルへの付着は化学的又は物理的結合により行われる。なお、前記蛍光色素は、蛍光色素の種類別に異なって波長（色）の蛍光を発するように選択してもよいが、蛍光色素の蛍光緩和特性（蛍光緩和時定数）が異なれば、同じ波長（色）で発光する蛍光色素を選択することもできる。
また、前記検出センサの個数をｍ個、前記蛍光色素の種類をｎ種類としたとき、２・ｍ≧ｎ＋１を満足することが好ましい。

さらに、前記補正変換行列を作成するステップでは、蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める第１のキャリブレーションが行われ、この第１のキャリブレーションでは、前記無標識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する前記自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この第１のキャリブレーションにより求められた蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成することが好ましい。
その際、前記補正変換行列の作成において、前記補正変換行列を作成するために前記第１のキャリブレーションにより求められる前記ゲイン定数を用いる際、各検出センサの検出値から得られるゲイン定数を、これらのゲイン定数のうち最大となるゲイン定数で規格化して用いることが好ましい。

また、前記第１のキャリブレーションにおいて、前記蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求めるときに用いられる検出値は、前記検出センサで検出された信号波形のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の振幅値であり、この位相情報を含む検出値は、前記標識サンプルの１つ１つに対して収集され、これら複数の検出値から代表値を抽出して前記第１のキャリブレーションに用いることが好ましい。

また、前記補正変換行列を作成するステップでは、前記標識サンプルの種類すべてについて、前記蛍光色素が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記標識サンプルの種類の別に求める第２のキャリブレーションが行われ、この第２のキャリブレーションでは、前記蛍光色素のうちの１種類が前記自家蛍光を発するサンプルに付着した標識サンプルを測定対象物として、前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から、この標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記自家蛍光を発するサンプルに付着させる蛍光色素の種類を変えながら、前記標識サンプルに含まれるすべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この第２のキャリブレーションにより求められた前記標識サンプルにおける蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成することが好ましい。

その際、前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める際、前記蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める第１のキャリブレーションが行われ、この第１のキャリブレーションでは、前記無標識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この第１のキャリブレーションにより求められた蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて、前記第２のキャリブレーションにおいて、前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求めることが好ましい。

また、前記補正変換行列の作成において、前記補正変換行列を作成するために前記第２のキャリブレーションにより求められる前記ゲイン定数を用いる際、各標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎に、各検出センサの検出値から得られるゲイン定数を、これらのゲイン定数のうち最大となるゲイン定数で規格化して用いることが好ましい。
また、前記第２のキャリブレーションにおいて、前記緩和時定数及びゲイン定数を求めるときに用いられる検出値は、前記検出センサで検出された信号波形のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の振幅値であり、この位相情報を含む検出値は前記標識サンプルの１つ１つに対して収集され、これら複数の標識サンプルの検出値から代表値を抽出して前記第２のキャリブレーションに用いることが好ましい。

本発明は、複数の蛍光色素により標識された標識サンプルにレーザ光を照射することによって発する複数の標識サンプルの蛍光の検出値から各蛍光強度を求める蛍光強度算出装置であって、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集する入力手段と、レーザ光を照射した標識サンプルの各蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列の行列要素を設定して前記補正変換行列を作成する行列作成手段と、各検出センサから収集された前記位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このベクトルに前記補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルの各々が発する蛍光の蛍光強度を求める強度算出手段と、を有することを特徴とする蛍光強度算出装置を提供する。

その際、前記標識サンプルは、互いに異なる種類の蛍光色素が、レーザ光の照射により自家蛍光を発するサンプルへ付着することにより、異なる複数の種類を有し、前記標識サンプルへのレーザ光の照射により、前記蛍光色素のうち少なくとも１種類の蛍光色素から発する蛍光と前記サンプルから発する自家蛍光とは、波長スペクトラムが波長領域で部分的に互いに重なっていてもよい。この場合、検出される検出値を前記標識サンプルの発する各蛍光強度とすることは困難であるが、前記蛍光強度算出方法を用いて各蛍光強度を求めることができる。なお、蛍光色素のサンプルへの付着は化学的又は物理的結合により行われる。

その際、蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める第１のキャリブレーション手段を有し、この第１のキャリブレーション手段は、前記無標識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する前記自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、前記行列作成手段は、この第１のキャリブレーション手段で求められた蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成することが好ましい。

また、前記標識サンプルの種類すべてについて、前記蛍光色素が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記標識サンプルの種類の別に求める第２のキャリブレーション手段を有し、この第２のキャリブレーション手段は、前記蛍光色素のうちの１種類が前記自家蛍光を発するサンプルに付着した標識サンプルを測定対象物として、前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から、この標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記自家蛍光を発するサンプルに付着させる蛍光色素の種類を変えながら、前記標識サンプルに含まれるすべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、前記行列作成手段は、この第２のキャリブレーション手段で求められた前記標識サンプルにおける蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成することが好ましい。

本発明では、複数の蛍光色素が標識された標識サンプルにレーザ光を照射しても、蛍光強度に対応するゲイン定数を求めることができる。その際、レーザ光を所定の周波数で時間変調するので、１つの光電変換器から位相差情報を検出することができる。したがって、これらの値を用いて蛍光強度を求めるので、従来のように、計測により求めることができる標識サンプルの数は、光電変換器の配置個数が同じ場合、識別可能な蛍光の種類を従来に比べて多くすることができる。

また、複数種類の標識サンプルに対する蛍光強度の前に、無標識サンプル及び各種類ごとの標識サンプルを用いて蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出っする第１のキャリブレーション及び第２のキャリブレーションを行なうので、複数種類の標識サンプルに対する蛍光強度を精度良く求めることができる。

以下、本発明の蛍光強度算出方法を実施する本発明の及び蛍光強度算出装置について、フローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光強度検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。

フローサイトメータ１０は、マイクロビーズや特定の細胞等の受容体サンプル（サンプルという）に蛍光色素が化学的結合又は物理的結合により付着して標識された標識サンプル１２にレーザ光を照射し、この標識サンプル１２から発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する信号処理装置２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果から標識サンプル１２の分析を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。前記サンプルは、レーザ光の照射に対して自家蛍光するようになっている。

信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及び標識サンプル１２からの蛍光信号を処理する処理部を有する制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液とともに標識サンプル１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に標識サンプル１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。

レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域の連続波のレーザ光、例えば波長４０５ｎｍのレーザ光を所定の周波数で強度変調して出射する部分である。
レーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられ、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力でレーザ光が出射される。一方、レーザ光の強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜１００ＭＨｚである。
なお、本発明においては、１つのレーザ光の他に、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ₁＝４０５ｎｍ、λ₂＝５３３ｎｍおよびλ₃＝６５０ｎｍ等のレーザ光を同時に出射させるように構成してもよい。この場合、ダイクロイックミラーを用いて、３つのレーザ光を１つの光束にまとめて照射するとよい。また、レーザ光の照射により蛍光がＲ，Ｇ，Ｂのうちどのレーザ光に反応したものであるかを識別することができるように、各レーザ光に互いに直交する符号化系列の信号情報を含ませるとよい。詳細は、本願出願人の出願である特願２００５−３７３９９号に詳細に記載されている。

レーザ光源部２２は、レーザ光が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光によって発する蛍光は、測定しようとする標識サンプル１２の自己発光の蛍光及び標識サンプル１２中の蛍光色素の発する蛍光であり、標識サンプル１２は管路３０を通過する際、測定点でレーザ光の照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。

受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する標識サンプル１２によってレーザ光が前方散乱することにより、標識サンプル１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において標識サンプル１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交方向であって、かつ管路３０中の標識サンプル１２の移動方向に対して直交方向に配置されており、測定点にて照射された標識サンプル１２が発する蛍光を受光するフォトマルチプライヤ（光電子倍増管）やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を備える。
図２は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。

図２に示す受光部２６は、標識サンプル１２からの蛍光の蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２と、バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３と、光電子倍増管やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。

ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ_１，２６ｂ_２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。

バンドパスフィルタ２６ｃ_１〜２６ｃ_３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光の波長帯域に対応して設定されており、互いに異なる波長帯域となっている。

光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は信号情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は位相差の信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給され、増幅器で増幅される。

制御・処理部２８は、図３に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０及びコントローラ４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２に供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号の位相差検出のための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。

信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射により標識サンプル１２が発する蛍光の位相遅れに関する情報（位相差）を抽出する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ〜５４ｃと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ（不図示）、及び増幅された蛍光信号を上記変調信号に合成するＩＱミキサ（不図示）を有する位相差検出器５６を有して構成される。

位相差検出器５６に設けられる図示されないＩＱミキサは、光電変換器２７ａ〜２７ｃから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として合成するために、光電変換器２７ａ〜２７ｃの別に設けられている。具体的には、ＩＱミキサのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。

コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御するとともに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を求める部分である。

具体的には、コントローラ４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。Ａ／Ｄ変換器６６では、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号がサンプリングされて、分析装置８０に供給される。

分析装置８０は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号値（検出値）をベクトル成分とするベクトルとし、予め定められた補正変換行列から作成される逆行列に対して、ベクトルを作用して、蛍光強度を算出する装置である。
分析装置８０は、本発明の蛍光強度算出装置に対応しており、後述する蛍光強度算出方法を実施する。

図４は、分析装置８０の概略構成図である。
分析装置８０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置であり、ＣＰＵ８２、メモリ８４、入出力ポート８６の他に、ソフトウェアを起動することによって形成される第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０及び強度算出ユニット９２を有する。また、分析装置８０にはディスプレイ９４が接続されている。

分析装置８０の行う処理は、図５〜７に示す処理である。強度算出ユニット９２は、図５に示す処理フローの主要部分を実行し、第１キャリブレーションユニット８８は図６に示す処理フローの主要部分を実行し、第２キャリブレーションユニット９０は図７に示す処理フローの主要部分を実行する。

ＣＰＵ８２は、コンピュータに設けられた演算プロセサであり、第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０及び強度算出ユニット９２の各種計算を実質的に実行する。
メモリ８４は、コンピュータ上で実行することにより、第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０及び強度算出ユニット９２を形成するプログラムを格納したＲＯＭと、第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０及び強度算出ユニット９２により算出された処理結果や入出力ポート８６から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備えている。
入出力ポート８６は、コントローラ４４から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の検出値の入力を受け入れるとともに、第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０及び強度算出ユニット９２で作成された処理結果の値やスキャッタグラム等の情報をディスプレイ９４に出力するために用いられる。
ディスプレイ９４は、第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０及び強度算出ユニット９２で求められた蛍光緩和時定数やゲイン定数等の処理結果の値やスキャッタグラム等のグラフを表示する。

強度算出ユニット９２は、図５に示す処理フローの主要部分を実行する部分であり、コントローラ４４から供給されたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の検出値から各蛍光強度を求める。
すなわち、強度算出ユニット９２は、レーザ光を照射した標識サンプルの蛍光がいずれも１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータ（ゲイン定数、蛍光緩和時定数）を用いて補正変換行列の行列要素を設定して補正変換行列の行列要素を求めることにより、補正変換行列を作成する。次に、コントローラ４４から供給された各検出センサから収集されたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の検出値（位相情報を含む検出値）の組をベクトルとし、このベクトルに先に作成された補正変換行列から作成された逆行列を作用させて標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度を算出する。強度算出ユニットの処理の詳細については、後述する。
なお、標識サンプル１２は、異なる種類の蛍光色素が細胞やマイクロビーズ等のサンプルへ付着することにより、標識された標識サンプルであるが、このときの標識サンプルの種類をｎ種類とし、光電検出器の個数をｍ個としたとき、２・ｍ≧ｎ＋１を満足するようにｍ、ｎが設定されている。

第１キャリブレーションユニット８８は、蛍光色素が付着しておらずマイクロビース等の自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルが発する自家蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める部分である。具体的には、第１キャリブレーションユニット８８は、無標識サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各光電変換器から収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出し、メモリ８４に記憶する。詳細の説明は後述する。

第２キャリブレーションユニット９０は、蛍光色素を有する標識サンプルの種類すべてについて、それぞれ別々に、蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出する部分である。この場合においても、蛍光色素が発する蛍光は１次遅れ系の緩和応答であるとする。
すなわち、第２キャリブレーションユニット９０は、１種類の蛍光色素のみを用いて標識された標識サンプル（１種類の蛍光色素が付着した自家蛍光を発するマイクロビーズ等のサンプル）を準備し、この標識サンプルを測定対象物として、所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から、選択した標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出する。そして、標識サンプル中の蛍光色素の種類を順次変えながら、標識サンプルの蛍光色素が発するすべての蛍光の緩和時定数及びゲイン定数を算出し、算出した緩和時定数及びゲイン定数をメモリ８４に記憶する。詳細の説明は後述する。

このように、第１キャリブレーションユニット及び第２キャリブレーションユニットで算出されてメモリ８４に記憶された自家蛍光及び蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数は、強度算出ユニット９２において補正変換行列を作成する際、伝達関数のパラメータとして用いられ、補正変換行列の行列要素の算出に用いられる。第１キャリブレーションユニット８８で算出された自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いるのは、標識サンプルから発する自家蛍光によって蛍光色素の発するｎ個の蛍光強度の算出結果の精度が劣化するのを防ぐためである。
また、上記伝達関数の値の算出の際、第２キャリブレーションユニット９０で算出された蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いるのは、ｎ個の蛍光色素から発する蛍光を同時に計測するとき、蛍光強度を精度良く求めるためである。
すなわち、強度算出ユニット９２は、メモリ８４に記憶されて既知となった、自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数と、メモリ８４に記憶されて既知となった蛍光色素の蛍光緩和時定数及びゲイン定数とを用いて、補正変換行列を作成し、これを用いて蛍光強度を求める。詳細の説明は省略する。
以上が分析装置８０の構成である。

このようなフローサイトメータ１０では、図５に示すような処理が行われて、各蛍光の蛍光強度が求められる。
まず、ｎ種類の標識サンプルが準備される（ステップＳ１０）。ｎ種類の標識サンプルとは、ｎ種類の蛍光色素がマイクロビーズ等のサンプルに付着して標識されたものをいい、測定溶液中に混濁されているものをいう。標識サンプルの溶液はシース液を用いて管路３０内にてフローセルを形成する。このフローセルに所定の周波数で強度変調したレーザ光を照射して蛍光の計測が行われる（ステップＳ２０）。

蛍光の計測は、標識サンプル１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせる、受光部２４の生成するトリガ信号に応じて、波長帯域の異なるｍ個の光電変換器（図２に示す実施形態ではｍ＝３）による計測が開始される。
計測により得られた蛍光信号は、信号処理部４２の位相差検出器５６にて、蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号が取り出される。この処理信号は、コントローラ４４において、ローパスフィルタ６２により高周波信号が除去されて、蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分がＡＤ変換されて検出値として求められる。

求められたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分は、分析装置８０に供給され、所定の計測時間内に求められたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の情報を用いてスキャッタグラム（２次元相関図）がディスプレイ９４に表示される(ステップＳ３０)。
ディスプレイ９４にスキャッタグラムが表示されるとともに、光電変換器毎に検出されたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の検出値をベクトル成分とするベクトルにまとめ、このベクトルに後述する補正変換行列から作られた逆行列を作用させる(ステップＳ５０)。逆行列をベクトルに作用させることで、各標識サンプルの発する蛍光におけるゲイン定数が求められ、このゲイン定数が蛍光強度の比率のベクトルとして求められる。
こうして求められた蛍光強度の比率と蛍光緩和時定数がディスプレイ９４に表示される（ステップＳ５０）。

ここで、補正変換行列の行列要素は下記のように作成される。
標識サンプルの発する蛍光が１次遅れ系の緩和過程であるとしたとき、各光電変換器で出力される検出値（ｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分）は、標識サンプルが発するｎ種類の蛍光色素からの蛍光及び１種類の自家蛍光の各１次遅れ系の伝達関数を加算して下記式（１）、（２）のように表される。

ここでτ_i（ｉ＝１〜ｎ）は、ｉ番目の種類の蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時定数である。又、κ_ij(ｉ＝１〜ｎ, j＝１〜ｍ)は、ｉ番目の種類の蛍光色素が発する蛍光が、ｊ番目の光電変換器において検出されるときのゲイン定数であって、ｍ個の光電変換器で検出されるゲイン定数のうち最大のゲイン定数で規格化されたものをいう。
また、τ_０は自家蛍光を発するサンプルが自家蛍光を発するときの蛍光緩和時定数である。又、κ_０j(j＝１〜ｍ)は、前記サンプルが自家蛍光を発するときの自家蛍光が、ｊ番目の光電変換器において検出されるときのゲイン定数であって、ｍ個の光電変換器で検出されるゲイン定数のうち最大のゲイン定数で規格化されたものをいう。
これらの値は、後述する第１のキャリブレーション（図６に示す処理）及び第２のキャリブレーション（図７に示す処理）によって算出されてメモリ８４に記憶されたものである。なお、ω_Mは、レーザ光の変調周波数に２πを乗算した角周波数である。

一方、α_i（ｉ＝１〜ｎ）は、ｎ種類の蛍光色素及び１種類の自家蛍光を発するサンプルが同時に蛍光を発するときの、前記蛍光色素が発する蛍光のゲイン定数であり、このゲイン定数が同時にレーザ光を照射したときの蛍光強度を表すものである。α_０は、ｎ種類の蛍光色素及び１種類の前記サンプルが同時に蛍光を発するときの、前記サンプルが発する自家蛍光のゲイン定数である。これらのゲイン定数α_i、α_０は、ｎ種類の蛍光色素により標識された標識サンプルに同時にレーザ光を照射したときの蛍光強度を表す未知数であり、求めようとするものである。
したがって、式（１）、（２）から下記式（３）のように補正変換行列Ｍを用いて方程式が表される。ここで、補正変換行列Ｍの行列要素は、例えば１行１列の行列要素は、κ₁₁／（１＋（τ₁・ω_M）²）である。
このように伝達関数の値が行列要素となる補正変換行列Ｍが作成される。

なお、補正変換行列Ｍの行列サイズは、２・ｍ×（ｎ＋１）（縦方向×横方向）である。ここで、ｍ，ｎは上述したように２・ｍ≧ｎ＋１を満足するように設定されている。このため、補正変換行列の縦方向のサイズを縮小して、例えば、κ_ijの値の小さい行を取り除いて（ｎ＋１）×（ｎ＋１）の行列サイズにする。これにより、補正変換行列Ｍの行列はサイズが縮小し、この縮小した正方行列Ｍ’の逆行列Ｍ’^-1が求められ、この逆行列Ｍ’^-1を式（３）の左辺ベクトルＡに作用して、式（３）中の右辺ベクトルＸが算出される（ステップＳ４０）。

なお、上記のように行列サイズを縮小化する方法の他に、式（３）の両辺に補正変換行列Ｍの転置行列Ｍ^tを掛けて、補正変換行列を、（ｎ＋１）×（ｎ＋１）の行列サイズの正方行列Ｍ^t・Ｍに変え、この正方行列の逆行列（Ｍ^t・Ｍ）^-1を、式（３）中の左辺のベクトルＡに上記転置行列を掛けたＭ^tＡに作用させて、式（３）の右辺のベクトルＸ（＝（Ｍ^t・Ｍ）^-1・Ｍ^tＡ）を算出することもできる。
こうして求められた式(３)中の右辺のベクトルＸには、既知数であるτ_i（ｉ＝１〜ｎ）、τ_０が含まれるので、これらの値が代入されて、算出されたベクトルＸからα_i（ｉ＝１〜ｎ）、α_０が算出される。
最後に、各蛍光の蛍光緩和時定数τ_i、τ_０及びゲイン定数α_i、α_０がディスプレイ９４に表示される。ゲイン定数α_i、α_０は、各蛍光の蛍光強度を表す。

なお、上述したように、補正変換行列Ｍを作成する際、メモリ８４に記憶されたτ_０及びκ_０jを用いるが、これらの値は、図６に示す第１のキャリブレーションによって算出される。
以下、第１のキャリブレーションについて説明する。

図６に示す第１のキャリブレーションでは、まず、無標識サンプルが準備される（ステップＳ１００）。
無標識サンプルとは、レーザ光の照射により自家蛍光する１種類のサンプルの溶液をいう。このようなサンプルとして、抗体等が結合可能なウィスカが設けられたマイクロビーズや細胞等の受容体サンプルが挙げられる。

次に、無標識サンプルについてフローサイトメータで計測が行われる（ステップＳ１１０）。
フローサイトメータによる計測（ステップＳ１１０）及びスキャッタグラムのディスプレイ表示（ステップＳ１２０）は、図５に示すステップＳ２０、ステップＳ３０と同様の処理であるので説明は省略する。
次に、無標識サンプルが発する自家蛍光を特定するために、ディスプレイ９４に表示されたスキャッタグラムにおいて、無標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団が選択される（ステップＳ１３０）。この選択は、オペレータによるマウス等の入力操作系を用いて行われ、選択されたサンプル集団の領域に含まれる無標識サンプルのｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分、あるいは蛍光信号の振幅及び位相差の代表値（例えば平均値、重心値、頻度ピーク値）が求められる（ステップＳ１４０）。
次に求められた代表値を用いて、この代表値と蛍光緩和時定数及びゲイン定数との間の関係を規定した下記式（４）〜（７）を用いて蛍光緩和時定数及びゲイン定数が求められる（ステップＳ１５０）。

ここで、τ₀は、自家蛍光を発するサンプルの自家蛍光の蛍光緩和時定数であり、ω_Mはレーザ光の変調周波数に２πを乗算した角周波数である。α_0jは、ｊ番目（ｊ＝１〜ｍ）の光電変換器で得られる自家蛍光のゲイン定数である。Ｃは比例定数である。
自家蛍光の蛍光緩和時定数τ₀及び自家蛍光のゲイン定数α_0jは、式（４）〜（７）のいずれか２つを用いて算出される。
こうして算出された無標識サンプルの蛍光緩和時定数及びゲイン定数は、メモリ８４に記憶される（ステップＳ１５０）。
第１キャリブレーションは以上のように行われる。

次に、第２のキャリブレーションについて説明する。
図７に示す第２のキャリブレーションでは、まず、ｎ種類の標識サンプルのうち、１種類の蛍光色素が付着した標識サンプルが準備される（ステップＳ２００）。ここで、１種類の標識サンプルとは、マイクロビーズ等の自己発光する１種類のサンプルに、１種類の蛍光色素が付着されたものをいう。
次に、フローサイトメータ１０により蛍光の計測が行われ（ステップＳ２１０）、計測結果がスキャッタグラムに表示され（ステップＳ２２０）、スキャッタグラムから１種類の標識サンプルにおけるサンプル集団が選択される。

フローサイトメータによる計測（ステップＳ２１０）及びスキャッタグラムのディスプレイ表示（ステップＳ２２０）は、図５に示すステップＳ２０、ステップＳ３０と同様の処理であるので説明は省略する。
サンプル集団の選択は、１種類の標識サンプル中のサンプルが発する自家蛍光を特定するために行われる。具体的には、ディスプレイ９４に表示されたスキャッタグラムにおいて、１種類の標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団が選択される。この選択は、オペレータによるマウス等の入力操作系を用いて行われ、選択されたサンプル集団の領域に含まれる標識サンプルの発する蛍光のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分、あるいは蛍光信号の振幅及び位相差の代表値（例えば平均値、重心値、頻度ピーク値）が求められる（ステップＳ２４０）。

次に、求められた代表値を用い、さらに第１のキャリブレーションで算出され、メモリ８４に記憶されたサンプルの発する自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて、下記式（８）〜（１０）から標識サンプル内の蛍光色素から発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数が算出される（ステップＳ２５０）。

ここで、式（８）中の添字［１］及び［２］は、複数の光電変換器で得られた蛍光信号の振幅(（ｃｏｓ成分）²＋（ｓｉｎ成分）²)）^(1/2)のうち、振幅値が最大となる光電変換器の番号及び振幅値が２番目に大きい光電変換器の番号である。それゆえ、κ_0[1]及びκ_0[2]は、自己発光する蛍光のうち、第１のキャリブレーションにおいて算出されたゲイン定数の最大ゲインに対して規格化された比率であり、添字［１］及び［２］の番号が判っているので既知の値である。
式（８）によって算出された蛍光緩和時定数τ_iは、図５に示す処理フローにおいて式（３）中の補正変換行列の行列要素の値の算出に用いるために、メモリ８４に記憶される。さらに、この蛍光緩和時定数τ_iを用いて、式（９）からα_0maxが算出される。α_0maxは、第２キャリブレーションにおいて自家蛍光を発するサンプルが自家蛍光するときの蛍光の最大ゲイン定数である。このα_0maxを式（１０）に代入することにより、α_i[1]を算出することができる。α_i[1]は、蛍光色素が発する蛍光のうち、振幅値が最大となる光電変換器の番号において受光した蛍光のゲイン定数である。
同様に、下記式（１１）を用いて式（１１）中のｊ番目の光電変換器で受光した蛍光のゲイン定数α_ijを算出する。

こうして算出された蛍光緩和時定数及びゲイン定数は、メモリ９４に記憶されるが、算出された値は、１種類の標識サンプルにおける蛍光のパラメータである。したがって、ｎ種類の標識サンプルについてそれぞれ準備されて蛍光のパラメータが求められたか否かが判定される（ステップＳ２６０）。
判定の結果、すべての種類の標識サンプルが準備されておらず、蛍光のパラメータが算出されていない場合、ステップＳ２００に戻り、ステップＳ２００〜ステップＳ２５０を繰り返す。
こうして、各種類毎の標識サンプルにおける蛍光の計測から、各蛍光色素毎の蛍光緩和時定数及びゲイン定数がそれぞれ算出され、メモリ８４に記憶される。
こうしてメモリ８４に記憶された蛍光緩和時定数及びゲイン定数は、図５に示された処理中のステップＳ４０における補正変換行列の作成に用いられる。
以上が、第２のキャリブレーションの説明である。
第２のキャリブレーションで算出されたゲイン定数α_ij（ｉ＝１〜ｎ，ｊ＝１〜ｍ）は、これらのゲイン定数のうち、ｉを固定しｊを変えたとき最大値となるゲイン定数max（α_ij）で規格化することにより、式（３）中の補正変換行列中で用いるκ_ijを得ることができる。さらに、規格化されたκ_ijは、図５に示す処理フローにおいて式（３）中の補正変換行列の行列要素の値の算出に用いるためにメモリ８４に記憶される。

このように、本発明では、図５に示す処理フローに基づいて、ｎ種類の標識サンプルにレーザ光を照射しても、蛍光強度に対応するゲイン定数を求めることができる。その際、レーザ光を所定の周波数で時間変調するので、１つの光電変換器からｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値を検出することができる。したがって、これらの値を用いて蛍光強度を求めるので、従来のように、計測により求めることができる標識サンプルの数は、従来のように光電変換器の配置数と同数かそれ以下に制限されない。つまり、光電変換器の配置個数が同じ場合、識別可能な蛍光の種類を従来に比べて多くすることができる。
また、ｎ種類の標識サンプルに対して図５に示す処理を行う前に、無標識サンプル及び各種類ごとの標識サンプルを用いて蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出する第１のキャリブレーション及び第２のキャリブレーションを行なうので、図５に示す処理の際、蛍光強度を精度良く求めることができる。

以上、本発明の蛍光強度算出方法及び蛍光強度算出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。

本発明の蛍光強度検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータの受光部の一例を示す略構成図である。 図１に示すフローサイトメータの制御・処理部の一例を示す略構成図である。 図１に示すフローサイトメータの分析装置の一例を示す略構成図である。 本発明の蛍光強度検出方法の流れの一例を示すフローチャートである。 本発明の蛍光強度検出方法で行う第１のキャリブレーションの流れの一例を示すフローチャートである。 本発明の蛍光強度検出方法で行う第２のキャリブレーションの流れの一例を示すフローチャートである。

符号の説明

１０ フローサイトメータ
１２ 標識サンプル
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２４，２６ 受光部
２６ａ レンズ系
２６ｃ₁，２６ｃ₂，２６ｃ_３ バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ コントローラ
４６ 発振器
４８ パワースプリッタ
５０，５２，５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，６４ 増幅器
５６ 位相差検出器
６０ システム制御器
６２ ローパスフィルタ
６６ Ａ／Ｄ変換器
８０ 分析装置
８２ ＣＰＵ
８４ メモリ
８６ 入出力ポート
８８ 第１キャリブレーションユニット
９０ 第２キャリブレーションユニット
９２ 強度算出ユニット

Claims (14)

1. 複数の蛍光色素により標識された標識サンプルにレーザ光を照射することによって発する蛍光の検出値から各蛍光強度を求める蛍光強度算出方法であって、
   レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集するステップと、
   レーザ光を照射した標識サンプルの各蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列の行列要素を設定して前記補正変換行列を作成するステップと、
   各検出センサから収集された前記位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このベクトルに前記補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルから発する蛍光の蛍光強度を求めるステップと、を有することを特徴とする蛍光強度算出方法。
2. 前記標識サンプルは、互いに異なる種類の蛍光色素が、レーザ光の照射により自家蛍光を発するサンプルへ付着することにより、異なる複数の種類を有し、
   前記標識サンプルへのレーザ光の照射により、前記蛍光色素のうち少なくとも１種類の蛍光色素から発する蛍光と前記サンプルから発する自家蛍光とは、波長スペクトラムが波長領域で部分的に互いに重なっている請求項１に記載の蛍光強度算出方法。
3. 前記検出センサの個数をｍ個、前記蛍光色素の種類をｎ種類としたとき、２・ｍ≧ｎ＋１を満足する請求項２に記載の蛍光強度算出方法。
4. 前記補正変換行列を作成するステップでは、蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める第１のキャリブレーションが行われ、
   この第１のキャリブレーションでは、前記無標識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する前記自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、
   この第１のキャリブレーションにより求められた蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成する請求項２又は３に記載の蛍光強度算出方法。
5. 前記補正変換行列の作成において、前記補正変換行列を作成するために前記第１のキャリブレーションにより求められる前記ゲイン定数を用いる際、各検出センサの検出値から得られるゲイン定数を、これらのゲイン定数のうち最大となるゲイン定数で規格化して用いる請求項４に記載の蛍光強度算出方法。
6. 前記第１のキャリブレーションにおいて、前記蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求めるときに用いられる検出値は、前記検出センサで検出された信号波形のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の振幅値であり、この位相情報を含む検出値は、前記標識サンプルの１つ１つに対して収集され、これら複数の検出値から代表値を抽出して前記第１のキャリブレーションに用いる請求項４又は５に記載の蛍光強度算出方法。
7. 前記補正変換行列を作成するステップでは、前記標識サンプルの種類すべてについて、前記蛍光色素が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記標識サンプルの種類の別に求める第２のキャリブレーションが行われ、
   この第２のキャリブレーションでは、前記蛍光色素のうちの１種類が前記自家蛍光を発するサンプルに付着した標識サンプルを測定対象物として、前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から、この標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記自家蛍光を発するサンプルに付着させる蛍光色素の種類を変えながら、前記標識サンプルに含まれるすべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、
   この第２のキャリブレーションにより求められた前記標識サンプルにおける蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成する請求項２〜５のいずれか１項に記載の蛍光強度算出方法。
8. 前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める際、前記蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める第１のキャリブレーションが行われ、
   この第１のキャリブレーションでは、前記無標識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この第１のキャリブレーションにより求められた蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて、前記第２のキャリブレーションにおいて、前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める請求項７に記載の蛍光強度算出方法。
9. 前記補正変換行列の作成において、前記補正変換行列を作成するために前記第２のキャリブレーションにより求められる前記ゲイン定数を用いる際、各標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎に、各検出センサの検出値から得られるゲイン定数を、これらのゲイン定数のうち最大となるゲイン定数で規格化して用いる請求項７又は８に記載の蛍光強度算出方法。
10. 前記第２のキャリブレーションにおいて、前記緩和時定数及びゲイン定数を求めるときに用いられる検出値は、前記検出センサで検出された信号波形のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の振幅値であり、この位相情報を含む検出値は前記標識サンプルの１つ１つに対して収集され、これら複数の標識サンプルの検出値から代表値を抽出して前記第２のキャリブレーションに用いる請求項７〜９のいずれか１項に記載の蛍光強度算出方法。
11. 複数の蛍光色素により標識された標識サンプルにレーザ光を照射することによって発する複数の標識サンプルの蛍光の検出値から各蛍光強度を求める蛍光強度算出装置であって、
    レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集する入力手段と、
    レーザ光を照射した標識サンプルの各蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列の行列要素を設定して前記補正変換行列を作成する行列作成手段と、
    各検出センサから収集された前記位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このベクトルに前記補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルの各々が発する蛍光の蛍光強度を求める強度算出手段と、を有することを特徴とする蛍光強度算出装置。
12. 前記標識サンプルは、互いに異なる種類の蛍光色素が、レーザ光の照射により自家蛍光を発するサンプルへ付着することにより、異なる複数の種類を有し、
    前記標識サンプルへのレーザ光の照射により、前記蛍光色素のうち少なくとも１種類の蛍光色素から発する蛍光と前記サンプルから発する自家蛍光とは、波長スペクトラムが波長領域で部分的に互いに重なっている請求項１１に記載の蛍光強度算出装置。
13. 蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求める第１のキャリブレーション手段を有し、
    この第１のキャリブレーション手段は、前記無標識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する前記自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、
    前記行列作成手段は、この第１のキャリブレーション手段で求められた蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成する請求項１２に記載の蛍光強度算出装置。
14. 前記標識サンプルの種類すべてについて、前記蛍光色素が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記標識サンプルの種類の別に求める第２のキャリブレーション手段を有し、
    この第２のキャリブレーション手段は、前記蛍光色素のうちの１種類が前記自家蛍光を発するサンプルに付着した標識サンプルを測定対象物として、前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサから収集し、これらの検出値から、この標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時定数及びゲイン定数を、前記自家蛍光を発するサンプルに付着させる蛍光色素の種類を変えながら、前記標識サンプルに含まれるすべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を求め、
    前記行列作成手段は、この第２のキャリブレーション手段で求められた前記標識サンプルにおける蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成する請求項１１又は１２に記載の蛍光強度算出装置。

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