KR101152614B1 - 형광 공명 에너지 이동 검출 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

도너(donor) 분자 및 억셉터 분자로 이루어지는 샘플에 관하여, 단시간에 다수의 샘플의 형광 공명 에너지 이동 검출을 행할 때, 우선 주파수 f+Δf로 강도 변조한 도너 분자 여기용의 제1 레이저광을 도너 분자에 조사(照射)하는 것과 함께, 주파수 f로 강도 변조한 억셉터 분자 여기용의 제2 레이저광을 억셉터 분자에 조사하여, 억셉터 분자가 발하는 형광을 수광(受光)한다. 수광한 형광의 형광 신호로부터, 형광 공명 에너지 이동에 의하여 억셉터 분자가 발하는 형광의 제1 신호 성분과, 제2 레이저광의 조사에 의하여 여기한 억셉터 분자가 발하는 형광의 제2 신호 성분을 추출한다. 추출한 제1 신호 성분의 위상 지연과, 추출한 제2 신호 성분의 위상 지연을 산출하고, 이들의 위상 지연에 기초하여 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무를 판정한다.
Figure R1020097027237
형광 공명 에너지 이동 검출 방법, 도너 분자, 억셉터 분자, 레이저광, 신호 성분

Description

형광 공명 에너지 이동 검출 방법 및 장치{FRET DETECTION METHOD AND DEVICE}
본 발명은, 형광 공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)을 검출하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 구체적으로는, 형광 분자인 도너(donor) 분자와 형광 분자인 억셉터 분자의 비에 관하여, 양 분자의 상호 작용을 형광에 의하여 검출하는 형광 공명 에너지 이동 검출 기술에 관한 것이다.
현재, 의료, 창약(創藥, 신약 물질의 발견), 식품 산업에 있어서의 포스트 게놈(post-genome) 관련 기술로서, 단백질의 기능 해석이 중요해지고 있다. 특히, 세포의 작용을 해석하기 위하여, 생 세포에 있어서의 생체 물질인 단백질과, 다른 단백질이나 저분자 화합물과의 사이의 상호 작용(결합, 분리)의 연구가 필요하다.
이와 같은 단백질의 다른 단백질이나 저분자 화합물과의 사이의 상호 작용에 관하여, 형광 공명 에너지 이동(FRET) 현상을 이용하여 해석하는 것이 최근 행하여지고 있다. 즉, 수 나노미터의 영역에서의 분자 간의 상호 작용을 형광을 이용하여 검출한다. 이와 같은 형광 공명 에너지 이동 현상을 이용한 검출은, 주로 현미경 시스템을 이용하여 행하여진다.
일본국 공개특허공보 특개2005-207823호는, 형광 공명 에너지 이동을 이용한 1분자 형광 해석을 개시하고 있다. 이 문헌에서는, 형광 공명 에너지 이동 현상을 이용하여, 수광한 형광에 기초하여 형광 상관 분석법 또는 형광 강도 분포 해석을 행한다. 그러나, 이 방법에서는, 단시간에 형광 공명 에너지 이동의 검출을 행할 수 있는 세포 등의 샘플수는, 겨우 수십 개 정도로 한정되어 있어, 많은 세포를 해석 대상으로 하여 단시간에 통계적으로 해석하는 것은 어렵다.
특허 문헌 1: 일본국 공개특허공보 특개2005-207823호
그래서, 본 발명은, 상기 문제점을 해결하기 위하여, 도너 분자 및 억셉터 분자를 포함하는 샘플에 관하여 단시간에 다수의 샘플을 해석할 수 있는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법 및 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 레이저광의 조사(照射)에 의하여 여기(勵起)된 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 형광 공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)을 검출하는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법이고, 제1 분자를 여기하기 위하여 제1 주파수로 강도 변조한 제1 레이저광을 제1 분자에 조사하는 것과 함께, 제2 분자를 여기하기 위하여 제1 주파수와 다른 제2 주파수로 강도 변조한 제2 레이저광을 제2 분자에 조사하는 스텝과, 제2 분자가 발하는 형광을 수광하는 스텝과, 수광한 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제1 위상 지연과, 수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분의, 제2 레이저광의 강도 변조에 대한 제2 위상 지연을 골라내고, 이 제1 위상 지연과 제2 위상 지연에 기초하여, 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 에너지 이동의 유무를 판정하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법을 제공한다.
여기서, 상기 에너지 이동은, 상기 제2 위상 지연에 대한 상기 제1 위상 지연의 비에 의하여 판정되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제1 레이저광은, 상기 제1 레이저광의 강도 변조를 위하여 제1 주파수를 가지는 제1 변조 신호를 이용하여 강도 변조되고, 상기 제2 레이저광은, 상기 제2 레이저광의 강도 변조를 위하여 제2 주파수를 가지는 제2 변조 신호를 이용하여 강도 변조되고, 상기 제1 주파수의 변조 신호는, 상기 제2 주파수의 변조 신호에, 차분 주파수의 생성 신호를 합성하여 얻어진 신호이며, 수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호는, 상기 차분 주파수의 생성 신호에 동기(同期)하여, 상기 차분 주파수의 정수배의 주파수를 샘플링 주파수로 하여 샘플링되는 것이 바람직하다. 그때, 상기 샘플링된 형광 신호를 상기 차분 주파수의 정수분의 1의 주파수를 주파수 분해능으로 하여 주파수 분석을 하는 것에 의하여, 상기 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분과 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분을 추출하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제2 분자가 발하는 형광을 수광할 때, 상기 제1 분자가 발하는 형광을 더 수광하고, 수광한 상기 제1 분자가 발하는 형광의 형광 신호의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제3 위상 지연을 산출하고, 이 제3 위상 지연을 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무의 판정에 이용할 수도 있다.
본 발명은, 나아가 레이저광의 조사에 의하여 여기된 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 형광 공명 에너지 이동을 검출하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치이고, 제1 분자를 여기하기 위하여 제1 레이저광을 제1 분자에 조사하는 것과 함께, 제2 분자를 여기하기 위하여 제2 레이저광을 제2 분자에 조사하는 레이저 광원부와, 제2 분자가 발하는 형광을 수광하는 수광부와, 상기 레이저 광원부로부터 출사(出射)하는 제1 레이저광을 제1 주파수로 강도 변조시키고, 또한 상기 레이저 광원부로부터 출사하는 제2 레이저광을 제1 주파수와 다른 제2 주파수로 강도 변조시키기 위하여, 변조 신호를 생성하는 광원 제어부와, 수광한 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제1 위상 지연과, 수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분의, 제2 레이저광의 강도 변조에 대한 제2 위상 지연을 골라내고, 이 제1 위상 지연과 제2 위상 지연에 기초하여, 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 에너지 이동의 유무를 판정하는 처리부를 가지는 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치를 제공한다.
그때, 상기 처리부는, 상기 제2 위상차에 대한 상기 제1 위상차의 비에 의하여 상기 에너지 이동을 판정하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 광원 제어부는, 상기 제1 레이저광을, 상기 제1 레이저광의 강도 변조를 위하여 제1 주파수를 가지는 제1 변조 신호를 이용하여 강도 변조시키며, 상기 제2 레이저광을, 상기 제2 레이저광의 강도 변조를 위하여 제2 주파수를 가지는 제2 변조 신호를 이용하여 강도 변조시키고, 상기 제1 주파수의 변조 신호는, 상기 제2 주파수의 변조 신호에, 차분 주파수의 생성 신호를 합성하여 얻어진 신호이며, 상기 처리부는, 수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호를, 상기 차분 주파수의 생성 신호에 동기하여, 상기 차분 주파수의 정수배의 주파수를 샘플링 주파수로 하여 샘플링하는 것이 바람직하다. 그때, 상기 처리부는, 상기 샘플링된 형광 신호를 상기 차분 주파수의 정수분의 1의 주파수를 주파수 분해능으로 하여 주파수 분석을 하는 것에 의하여, 상기 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분과 상기 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분을 추출하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 수광부는, 상기 제2 분자가 발하는 형광 외에, 상기 제1 분자가 발하는 형광을 수광하고, 상기 처리부는, 상기 수광부에서 수광한 제1 분자가 발하는 형광의 형광 신호의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제3 위상 지연을 산출고, 이 제3 위상 지연을 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무의 판정에 이용할 수도 있다.
<발명의 효과>
본 발명은, 제1 분자의 여기용 레이저광과, 제2 분자의 여기용 레이저광을 이용하여, 이들 레이저광을 소정의 주파수로 강도 변조를 행하고, 또한, 그때의 강도 변조의 주파수를, 형광의 식별을 위하여 주파수를 늦춘다. 나아가, 이들 레이저광에 의하여 발하는 형광의 수광 후, 강도 변조의 주파수가 다른 것을 이용하여 이 2개의 주파수에 있어서의 제2 분자가 발하는 형광의 위상 지연을 구하고, 이들 위상 지연을 이용하여 형광 공명 에너지 이동을 검출한다. 이와 같은 신호 처리는 단시간에 할 수 있기 때문에, 단시간에 효율 좋게 샘플의 측정을 할 수 있어, 통계적으로 형광 공명 에너지 이동 검출 결과를 정리할 수 있다.
특히, 상기 2개의 위상 지연의 비는, 형광 공명 에너지 이동의 발생에 의하여 크게 변화한다. 이 때문에, 이 비의 값을 이용하는 것으로, 형광 공명 에너지 이동 효율이 낮은 경우라도 형광 공명 에너지 이동의 검출을 정도(精度) 좋게 행할 수 있다. 또한, 본 발명을, 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 적용하면, 일정 속도로 측정점을 통과하는 샘플로부터의 형광의 신호 처리를 행하는 것으로 형광 공명 에너지 이동의 검출을 할 수 있다. 이 때문에, 단시간에 효율 좋게 샘플의 측정을 할 수 있고, 통계적으로 형광 공명 에너지 이동 검출 결과를 정리할 수 있어, 주목하는 분자의 상호 작용을 효율 좋게 조사할 수 있다.
도 1은 본 발명의 형광 공명 에너지 이동 검출 장치의 일 실시예인 플로우 사이토미터의 개략 구성도이다.
도 2는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터에 있어서의 레이저 광원부의 개략 구성도이다.
도 3은 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터에 있어서의 수광부의 개략 구성도이다.
도 4는 도 1에 도시하는 플로우 사이토미터에 있어서의 제어·처리부의 개략 구성도면이다.
도 5는 도 4에 도시하는 제어·처리부에 있어서의 SSB 변조기의 블록 구성도이다.
도 6은 본 발명의 형광 공명 에너지 이동 검출 방법의 일례의 흐름을 도시하는 플로차트이다.
도 7은 도너 분자의 에너지 흡수와 형광 및 억셉터 분자의 흡수와 형광의 스펙트럼의 예를 도시하는 도면이다.
도 8은 형광 공명 에너지 이동의 발생을 설명하는 설명도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
10: 플로우 사이토미터 12: 샘플
20: 검출부 22: 레이저 광원부
22a: 도너 여기 광원 22b: 억셉터 여기 광원
23a, 23b: 렌즈계 24, 26: 수광부
26a: 렌즈계 26b: 다이크로익 미러
26c1, 26c2: 밴드 패스 필터 27a, 27b: 광전 변환기
28: 제어·처리부 30: 관로
32: 회수 용기 34a, 34b: 레이저 드라이버
40: 신호 생성부 42: 신호 처리부
44: 컨트롤러 46, 47: 발진기
48, 56: 파워 스플리터 50: SSB 변조기
50a: 90도 하이브리드 50b, 50c: 믹서
50d: 90°위상기 52, 54a, 54b, 64: 증폭기
58a, 58b: IQ 믹서 60: 시스템 제어기
62: 로 패스 필터 66: A/D 변환기
80: 분석 장치
이하, 본 발명의 형광 공명 에너지 이동 검출 방법 및 장치에 관하여 상세하게 설명한다.
도 1은, 본 발명의 형광 공명 에너지 이동 검출 장치의 일 실시예인 플로우 사이토미터(10)의 개략 구성도이다.
플로우 사이토미터(10)는, 레이저광의 조사에 의하여 여기된 도너 분자의 에너지가 억셉터 분자의 에너지로 이동하는지 여부를 판정하는 것이다. 이와 같은 에너지 이동의 검출을 위하여, 도너 분자 및 억셉터 분자에 조사하는 레이저광은, 일정한 주파수로 강도 변조된다. 본 발명은, 이 레이저광의 조사에 응답하여 발하는 형광의 위상 지연을, 이하에 나타내는 바와 같이 측정하는 것에 의하여, 형광 공명 에너지 이동의 발생을 검출하는 것을 특징으로 한다.
플로우 사이토미터(10)는, 레이저광의 조사에 의하여 형광하는 도너 분자 및 억셉터 분자의 샘플(12)을 일정 속도로 흐르게 하고, 이 때 샘플(12)에 레이저광을 조사하여, 이 샘플(12)이 발하는 형광의 형광 신호를 검출하는 검출부(20)와, 검출부(20)에서 얻어진 처리 결과로부터 샘플(12)에 있어서 형광 공명 에너지 이동가 발생하고 있는지 여부의 검출을 행하는 분석 장치(컴퓨터, 80)를 가진다.
검출부(20)는, 레이저 광원부(22)와 수광부(24, 26)와 제어·처리부(28)와 관로(30)를 가진다. 제어·처리부(28)는, 레이저 광원부(22)로부터의 레이저광을 소정의 주파수로 강도 변조시키는 제어부, 및 샘플(12)로부터의 형광 신호를 처리하는 처리부를 가진다. 관로(30)에서는, 고속류를 형성하는 시스액(sheath fluid)과 함께 샘플(12)을 흐르게 하여 플로우 셀(flow cell)이 형성된다. 관로(30)의 출구에는, 회수 용기(32)가 설치되어 있다.
레이저 광원부(22)는, 도너 분자 및 억셉터 분자가 레이저광을 흡수하여 여기 상태로 되는 소정의 파장의 레이저광을 출사하는 도너 여기 광원(22a) 및 억셉터 여기 광원(22b)을 가진다.
도 2는, 레이저 광원부(22)의 개략 구성도이다.
도너 여기 광원(22a)은 도너 분자를 여기하는 레이저광을 출사하는 광원이다. 억셉터 여기 광원(22b)은 억셉터 분자를 여기하는 레이저광을 출사하는 광원이다. 도너 분자를 여기하는 레이저광과 억셉터 분자를 여기하는 레이저광은, 도너 분자, 억셉터 분자를 각각 호적하게 여기할 수 있도록 파장 대역이 달라 있다. 예를 들면, 도너 분자로서 CFP(Cyan Fluorescent Protein)를 이용하는 경우, 파장 405 ~ 440nm의 레이저광이 이용되고, 억셉터 분자로서 YFP(Yellow Fluorescent Protein)를 이용하는 경우, 파장 470 ~ 530nm의 레이저광이 이용된다. 레이저 광원부(22)는, 이와 같은 가시광선 대역의 연속파의 레이저광을 소정의 주파수로 강도 변조하여 출사하는 부분이다.
각 광원의 레이저광의 광로 상에는, 레이저광을 동일 위치에 집속(集束)하는 광학 렌즈(23a, 23b)가 설치되고, 이 집속 위치를 측정 대상의 샘플(12)이 통과하도록 되어 있다.
각 레이저 광원에는, 각각의 광원을 구동하여 레이저광을 출사시키는 레이저 드라이버(34a, 34b)가 접속되어 있다. 레이저 드라이버(34a, 34b)는, 후술하는 신호 생성부(도 4 참조, 40)로부터의 신호에 의하여, 레이저광을 강도 변조하도록 제어된다.
레이저광을 출사하는 도너 여기 광원(22a) 및 억셉터 여기 광원(22b)으로서 예를 들면 반도체 레이저가 이용되고, 예를 들면 5 ~ 100mW 정도의 출력으로 레이저광이 출사된다. 레이저광의 강도 변조의 주파수(변조 주파수)는, 그 강도 변조의 주기가 도너 분자, 억셉터 분자가 발하는 형광의 형광 완화 시간에 비해 길고, 예를 들면 10 ~ 100MHz이다. 도너 분자를 여기하기 위한 레이저광과 억셉터 분자를 여기하기 위한 레이저광은, 강도 변조의 주파수가 100kHz ~ 2MHz 다르고, 도너 분자를 여기하는 레이저광의 강도 변조의 주파수가 높아져 있다. 본 발명에 있어서는, 억셉터 분자를 여기하는 레이저광의 강도 변조의 주파수가 도너 분자를 여기하기 위한 레이저광의 강도 변조의 주파수에 비해 높아도 무방하다. 이와 같이, 레이저광의 강도 변조의 주파수를 약간 바꾸는 것은, 후술하는 바와 같이, 수광한 형광의 형광 신호의 처리가 단시간에 행하여지도록 하기 위함이다.
레이저 광원부(22)는, 레이저광이 도너 분자 및 억셉터 분자를 각각 여기하 여 특정의 파장 대역의 형광을 발하도록, 미리 정해진 파장 대역에서 발진한다. 레이저광에 의하여 발하는 형광은, 샘플(12) 중의 도너 분자 및 억셉터 분자가 발하는 형광이며, 샘플(12)은 관로(30)를 통과할 때, 측정점에서 레이저광의 조사를 받아 형광 분자 특유의 파장으로 형광을 발한다.
수광부(24)는, 관로(30)를 사이에 두고 레이저 광원부(22)와 대향하도록 배치되어 있고, 측정점을 통과하는 샘플(12)에 의하여 레이저광이 전방(前方) 산란하는 것에 의하여, 샘플(12)이 측정점을 통과하는 취지의 검출 신호를 출력하는 광전 변환기를 구비한다. 이 수광부(24)로부터 출력되는 신호는, 제어·처리부(28)로 공급되고, 제어·처리부(28)에 있어서 표지 샘플(12)이 관로(30) 중의 측정점을 통과하는 타이밍을 알리는 트리거(trigger) 신호로서 이용된다.
한편, 수광부(26)는, 레이저 광원부(22)로부터 출사되는 레이저광의 출사 방향에 대하여 직교 방향이고, 또한 관로(30) 중의 샘플(12)의 이동 방향에 대하여 직교 방향으로 배치되어 있다. 수광부(26)는, 측정점에서 조사된 샘플(12)이 발하는 형광을 수광하는 포토멀티플라이어(photomultiplier, 광전자 배증관)나 애밸런치 포토다이오드(avalanche photodiode) 등의 광전 변환기가 이용된다.
도 3은, 수광부(26)의 일례의 개략의 구성을 도시하는 개략 구성도이다.
도 3에 도시하는 수광부(26)는, 샘플(12)로부터의 형광의 형광 신호를 집속시키는 렌즈계(26a)와, 다이크로익 미러(dichroic mirro, 26b)와, 밴드 패스 필터(26c1, 26c2)와, 광전자 배증관이나 애밸런치 포토다이오드 등의 광전 변환 기(27a, 27b)를 가진다.
렌즈계(26a)는, 수광부(26)에 입사한 형광을 광전 변환기(27a, 27b)의 수광면에 집속시키도록 구성된다.
다이크로익 미러(26b)는, 억셉터 분자의 형광을 투과시키고 도너 분자의 형광을 반사시키도록, 반사, 투과의 파장 특성이 정해져 구성된 미러이다. 밴드 패스 필터(26c1, 26c2)에서 필터링하여 광전 변환기(27a, 27b)는, 각각 도너 분자의 형광 및 억셉터 분자의 형광의 소정의 파장 대역의 형광을 받아들인다. 따라서, 광전 변환기(27a)는 도너 분자가 발하는 형광을 수광하고, 광전 변환기(27b)는 억셉터 분자가 발하는 형광을 수광한다.
밴드 패스 필터(26c1, 26c2)는, 각 광전 변환기(27a, 27b)의 수광면의 전면(前面)에 설치되고, 소정의 파장 대역의 형광만이 투과하는 필터이다. 투과하는 형광의 파장 대역은, 도너 분자의 형광 및 억셉터 분자의 형광의 파장 대역에 대응하여 설정되어 있고, 서로 다른 파장 대역으로 되어 있다.
광전 변환기(27a, 27b)는, 예를 들면 광전자 배증관을 구비한 센서를 구비하고, 광전면에서 수광한 빛을 전기 신호로 변환하는 센서이다. 여기서, 수광하는 형광은 강도 변조된 레이저광의 조사에 의하여 발하는 위상이 늦은 형광이다. 이 형광은, 위상 지연의 정보를 가진 광신호로서 수광된다. 이 때문에, 출력되는 전기 신호는 위상차의 신호 정보를 가진 형광 신호로 된다. 이 형광 신호는, 제어·처리부(28)로 공급되어, 증폭기로 증폭된다.
제어·처리부(28)는, 도 4에 도시하는 바와 같이, 신호 생성부(40)와 신호 처리부(42)와 컨트롤러(44)를 가지고 구성된다. 신호 생성부(40)는, 소정의 주파수의 변조 신호를 생성하는 본 발명의 광원 제어부를 형성한다. 또한, 컨트롤러(44) 및 후술의 분석 장치(80)는, 본 발명에 있어서의 처리부를 형성한다.
신호 생성부(40)는, 레이저광의 강도를 소정의 주파수로 변조(진폭 변조)하기 위한 변조 신호를 생성하는 부분이다.
구체적으로는, 신호 생성부(40)는, 발진기(46, 47), 파워 스플리터(power splitter, 48) 및 SSB(Single Side Band) 변조기(50) 및 앰프(52)를 가진다. 신호 생성부(40)는, 생성되는 변조 신호를, 레이저 광원부(22)의 레이저 드라이버(34a, 34b)로 공급하는 것과 함께, 신호 처리부(42)로 공급한다. 신호 처리부(42)로 변조 신호를 공급하는 것은, 후술하는 바와 같이, 광전 변환기(27a, 27b)로부터 출력되는 형광 신호의 위상차 검출을 위한 참조 신호로서 이용하기 위함이다. 덧붙여, 변조 신호는, 소정의 주파수의 정현파 신호이며, 10 ~ 100MHz의 범위의 주파수로 설정된다. 레이저 드라이버(34b)로 공급하는 변조 신호의 주파수를 f라 하면, f는 상술한 바와 같이 억셉터 분자를 여기하는 레이저광의 변조 신호의 주파수이며, 10 ~ 100MHz이다. 레이저 드라이버(34a)로 공급하는 변조 신호의 주파수는, 도너 분자를 여기하는 레이저광의 주파수이며, f+Δf로 된다. 이 때의 Δf는, 100kHz ~ 2MHz이며, f=10 ~ 100MHz에 비해 그 주파수는 작다.
발진기(46)는 주파수 f의 정현파 신호를 생성하고, 발진기(47)는 주파수 Δf의 정현파 신호를 생성한다. SSB 변조기(50)는, 주파수 f의 정현파 신호에 주파수 Δf의 정현파 신호를 합성하여, 고주파 측의 합성 신호(USB 신호)인 주파수 f+Δf의 정현파 신호를 생성한다. 이 정현파 신호는, 변조 신호로서 레이저 드라이버(34a)로 공급된다. 레이저 드라이버(34b)에는, 파워 스플리터(48)로부터 주파수 f의 정현파 신호가 변조 신호로서 공급된다.
도 5는, SSB 변조기(50)의 블록 구성도이다.
SSB 변조기(50)는, 90도 하이브리드(50a), 믹서(50b, 50c), 90°위상기(50d), 180도 하이브리드(50e)를 가지고 구성된다.
90도 하이브리드(50a)는, 발진기(46)로부터 공급되는 주파수 f의 정현파 신호의 위상을 0도 및 90도로 분리하는 하이브리드 링을 구비하는 고주파 소자이며, 0도 및 90도로 분리된 정현파 신호를 믹서(50b, 50c)로 공급한다. 한편, 90°위상기(50d)는, 발진기(47)로부터 공급된 주파수 Δf의 정현파 신호를 위상 0도 및 90도로 바꾸어 믹서(50b, 50c)로 공급한다.
180도 하이브리드(50e)는, 수광 신호의 위상을 0도 및 180도로 분리하는 하이브리드 링을 구비하는 고주파 소자이다. 180도 하이브리드(50e)의 단자의 일방(一方)에서는, 정현파 신호의 위상 정보를 보지(保持)한 채, 고주파 측으로 주파수 Δf 시프트시킨 USB 신호가 생성되고, 타방(他方)의 단자에서는, 수광 신호의 위상 정보를 보지한 채, 저주파 측으로 주파수 Δf 시프트시킨 LSB 신호가 생성된다.
SSB 변조기(50)는, USB 신호를 출력하여 레이저 드라이버(34a)로 공급한다.
신호 처리부(42)는, 광전 변환기(27a, 27b)로부터 출력되는 형광 신호를 이용하여, 레이저광의 조사에 의하여 샘플(12)이 발하는 형광의 위상 지연에 관한 정 보(위상차)를 추출하는 부분이다. 신호 처리부(42)는, 앰프(54a, 54b)와 파워 스플리터(56)와 IQ 믹서(58a, 58b)를 가진다. 앰프(54a, 54b)는, 광전 변환기(27a, 27b)로부터 출력되는 형광 신호를 증폭한다. 파워 스플리터(56)는, 증폭된 형광 신호의 각각을 신호 생성부(40)로부터 공급된 주파수 f의 정현파 신호인 변조 신호를 분배한다. IQ 믹서(58a, 58b)는, 증폭된 형광 신호를 상기 변조 신호에 합성한다.
IQ 믹서(58a, 58b)는, 광전 변환기(27a, 27b)로부터 공급되는 도너 분자의 형광 및 억셉터 분자가 발하는 형광의 형광 신호를, 신호 생성부(40)로부터 공급되는 변조 신호를 참조 신호로서 동기하여 합성하기 위하여, 광전 변환기(27a, 27b)가 따로 설치되어 있다. 변조 신호를 참조 신호로서 동기하여 합성하는 것으로, 후술하는 바와 같이, 형광의 위상 지연을 구할 수 있다.
구체적으로는, IQ 믹서의 각각은, 참조 신호를 형광 신호(RF 신호)와 곱셈하여, 형광 신호의 cos 성분(실수부)과 고주파 성분을 포함하는 처리 신호를 산출하는 것과 함께, 참조 신호의 위상을 90도 시프트시킨 신호를 형광 신호와 곱셈하여, 형광 신호의 sin 성분(허수부)과 고주파 성분을 포함하는 처리 신호를 산출한다. 처리 신호는, 도너 분자가 발한 형광의 신호 및 억셉터 분자가 발한 2개의 형광의 신호이다. 이 cos 성분을 포함하는 처리 신호 및 sin 성분을 포함하는 처리 신호는, 컨트롤러(44)로 공급된다.
컨트롤러(44)는, 신호 생성부(40)에 주파수 f 및 Δf의 정현파 신호를 생성시키도록 제어하는 것과 함께, 신호 처리부(42)에서 구해진 형광 신호의 cos 성분 및 sin 성분을 포함하는 처리 신호로부터, 고주파 성분을 제거하여 형광 신호의 cos 성분 및 sin 성분을 구하는 부분이다.
구체적으로는, 컨트롤러(44)는, 시스템 제어기(60)와 로 패스 필터(low pass filter, 62)와 앰프(64)와 A/D 변환기(66)를 가진다. 시스템 제어기(60)는, 각 부분의 동작 제어를 위한 지시를 내리는 것과 함께, 플로우 사이토미터(10)의 전(全) 동작을 제어 관리한다. 로 패스 필터(62)는, 신호 처리부(42)에서 연산된 cos 성분, sin 성분에 고주파 성분이 가산된 처리 신호로부터 고주파 성분을 제거한다. 앰프(64)는, 고주파 성분이 제거된 cos 성분, sin 성분의 처리 신호를 증폭한다. A/D 변환기(66)는, 증폭된 처리 신호를 샘플링한다. A/D 변환기(66)에서는, 고주파 성분이 제거된 cos 성분, sin 성분의 처리 신호가 샘플링되어, 분석 장치(80)로 공급된다. 샘플링은, 상술의 주파수 Δf의 정수배(바람직하게는 3배 이상의 정수배)의 주파수를 샘플링 주파수로 한다. 로 패스 필터(62)는, A/D 변환기(66)에 의한 디지털화 때의 앤티엘리어싱(anti-aliasing)을 위하여, 또한 주파수 Δf의 신호 성분을 통과시키기 위하여, 주파수 특성이 정해진다.
분석 장치(80)는, 공급된 처리 신호를 이용하여, 상술한 Δf의 정현파 신호에 동기시켜, Δf의 정수분의 1의 주파수를 주파수 분해능으로 하는 주파수 분석을 행하고, 주파수 분석을 행한 0Hz에 있어서의 진폭과 위상을 구하는 것과 함께, 주파수 Δf에 있어서의 처리 신호의 진폭과 위상을 구한다. 구해진 위상은, 상술한 바와 같이 주파수 f에 있어서의 정현파 신호를 참조 신호로 하여 합성된 처리 신호에 기초하여 얻어져 있기 때문에, 이들의 위상은, 상기 정현파 신호(레이저광의 강도 변조)에 대한 위상 지연으로 되어 있다. 또한, 처리 신호는, 상술한 바와 같이, 레이저광의 조사에 의하여 도너 분자가 발하는 형광의 형광 신호에 유래하는 것과, 억셉터 분자가 발하는 형광의 형광 신호에 유래하는 것을 포함하기 때문에, 이 2개의 형광 신호를 분리하기 위하여, 주파수 0Hz와 주파수 Δf에 있어서의 진폭과 위상이 각각 골라내진다.
분석 장치(80)는, 억셉터 분자가 발하는 형광의 처리 신호의 0Hz에 있어서의 위상과, 주파수 Δf에 있어서의 위상을 구하고, 주파수 Δf에 있어서의 위상의, 0Hz에 있어서의 위상에 대한 비를 산출하여, 이 비의 값의 대소에 의하여, 형광 공명 에너지 이동을 검출한다. 즉, 상술한 형광 공명 에너지 이동 발생의 유무를 판정한다. 예를 들면, 상기 비가 미리 설정된 역치를 넘은 경우, 형광 공명 에너지 이동의 발생으로서 판정한다.
이와 같이, 억셉터가 발하는 형광의 처리 신호의 0Hz에 있어서의 위상과 주파수 Δf에 있어서의 위상을 이용하는 것은, 이하의 이유에 의한다. 즉, 0Hz에 있어서의 처리 신호의 위상은, 억셉터 분자가 주파수 f로 강도 변조된 레이저광의 조사에 의하여 발한 형광의 위상 지연을 나타내고, 주파수 Δf에 있어서의 처리 신호의 위상은, 형광 공명 에너지 이동의 발생에 의하여 생긴 위상 지연을 나타내기 때문이다.
주파수 Δf에 있어서의 처리 신호의 위상, 즉 형광 공명 에너지 이동의 발생에 의하여 생긴 위상 지연은, 후술하는 바와 같이, 레이저광이 조사되어 발하는 도너 분자의 형광의 형광 방사 속도 및 형광 공명 에너지 이동의 발생 속도와, 형광 공명 에너지 이동을 통하여 여기한 억셉터 분자가 발하는 형광의 형광 방사 속도와, 레이저광이 조사된 억셉터 분자가 발하는 형광의 형광 방사 속도에 의하여 나타내진다. 또한, 0Hz에 있어서의 처리 신호의 위상, 즉 레이저광의 조사에 의하여 발한 형광의 위상 지연은, 후술하는 바와 같이, 레이저광이 조사되어 억셉터 분자가 발하는 형광의 형광 방사 속도에 의하여 나타내진다. 이 때문에, 후술하는 바와 같이, 위상 지연의 비를 구하는 것으로, 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무를 판정할 수 있다. 특히, 형광 공명 에너지 이동의 속도는 도너 분자의 형광 방사 속도 및 억셉터 분자의 형광 방사 속도에 비해 그 값이 매우 작은 경우가 많고, 나아가 도너 분자 및 억셉터 분자의 방사 속도가 비교적 동일한 경우, 상기 비의 값은 2가 된다. 따라서, 분석 장치(80)는, 측정 결과인 위상 지연의 비를 산출하는 것에 의하여, 형광 공명 에너지 이동의 발생을 상기 비의 값에 의하여 비교적 용이하게 검출할 수 있다.
또한, 형광 공명 에너지 이동이 발생하였을 때, 도너 분자가 발하는 형광의 처리 신호의 ΔfHz에 있어서의 위상은, 형광 공명 에너지 이동의 발생에 따라 바뀐다. 이 위상의 변화를 이용하여 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무를 판정할 수도 있다. 즉, 도너 분자가 발하는 형광의 형광 신호로부터, 도너 분자의 여기용의 레이저광의 강도 변조에 대한 위상 지연을 골라내어, 이 위상 지연을 형광 공명 에너지 이동의 검출에 이용할 수도 있다.
물론, 분석 장치(80)에서는, 처리 신호의 0Hz 및 주파수 Δf에 있어서의 진폭을 이용하여, 도너 분자 및 억셉터 분자가 발하는 형광 강도를 정량적으로 구할 수도 있고, 주파수 Δf에 있어서의 형광 강도에 의하여, 형광 공명 에너지 이동의 발생을 검출할 수도 있다.
이상이, 본 발명을 실시하는 플로우 사이토미터(10)의 설명이다.
다음으로, 이 플로우 사이토미터(10)에서 행하여지는 형광 공명 에너지 이동의 검출 방법을 설명한다. 도 6은, 형광 공명 에너지 이동의 발생의 검출의 흐름을 나타내는 플로차트(flow chart)이다.
우선, 컨트롤러(44)로부터의 지시에 의하여, 주파수 f의 정현파 신호를 발진기(46)에 발생시키고, 나아가 주파수 Δf의 정현파 신호를 발진기(47)에 발생시킨다. 주파수 f의 정현파 신호는, 파워 스플리터(48)에서 나뉘어, 일방은 SSB 변조기(50)로, 타방은 앰프(52)로 공급된다. 주파수 Δf의 정현파 신호는 SSB 변조기(50)로 공급된다.
SSB 변조기(50)에서는, 공급된 주파수 f의 정현파 신호는 주파수 Δf의 정현파 신호와 합성되어, 고주파 측의 합성 신호인 주파수 f+Δf의 정현파 신호가 생성되고, 레이저 드라이버(34a)로 강도 변조 신호로서 공급된다.
한편, 파워 스플리터(48)에서 나뉜 주파수 f의 정현파 신호는, 레이저 드라이버(34b)로 강도 변조 신호로서 공급된다.
이 상태에서, 샘플(12)이 관로(30)를 흘러, 시스 플로우(sheath flow)가 형성된다. 시스 플로우는, 예를 들면 100㎛의 유로 직경에 1 ~ 10m/초의 유속을 가진다. 또한, 샘플(12)에는 레이저광의 조사에 의하여 형광을 발하는 도너 분자와 억셉터 분자가 포함된다.
레이저광은, 도너 여기 광원(22a)으로부터 주파수 f+Δf로 강도 변조된 레이저광과, 억셉터 여기 광원(22b)으로부터 주파수 f로 강도 변조된 레이저광이 동시에 샘플(12)을 향하여 조사된다(스텝 S10).
측정점에서 이들 레이저광에 의한 조사가 이루어지고, 수광부(24)에서 샘플(12)의 통과를 검출하면, 검출 신호가 컨트롤러(44)로 트리거 신호로서 출력된다.
신호 처리부(42) 및 컨트롤러(44)에서는, 이 검출 신호를 트리거 신호로 하여, 도너 분자가 발하는 형광의 수광이 광전 변환기(27a)에서, 억셉터 분자가 발하는 형광의 수광이 광전 변환기(27b)에서 각각 개시되어, 수광된 형광의 형광 신호의 신호 처리가 행하여진다(스텝 S20).
구체적으로는, 앰프(52)로부터 공급된 주파수 f의 정현파 신호를 참조 신호로 하여, IQ 믹서(58a, 58b)에서 합성되고, cos 성분, sin 성분에 고주파 성분이 가산된 처리 신호가 생성된다. 이 처리 신호는 컨트롤러(44)로 공급된다.
컨트롤러(44)에서는, 필터링 처리가 행하여지고, cos 성분, sin 성분에 고주파 성분이 가산된 처리 신호로부터 고주파 성분이 제거되어, 형광 신호의 cos 성분, sin 성분으로 이루어지는 처리 신호가 골라내진다. 이 신호는, 앰프(64)를 통하여 A/D 변환기(66)로 공급된다.
여기서, 컨트롤러(44)의 시스템 제어기(60)에는, 발진기(47)에서 생성되는 주파수 Δf의 정현파 신호의 정수배의 주파수 (n·Δf)를 가지는 신호가 공급되고, 이 신호에 동기하여 A/D 변환기(66)에서 도너 분자가 발하는 형광의 처리 신호 및 억셉터 분자가 발하는 형광의 처리 신호의 샘플링이 행하여진다(스텝 S30).
이렇게 하여 디지털화된 처리 신호는, 분석 장치(80)로 공급된다.
분석 장치(80)에서는, 샘플링된 억셉터 분자의 형광의 처리 신호에 대해서 주파수 분석이 행하여진다(스텝 S40). 주파수 분석은, 주파수 Δf의 정수분의 1의 주파수를 주파수 분해능으로 하여 행하여진다. 주파수 분석 후의, 0Hz에 있어서의 처리 신호의 성분은, 억셉터 분자에 레이저광이 조사되어 발한 형광의 형광 신호 성분이다. 주파수 Δf에 있어서의 처리 신호의 성분은, 형광 공명 에너지 이동에 의하여 발한 억셉터 분자의 형광의 형광 신호 성분이다. 이와 같이, 형광 신호 성분은, 레이저광의 강도 변조의 주파수의 차이를 이용하여 골라내진다.
얻어진 주파수 분석의 결과로부터, 0Hz에 있어서의 억셉터 분자의 형광의 처리 신호의 위상에 대한, ΔfHz에 있어서의 억셉터 분자의 형광의 처리 신호의 위상 지연의 비를 구한다. 이 비가 미리 설정된 역치와 비교되고, 이 역치를 넘는 경우, 형광 공명 에너지 이동이 발생했다고 판정하는 것에 의하여, 형광 공명 에너지 이동의 검출이 행하여진다(스텝 S50).
그때, 억셉터 분자의 형광의 처리 신호 외에, 도너 분자의 형광의 처리 신호의 위상 지연의 비를 구하고, 이 비를 이용하여 형광 공명 에너지 이동의 검출을 종합적으로 행할 수도 있다.
마지막으로, 플로우 사이토미터(10)에서 측정점을 통과하여 측정되는 샘플수가 소정의 수에 달하였는지, 예를 들면 샘플수가 1000에 달하였는지 여부를 판정하고, 샘플수가 소정의 수에 달할 때까지 측정을 계속한다.
이와 같이, 강도 변조한 레이저광을 샘플 중의 도너 분자에 조사하여 억셉터 분자로부터 발하는 형광을 수광하여, 신호 처리하고, 레이저광의 강도 변조에 대한 위상 지연을 구하는 것으로, 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무의 판정을 단시간에 행할 수 있어, 측정점을 통과하는 샘플의 형광 공명 에너지 이동의 검출을 효율 좋게 행할 수 있다.
도 7은, 도너 분자의 에너지 흡수와 형광 및 억셉터 분자의 흡수와 형광의 스펙트럼의 예를 도시하는 도면이다. 도 8은, 형광 공명 에너지 이동의 발생을 알기 쉽게 설명한 설명도이다.
도 7에서는, 도너 분자가 CFP(Cyan Fluorescent Protein), 억셉터 분자가 YFP(Yellow Fluorescent Protein)일 때의 에너지의 흡수, 형광 방사의 특성을 나타내고 있다. 도 7 중, 곡선 A1은 CFP의 에너지 흡수스펙트럼을, 곡선 A2는 CFP의 형광 방사 스펙트럼을, 곡선 B1은 YFP의 에너지 흡수스펙트럼을, 곡선 B2는 YFP의 형광 방사 스펙트럼을 각각 나타낸다. 도 7 중, 사선의 부분은, 형광 공명 에너지 이동이 생기는 파장 대역을 나타낸다.
일반적으로, 형광 공명 에너지 이동은, 도너 분자가 레이저광에 의하여 여기되고, 그 여기된 도너 분자의 일부분이 형광을 방사하여, 일부의 에너지는 쿨롱 상호 작용에 의하여 억셉터 분자로 흐른다. 이 에너지 이동은, 2nm 이하의 극히 지근(至近) 거리에 의하여 생기는 것이며, 이 에너지 이동이, 분자의 상호 작용(결합)을 나타낸다. 따라서, 에너지 이동이 일어나는 것으로, 억셉터 분자가 여기되어 억셉터 분자로부터 형광이 방사된다. 이 때, 도 7에 도시하는 바와 같이, 도너 분자의 형광 방사 파장 대역과 억셉터 분자의 에너지 흡수의 파장 대역이 일부분에서 겹쳐 있는 것이, 형광 공명 에너지 이동의 발생에 있어서 필요하다.
본 발명에서는, 도 8에 도시하는 바와 같이, 주파수 f+Δf로 강도 변조한 레이저광이 조사된 도너 분자가 억셉터 분자를 여기하여, 주파수 f+Δf로 형광 강도가 변화하는 형광을 억셉터 분자는 방사한다. 동시에, 주파수 f로 강도 변조된 레이저광이 조사된 억셉터 분자는 주파수 f로 형광 강도가 변화하는 형광을 방사한다. 이것에 의하여, 주파수 f+Δf의 형광과 주파수 f의 형광을 동시에 수광하지만, 이 2개의 형광의 형광 신호는, 상기 주파수의 차이에 의하여 분리할 수 있다.
이와 같은 형광 공명 에너지 이동의 현상을, 1차의 완화 과정에 의하여 이하와 같이 간단하게 설명할 수 있다. 구체적으로, 형광 공명 에너지 이동 현상은, 이하의 방정식으로 규정된다.
Figure 112009080805880-pct00001
여기서, Wd는 도너 분자의 여기 상태 밀도, Wa는 억셉터 분자의 여기 상태 밀도, kd는 도너 분자의 형광 방사 속도, ka는 억셉터의 형광 방사 속도, kda는 형광 공명 에너지 이동 속도를 각각 나타낸다. 또한, pejωt는 레이저광에 의하여 단위 시간에 여기되는 상태 밀도이며, ω는 2πf(f는 강도 변조의 주파수)를 나타낸다(각주파수).
여기서, Wd 및 Wa는 각주파수 ω를 이용하여 하기 식 (3), (4)로 나타내진다.
Figure 112009080805880-pct00002
상기 식 (3), (4)에 있어서의 Wd, Wa의 위상은, 하기 식 (5), (6)으로 된다.
한편, 레이저광이 억셉터 분자를 직접 여기하여 형광을 발할 때, 형광은 하기 식 (7)에 의하여 나타내진다.
Figure 112009080805880-pct00003
Figure 112009080805880-pct00004
레이저광의 조사에 의하여 여기한 억셉터 분자가 형광을 발할 때, Wa는, 상기 식(7)로부터 하기 식 (8)로 나타내지고, 하기 식 (9)에 나타내는 위상을 일으킨다.
Figure 112009080805880-pct00005
Figure 112009080805880-pct00006
이 때, 상기 식 (6) 및 식 (9)로부터 위상의 비를 구하면, 하기 식 (10)과 같이 된다.
Figure 112009080805880-pct00007
상기 식 (10)에서 구해지는 비는, 억셉터 분자에 직접 레이저광을 조사하였을 때의 위상 지연에 대한, 도너 분자에 레이저광을 조사하여 형광 공명 에너지 이동을 통하여 억셉터 분자가 발하는 형광의 위상 지연의 비를 나타낸다. 실측으로 얻어지는 위상 지연은, 형광 공명 에너지 이동이 발생하는 경우, 식 (10)에 대략 가까운 값을 가지기 때문에, 이 위상 지연의 비의 값과 미리 설정된 역치를 비교하여, 비의 값이 역치보다 큰 경우 형광 공명 에너지 이동이 발생하고 있다고 판정한다.
특히, 많은 도너 분자 및 억셉터 분자에 있어서, kd, ka>>kda이기 때문에, 상기 식 (10)은, 하기 식 (11)과 같이 나타낼 수 있어, kd, ka로 비를 나타낼 수 있다. 나아가, ω2<<kd·ka일 때, 상기 비는, 하기 식 (12)와 같이 나타내진다.
특히, 상기 방사 속도 kd, ka가 비교적 동일한 경우, 상기 식 (12)에서 정해지는 비의 값은 2가 된다. 따라서, 분석 장치(80)에서는, 억셉터 분자가 방사하는 형광의 측정 결과인 위상 지연의 비를 산출하여, 미리 설정된 역치와 비교하는 것에 의하여, 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무를 정도 좋게 판정할 수 있다. 형광 공명 에너지 이동이 발생하지 않는 경우, 상기 위상 지연의 비는 상기 역치 이하로 된다.
Figure 112009080805880-pct00008
Figure 112009080805880-pct00009
플로우 사이토미터(10)에서는, 단독의 도너 분자를 레이저광으로 조사하였을 때의 형광의 위상 지연과, 레이저광을 조사하여 억셉터 분자와의 사이에서 형광 공명 에너지 이동이 발생하였을 때의 도너 분자의 형광의 위상 지연과의 비를 구할 수도 있지만, 억셉터 분자에 있어서의 위상 지연의 비의 값이 상술한 바와 같이 2가 될 때, 도너 분자에 있어서의 위상 지연의 비의 값은 1 근방의 값으로 되어, 억셉터 분자에 있어서의 위상 지연의 비에 비해 형광 공명 에너지 이동의 검출이 어려워진다. 이 때문에, 본 발명에서는, 억셉터 분자의 형광의 위상 지연의 비를 구한다. 물론, 억셉터 분자의 형광의 위상 지연의 비에 더하여, 도너 분자의 형광의 위상 지연의 비를 이용하여 형광 공명 에너지 이동을 종합적으로 검출할 수도 있다.
종래, 도너 분자의 여기용 레이저광을 도너 분자에 조사하고, 형광 공명 에너지 이동을 통하여 발하는 억셉터 분자의 형광 강도를 측정하는 방법이 행하여지고 있다. 그러나, 이 방법의 경우, 억셉터 분자가 도너 분자의 여기용 레이저광에 의하여 여기되어 형광을 발하는 일도 있어, 형광 공명 에너지 이동에 의하여 여기된 억셉터 분자가 발하는 형광의 외, 도너 분자의 여기용 레이저광에 의하여 여기되어 발하는 억셉터 분자의 형광을 여분으로 수광한다. 이 때문에, 발생 효율이 낮은 형광 공명 에너지 이동인 경우 형광 공명 에너지 이동의 오류 검출을 행한다고 한 문제가 생긴다. 그러나, 본 발명은, 도너 분자의 여기용 레이저광과 억셉터 분자의 여기용 레이저광을 이용하여, 이들 레이저광을 소정의 주파수로 강도 변조를 행하고, 또한, 그때의 강도 변조의 주파수를, 형광의 식별을 위하여 주파수 Δf 늦춘다. 나아가, 이들 레이저광에 의하여 발하는 형광의 수광 후, 형광 공명 에너지 이동을 통하여 발하는 억셉터 분자의 형광의 위상 지연과, 억셉터 분자가 레이저광으로 여기되어 발하는 형광의 위상 지연을 구하여, 이들 위상 지연을 이용하여 형광 공명 에너지 이동을 검정한다. 이 때 위상 지연의 비의 값은, 상술한 바와 같이 형광 공명 에너지 이동의 유무에 의하여 비교적 크게 변화한다. 이 때문에, 형광 공명 에너지 이동 효율이 낮은 경우라도 검출을 정도 좋게 행할 수 있다. 또한, 상기 플로우 사이토미터에 있어서, 신호 처리를 행하는 것으로 형광 공명 에너지 이동의 검출을 할 수 있기 때문에, 단시간에 효율 좋게 샘플의 측정을 할 수 있고, 통계적으로 형광 공명 에너지 이동 검출 결과를 정리할 수 있어, 주목하는 분자의 상호 작용을 조사할 수 있다.
이상, 본 발명의 형광 공명 에너지 이동 검출 방법 및 장치에 관하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않고, 본 발명의 주지를 일탈하지 않는 범위에 있어서, 여러 가지의 개량이나 변경을 해도 무방한 것은 것은 물론이다.

Claims (10)

  1. 레이저광의 조사(照射)에 의하여 여기(勵起)된 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 형광 공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET)을 검출하는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법이고,
    제1 분자를 여기하기 위하여 제1 주파수로 강도 변조한 제1 레이저광을 제1 분자에 조사하는 것과 함께, 제2 분자를 여기하기 위하여 제1 주파수와 다른 제2 주파수로 강도 변조한 제2 레이저광을 제2 분자에 조사하는 스텝과,
    제2 분자가 발하는 형광을 수광(受光)하는 스텝과,
    수광한 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제1 위상 지연과, 수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분의, 제2 레이저광의 강도 변조에 대한 제2 위상 지연을 골라내고, 이 제1 위상 지연과 제2 위상 지연에 기초하여, 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 에너지 이동의 유무를 판정하는 스텝을 가지는 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 에너지 이동은, 상기 제2 위상 지연에 대한 상기 제1 위상 지연의 비에 의하여 판정되는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 레이저광은, 상기 제1 레이저광의 강도 변조를 위하여 제1 주파수를 가지는 제1 변조 신호를 이용하여 강도 변조되고, 상기 제2 레이저광은, 상기 제2 레이저광의 강도 변조를 위하여 제2 주파수를 가지는 제2 변조 신호를 이용하여 강도 변조되고, 상기 제1 주파수의 변조 신호는, 상기 제2 주파수의 변조 신호에, 차분 주파수의 생성 신호를 합성하여 얻어진 신호이고,
    수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호는, 상기 차분 주파수의 생성 신호에 동기(同期)하여, 상기 차분 주파수의 정수배의 주파수를 샘플링 주파수로 하여 샘플링되는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 샘플링된 형광 신호를 상기 차분 주파수의 정수분의 1의 주파수를 주파수 분해능으로 하여 주파수 분석을 하는 것에 의하여, 상기 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분과 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분을 추출하는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 분자가 발하는 형광을 수광할 때, 상기 제1 분자가 발하는 형광을 더 수광하고,
    수광한 상기 제1 분자가 발하는 형광의 형광 신호의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제3 위상 지연을 산출하고, 이 제3 위상 지연을 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무의 판정에 이용하는 형광 공명 에너지 이동 검출 방법.
  6. 레이저광의 조사에 의하여 여기된 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 형광 공명 에너지 이동을 검출하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치이고,
    제1 분자를 여기하기 위하여 제1 레이저광을 제1 분자에 조사하는 것과 함께, 제2 분자를 여기하기 위하여 제2 레이저광을 제2 분자에 조사하는 레이저 광원부와,
    제2 분자가 발하는 형광을 수광하는 수광부와,
    상기 레이저 광원부로부터 출사(出射)하는 제1 레이저광을 제1 주파수로 강도 변조시키고, 또한 상기 레이저 광원부로부터 출사하는 제2 레이저광을 제1 주파수와 다른 제2 주파수로 강도 변조시키기 위하여, 변조 신호를 생성하는 광원 제어부와,
    수광한 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제1 위상 지연과, 수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분의, 제2 레이저광의 강도 변조에 대한 제2 위상 지연을 골라내고, 이 제1 위상 지연과 제2 위상 지연에 기초하여, 제1 분자의 에너지가 제2 분자로 이동하는 에너지 이동의 유무를 판정하는 처리부를 가지는 것을 특징으로 하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 처리부는, 상기 제2 위상차에 대한 상기 제1 위상차의 비에 의하여 상기 에너지 이동을 판정하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 광원 제어부는, 상기 제1 레이저광을, 상기 제1 레이저광의 강도 변조를 위하여 제1 주파수를 가지는 제1 변조 신호를 이용하여 강도 변조시키고, 상기 제2 레이저광을, 상기 제2 레이저광의 강도 변조를 위하여 제2 주파수를 가지는 제2 변조 신호를 이용하여 강도 변조시키고, 상기 제1 주파수의 변조 신호는, 상기 제2 주파수의 변조 신호에, 차분 주파수의 생성 신호를 합성하여 얻어진 신호이고,
    상기 처리부는, 수광한 상기 제2 분자가 발하는 형광의 형광 신호를, 상기 차분 주파수의 생성 신호에 동기하여, 상기 차분 주파수의 정수배의 주파수를 샘플링 주파수로 하여 샘플링하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 처리부는, 상기 샘플링된 형광 신호를 상기 차분 주파수의 정수분의 1의 주파수를 주파수 분해능으로 하여 주파수 분석을 하는 것에 의하여, 상기 형광 신호 중 상기 제1 주파수의 신호 성분과 상기 형광 신호 중 상기 제2 주파수의 신호 성분을 추출하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 수광부는, 상기 제2 분자가 발하는 형광 외에, 상기 제1 분자가 발하는 형광을 수광하고,
    상기 처리부는, 상기 수광부에서 수광한 제1 분자가 발하는 형광의 형광 신호의, 제1 레이저광의 강도 변조에 대한 제3 위상 지연을 산출하고, 이 제3 위상 지연을 형광 공명 에너지 이동의 발생의 유무의 판정에 이용하는 형광 공명 에너지 이동 검출 장치.
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