JP4365380B2 - Ｆｒｅｔ検出方法および装置 - Google Patents

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本発明は、レーザ光の照射によって励起された第１分子が発する蛍光が励起光として第２分子を励起し、第1分子のエネルギーが第２分子のエネルギーに移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を、この励起された第２分子が発する蛍光、および第１分子が発する蛍光を受光することによって検出する方法及び装置に関する。具体的には、蛍光分子であるドナー分子と蛍光分子であるアクセプタ分子との対に関して、両分子の相互作用を蛍光によって検出するＦＲＥＴ検出技術に関する。
現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
このようなタンパク質の他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用について、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して解析することが最近行われている。すなわち、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を蛍光を用いて検出する。このようなＦＲＥＴ現象を利用した検出は、主に顕微鏡システムを用いて行われる。
例えば、下記特許文献１は、ＦＲＥＴを用いた一分子蛍光解析を開示している。この文献では、ＦＲＥＴ現象を用いて、受光した蛍光に基づいて蛍光相関分析法又は蛍光強度分布解析を行う蛍光分光分析方法が提案されている。
特開２００５−２０７８２３号公報
しかし、この方法では、短時間にＦＲＥＴの検出を行うことのできる細胞等のサンプル数は、せいぜい数十個程度に限られており、多くの細胞を解析対象として短時間に統計的に解析することは難しい。また従来は、蛍光強度のみの計測であり、この蛍光強度は細胞に付着させる蛍光たんぱくの標識量の影響を受けて変化するため、測定した蛍光情報の不確定要素を完全に排除することはできず、ＦＲＥＴの発生の程度を定量的に検出することが困難であるといった問題もあった。
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、ドナー分子及びアクセプタ分子を含むサンプルについて、蛍光たんぱくの標識量や、ドナー分子からの蛍光の蛍光波長の広がりと、アクセプタ分子からの蛍光の蛍光波長の広がりなどに起因する、蛍光検出情報の不確定要素を除外して、定量的にＦＲＥＴの発生の程度（例えばＦＲＥＴ効率）を測定することを可能とするＦＲＥＴ検出方法および装置を提供する。
上記目的を達成するために、本発明は、第１分子および第２分子で標識された測定対象サンプルにレーザ光を照射し、このとき測定対象サンプルが発する蛍光を受光することによって、第１分子のエネルギーが第２分子に移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を検出するＦＲＥＴ検出方法であって、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して前記測定対象サンプルに照射し、このときの前記測定対象サンプルの発する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集するステップと、予め記憶手段に記憶されている情報であって、前記測定対象サンプルの前記蛍光のうち前記第１分子が発する第１分子蛍光成分の、前記受光波長帯域における蛍光強度の比を表す第１の強度比率と、前記レーザ光の時間変調に対する前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記蛍光のうち前記第２分子が発する第２分子蛍光成分の、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を表す第２の強度比率と、前記レーザ光の時間変調に対する前記第２分子蛍光成分の位相情報と、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたとき定義される寿命であって前記ＦＲＥＴが発生しない状態における前記第１分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命と、を少なくとも含むキャリブレーション情報を読み出して取得するステップと、各検出センサから収集された前記検出値から、前記受光波長帯域毎に、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を求めて、求めた前記蛍光強度情報および前記位相情報と、前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報と、を用いて、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたとき定義される前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップと、前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記第１分子蛍光成分の前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命との比を用いてＦＲＥＴ発生情報を求めるステップと、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出方法を提供する。
なお、前記ＦＲＥＴ発生情報を求めるステップでは、前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命をτd、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命をτd *とするとき、前記ＦＲＥＴ発生情報として、１−（τd *／τd）で表されるＦＲＥＴ効率Ｅtを求めればよい。
また、前記検出値を収集するステップでは、複数の前記測定対象サンプルに前記レーザ光を照射し、前記センサにて複数の前記測定対象サンプルそれぞれについて前記検出値を収集し、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、各検出値に基づいて、前記測定対象サンプルそれぞれの蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた複数の蛍光強度情報および位相情報から前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めることが好ましい。
また、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記受光波長帯域毎に前記検出値から求めた前記蛍光強度および位相情報をベクトルで表し、このベクトルと、前記第１の強度比率および前記第２の強度比率とを、前記受光波長帯域毎に用いて、ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報と、前記第２分子蛍光成分のうちＦＲＥＴが生じることで発するＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報とを求め、求めた情報を用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めることが好ましい。
また、前記受光波長帯域は、前記第１分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第１波長帯域と、前記第２分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第２波長帯域とを有し、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記第１波長帯域の前記検出センサにて収集される検出値によって表される第１波長帯域における前記ベクトルと前記第２の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第２波長帯域の前記検出センサにより収集される検出値によって表される第２波長帯域における前記ベクトルと前記第１の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報を求めることが好ましい。
また、前記記憶手段には、前記第２分子蛍光成分のうち前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報があらかじめ記憶されており、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、前記記憶手段に記憶されている前記直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を呼び出して、直接励起蛍光成分の情報をベクトルで表し、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記直接励起蛍光成分の前記ベクトルと、前記第２波長帯域における前記ベクトルとを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第２分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求めることが好ましい。
また、前記記憶手段には、前記第２分子蛍光成分のうち前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報があらかじめ記憶されており、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、前記第２分子蛍光成分のうち、前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を呼び出して、前記直接励起蛍光成分のベクトルで表し、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ寿命を前記キャリブレーション情報を用いて求めるのに加えて、前記第２波長帯域における前記ベクトルと、前記第１の強度比率とを少なくとも用いて前記ＦＲＥＴ成分の位相情報を求め、求めた前記ＦＲＥＴ成分の位相情報と前記直接励起蛍光成分の前記ベクトルとを用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第２分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記ＦＲＥＴが生じない状態における前記第２分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命とを求め、前記第２分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記第２分子蛍光成分の前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命とを用いて、前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命を求めることが好ましい。
また、前記測定対象サンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第１分子および前記第２分子で標識されたサンプルであって、
前記記憶手段には、前記自家蛍光サンプル体に前記レーザ光を照射することにより発する前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報が予め記憶されており、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、前記記憶手段に記憶されている、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を呼び出して前記自家蛍光サンプル体の蛍光をベクトルで表し、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記受光波長帯域毎の前記測定対象サンプルの前記ベクトルのそれぞれから、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の前記ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルを用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めることが好ましい。
また、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、前記自家蛍光キャリブレーションでは、前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
また、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションでは、前記第１分子および前記第２分子がサンプルに付着されて、ＦＲＥＴが生じない処理がなされたｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報と、前記記憶手段に予め記憶された前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記記憶手段に予め記憶された前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の位相情報と、を用いて、レーザ光によって第２分子が直接励起される直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
また、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第１分子および前記第２分子で標識されたサンプルであって、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、前記自家蛍光キャリブレーションは、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションに先がけて行われるキャリブレーションであって、前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶し、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションでは、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報をベクトルで表したｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルベクトルから、前記自家蛍光キャリブレーションで求められた前記自家蛍光の情報をベクトルで表した自家蛍光ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルと、前記記憶手段に予め記憶された前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記記憶手段に予め記憶された前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の位相情報と、を用いて前記直接励起蛍光成分ベクトルを導出し、導出した結果を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
また、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、第１分子キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、前記第１分子キャリブレーションでは、前記第１分子のみで標識された第１分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第１の強度比率として、前記第１分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、求めた前記第１の強度比率と求めた前記位相情報とを前記記憶手段に記憶することが好ましい。
また、前記第１分子サンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第１分子で標識されたサンプルであって、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、前記自家蛍光キャリブレーションは、前記第１分子キャリブレーションに先がけて行われるキャリブレーションであって、前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎に蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶し、前記第１分子キャリブレーションでは、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報をベクトルで表した第１分子サンプルベクトルから、前記自家蛍光キャリブレーションで求められた前記自家蛍光サンプル体の蛍光の情報をベクトルで表した自家蛍光ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルを用いて、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
また、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、第２分子キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、前記第２分子キャリブレーションでは、前記第２分子のみで標識された第２分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第２の強度比率として、前記第２分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、求めた前記第２の強度比率および求めた前記位相情報を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
また、前記第２分子サンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第２分子で標識されたサンプルであって、前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、前記自家蛍光キャリブレーションは、前記第２分子キャリブレーションに先がけて行われるキャリブレーションであって、前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎に蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶し、前記第２分子キャリブレーションでは、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報をベクトルで表した第２分子サンプルベクトルから、前記自家蛍光サンプル体キャリブレーションで求められた前記自家蛍光サンプルの蛍光の情報をベクトルで表した自家蛍光ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルを用いて、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
本発明は、また、第１分子および第２分子で標識された測定対象サンプルにレーザ光を照射し、このとき測定対象サンプルが発する蛍光を受光することによって、第１分子のエネルギーが第２分子に移動するＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)を検出するＦＲＥＴ検出装置であって、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して前記測定対象サンプルについて照射し、このときの前記測定対象サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を取得する検出情報取得部と、前記測定対象サンプルの前記蛍光のうち前記第１分子が発する第１分子蛍光成分の、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を表す第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記第２分子が発する第２分子蛍光成分の、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を表す第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の位相情報と、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときに定義される寿命であって、前記ＦＲＥＴが発生しない状態における前記第１分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命と、を少なくとも含むキャリブレーション情報を予め記憶しておく記憶手段と、前記検出情報取得部が取得した前記検出値から、前記受光波長帯域それぞれについて、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を求めて、求めた前記蛍光強度情報および前記位相情報と、前記記憶手段から読み出した前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報と、を用いて、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときに定義される前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるＦＲＥＴ蛍光寿命算出部と、前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記第１分子蛍光成分の前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命との比を用いて表されるＦＲＥＴ発生情報を求めるＦＲＥＴ発生情報算出部と、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出装置を、併せて提供する。
なお、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部では、前記検出値それぞれから求めた前記蛍光強度および位相情報をベクトルで表し、それぞれのベクトルと、前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２分子蛍光成分の前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報とを用いて、ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報と、前記第２分子蛍光成分のうちＦＲＥＴが生じることで発するＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報とを求め、求めたこれらの情報を用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めることが好ましい。
また、前記センサの各受光波長帯域は、前記第１分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第１波長帯域と、前記第２分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第２波長帯域であり、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部では、前記第１波長帯域の検出センサによる前記検出値から求められる第１波長帯域におけるベクトルと、前記第２の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第２波長帯域の前記検出センサによる前記検出値によって表される第２波長帯域におけるベクトルと、前記第１の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報を求めることが好ましい。
また、前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、自家蛍光キャリブレーション部を有し、前記自家蛍光キャリブレーション部は、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、前記検出センサそれぞれから、前記受光波長帯域の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集し、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求めて、前記記憶手段に記憶し、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部では、前記受光波長帯域毎の前記測定対象サンプルの蛍光の情報をベクトルで表し、このベクトルから、前記自家蛍光サンプル体の前記蛍光強度情報および前記位相情報を表したベクトルを減算し、減算して得られたベクトルを用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めることが好ましい。
また、前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーション部を有し、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーション部は、前記第１分子および前記第２分子がサンプルに付着されて、ＦＲＥＴが生じない処理がなされたｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集した際、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた蛍光強度情報および位相情報と、前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報と、を用いて、前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、これらの情報をベクトルで表した直接励起蛍光成分ベクトルを導出し、この導出結果を前記記憶手段に記憶し、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部は、前記直接励起蛍光成分ベクトルを用いて前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めることが好ましい。
また、前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、第１分子キャリブレーション部を有し、前記第１分子キャリブレーション部は、前記第１分子のみで標識された第１分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集した際、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第１の強度比率として、前記第１分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、求めた前記第１の強度比率及び求めた前記第１分子サンプルの蛍光の前記位相情報を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
また、前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、第２分子キャリブレーション部を有し、前記第２分子キャリブレーション部は、前記第２分子のみで標識された第２分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集した際、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第２の強度比率として、前記第２分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、求めた前記第２の強度比率及び求めた前記第２分子サンプルの蛍光の前記位相情報を前記記憶手段に記憶することが好ましい。
本発明のＦＲＥＴ検出方法および装置によれば、例えば、細胞に、蛍光たんぱくであるドナー分子及びアクセプタ分子が付着された測定対象サンプルについて、蛍光たんぱくの標識量や、ドナー分子からの蛍光の波長帯域とアクセプタ分子からの蛍光の波長帯域との重なりなどに起因する、蛍光検出情報の不確定要素を除外して、定量的にＦＲＥＴの発生の程度（例えばＦＲＥＴ効率）を測定することができる。
以下、本発明のＦＲＥＴ検出方法および装置について、フローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、本発明のＦＲＥＴ検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、特定の細胞等の受容体サンプル（以下細胞とする）に、ドナー分子およびアクセプタ分子が化学的結合又は物理的結合により付着して標識されたＦＲＥＴ検出対象サンプル１２（以降、ＦＲＥＴサンプル１２とする）にレーザ光を照射し、このＦＲＥＴサンプル１２から発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する信号処理装置２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果からＦＲＥＴサンプル１２の分析を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。サンプルは、レーザ光の照射に対して自家蛍光するようになっている。このような自家蛍光は計測のノイズ成分となり、本来ならば発生しないことが望ましい。ただし、細胞等にレーザ光が照射された場合など、ある程度は発生してしまうものである。
本発明の一実施形態であるフローサイトメータ１０は、測定溶液中に混濁された状態で用意された複数のＦＲＥＴサンプルについて、ＦＲＥＴサンプルにレーザを照射した際に発する蛍光の蛍光成分（後述するドナー波長帯域の蛍光成分と、アクセプタ波長帯域の蛍光成分）それぞれの蛍光寿命（蛍光緩和時定数）の変化をＦＲＥＴサンプル１つ１つについて検出し、ＦＲＥＴサンプルにおけるＦＲＥＴの発生の程度を表すＦＲＥＴ効率を算出する装置である。
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及びＦＲＥＴサンプル１２からの蛍光信号を処理する処理部を有する制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液とともにＦＲＥＴサンプル１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内にＦＲＥＴサンプル１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
レーザ光源部２２はドナー分子を励起するためのレーザ光を出射する光源である。例えば、ドナー分子としてＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）を用い、アクセプタ分子としてＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）を用いる場合、ドナー分子が主に励起される波長である、波長４０５〜４４０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光源部２２は、このような、ドナー分子を励起するための波長のレーザ光を、所定の周波数で強度変調して出射する部分である。
ここで、ＦＲＥＴの発生について簡単に説明する。図２は、ドナー分子のエネルギー吸収と蛍光及びアクセプタ分子の吸収と蛍光のスペクトルの例を示す図である。図３は、ＦＲＥＴの発生を判り易く説明した説明図である。
図２では、ドナー分子がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプタ分子がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）であるときのエネルギーの吸収、蛍光放射の特性を示している。図２中、曲線Ａ1はＣＦＰのエネルギー吸収スペクトルを、曲線Ａ2はＣＦＰの蛍光放射スペクトルを、曲線Ｂ1はＹＦＰのエネルギー吸収スペクトルを、曲線Ｂ2はＹＦＰの蛍光放射スペクトルをそれぞれ示す。図２中、斜線の部分は、ＣＦＰが放射した蛍光をＹＦＰがエネルギー吸収して、ＦＲＥＴが生じる波長帯域を示す。
一般に、ＦＲＥＴでは、ドナー分子がレーザ光により励起され、その一部分が蛍光を放射し、一部のエネルギーはクローン相互作用によりアクセプタ分子へ流れる。このエネルギー移動は、２ｎｍ以下の極めて至近距離によって生じるものであり、このエネルギー移動が、分子の相互作用（結合）を表す。したがって、エネルギー移動が起きることで、アクセプタ分子が励起されてアクセプタ分子から蛍光が放射される。このとき、図２に示すように、ドナー分子の蛍光放射波長帯域と、アクセプタ分子のエネルギー吸収の波長帯域とが一部分で重なっていることが、ＦＲＥＴの発生において必要である。
一般的に、同一分子では、蛍光放射エネルギーがよほど大きくない限り、エネルギー吸収のピーク波長と蛍光放射のピーク波長とは近接している。図２に示すように、ドナー分子であるＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプタ分子であるＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）についてもこれはいえる。ＦＲＥＴの発生のために、ドナー分子の蛍光放射波長帯域と、アクセプタ分子のエネルギー吸収の波長帯域とが一部分で重なっていることが必要であるので、当然、図２に示す曲線Ａ1、Ａ2、Ｂ1、Ｂ2それぞれのピーク波長は、狭い波長帯域に集中して存在し、波長スペクトルの一部分は、それぞれ重なっている。このため、レーザ光源部２２から、ドナー分子を励起するためのレーザ光（例えば周波数ｆで変調されたレーザ光）を出射した場合、このレーザ光によって、ドナー分子のみでなくアクセプタ分子も直接励起されて蛍光を発する（図３参照）。
フローサイトメータ１０では、レーザ光源部２２からレーザ光が照射されることで、ＦＲＥＴサンプル１２からは、測定しようとするＦＲＥＴサンプル１２中の細胞の自家蛍光（図３においては図示せず）、及びＦＲＥＴサンプル１２中のドナー分子が励起されて発する蛍光、アクセプタ分子が励起されて発する蛍光、アクセプタ分子から発せられるＦＲＥＴ蛍光がそれぞれ発せられる。
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過するＦＲＥＴサンプル１２によってレーザ光が前方散乱することにより、ＦＲＥＴサンプル１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８においてＦＲＥＴサンプル１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交方向であって、かつ管路３０中のＦＲＥＴサンプル１２の移動方向に対して直交方向に配置されており、測定点にて照射されたＦＲＥＴサンプル１２が発する蛍光を受光するフォトマルチプライヤ（光電子倍増管）やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器を備える。
図４は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。図４に示す受光部２６は、ＦＲＥＴサンプル１２からの蛍光の蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2と、バンドパスフィルタ２６ｃ1、２６ｃ2と、光電子倍増管やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器２７ａ、２７ｂと、を有する。レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａおよび２７ｂの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ1、２６ｃ2でフィルタリングして光電変換器２７ａおよび２７ｂで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ1，２６ｂ2の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
バンドパスフィルタ２６ｃ1、２６ｃ2は、各光電変換器２７ａおよび２７ｂの各受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光の波長帯域に対応して設定されており、互いに異なる波長帯域となっている。
ドナー分子としてＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプタ分子としてＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）を用いた場合、ドナー分子の蛍光である図２の曲線Ａ2で示す蛍光と、アクセプタ分子の蛍光である図２の曲線Ｂ2で示す蛍光とを、それぞれ計測できるの波長帯域が設定される。例えば、ドナー分子からの蛍光（ドナー蛍光）を主に透過するための波長帯域（ドナー波長帯域）として、図２の矢印Ａで示す波長帯域が設定され、アクセプタ分子からの蛍光（アクセプタ蛍光）を主に透過するための波長帯域（アクセプタ波長帯域）として、図２の矢印Ｂで示す波長帯域が設定される。
ここで、上述のように、実際のドナー蛍光の波長帯域とアクセプタ蛍光の波長帯域とは重なっており、透過されたドナー波長帯域の光（蛍光）には、アクセプタ蛍光の成分も漏れこんでくる。同様に、アクセプタ波長帯域には、ドナー蛍光の成分も漏れこんでくる。このような漏れ込みは、ＦＲＥＴを発生させる条件（ドナー分子の蛍光放射波長帯域と、アクセプタ分子のエネルギー吸収の波長帯域とが一部分で重なっていること）に伴い、必然的に生じるものともいえる。従来、このような漏れこみの成分は、ＦＲＥＴの発生を計測・評価する上での不確定因子となり、計測・評価の精度を低下させていた。本願では、計測結果から、このような漏れ込み成分の影響も考慮し、高精度にＦＲＥＴを計測・評価することを特徴の１つとしている。
光電変換器２７ａおよび２７ｂは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。受光部２６では、光電変換器２７ａがドナー波長帯域の光を受光し、光電変換器２７ｂが、アクセプタ波長帯域の光を受光するよう構成されている。
図５は、レーザ光源部２２からレーザ光を照射することで、管路３０を流れるＦＲＥＴサンプル１２から発する蛍光の成分と、各蛍光成分の光電変換器２７ａおよび２７ｂの受光面への入射について説明する概略図である。ＦＲＥＴサンプル１２は、自家蛍光を発する細胞に、ドナー分子であるＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプタ分子であるＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）とが付着された細胞である。レーザ光源部２２からからレーザ光が出射されると、管路３０を流れるＦＲＥＴサンプル１２からは、ＦＲＥＴサンプル１２中のドナー分子がレーザによって直接励起されて発する蛍光ｆd、アクセプタ分子がレーザ光によって直接励起されて発する蛍光ｆa、ＦＲＥＴサンプル１２中の細胞の自己発光の蛍光ｆs、そして、アクセプタ分子から発せられるＦＲＥＴ蛍光ｆfがそれぞれ発せられる。各蛍光は、ミラーおよびフィルタによって、ドナー波長帯域の成分とアクセプタ波長帯域の成分とに分けられ、光電変換器２７ａおよび２７ｂに、それぞれ入射する。ここで、ＦＲＥＴ蛍光ｆfについは、レーザによって直接励起されて発する他の蛍光に比べて小さく、ドナー波長帯域への漏れ込みの成分については十分に小さいと仮定することができる。
光電変換器２７ａで受光する光には、図５に示すＲ1〜Ｒ3のルートの蛍光が含まれ、光電変換器２７ｂで受光する光には、図５に示すＲ4〜Ｒ7のルートの蛍光が含まれている。フローサイトメータ１０の以下に説明する各部における処理は、光電変換器２７ａで受光する光（ドナー波長帯域の蛍光）、および光電変換器２７ｂで受光する光（アクセプタ波長帯域の蛍光）それぞれについて成される。
光電変換器２７ａおよび光電変換器２７ｂでは、信号情報を持った光信号として受光されるので、光電変換器２７ａおよび光電変換器２７ｂから出力される電気信号は位相差の信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給され増幅器で増幅されて、分析装置８０に送られる。
制御・処理部２８は、図６に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０及びコントローラ４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２に供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換器２７ａおよび２７ｂから出力される蛍光信号の位相差検出のための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜１００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
信号処理部４２は、光電変換器２７ａおよび２７ｂから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射によりＦＲＥＴサンプル１２が発する蛍光の位相遅れに関する情報（位相差）を抽出する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａおよび２７ｂから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａおよび５４ｂと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ（不図示）、及び増幅された蛍光信号を上記変調信号に合成するＩＱミキサ（不図示）を有する位相差検出器５６を有して構成される。
位相差検出器５６に設けられる図示されないＩＱミキサは、光電変換器２７ａおよび２７ｂから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として合成するために、光電変換器２７ａおよび２７ｂの別に設けられている。具体的には、ＩＱミキサのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。
コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御するとともに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を求める部分である。
具体的には、コントローラ４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。Ａ／Ｄ変換器６６では、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号がサンプリングされて、分析装置８０に供給される。
分析装置８０は、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の処理信号値（検出値）から、各蛍光の成分の蛍光強度情報や位相情報、蛍光寿命（蛍光緩和時定数）、ＦＲＥＴ効率などを算出する装置である。例えば、光電変換器２７ａによる検出値から、ドナー波長帯域の蛍光強度Ｐdと位相θd（計測値）を求め、光電変換器２７ｂによる検出値から、アクセプタ波長帯域での蛍光強度Ｐaと位相θa（計測値）を求める。分析装置８０は、本発明のＦＲＥＴ検出装置に対応しており、後述するＦＲＥＴ検出方法を実施する。
図７は、分析装置８０の概略構成図である。
分析装置８０は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成される装置であり、ＣＰＵ８２、メモリ８４、入出力ポート８６の他に、ソフトウェアを起動することによって形成される第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０、第３キャリブレーションユニット９２、第４キャリブレーションユニット９４、蛍光緩和時定数算出ユニット９６、およびＦＲＥＴ効率算出ユニット９８を有する。また、分析装置８０にはディスプレイ９４が接続されている。
ＣＰＵ８２は、コンピュータに設けられた演算プロセサであり、第１キャリブレーションユニット８８、第２キャリブレーションユニット９０、第３キャリブレーションユニット９２、第４キャリブレーションユニット９４、蛍光緩和時定数算出ユニット９６、およびＦＲＥＴ効率算出ユニット９８の各種計算を実質的に実行する。
メモリ８４は、コンピュータ上で実行することにより、第１キャリブレーションユニット８８〜第４キャリブレーションユニット９４、蛍光緩和時定数算出ユニット９６、およびＦＲＥＴ効率算出ユニット９８を形成するプログラムを格納したＲＯＭと、これらのユニットにより算出された処理結果や入出力ポート８６から供給されたデータを記憶するＲＡＭと、を備えている。
入出力ポート８６は、コントローラ４４から供給される蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）、ｓｉｎ成分（虚数部）の検出値の入力を受け入れるとともに、各ユニットで作成された処理結果の値やスキャッタグラム等の情報をディスプレイ９４に出力するために用いられる。ディスプレイ９４は、各ユニットで求められた、蛍光の振幅情報や位相差の情報、蛍光緩和時定数やＦＲＥＴ効率等の処理結果の値やスキャッタグラム等のグラフを表示する。
蛍光緩和時定数算出ユニット９６は、コントローラ４４から供給されたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の検出値から、光電変換器２７ａおよび２７ｂそれぞれで受光した蛍光の蛍光強度情報および位相情報（位相差の情報）を求める。そして、この蛍光強度情報および位相情報と、メモリ８４に予め記憶されている後述のキャリブレーション情報とを用いて、ドナー分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命や、アクセプタ分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命、アクセプタ分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命などを求める。ドナー分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命とは、ＦＲＥＴが生じた場合の、ドナー分子がレーザによって励起されて発する蛍光成分の蛍光寿命のことである。アクセプタ分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命とは、ＦＲＥＴが生じた場合の、アクセプタ分子がレーザによって励起されて発する蛍光成分の蛍光寿命のことである。また、アクセプタ分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命とは、ＦＲＥＴが生じない場合の、アクセプタ分子がレーザによって励起されて発する蛍光成分の蛍光寿命のことである。各蛍光寿命は、レーザ光を照射したＦＲＥＴサンプル１２の蛍光成分がいずれも１次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時定数で表される。蛍光緩和時定数算出ユニット９６の詳細は、後述する。
ＦＲＥＴ効率算出ユニット９８は、蛍光緩和時定数算出ユニット９６で求められた、ドナー分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、キャリブレーション情報に含まれる、ドナー分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命との比を用いて表されるＦＲＥＴ効率を求める。ドナー分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命とは、ＦＲＥＴが生じない場合の、ドナー分子がレーザによって励起されて発する蛍光成分の蛍光寿命のことである。または、蛍光緩和時定数算出ユニット９６で求められた、アクセプタ分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命、アクセプタ分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命などを用い、ＦＲＥＴ効率とは異なる値を算出してもよい。ＦＲＥＴ効率算出ユニット９８の詳細は、後述する。
ここで、本願のＦＲＥＴ検出方法の原理について説明しておく。上述のように、ドナー分子とアクセプタ分子とを有するＦＲＥＴサンプルに、主にドナー分子を励起するためのレーザを照射してＦＲＥＴが発生した際に、標識サンプルからは図５に示される各蛍光（ｆd、ｆf、ｆa、ｆs）が照射される。
まず、Ｔ＝０の理想的なパルス光源でＦＲＥＴサンプルを励起した場合の、無輻射過程を含んだ蛍光発光モデルを考えると、インパルス応答（単位体積から放射される光子の数（蛍光強度））は、以下の式（１）で表せる。蛍光分子が光を吸収し、その電子が励起状態に遷移するのにわずか１０-15ｓｅｃしかかからず、その後、分子内緩和過程により１０-13〜１０-11ｓｅｃで、第一励起状態まで落ちる。下記式（１）に示すモデルでのように、これらの吸収、分子内緩和過程のダイナミクスは無視し、第一励起状態からの発光遷移過程のみを対象とすることができる。
Figure 0004365380
 ここで、
Ｎ（ｔ）：励起状態にある単位体積中の蛍光分子数（励起状態密度関数）
Ｎ0：時刻0で励起状態にある単位体積中の蛍光分子数
ｋf：発光遷移の速度定数（単位時間に発光遷移する分子数の に対する割合）
ｋnf：無輻射遷移の速度定数（単位時間に無輻射遷移する分子数の に対する割合）
τ0≡１／ｋf：無輻射過程がないと仮定したときの励起状態の寿命（自然寿命）
τ≡１／（ｋf＋ｋnf）：蛍光緩和時定数（蛍光緩和時定数）
である。
ここでＮ0は、蛍光分子のモル吸光係数、モル濃度に依存する量であり、蛍光分子の標識量（細胞に対する、ドナー分子やアクセプタ分子の付着量や状態）が変わると変化する。また、ｋf，ｋnfは、蛍光分子の量子収率φと以下の式（２）関係で示される。
Figure 0004365380
インパルス応答が式(1)で表現される系の微分方程式は、レーザの入射パワーをｕ（ｔ）とすると、以下で表現される。
Figure 0004365380
このような蛍光分子からの蛍光発光のインパルスモデルに基づき、図５で示すＦＲＥＴ発生時に発生する各蛍光成分に対応する、蛍光発光過程のダイナミクスモデルを考える。ドナー分子とアクセプタ分子とを有するＦＲＥＴサンプルにおいてＦＲＥＴが生じた場合、ドナー分子においては、発光遷移、無輻射遷移、励起エネルギー移動が競合して進む。ドナー分子のドナー波長帯域での蛍光成分（図５中の経路Ｒ1に対応）のモデルは、下記式（４）および（５）で表すことができる。
Figure 0004365380
一方、アクセプタ分子においては、励起エネルギー移動で励起された蛍光分子が追加励起される。アクセプタ分子のアクセプタ波長帯域での蛍光成分（図５中の経路Ｒ4と経路Ｒ7とに対応）のモデルは、下記式（６）および下記式（７）で表すことができる。
Figure 0004365380
ここで、Ｎd（ｔ）およびＮd（ｔ）は、それぞれドナー分子のＮ（ｔ）およびアクセプタ分子のＮ（ｔ）、ｋdおよびｋaは、それぞれドナー分子の（ｋf＋ｋnf）およびアクセプタ分子の（ｋf＋ｋnf）、ｋdfおよびｋafは、それぞれドナー分子のｋfおよびアクセプタ分子のｋf、Ｎd0およびＮa0は、それぞれドナー分子のＮ0およびアクセプタ分子のＮ0、ｋtはドナー分子からアクセプタ分子へのエネルギー移動速度定数である。なお、式（７）中のｋtＮｄ（ｔ）の項が、ＦＲＥＴによるアクセプタ分子からの蛍光成分であり、図５中の経路Ｒ7の蛍光成分に対応している。
また、ドナー分子のアクセプタ波長帯域での蛍光成分（図５中の経路Ｒ５に対応）のモデルは、下記式（８）および（９）で表すことができる。また、アクセプタ分子のドナー波長帯域での蛍光成分（図５中の経路Ｒ２に対応）のモデルは、下記式（１０）および下記式（１１）で表すことができる。なお、一般に、ドナー分子、アクセプタ分子の蛍光のダイナミクスは、波長帯域が変わっても変化しないことも考えられるが、ここではより一般的に異なるダイナミクスをもつと仮定している。
Figure 0004365380
ここで、Ｎda（ｔ）およびＮad（ｔ）は、それぞれドナー分子のアクセプタ波長帯域でのＮ（ｔ）およびアクセプタ分子のドナー波長帯域でのＮ（ｔ）、ｋdaおよびｋadは、それぞれドナー分子のアクセプタ波長帯域での（ｋf＋ｋnf）およびアクセプタ分子のドナー波長帯域での（ｋf＋ｋnf）、ｋdafおよびｋadfは、それぞれドナー分子のアクセプタ波長帯域でのｋfおよびアクセプタ分子のドナー波長帯域でのｋf、Ｎda0およびＮad0は、それぞれドナー分子のアクセプタ波長帯域でのＮ0およびアクセプタ分子のドナー波長帯域でのＮ0、である。
また、細胞の自家蛍光のドナー波長帯域での蛍光成分（図５中の経路Ｒ3に対応）のモデルは、下記式（１２）および下記式（１３）で表すことができ、また、細胞の自家蛍光のアクセプタ波長帯域での蛍光成分（図５中の経路Ｒ6に対応）のモデルは、下記式（１４）および下記式（１５）で表すことができる。なお、細胞から発せられる自家蛍光には、複数種類の分子からの寄与が考えられ、単一種の蛍光モデルと異なることも考えられるが、一般的に光は強くないこともあり、下記式（１２）〜式（１５）では、それらの総和の特性を一次で近似している。
Figure 0004365380
上記式（４）〜（１５）に対してラプラス変換を施し、ドナー波長帯域およびアクセプタ波長帯域毎にまとめると、ドナー波長帯域の蛍光Ｆdonorについては式（１６）で表され、アクセプタ波長帯域の蛍光Ｆaccepterについては式（１７）で表される。
Figure 0004365380
 ここで、
τd *：ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光緩和時定数＝１／（ｋd＋ｋt）
（ｋt＝０（非ＦＲＥＴ時）、τd *＝τd＝１／ｋd）
τa：アクセプタ分子の蛍光緩和時定数＝１／ｋa
τad：アクセプタ分子のドナー波長帯域での蛍光緩和時定数＝１／ｋad
τda：ドナー分子のアクセプタ波長帯域での蛍光緩和時定数＝１／ｋda
τbd：細胞の自家蛍光のドナー波長帯域での蛍光緩和時定数＝１／ｋbd
τba：細胞の自家蛍光のアクセプタ波長帯域での蛍光緩和時定数＝１／ｋbaである。
図８は、式（１６）、（１７）で表される、ＦＲＥＴ発生時の蛍光発光のダイナミクスについて表したモデルである。ＦＲＥＴサンプル１２からは、図８で表されるＷ1〜Ｗ7の過程を経て発せられるそれぞれの蛍光成分が発せられると考えることができる。本願発明では、このようなモデルで表される、Ｗ1〜Ｗ7の過程で発せられた各蛍光成分が、図４に示す、光電変換器２７ａおよび２７ｂに入射する蛍光成分（Ｒ1〜Ｒ7）それぞれに対応すると考えることができる。
装置１０では、レーザ光源部２２から周波数変調したレーザ光の出力を高速で正弦波に変化（変調）させてサンプルに照射し、サンプルから放射された蛍光強度信号を高速に処理して、振幅（蛍光強度情報）と位相（位相情報）を一細胞毎に検出する。すなわち、式（１６）および式（１７）の伝達関数の周波数応答特性を検出する。レーザのパワーｕ（ｔ）に角周波数ωMの正弦波を与えたときの蛍光信号を測定すると、蛍光信号は同じ角周波数をもつ正弦波で放射される。入力信号と出力信号の振幅の比および位相差は、式（１６）および式（１７）のｓ＝ｊωMとしたときの、複素平面上のベクトルの総和として、以下の式（１８）および式（１９）のように表現することができる。
Figure 0004365380
なお、式（１８）の第１項が図８におけるＷ1に対応し、第２項が図８におけるＷ2、第３項が図８におけるＷ3に対応し、また、式（１９）の第１項が図８におけるＷ7（ＦＲＥＴ成分）に対応し、第２項が図８におけるＷ4、第３項が図８におけるＷ5、第４項が図８におけるＷ6、にそれぞれ対応していることはいうまでもない。
従来は、ＦＲＥＴ発生時のドナー分子の蛍光緩和時定数τd *、または、ＦＲＥＴ発生時のアクセプタ分子の等価蛍光緩和時定数τa *（＝ｔａｎθ7／ωM）を定量的に求めることは困難であった。τd *やτa *をそれぞれ求めることができれば、ＦＲＥＴの発生を高精度に検出することができる。上記の関係からわかるように、Ｐ1、θ1がわかればτd *が求まり、上記Ｐ7、θ7が求めればτa *を求めることができる。
ここで、ドナー波長帯域での蛍光（図８におけるＷ1〜Ｗ3を含む）の蛍光強度Ｐdonorと位相θdonor、とすると、式（１８）は、下記式（２０）のように変形できる。式（２０）から判断できるように、Ｐ1およびθ1は、ドナー波長帯域での蛍光（図８におけるＷ1〜Ｗ3を含む）の強度Ｐdonorと位相θdonor、Ｐ2／Ｐ4、Ｐ4、Ｐ3およびθ3がわかれば、求めることができる。
Figure 0004365380
また、アクセプタ波長帯域での蛍光（図８におけるＷ4〜Ｗ7を含む）の強度をＰacceptorとし、位相をθacceptorとすると、式（１９）は、下記式（２１）のように変形できる。式（２１）から判断できるように、Ｐ7およびθ7は、アクセプタ波長帯域での蛍光の強度Ｐacceptor、位相θacceptor、Ｐ5／Ｐ1、Ｐ1、Ｐ6およびθ6がわかれば、求めることができる。
Figure 0004365380
分析装置８０の蛍光緩和時定数算出ユニット９６では、まず、上記ｃｏｓ成分およびｓｉｎ成分から、ドナー分子とアクセプタ分子とが付着された標識サンプルに上記レーザ光を照射した際の、ドナー波長帯域での蛍光（図５におけるＲ1〜Ｒ3を含む）の蛍光強度Ｐdと位相θd、およびアクセプタ波長帯域での蛍光（図５におけるＲ4〜Ｒ7を含む）の蛍光強度Ｐaと位相θaを求める。計測値であるＰdは上記Ｐdonorに、θdはθdonorに対応し、同じくＰaはＰacceptorに、θaはθacceptorに対応する。分析装置８０のメモリ８４には、後述する第１キャリブレーションユニット８８〜第４キャリブレーションユニット９４において算出された、上記のＰ2／Ｐ4、Ｐ3およびθ3、Ｐ6およびθ6、Ｐ4、に対応する値が記憶されており、これらの値を用いて、Ｐ1およびθ1、あるいはＰ7およびθ7を求めて、τd *、τa *やτa、すなわち、ドナー分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命や、アクセプタ分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命、アクセプタ分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命などを求める。この際、式（２０）や式（２１）に示されるように、蛍光緩和時定数算出ユニット９６では、各値で表されたベクトルを用いた処理（ベクトル減算など）が、逐次行なわれる。
ＦＲＥＴ効率算出ユニット９８では、ドナー波長帯域におけるドナー分子の蛍光成分（ＦＲＥＴが発生しない状態での、図４における経路Ｒ1に対応）の蛍光緩和時定数τdとを用いて、下記式（２２）に規定されるＦＲＥＴ効率Ｅtを求める。なお、この蛍光緩和時定数τdは、例えば後述の第２キャリブレーションユニット９０や第４キャリブレーションユニット９４によって予め求められて、メモリ８４に記憶されている。
Figure 0004365380
ドナー分子の蛍光緩和時定数は、ＦＲＥＴの程度が大きいほど、すなわちドナー分子からアクセプタ分子へのエネルギーの移動が大きいほど短くなる。このようなＦＲＥＴ効率Ｅtは、ドナー分子からアクセプタ分子へのエネルギーの移動の程度（ＦＲＥＴの程度）を表している。
また、例えば、以下の式（２３）に適用することで、ＦＲＥＴ発生時における蛍光緩和時定数を、ドナー波長帯域およびアクセプタ波長帯域の双方から多角的に検討することができる。また、本願発明では、アクセプタ分子の波長帯域における測定結果からも、ＦＲＥＴを定量的に測定することができる。なお、この蛍光緩和時定数τaは、例えば後述の第３キャリブレーションユニット９２や第４キャリブレーションユニット９４によって予め求められて、メモリ８４に記憶されている値を用いてもよい。
Figure 0004365380
次に、第１キャリブレーションユニット８８〜第４キャリブレーションユニット９４それぞれについて説明する。第１キャリブレーションユニット８８は、蛍光色素が付着しておらず細胞等の自家蛍光を発するサンプルからなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルが発する自家蛍光の蛍光強度情報および位相の情報を求める。第１キャリブレーションユニット８８は、無標識サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各光電変換器から収集し、これらの検出値から蛍光強度情報および位相の情報を求める。
具体的には、第１キャリブレーション部８８では、図９に示すように、無標識サンプルにレーザ光を照射し、細胞自体が発する蛍光について、ドナー波長帯域およびアクセプタ波長帯域での蛍光強度情報および位相情報を求める。ここで、細胞自体が発する蛍光については、ドナー分子やアクセプタ分子などの標識による影響を受けないと仮定することができる。すなわち、第１キャリブレーション部８８で得られた、ドナー波長帯域における自家蛍光の蛍光強度の計測値Ｐmd1、ドナー波長帯域における自家蛍光の位相の計測値θmd1、は、図５で示されるＲ3で示される蛍光成分を表す情報であり、アクセプタ波長帯域における自家蛍光の蛍光強度の計測値Ｐma1、アクセプタ波長帯域における自家蛍光の位相差の計測値θma1は、図５で示されるＲ6で示される蛍光成分を表す情報であるとすることができる。このような計測値は、図８に示すＦＲＥＴ発生過程のモデルに直接用いることができ、下記式（２４）および式（２５）の関係が成り立つ。このように求められた、Ｐ3およびθ3、Ｐ6およびθ6は、メモリ８４に記憶される。
Figure 0004365380
第２キャリブレーションユニット９０は、ドナー蛍光色素のみを有するドナー標識サンプルについて、このドナー標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度および位相を求める。さらに、求めたドナー標識サンプルの蛍光強度および位相の情報と、第１キャリブレーションユニットで求められた、無標識サンプルの蛍光強度および位相（Ｐ3およびθ3、Ｐ6およびθ6）を用いて、特に、ドナー標識サンプルが発する蛍光のうち、ドナー波長帯域の蛍光成分の蛍光強度に対する、アクセプタ波長帯域の蛍光成分の蛍光強度の比（ドナー蛍光漏れこみ率）を求めておく。
具体的には、第２キャリブレーション部９０では、図１０に示すようにドナー標識サンプルにレーザ光を照射し、ドナー分子が発する蛍光、および細胞自体が発する蛍光について、ドナー波長帯域およびアクセプタ波長帯域での蛍光強度および位相を求める。ここで、第２キャリブレーション部９０で得られた、ドナー波長帯域における蛍光の蛍光強度の計測値Ｐmd2、ドナー波長帯域における蛍光の位相差の計測値θmd2、アクセプタ波長帯域における蛍光の蛍光強度の計測値Ｐma2、アクセプタ波長帯域における蛍光の位相差の計測値θma2とする。そして、ドナー標識サンプルのドナー分子が発する蛍光（図１０中のＲ１’で示す）のドナー波長帯域での蛍光強度をＰ1’、同じくこの蛍光の位相をθ1’、ドナー標識サンプルのアクセプタ分子が発する蛍光（図１０中のＲ５’で示す）のドナー波長帯域での蛍光強度をＰ5’、同じくこの蛍光の位相をθ5’とすると、下記式（２６）および式（２７）の関係が成り立つ。上述したように、自家蛍光の成分については、第１キャリブレーションで求めた値をそのまま用いることができる。
Figure 0004365380
第２キャリブレーションユニット９０では、メモリ８４から、第１キャリブレーションユニット８８で求めておいたＰ3およびθ3、Ｐ6およびθ6を呼び出し、式（２６）および式（２７）の関係を用いて、Ｐ1’およびθ1’、Ｐ5’およびθ5’を求める。第２キャリブレーションユニット９０では、これらの結果より、ＦＲＥＴ発生が生じない場合の、ドナー分子のドナー波長帯域における蛍光緩和時定数τd、ドナー分子のアクセプタ波長帯域における蛍光緩和時定数τdaを求めておくこともできる。
上述したように、ＦＲＥＴ発生の際には、ドナー分子では、発光遷移、無輻射遷移、励起エネルギー移動が競合して進む。また、標識量が異なれば蛍光強度も異なるため、Ｐ1’およびθ1’、Ｐ5’およびθ5’については、図５で示されるＲ1やＲ5で示される蛍光成分を表す情報であるとすることはできず、このような計測値は、図８に示すＦＲＥＴ発生過程のモデルに直接用いることができない。ただし、ドナー分子の蛍光のドナー波長帯域における蛍光強度と、ドナー分子の蛍光のアクセプタ波長帯域における蛍光強度の比Ｐ5’／Ｐ1'（ドナー蛍光の漏れ込み率）については、サンプルが異なっても一定であると仮定することができる。すなわち、式（２０）および式（２１）におけるＰ5とＰ1の比Ｐ5／Ｐ1＝Ｐ5’／Ｐ1'として表すことができる。第２キャリブレーションユニット９０で求められたＰ5’／Ｐ1'（以降、Ｐ5／Ｐ1で示す）は、メモリ８４に記憶される。なお、この際、Ｐ1’およびθ1’、Ｐ5’およびθ5’ＦＲＥＴ発生が生じない場合の、ドナー分子のドナー波長帯域における蛍光緩和時定数τd、ドナー分子のアクセプタ波長帯域における蛍光緩和時定数τdaの値なども併せて記憶しておく。
第３キャリブレーションユニット９２は、アクセプタ蛍光色素のみを有するドナー標識サンプルについて、このドナー標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度および位相を求める。さらに、求めたドナー標識サンプルの蛍光強度および位相の情報と、第１キャリブレーションユニットで求められた、無標識サンプルの蛍光強度および位相（Ｐ3およびθ3、Ｐ6およびθ6）を用いて、特に、アクセプタ標識サンプルが発する蛍光のうち、アクセプタ波長帯域の蛍光成分の蛍光強度に対する、ドナー波長帯域の蛍光成分の蛍光強度の比（アクセプタ蛍光漏れこみ率）を求めておく。
具体的には、第３キャリブレーション部９２では、図１１に示すように、アクセプタ標識サンプルにレーザ光を照射し、アクセプタ分子が発する蛍光、および細胞自体が発する蛍光について、ドナー波長帯域およびアクセプタ波長帯域での蛍光強度および位相を求める。第３キャリブレーション部９０で得られた、ドナー波長帯域における蛍光の蛍光強度の計測値Ｐmd3、ドナー波長帯域における蛍光の位相差の計測値θmd3、アクセプタ波長帯域における蛍光の蛍光強度の計測値Ｐma3、アクセプタ波長帯域における蛍光の位相差の計測値θma3とする。そして、アクセプタ標識サンプルのアクセプタ分子が発する蛍光（図１１中のＲ2’で示す）のドナー波長帯域での蛍光強度をＰ2’、同じくこの蛍光の位相をθ2’、アクセプタ標識サンプルのアクセプタ分子が発する蛍光（図１１中のＲ4’で示す）のドナー波長帯域での蛍光強度をＰ4’、同じくこの蛍光の位相をθ4’とすると、下記式（２８）および式（２９）の関係が成り立つ。上述したように、自家蛍光の成分については、第１キャリブレーションで求めた値をそのまま用いることができる。
Figure 0004365380
第３キャリブレーションユニット９２では、メモリ８４から、第１キャリブレーションユニット８８で求めておいたＰ3およびθ3、Ｐ6およびθ6を呼び出し、式（３０）および式（３１）の関係を用いて、Ｐ2’およびθ2’、Ｐ4’およびθ4’を求める。第３キャリブレーションユニット９２では、これらの結果より、ＦＲＥＴ発生が生じない場合のアクセプタ分子の蛍光緩和時定数τa、アクセプタ分子のドナー波長帯域における蛍光緩和時定数τdaを求めておくこともできる。上述したように、標識量が異なれば蛍光強度も異なるため、Ｐ2’およびθ2’、Ｐ4’およびθ4’については、図８に示すＦＲＥＴ発生時のモデルに適用することはできない。ただし、アクセプタ分子の蛍光のアクセプタ波長帯域における蛍光強度と、アクセプタ分子の蛍光のドナー波長帯域における蛍光強度の比Ｐ2’／Ｐ4'（ドナー蛍光の漏れ込み率）については、サンプルが異なっても一定であると仮定することができる。すなわち、式（２０）および式（２１）におけるＰ2とＰ4の比Ｐ2／Ｐ4＝Ｐ2’／Ｐ4'として表すことができる。第３キャリブレーションユニット９０で求められたＰ2’／Ｐ4'（以降、Ｐ2／Ｐ4で示す）は、メモリ８４に記憶される。なお、この際、Ｐ2’およびθ2’、Ｐ4’およびθ4’ＦＲＥＴ発生が生じない場合の、アクセプタ分子のアクセプタ波長帯域における蛍光緩和時定数τa、アクセプタ分子のドナー波長帯域における蛍光緩和時定数τdaの値も併せて記憶しておく。
第４キャリブレーションユニット９４は、ドナー蛍光分子およびアクセプタ蛍光分子の双方を有し、タンパク室の構造変化や結合に対しての不活性因子を導入するなどして、ＦＲＥＴが発生しないように調整処理したｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルについて、このｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルが発する蛍光の蛍光強度および位相の情報を求める。さらに、求めたｎｏｎ−ＦＲＥＴの蛍光強度および位相の情報と、第１キャリブレーションユニットで求められた、無標識サンプルの蛍光強度および位相（Ｐ3およびθ3、Ｐ6およびθ6）、第２キャリブレーションユニット９０で求めたドナー蛍光の漏れ込み率（Ｐ5／Ｐ1）、第３キャリブレーションユニット９２でも求めたアクセプタ蛍光の漏れ込み率（Ｐ2／Ｐ4）を用いて、特に、アクセプタ標識サンプルがレーザによって直接励起されて発する蛍光の蛍光強度および位相を求めておく。
具体的には、第４キャリブレーションユニット９４では、図１２に示すようにｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルにレーザ光を照射し、ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルの、ドナー分子およびアクセプタ分子それぞれが発する蛍光、および細胞自体が発する蛍光について、ドナー波長帯域およびアクセプタ波長帯域での蛍光強度および位相を求める。第４キャリブレーションユニット９４で得られた、ドナー波長帯域における蛍光の蛍光強度の計測値Ｐmd4、ドナー波長帯域における蛍光の位相差の計測値θmd4、アクセプタ波長帯域における蛍光の蛍光強度の計測値Ｐma4、アクセプタ波長帯域における蛍光の位相差の計測値θma4とし、ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルのドナー分子が発する蛍光のドナー波長帯域での蛍光（図１２中のＲ１”で示す）の蛍光強度をＰ1”、同じくこの蛍光の位相をθ1”、ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルのアクセプタ分子が発する蛍光のドナー波長帯域での蛍光（図１２中のＲ2”で示す）の蛍光強度をＰ2”、同じくこの蛍光の位相をθ2”、ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルのアクセプタ分子が発する蛍光のドナー波長帯域での蛍光（図１２中のＲ5”で示す）の蛍光強度をＰ5”、同じくこの蛍光の位相をθ5”、ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルのアクセプタ分子が発する蛍光のアクセプタ波長帯域での蛍光（図１２中のＲ４”で示す）の蛍光強度をＰ4”、同じくこの蛍光の位相をθ4”、とすると、下記式（３０）および式（３１）の関係が成り立つ。上述したように、自家蛍光の成分については、第１キャリブレーションで求めた値をそのまま用いることができる。
Figure 0004365380
式（３１）におけるＰ5”／Ｐ1”は、上述のように、第２キャリブレーションユニット９０で求めたドナー蛍光の漏れ込み率（Ｐ5／Ｐ1）を、そのまま用いることができる（ドナー蛍光の漏れ込み率については、標識量が変わっても変わらないので）。同様に、Ｐ2”／Ｐ4”は、上述のように、第３キャリブレーションユニット９２で求めたアクセプタ蛍光の漏れ込み率（Ｐ2／Ｐ4）を、そのまま用いることができる。第４キャリブレーションユニット９２では、メモリ８４から、第１キャリブレーションユニット８８で求めておいたＰ3およびθ3、Ｐ6およびθ6を呼び出し、また、第２キャリブレーションユニット９２で求めたＰ5／Ｐ1、第３キャリブレーションユニット９４で求めたＰ2／Ｐ4を呼び出し、式（３０）および式（３１）の関係を用いて、特に、Ｐ4”およびθ4”を求める。なお、θ2”は第３キャリブレーションユニットで求めたθ2’を、およびθ5”は第２キャリブレーションユニットで求めたθ5’を、それぞれ求めればよい。
Ｐ4”およびθ4”は、サンプルにドナー分子とアクセプタ分子が付着された状態における、アクセプタ標識サンプルがレーザによって直接励起されて発する蛍光の蛍光強度および位相である。式（２１）を見てもわかるように、ＦＲＥＴが発生した場合でも、アクセプタ分子については、ＦＲＥＴ蛍光はこの直接励起の項に追加されるのみである。アクセプタ標識サンプルがレーザによって直接励起されて発する蛍光の蛍光強度および位相については、ＦＲＥＴを測定するサンプルと標識量が同等の（アクセプタ分子およびドナー分子の双方が細胞に付着された状態の）ｎｏｎ−ＦＲＥＴ細胞での計測結果（Ｐ4”およびθ4”）を、そのまま用いることができる（Ｐ4”＝Ｐ4およびθ4”＝θ4として用いることができる）。なお、式（３０）および（３１）は互いに干渉しているが、Ｐ5”／Ｐ1”やＰ2”／Ｐ4”の値が０〜１であるので、例えば逐次代入法などを用いて収束させることができ、簡単に求めることができる。
蛍光緩和時定数算出ユニット９６は、このように、第１キャリブレーションユニット８８〜第４キャリブレーションユニット９４で算出されてメモリ８４に記憶された各情報（Ｐ2／Ｐ4、Ｐ3およびθ3、Ｐ6およびθ6、Ｐ4などの値）と、ＦＲＥＴサンプル１２についての計測値であるＰdnonorおよびθdonor、同じくＰaccepterおよびθaccepter、上記式（２０）および式（２１）を用いて、τd *やτa *を求める。そして、ＦＲＥＴ効率算出ユニット９８が、ＦＲＥＴ効率Ｅt等を求める。
このようなフローサイトメータ１０では、図１３に示すような処理が行われて、ＦＲＥＴ効率が算出される。各処理の詳細については、上述の通りである。まず、ＦＲＥＴサンプルが準備される（ステップＳ１０）。この際、複数のＦＲＥＴサンプルが測定溶液中に混濁された状態で用意され、このＦＲＥＴサンプルの溶液はシース液を用いて管路３０内にてフローセルを形成する。このフローセルに所定の周波数で強度変調したレーザ光を照射して蛍光の計測が行われる（ステップＳ２０）。
蛍光の計測は、ＦＲＥＴサンプル１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせる、受光部２４の生成するトリガ信号に応じて、波長帯域がそれぞれ異なる光電変換器２７ａおよび２７ｂによる計測が開始される。計測により得られた蛍光信号は、信号処理部４２の位相差検出器５６にて、蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号が取り出される。この処理信号は、コントローラ４４において、ローパスフィルタ６２により高周波信号が除去されて、蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分がＡＤ変換されて求められる。
求められたｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分は分析装置８０に供給され、計測情報（各ＦＲＥＴサンプルの、ドナー受光波長帯域における蛍光強度情報および位相情報、アクセプタ波長帯域における蛍光強度および位相情報）が求められる。そして、所定の計測時間内に求められた、ドナー受光波長帯域の蛍光強度情報と、アクセプタ受光波長帯域における蛍光強度情報を用いてスキャッタグラム（２次元相関図）がディスプレイ９４に表示される(ステップＳ３０)。
次に、ＦＲＥＴが発生したサンプルを特定するために、ディスプレイ９４に表示されたスキャッタグラムにおいて、ＦＲＥＴが発生したサンプルの蛍光領域のサンプル集団が選択される。この選択は、オペレータによるマウス等の入力操作系を用いて行われてもよいし、例えばＣＰＵ８２によって自動的に選択してもよい。選択されたサンプル集団の領域に含まれるＦＲＥＴサンプルの蛍光強度情報や位相情報の代表値（例えば平均値、重心値、頻度ピーク値）が求められる（ステップＳ４０）。この代表値を、上述のＰdおよびθd、Ｐaおよびθaとして用いる。
次に分析装置８０のメモリ８４から、第１キャリブレーションユニット８８〜第４キャリブレーションユニット９４によって予め算出されて記憶された各キャリブレーション情報（第１キャリブレーション情報〜第４キャリブレーション情報）を読み出す（ステップＳ５０）。
そして、上述のＰdおよびθd、Ｐaおよびθaと、各キャリブレーション情報を用いて、Ｐ1およびθ1、あるいはＰ7およびθ7を求めて、τd *、τa *やτa、すなわち、ドナー分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命や、アクセプタ分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命、アクセプタ分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命などを求める。この際、式（２０）や式（２１）に示されるように、蛍光緩和時定数算出ユニット９６では、各値で表されたベクトルを用いた処理（ベクトル減算など）が、逐次行なわれる（ステップＳ６０）。
そして、ドナー波長帯域におけるドナー分子の蛍光成分（ＦＲＥＴが発生しない状態での、図４における経路Ｒ1に対応）の蛍光緩和時定数τdとを用いて、例えば、ＦＲＥＴ効率Ｅtを求める（ステップＳ７０）。
図１４は、フローサイトメータ１０で行なわれる第１のキャリブレーションのフローチャート図である。第１のキャリブレーションでは、まず、無標識サンプルが準備される（ステップＳ１１０）。
次に、無標識サンプルについてフローサイトメータで計測が行われる（ステップＳ１２０）。フローサイトメータによる計測（ステップＳ１２０）及びスキャッタグラムのディスプレイ表示（ステップＳ１３０）、無標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団の選択（ステップＳ１４０）は、図１３に示すステップＳ２０〜ステップＳ４０と同様の処理であるので説明は省略する。第１キャリブレーションでは、このステップＳ１４０において抽出された代表値を、上記Ｐmd1、θmd1およびＰma1、θma1とする。そして、この計測情報の代表値Ｐmd1、θmd1およびＰma1、θma1を、無標識サンプルにレーザ光を照射し、細胞自体が発する蛍光についての、ドナー波長帯域およびアクセプタ波長帯域での蛍光強度情報Ｐ3、Ｐ6および位相情報θ3、θ6を表す第１キャリブレーション情報として、メモリ８４に記憶する（ステップＳ１５０）。なお、第１キャリブレーションで求められる各種情報（第１キャリブレーション情報）と、第１キャリブレーションにおける処理の詳細は、先に述べたとおりである。
図１５は、フローサイトメータ１０で行なわれる第２のキャリブレーションのフローチャート図である。第１のキャリブレーションでは、まず、ドナー標識サンプルが準備される（ステップＳ２１０）。
次に、ドナー標識サンプルについてフローサイトメータで計測が行われる（ステップＳ１２０）。フローサイトメータによる計測（ステップＳ２２０）及びスキャッタグラムのディスプレイ表示（ステップＳ２３０）、ドナー標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団の選択（ステップＳ２４０）は、図１３に示すステップＳ２０〜ステップＳ４０と同様の処理であるので説明は省略する。第２キャリブレーションでは、このステップＳ２４０において抽出された代表値を、上記Ｐmd2、θmd2およびＰma2、θma2とする。次に、第１キャリブレーションユニットで求められた、第１キャリブレーション情報をメモリ８４から読み出す（ステップＳ２５０）。そして、Ｐmd2、θmd2およびＰma2、θma2と、第１キャリブレーション情報を用いて、特に、ドナー標識サンプルが発する蛍光のうち、ドナー波長帯域の蛍光成分の蛍光強度に対する、アクセプタ蛍光波長帯域の蛍光成分の蛍光強度の比（ドナー蛍光漏れこみ率）を表すＰ5／Ｐ1を含む、第２キャリブレーション情報を算出する（ステップＳ２６０）。この際、上述のように、ＦＲＥＴ発生が生じない場合の、ドナー分子のドナー波長帯域における蛍光緩和時定数τd、ドナー分子のアクセプタ波長帯域における蛍光緩和時定数τdaなども求めておく（第２キャリブレーション情報に含まれる）。この第２キャリブレーション情報を、メモリ８４に記憶する（ステップＳ２７０）。なお、第２キャリブレーションで求められる各種情報（第２キャリブレーション情報）と、第２キャリブレーションにおける処理の詳細は、先に述べたとおりである。
図１６は、フローサイトメータ１０で行なわれる第３のキャリブレーションのフローチャート図である。第３キャリブレーションでは、まず、アクセプタ標識サンプルが準備される（ステップＳ３１０）。
次に、アクセプタ標識サンプルについてフローサイトメータで計測が行われる（ステップＳ３２０）。フローサイトメータによる計測（ステップ３２０）及びスキャッタグラムのディスプレイ表示（ステップＳ３３０）、アクセプタ標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団の選択（ステップＳ３４０）は、図１３に示すステップＳ２０〜ステップＳ４０と同様の処理であるので説明は省略する。第３キャリブレーションでは、このステップＳ３４０において抽出された代表値を、上記Ｐmd3、θmd3およびＰma3、θma3とする。次に、第１キャリブレーションユニットで求められた、第１キャリブレーション情報をメモリ８４から読み出す（ステップＳ３５０）。そして、Ｐmd3、θmd3およびＰma3、θma3と、第１キャリブレーション情報を用いて、特に、アクセプタ標識サンプルが発する蛍光のうち、アクセプタ波長帯域の蛍光成分の蛍光強度に対する、ドナー波長帯域の蛍光成分の蛍光強度の比（ドナー蛍光漏れこみ率）を表すＰ2／Ｐ4を含む、第２キャリブレーション情報を算出する（ステップＳ２６０）。この際、上述のように、ＦＲＥＴ発生が生じない場合の、アクセプタ分子のアクセプタ波長帯域における蛍光緩和時定数τa、アクセプタ分子のドナー波長帯域における蛍光緩和時定数τdaなども求めておく（第３キャリブレーション情報に含まれる）。この第３キャリブレーション情報を、メモリ８４に記憶する（ステップＳ３７０）。なお、第３キャリブレーションで求められる各種情報（第３キャリブレーション情報）と、第３キャリブレーションにおける処理の詳細は、先に述べたとおりである。
図１７は、フローサイトメータ１０で行なわれる第４のキャリブレーションのフローチャート図である。第４キャリブレーションでは、まず、ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルが準備される（ステップＳ４１０）。
次に、ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルについてフローサイトメータで計測が行われる（ステップＳ４２０）。フローサイトメータによる計測（ステップ４２０）及びスキャッタグラムのディスプレイ表示（ステップＳ４３０）、アクセプタ標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団の選択（ステップＳ４４０）は、図１３に示すステップＳ２０〜ステップＳ４０と同様の処理であるので説明は省略する。第４キャリブレーションでは、このステップＳ４４０において抽出された代表値を、上記Ｐmd4、θmd4およびＰma4、θma4とする。次に、第１〜第３キャリブレーションユニットで求められた、第１〜第３キャリブレーション情報をメモリ８４から読み出す（ステップＳ４５０）。そして、Ｐmd4、θmd4およびＰma4、θma4と、第１〜第３キャリブレーション情報を用いて、特に、アクセプタ標識サンプルがレーザによって直接励起されて発する蛍光の蛍光強度Ｐ4および位相θ4を表す情報を含む、第４キャリブレーション情報を算出する（ステップＳ４６０）。そして、求められた第４キャリブレーション情報は、メモリ８４に記憶する（ステップＳ４７０）。第１〜第４キャリブレーションで求められた各キャリブレーション情報は、図１３に示すフローチャートで示される、ＦＲＥＴサンプルを用いたＦＲＥＴの検出に用いられる。なお、第４キャリブレーションで求められる各種情報（第４キャリブレーション情報）と、第４キャリブレーションにおける処理の詳細は、先に述べたとおりである。
以上のように、本発明では、特に、ＦＲＥＴを測定する対象の標識量が変化しない、ドナー分子蛍光漏れ込み率（Ｐ5／Ｐ1）や、アクセプタ蛍光漏れ込み率（Ｐ2／Ｐ4）を、ＦＲＥＴ標識サンプルとは標識量が異なるサンプル（ドナー標識サンプルやアクセプタ標識サンプル）を用いて予め求めておき、このような漏れ込み率の情報を用いてＦＲＥＴサンプルの計測情報を処理することで、ＦＲＥＴサンプルの蛍光寿命を高精度に求めることができる。また、ＦＲＥＴが発生しないように処理されたｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルを用いて、アクセプタ分子がレーザ光によって直接励起されて生じる蛍光の成分を予め求めておき、このような情報を用いてＦＲＥＴサンプルの計測情報を処理することで、ＦＲＥＴサンプルの蛍光寿命をより高精度に求めることができる。また、ドナー分子やアクセプタ分子が付着される細胞そのものからの自家蛍光の成分を除去することで、ＦＲＥＴサンプルの蛍光寿命をより高精度に求めることができる。
なお、上述の実施形態では、ドナー蛍光分子およびアクセプタ蛍光分子の双方を有し、タンパク質の構造変化や結合に対しての不活性因子を導入するなどして、ＦＲＥＴが発生しないように調整処理したｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルについて、このｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルが発する蛍光の蛍光強度および位相の情報を求めることで、特に、アクセプタ標識サンプルがレーザによって直接励起されて発する蛍光成分の蛍光強度および位相を求めている。例えば、アクセプタ分子で標識されたサンプルに、異なる２つの波長のレーザ光を照射し、各レーザ光それぞれによってアクセプタ分子が励起されて蛍光が発せられる場合、１つの波長帯域で測定される各レーザ光それぞれからの蛍光成分それぞれの比は、サンプルの標識量によらず一定であると仮定できる。すなわち、アクセプタ標識サンプルについての、この２つのレーザ光からの蛍光成分の比に対する、ＦＲＥＴ標識サンプルについての、この２つのレーザ光からの蛍光成分の比の変化量は、ＦＲＥＴ成分によるものであると仮定できる。アクセプタ標識サンプルについての、この２つのレーザ光からの蛍光成分の比を求めておけば、ＦＲＥＴ標識サンプルについて、この２つのレーザ光からの蛍光成分の比を求めることで、アクセプタ標識サンプルがレーザによって直接励起されて発する蛍光成分の蛍光強度情報や位相情報を求めることができるといえる。本願では、このような手法によって、アクセプタ標識サンプルがレーザによって直接励起されて発する蛍光成分の蛍光強度情報や位相情報を求めてもよい。なお、２つのレーザ光からの蛍光成分を独立に検出する手段としては、本願出願人による先の出願である特願２００５−３７３９９号明細書や特願２００６−０５４３４７号明細書に記載の手段を用いればよい。
以上、本発明のＦＲＥＴ検出方法及びＦＲＥＴ検出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
本発明のＦＲＥＴ検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 ドナー分子のエネルギー吸収と蛍光及びアクセプタ分子の吸収と蛍光のスペクトルの例を示す図である。 ＦＲＥＴの発生を説明する摸式図である。 図１に示すフローサイトメータの受光部の一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて、ＦＲＥＴサンプルから発する蛍光の成分と、各蛍光成分の光電変換器への入射について説明する図である。 図１に示すフローサイトメータの制御・処理部の一例を示す概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータの分析装置の一例を示す概略構成図である。 ＦＲＥＴ発生時の蛍光発光のダイナミクスについて表したモデル図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて、無標識サンプルから発する蛍光の成分と、各蛍光成分の光電変換器への入射について説明する図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて、ドナー標識サンプルから発する蛍光の成分と、各蛍光成分の光電変換器への入射について説明する図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて、アクセプタ標識サンプルから発する蛍光の成分と、各蛍光成分の光電変換器への入射について説明する図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて、ｎｏｎ−ＦＲＥＴ標識サンプルから発する蛍光の成分と、各蛍光成分の光電変換器への入射について説明する図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて行なわれるＦＲＥＴ検出方法のフローチャート図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて行なわれる第１キャリブレーションのフローチャート図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて行なわれる第２キャリブレーションのフローチャート図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて行なわれる第３キャリブレーションのフローチャート図である。 図１に示すフローサイトメータにおいて行なわれる第４キャリブレーションのフローチャート図である。
符号の説明
１０ フローサイトメータ
１２ ＦＲＥＴサンプル
２０ 信号処理装置
２２ レーザ光源部
２４，２６ 受光部
２６ａ レンズ系
２６ｃ1，２６ｃ2， バンドパスフィルタ
２７ａ、２７ｂ 光電変換器
２８ 制御・処理部
３０ 管路
３２ 回収容器
４０ 信号生成部
４２ 信号処理部
４４ コントローラ
４６ 発振器
４８ パワースプリッタ
５０，５２，５４ａ，５４ｂ 増幅器
５６ 位相差検出器
６０ システム制御器
６２ ローパスフィルタ
６６ Ａ／Ｄ変換器
８０ 分析装置
８２ ＣＰＵ
８４ メモリ
８６ 入出力ポート
８８ 第１キャリブレーションユニット
９０ 第２キャリブレーションユニット
９２ 第３キャリブレーションユニット
９４ 第４キャリブレーションユニット
９６ 蛍光緩和時定数算出ユニット
９８ ＦＲＥＴ効率算出ユニット

Claims (22)

  1. 第１分子および第２分子で標識された測定対象サンプルにレーザ光を照射し、このとき測定対象サンプルが発する蛍光を受光することによって、第１分子のエネルギーが第２分子に移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を検出するＦＲＥＴ検出方法であって、
    レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して前記測定対象サンプルに照射し、このときの前記測定対象サンプルの発する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集するステップと、
    予め記憶手段に記憶されている情報であって、前記測定対象サンプルの前記蛍光のうち前記第１分子が発する第１分子蛍光成分の、前記受光波長帯域における蛍光強度の比を表す第１の強度比率と、前記レーザ光の時間変調に対する前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記蛍光のうち前記第２分子が発する第２分子蛍光成分の、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を表す第２の強度比率と、前記レーザ光の時間変調に対する前記第２分子蛍光成分の位相情報と、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたとき定義される寿命であって前記ＦＲＥＴが発生しない状態における前記第１分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命と、を少なくとも含むキャリブレーション情報を読み出して取得するステップと、
    各検出センサから収集された前記検出値から、前記受光波長帯域毎に、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を求めて、求めた前記蛍光強度情報および前記位相情報と、前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報と、を用いて、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたとき定義される前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップと、
    前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記第１分子蛍光成分の前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命との比を用いてＦＲＥＴ発生情報を求めるステップと、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出方法。
  2. 前記ＦＲＥＴ発生情報を求めるステップでは、前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命をτd、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命をτd *とするとき、
    前記ＦＲＥＴ発生情報として、１−（τd *／τd）で表されるＦＲＥＴ効率Ｅtを求める請求項１に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  3. 前記検出値を収集するステップでは、複数の前記測定対象サンプルに前記レーザ光を照射し、前記センサにて複数の前記測定対象サンプルそれぞれについて前記検出値を収集し、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、各検出値に基づいて、前記測定対象サンプルそれぞれの蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた複数の蛍光強度情報および位相情報から前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求める請求項１または２に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  4. 前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記受光波長帯域毎に前記検出値から求めた前記蛍光強度および位相情報をベクトルで表し、このベクトルと、前記第１の強度比率および前記第２の強度比率とを、前記受光波長帯域毎に用いて、ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報と、前記第２分子蛍光成分のうちＦＲＥＴが生じることで発するＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報とを求め、求めた情報を用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求める請求項１〜３のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出方法。
  5. 前記受光波長帯域は、前記第１分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第１波長帯域と、前記第２分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第２波長帯域とを有し、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、
    前記第１波長帯域の前記検出センサにて収集される検出値によって表される第１波長帯域における前記ベクトルと前記第２の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、
    前記第２波長帯域の前記検出センサにより収集される検出値によって表される第２波長帯域における前記ベクトルと前記第１の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報を求める請求項４に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  6. 前記記憶手段には、前記第２分子蛍光成分のうち前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報があらかじめ記憶されており、
    前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、前記記憶手段に記憶されている前記直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を呼び出して、直接励起蛍光成分の情報をベクトルで表し、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記直接励起蛍光成分の前記ベクトルと、前記第２波長帯域における前記ベクトルとを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第２分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求める請求項５に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  7. 前記記憶手段には、前記第２分子蛍光成分のうち前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報があらかじめ記憶されており、
    前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、前記第２分子蛍光成分のうち、前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を呼び出して、前記直接励起蛍光成分のベクトルで表し、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ寿命を前記キャリブレーション情報を用いて求めるのに加えて、前記第２波長帯域における前記ベクトルと、前記第１の強度比率とを少なくとも用いて前記ＦＲＥＴ成分の位相情報を求め、
    求めた前記ＦＲＥＴ成分の位相情報と前記直接励起蛍光成分の前記ベクトルとを用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第２分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記ＦＲＥＴが生じない状態における前記第２分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命とを求め、
    前記第２分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記第２分子蛍光成分の前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命とを用いて、前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命を求める請求項５に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  8. 前記測定対象サンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第１分子および前記第２分子で標識されたサンプルであって、
    前記記憶手段には、前記自家蛍光サンプル体に前記レーザ光を照射することにより発する前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報が予め記憶されており、
    前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、前記記憶手段に記憶されている、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を呼び出して前記自家蛍光サンプル体の蛍光をベクトルで表し、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるステップでは、前記受光波長帯域毎の前記測定対象サンプルの前記ベクトルのそれぞれから、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の前記ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルを用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求める請求項４〜７のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出方法。
  9. 前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、
    前記自家蛍光キャリブレーションでは、
    前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶する請求項８に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  10. 前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、
    前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションでは、
    前記第１分子および前記第２分子がサンプルに付着されて、ＦＲＥＴが生じない処理がなされたｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、
    求めた前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報と、前記記憶手段に予め記憶された前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記記憶手段に予め記憶された前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の位相情報と、を用いて、レーザ光によって第２分子が直接励起される直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶する請求項１〜９のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出方法。
  11. 前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第１分子および前記第２分子で標識されたサンプルであって、
    前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、
    前記自家蛍光キャリブレーションは、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションに先がけて行われるキャリブレーションであって、前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶し、
    前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーションでは、前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報をベクトルで表したｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルベクトルから、前記自家蛍光キャリブレーションで求められた前記自家蛍光の情報をベクトルで表した自家蛍光ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルと、前記記憶手段に予め記憶された前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記記憶手段に予め記憶された前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の位相情報と、を用いて前記直接励起蛍光成分ベクトルを導出し、導出した結果を前記記憶手段に記憶する請求項１０に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  12. 前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、第１分子キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、
    前記第１分子キャリブレーションでは、
    前記第１分子のみで標識された第１分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、
    前記第１の強度比率として、前記第１分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、
    求めた前記第１の強度比率と求めた前記位相情報とを前記記憶手段に記憶する請求項１〜１１のいずれかに記載のFRET検出方法。
  13. 前記第１分子サンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第１分子で標識されたサンプルであって、
    前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、
    前記自家蛍光キャリブレーションは、前記第１分子キャリブレーションに先がけて行われるキャリブレーションであって、前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎に蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶し、
    前記第１分子キャリブレーションでは、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報をベクトルで表した第１分子サンプルベクトルから、前記自家蛍光キャリブレーションで求められた前記自家蛍光サンプル体の蛍光の情報をベクトルで表した自家蛍光ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルを用いて、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶する請求項１２に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  14. 前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、第２分子キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、
    前記第２分子キャリブレーションでは、
    前記第２分子のみで標識された第２分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、
    前記第２の強度比率として、前記第２分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、
    求めた前記第２の強度比率および求めた前記位相情報を前記記憶手段に記憶する請求項１〜１３のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出方法。
  15. 前記第２分子サンプルは、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光サンプル体に、前記第２分子で標識されたサンプルであって、
    前記キャリブレーション情報を取得するステップでは、自家蛍光キャリブレーションによって得られた情報を前記記憶手段から呼び出して取得し、
    前記自家蛍光キャリブレーションは、前記第２分子キャリブレーションに先がけて行われるキャリブレーションであって、前記自家蛍光サンプル体を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎に蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集して、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶し、
    前記第２分子キャリブレーションでは、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報をベクトルで表した第２分子サンプルベクトルから、前記自家蛍光サンプル体キャリブレーションで求められた前記自家蛍光サンプルの蛍光の情報をベクトルで表した自家蛍光ベクトルを減算し、この減算で得られたベクトルを用いて、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた情報を前記記憶手段に記憶する請求項１４に記載のＦＲＥＴ検出方法。
  16. 第１分子および第２分子で標識された測定対象サンプルにレーザ光を照射し、このとき測定対象サンプルが発する蛍光を受光することによって、第１分子のエネルギーが第２分子に移動するＦＲＥＴ(Fluorescence Resonance Energy Transfer)を検出するＦＲＥＴ検出装置であって、
    レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して前記測定対象サンプルについて照射し、このときの前記測定対象サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を取得する検出情報取得部と、
    前記測定対象サンプルの前記蛍光のうち前記第１分子が発する第１分子蛍光成分の、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を表す第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の位相情報と、前記第２分子が発する第２分子蛍光成分の、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を表す第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の位相情報と、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときに定義される寿命であって、前記ＦＲＥＴが発生しない状態における前記第１分子蛍光成分の非ＦＲＥＴ蛍光寿命と、を少なくとも含むキャリブレーション情報を予め記憶しておく記憶手段と、
    前記検出情報取得部が取得した前記検出値から、前記受光波長帯域それぞれについて、前記測定対象サンプルの蛍光の蛍光強度情報および位相情報を求めて、求めた前記蛍光強度情報および前記位相情報と、前記記憶手段から読み出した前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報と、を用いて、レーザ光によって励起された第１分子が発する蛍光が１次遅れ系の緩和応答であるとしたときに定義される前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命を求めるＦＲＥＴ蛍光寿命算出部と、
    前記第１分子蛍光成分のＦＲＥＴ蛍光寿命と、前記第１分子蛍光成分の前記非ＦＲＥＴ蛍光寿命との比を用いて表されるＦＲＥＴ発生情報を求めるＦＲＥＴ発生情報算出部と、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出装置。
  17. 前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部では、前記検出値それぞれから求めた前記蛍光強度および位相情報をベクトルで表し、それぞれのベクトルと、前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２分子蛍光成分の前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報とを用いて、ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報と、前記第２分子蛍光成分のうちＦＲＥＴが生じることで発するＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報とを求め、求めたこれらの情報を用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求める請求項１６に記載のＦＲＥＴ検出装置。
  18. 前記センサの各受光波長帯域は、前記第１分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第１波長帯域と、前記第２分子蛍光成分の蛍光強度が最大となるピーク波長を中心とした第２波長帯域であり、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部では、
    前記第１波長帯域の検出センサによる前記検出値から求められる第１波長帯域におけるベクトルと、前記第２の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴが生じた状態における前記第１分子蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、
    前記第２波長帯域の前記検出センサによる前記検出値によって表される第２波長帯域におけるベクトルと、前記第１の強度比率とを少なくとも用いて、前記ＦＲＥＴ成分の蛍光強度情報および位相情報を求める請求項１６または１７に記載のＦＲＥＴ検出装置。
  19. 前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、自家蛍光キャリブレーション部を有し、
    前記自家蛍光キャリブレーション部は、前記レーザ光によって励起されて自家蛍光を発する自家蛍光を測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、前記検出センサそれぞれから、前記受光波長帯域の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集し、前記自家蛍光サンプル体の蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求めて、前記記憶手段に記憶し、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部では、前記受光波長帯域毎の前記測定対象サンプルの蛍光の情報をベクトルで表し、このベクトルから、前記自家蛍光サンプル体の前記蛍光強度情報および前記位相情報を表したベクトルを減算し、減算して得られたベクトルを用いて、前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求める請求項１６〜１８のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出装置。
  20. 前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーション部を有し、
    前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴキャリブレーション部は、
    前記第１分子および前記第２分子がサンプルに付着されて、ＦＲＥＴが生じない処理がなされたｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集した際、
    前記ｎｏｎ−ＦＲＥＴサンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、求めた蛍光強度情報および位相情報と、前記第１の強度比率と、前記第１分子蛍光成分の前記位相情報と、前記第２の強度比率と、前記第２分子蛍光成分の前記位相情報と、を用いて、前記レーザ光によって第２分子が直接励起されることで発生する直接励起蛍光成分の蛍光強度情報および位相情報を求め、これらの情報をベクトルで表した直接励起蛍光成分ベクトルを導出し、この導出結果を前記記憶手段に記憶し、
    前記ＦＲＥＴ蛍光寿命算出部は、前記直接励起蛍光成分ベクトルを用いて前記ＦＲＥＴ蛍光寿命を求める請求項１６〜１９のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出装置。
  21. 前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、第１分子キャリブレーション部を有し、
    前記第１分子キャリブレーション部は、
    前記第１分子のみで標識された第１分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集した際、
    前記第１分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第１の強度比率として、前記第１分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、求めた前記第１の強度比率及び求めた前記第１分子サンプルの蛍光の前記位相情報を前記記憶手段に記憶する請求項１６〜２０のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出装置。
  22. 前記ＦＲＥＴ検出装置は、さらに、第２分子キャリブレーション部を有し、
    前記第２分子キャリブレーション部は、
    前記第２分子のみで標識された第２分子サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、各検出センサから、前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を含む検出値を収集した際、
    前記第２分子サンプルの蛍光の、前記受光波長帯域毎の蛍光強度情報および位相情報を求め、前記第２の強度比率として、前記第２分子サンプルの、前記受光波長帯域の蛍光強度の比を求め、求めた前記第２の強度比率及び求めた前記第２分子サンプルの蛍光の前記位相情報を前記記憶手段に記憶する請求項１６〜２１のいずれかに記載のＦＲＥＴ検出装置。
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