KR200458306Y1 - 고감도 휴대용 ｆｒｅｔ 형광측정 장치 - Google Patents

Abstract

본 고안은 고감도의 휴대용 FRET 형광측정 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는, LED와 실리콘 광검출기로 구성된 고감도의 소형 광학계와 형광신호를 발생시키는 FRET 바이오센서를 이용하여 현장에서 신속하고 정량적인 분자진단이 가능하도록 고안된, 휴대용 FRET 형광측정 장치에 관한 것이다.

본 고안에 따른 휴대용 형광측정 장치는 미세한 형광신호를 고감도로 검출할 수 있는 광학계를 포함하고 있으며, 동시에 휴대가 용이하고 조작이 간단한 소형 장비로 구성이 가능하므로, 현장에서 신속한 분석을 목적으로 하는 현장진단의 용도로 적합한 장점이 있다.

FRET(fluorescence resonance energy transfer; 형광공명에너지전이), 바이오센서, 현장진단(point-of-care testing, POCT), 형광 측정장치(fluorescence photometer)

Description

고감도 휴대용 ＦＲＥＴ 형광측정 장치 {High sensitivity portable FRET photometer}

본 고안은 FRET 바이오센서를 이용하여 현장에서 신속하고 정량적인 분자진단이 가능한 고감도의 휴대용 형광측정 장치의 구성에 관한 것이다.

현장진단(Point-of-care testing, POCT)이란, 환자자신 또는 비전문가가 손쉽게 시행할 수 있는 환자근접검사(near-patient testing)를 가리키며, 특히, 전문적인 처치에 접근하기 어려운 응급상황에 서 적절한 진단결과를 얻을 수 있는 간편한 테스트를 의미한다.

현장진단기기 시장은 최근 SARS (중증성호흡기증후군), 조류독감 등의 발생으로 더욱 주목받고 있으며, 그 이유는 고가의 의료장비를 사용하지 않고 혈액이나 소변 등을 이용하여 간편하게 발병여부를 확인할 수 있기 때문이다.

현장진단기기로서 이미 널리 사용되고 있는 임신, 혈당 진단키트 이외에도 간염, 결핵, 에이즈, 각종 암, 심장질환, 각종 유전질환까지도 진단할 수 있는 진 단키트 등이 개발되어 시장에 진입하고 있으므로 시장규모는 더욱 커질 것으로 예상된다. 또한, 향후 의료 분야 이외에 환경, 식품, 산업, 군사등의 분야로 폭넓게 확대될 전망이고, 특히 식품과 환경 분야가 빠르게 발전할 것으로 기대되기 때문에, 이들 분야에 적용할 수 있는 바이오센서의 개발도 시급하다고 할 수 있다.

한편, 현대에는 인체 내의 당과 관련된 질환, 예를 들어, 당뇨병, 비만질환 등이 증가함에 따라, 당의 분석기술도 발전하고 있다. 다양한 생리기능을 수행하는 당류는 미세한 차이(epimer 등)에 의하여 생화학적 역할이 크게 달라지지만, 구조적 차이를 정확하게 분석하기 위해서는 Bio-LC, MALDI-TOF/MS 등과 같이 시간과 노력이 많이 소요되는 분석기술에 의존해야 하는 큰 단점이 있었다.

특히, 단백질에 결합된 당류는 단백질의 활성, 용해도, 분해저항성, 면역반응 및 신호전달 등에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있고(Varki, A., Glycobiology, 3:97-130, 1993), 세포의 성장환경 및 상태에 따라 혹은 세포의 종류 및 돌연변이에 따라 같은 단백질도 결합되는 당의 종류와 양이 다르게 생성되어, 질병 마커로의 가치가 높으며, 특히 단백질의약에 결합되는 당의 정도나 종류에 따라 효능에 차이를 보이는 것으로 알려져 있다.

당단백질의 분석은 동위원소, 항원인식, TAP 표지법을 이용하며, 효소반응을 통하여 당을 떼어낸 후 분석하는 방법으로 SDS-PAGE, 나아가 기존의 분자량분석에 의한 당량분석 기법은 quality control이나 drug screening을 위한 대량분석에는 적용하기 어려워, 새로운 분자진단기술의 개발이 요구되고 있다.

최근에는 형광 프루브를 이용한 분자진단 기술들이 큰 주목을 받고 있으며, 그 중에서도 형광물질 사이의 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 적용시킨 바이오센서의 개발이 주목을 받고 있는데, 형광 탐지방법 및 장치(미국공개특허 2008-0290292), 고감도 FRET 센서의 개발 및 그 사용방법(일본공개특허 2008-516607), FRET 측정용 다이 시스템(일본공개특허 2004-514139) 등이 보고되어 있으며, 본 고안자들도 FRET 바이오센서의 구성과 이용에 관한 기술을 개발하여 대한민국등록특허 10-0739529와 미국등록특허 7432353를 보유하고 있다.

이에 본 고안자들은 상기 FRET 바이오센서 기술을 토대로 현장검사가 가능한 소형 진단기를 개발하고자 예의 노력한 결과, 다양한 종류의 당 농도를 정량적으로 감지하는 FRET 기반의 바이오센서와 고감도로 상기 바이오센서의 형광신호를 측정할 수 있는 LED와 광검출기로 구성된 광학장치를 융합함으로써, 이동과 조작이 용이한 고감도의 휴대용 형광 측정장치를 제작할 수 있다는 것을 확인하고, 본 고안을 완성하게 되었다.

본 고안의 목적은 FRET 바이오센서를 이용하여 현장에서 신속하고 정량적인 분자진단이 가능하도록 고안된 휴대용 형광측정 장치를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 고안은, (a) (i) 광원 및 상기 광원을 이용하여 시료를 측정하는 FRET 바이오센서를 포함하는 발광계; 및 (ii) 상기 FRET 바이오센서로부터 시료 측정 후 형광신호를 통과시키는 대역통과필터(Band Pass Filter, BPS) 및 상기 대역통과필터를 통과한 형광신호를 검출하는 광검출기를 포함하는 수광계;를 포함하는 광학부; (b) 상기 광학부의 작용을 제어하기 위한 제어회로를 포함하는 제어부; 및 (c) 상기 광학부 및 제어부에 전원을 공급하는 전원공급회로 및 배터리를 충전시키기 위한 배터리 충전회로를 포함하는 전원부를 포함하는, 고감도의 휴대용 형광측정 장치를 제공한다.

본 고안에 따른 휴대용 형광측정 장치는 미세한 형광신호를 고감도로 검출할 수 있는 광학부를 포함하고 있으며, 동시에 휴대가 용이하고 조작이 간단한 소형 장비로 구성이 가능하므로, 현장에서 신속한 분석을 목적으로 하는 현장진단의 용도로 적합한 장점이 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 고안이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 고안은 형광물질들 사이에서 발생하는 FRET 현상과 고감도 광학 측정기술을 융합한 것으로, 당을 비롯한 다양한 생체물질에 대한 특이성 및 민감성을 중요시하는 분자진단의 적용에 적합하다.

즉, 본 고안은 FRET 현상 기반의 바이오센서(이하 FRET 바이오센서)와 고감도 광학 측정기술 기반의 광학장치를 이용한 형광신호 측정기로서, 이동 및 조작이 용이한 고감도의 휴대용 FRET 형광측정 장치에 관한 것이다.

본 고안은 일 관점에서, (a) (i) 광원 및 상기 광원을 이용하여 시료를 측정하는 FRET 바이오센서를 포함하는 발광계; 및 (ii) 상기 FRET 바이오센서로부터 시료 측정 후 형광신호를 통과시키는 대역통과필터(Band Pass Filter, BPF) 및 상기 대역통과필터를 통과한 형광신호를 검출하는 광검출기를 포함하는 수광계;를 포함하는 광학부; (b) 상기 광학부의 작용을 제어하기 위한 제어회로를 포함하는 제어부; 및 (c) 상기 광학부 및 제어부에 전원을 공급하는 전원공급회로 및 배터리를 충전시키기 위한 배터리 충전회로를 포함하는 전원부를 포함하는, 고감도의 휴대용 FRET 형광측정 장치에 관한 것이다.

이하, 도면을 참조하여 본 고안에 따른, 휴대용 형광 측정장치의 구성 및 작용을 보다 상세하게 설명한다.

도 1은 본 고안에 따른 휴대용 형광 측정장치의 개념도로서, 상기 FRET 바이오센서를 이용한 고감도의 휴대용 형광 측정장치는 광학부, 제어부 및 전원부를 포함한다.

광학부는 시료에 포함된 성분의 분석을 위해 FRET 바이오센서로 부터 발생되는 형광신호를 검출하는 기능을 하며, 발광계 및 수광계를 모두 포함한다.

제어부는 상기 광학부의 작동 및 검출된 형광신호를 화면에 디스플레이하는 기능을 포함하며 진단장치를 전반적으로 제어하는 기능을 담당한다.

전원부는 상기 광학부 및 제어부에 전원을 공급하는 기능을 하며 현장에서 사용이 가능하도록 충전기를 포함하여 구성된다.

도 2는 본 고안에 따른 고감도의 휴대용 형광 측정장치의 개략도로서, 광원이 LED인 경우의 광학부를 나타낸 것이다.

본 고안에 있어서, 상기 광원은 주 파장대역이 400~450nm인 것인 특징으로 할 수 있으며, 특히 상기 광원은 LED(light emitting diode)인 것이 바람직하다. LED는 주 파장대역이 405nm로서, 작은 크기, 높은 변화효율 및 높은 스펙트럼 집중성이 장점이다. 본 고안에 있어서, 상기 광원은 주 파장대역이 430nm인 광원이 가장 바람직하나, 현재까지는 상기 파장대역의 고출력 광원이 시장에 존재하지 않는 문제로 인해, 차선책으로 405nm대의 LED가 현실적인 대안이라고 할 수 있다. 참고 로 405nm 대역에서의 흡수 효율은 430nm의 약 50%이다.

도 3은 광원이 405nm LED일때 광원의 각도에 따른 파워의 분포를 나타낸 것이다. 그래프에서 확인 되듯이 405 nm LED에서 나오는 빛은 큰 각도를 가지고 퍼짐을 알 수 있으며, 중심의 파워를 1이라 할 때, 세기가 1/2이 되는 각도는 ±60도로 확인된다. 이와 같은 큰 각도를 가지고 퍼지는 빛을 작은 크기의 시료에 전달하기 위해서는 발광계가 반드시 필요하며, 이러한 필요에 의에 발광계의 광원, 즉, LED의 출력광을 집속하기 위하여, 2매의 구면렌즈가 사용되는 것이 바람직하다.

도 4는 광원(405nm LED) 및 FRET 바이오센서를 포함하는 발광계를 시뮬레이션한 결과를 나타낸 것으로, 전술한 바와 같이, 상기 발광계는 광원의 출력광을 집속하기 위한 목적으로 2매의 구면렌즈를 포함하고 있다.

본 고안에 있어서, 주 분석 대상물이 액상인 것을 고려하여 상기 큐벳홀더는 형광측정 장치에서 범용적으로 사용되는 방법을 선택하여, 기존의 부품을 사용하는 방법이 가장 바람직하다. 일반적인 범용 형광 측정장치의 경우는 12.5mm x 2.5mm x 5mm인 직육면체 형태의 큐벳(cuvette)을 사용하고 있으며, 본 고안에서도 이와 동일한 크기의 큐벳을 사용하는 발광계를 고려하여 큐벳홀더를 구성하였다.

상기 큐벳은 직육면체 형태의 용기로서 FRET 바이오센서와 외부에서 주입되는 시료를 담기 위한 것으로, 일회용 큐벳을 사용하는 것도 가능하다.

상기 "FRET 바이오센서"는 형광공여체(fluorescent donor), 형광수여체(fluorescent acceptor) 및 리간드 결합단백질(binding protein, BP)로 구성되어, 타깃물질의 농도에 감응하여 FRET 신호를 발생시키는 원리를 기반으로 한다.

본 고안에서, "FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)"이란 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질들 사이에서 발생하는 비방사성(non-radiative) 에너지 전이현상으로, 여기(excitation)된 상태의 형광공여체의 여기에너지가 형광수여체로 전달되어 형광수여체로부터 발광(emission)이 관찰되는 현상이다(Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999).

본 고안에서, "형광공여체"란 FRET 현상에서 공여체로 작용하는 형광물질을 의미하고, "형광수여체"란 FRET 현상에서 수여체로 작용하는 형광물질을 의미하며, 형광공여체의 발광스펙트럼과 형광수여체의 흡광스펙트럼이 서로 중첩되어 FRET 또는 형광감소(quenching)를 유발할 수 있는 것이라면 어느 것이든 무방하다.

본 고안에서, "리간드 결합 단백질"이란 리간드의 결합에 의하여 구조적 변화를 일으키는 단백질들의 집합체를 의미하며, 여기에는 대장균 유래의 세포막간 결합단백질(periplasmic binding protein) 등을 포함한다. 여기서, "리간드"란 리간드 결합단백질에 결합하여 구조적인 변화를 일으키는 분자로, 당, 아미노산, 단백질, 지질, 유기산, 금속 또는 금속이온, 산화물, 수산화물 또는 그 컨쥬게이트, 무기 이온, 아민 또는 폴리아민, 비타민 등일 수 있다.

상기 FRET 바이오센서는 형광단백질인 ECFP(green fluorescent protein)와 EYFP(yellow fluorescent protein)를 각각 형광공여체와 형광수여체로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. ECFP와 EYFP는 바이오센서의 신호부(signaling domain)이며, 리간드 결합단백질은 감지부(sensing domain)로, ECFP와 EYFP를 리간드 결합단 백질의 양 말단에 융합시키는 "ECFP-BP-EYFP"의 구성으로 FRET 바이오센서를 구성할 수 있다 (한국등록특허 제739,529호 및 미국등록특허 제7,432,353호).

상기 FRET 바이오센서의 형광을 발생시키기 위해 필요한 여기광은, 형광공여체가 ECFP인 것을 고려하면 400~450nm의 파장대역인 것이 바람직하나, 여기광의 파장대역은 사용되는 형광물질의 종류에 따라 달라질 수 있다.

본 고안에서, "시료"란, 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 혈액, 세포, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 인체를 포함한 동물, 식물 장내 및 동물, 식물 조직 중 어느 하나 이상에서 수집된 것일 수 있으며, 특히, 액상인 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 시료로서 혈액, 소변 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 고안에 따른 수광계의 모듈은 다음과 같이 구성된다. 우선 큐벳에 함유된 FRET 바이오센서가 광원에 의해 여기되어 형광을 발생하면, 이 형광은 광분할기에 의하여 두 경로로 갈라져 진행한다. 이중 한 경로는 1차형광의 파장만을 통과시키는 대역통과필터(band pass filter, BPF)로부터 실리콘 광검출기(Si Photodiode, Si-PD)에 도달하여 전기신호로 바뀐다. 또한 두 번째 경로를 진행한 빛은 2차 형광 신호만을 통과시키는 대역파장필터로부터 실리콘 광검출기에 의해 전기신호로 바뀐다.

도 5는 대역통과필터 및 실리콘광검출기를 포함하는 수광계를 시뮬레이션한 결과를 나타낸 것이다.

광학부에 포함된 상기 수광계는 발광계에서 발생된 형광신호를 포집하여 평 행광신호로 변환시키는 대물렌즈; 상기 평행광신호를 분할하는 광분할기(beam splitter, BS); 상기 분할된 평행광신호 중 1차 형광의 파장만을 통과시키는 제1 대역통과필터(band pass filter, BPF), 상기 제1 대역통과필터를 통과한 1차 형광신호를 제1 광검출기로 집속시키는 제1 렌즈, 및 상기 제1 렌즈를 통과한 형광신호를 검출하는 제1 광검출기를 포함하는 제1 광검출 광학계; 및 상기 분할된 평행광 신호 중 2차 형광의 파장만을 통과시키는 제2 대역통과필터, 상기 제2 대역통과필터를 통과한 2차 형광신호를 제2 광검출기로 집속시키는 제2 렌즈 및 상기 제2 렌즈를 통과한 형광신호를 검출하는 제2 광검출기를 포함하는 제2 광검출 광학계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 고안에 있어서, 상기 광분할기는 큐벳으로 부터 방출된 형광의 광축에 대해 실질적으로 45°각도로 경사지게 배치되어, 상기 형광을 그 파장에 따라 50:50으로 투과 또는 직각으로 반사시키는 것이 바람직하며, 광분할기에 의해 반사되는 형광을 1차 형광신호로, 광분할기를 투과하는 형광을 2차 형광신호로 정의한다.

본 고안의 제1 광검출 광학계의 형광 파장대역은 465~510nm이고, 제 2광검출 광학계의 형광 파장대역은 520~560nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이는 FRET 바이오센서의 신호부가 ECFP와 EYFP인 경우에 해당하며, 바이오센서를 구성하는 복수 형광물질의 종류에 따라 형광 파장대역은 달라질 수 있다. 본 고안에서는 상기와 같이 두 종류의 형광 파장대역을 선정하고, 상기 각각의 파장대역 내에서의 형광값을 광검출기를 이용하여 전기적 신호로 측정하고, 결과적으로 측정된 신호로부터 분석 대상물의 농도를 계산할 수 있다.

본 고안에 있어서, 상기 광검출기는 실리콘 광검출기(Si Photodiode, Si-PD)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 실리콘 광검출기는 일반적으로 가시광선 영역의 빛을 검출하기 위하여 널리 쓰이는 소자로서, 가격이 저렴하여 경제적인 소형 형광 측정장치를 구현하기에 적합한 광검출기이다.

하우징은 상기 발광계와 수광계를 포함하며 외부의 빛에 의한 교란을 방지하기 위한 것으로, 직육면체 형상의 용기인 것이 바람직하다.

도 6은 본 고안에 따른, FRET 바이오센서를 이용한 고감도의 휴대용 형광 측정장치의 사진으로, 상술한 바와 같은 구성요소를 모두 포함하여 제작된 것이다.

이하 실시예를 통하여 본 고안을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 고안을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 고안의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아님은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. FRET 바이오센서의 준비

본 고안의 테스트를 위해 사용된 FRET 바이오센서는 이당류인 말토오스를 정량적으로 분석할 수 있는 바이오센서로서, 본 출원인들에 의해 선출원된 한국등록특허 10-0739529호에서 제시된 CMYB-LH/W62L센서이며, 상세하게는 다음의 방법에 의하여 준비하였다.

한국등록특허 10-0739529호에서 제작된, CMYB-LH/W62L 바이오센서가 발현 가능하도록 형질전환된 JM109(DE3) 대장균을 50㎍/ml의 ampicillin이 첨가된 LB 배지(1% bacto-trypton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하였다.

상기에서 배양시킨 대장균들은 50 ㎍/ml의 ampicillin이 첨가된 1 L의 LB 배지에 1%되게 접종하여 37℃에서 약 2 시간 정도 배양시켰으며, O.D. 600 nm에서의 흡광도가 0.5에 도달한 시점에 IPTG(isopropyl β-d-thiogalactopyranoside)를 0.5 mM 되게 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 단백질들의 발현을 유도하였다.

배양을 마친 균주들은 6000 rpm의 속도로 원심분리기(Supra22K, Hanil, Korea)를 이용하여 회수하였고, 20mM 인산염 완충액(pH 7.5)에 현탁시켜 초음파 분쇄기로 세포막을 파괴시켰다. 용해된 균주들은 다시 고속 원심분리기로 15000rpm에서 침전물을 제거하였고, 상층액만을 0.2㎛ 필터로 여과하여 이후의 정제과정에 사용하였다.

FRET 바이오센서들은 C-말단에 6xHis-tag이 융합된 형태로 발현되기 때문에 FPLC(fast-performance liquid chromatography)에 연결된 친화성 크로마토그래피 컬럼인 HisTrap^TM HP(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 이용하여 1차 정제를 하였고, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼인 HiTrap^TM Q HP(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 이용하여 2차 정제를 하였다.

정제를 마친 FRET 바이오센서는 20% 글리세롤이 포함된 PBS 완충액(pH 7.4) 에 10mg/ml의 농도로 농축하여 -70℃에서 보관하면서 하기의 실시예에서 사용하였다.

실시예 2. FRET 바이오센서의 형광 분석

실시예 1에서 준비된 FRET 바이오센서의 형광신호는 본 고안에 따른 휴대용 형광 측정장치를 사용하여 측정하였으며, 정제된 센서 단백질을 3 ml의 PBS 완충액(pH 7.4)에 0.2μM의 농도로 동일하게 조절한 조건에서, 405nm의 LED로 여기 시켜 발생되는 480nm의 ECFP 발광과 FRET에 의해 발생되는 ECFP의 형광(Blue)값과 FRET에 의해 발생되는 EYFP의 형광(Green)값의 비율인 Green/Blue ratio를 FRET 바이오센서의 형광신호로 정의하였다.

본 고안에 따른 형광 측정장치의 광검출기는 고감도 형광검출이 가능한 장비이나, 주위의 약한 빛에도 큰 영향을 받는 문제점이 있으므로, 이러한 문제를 피하고자, 여기광을 사각파 형태로 구동하여 형광신호를 다른 빛과 분리하였다.

도 7은 휴대용 형광 진단장치를 이용하여 여기광의 파형과 말토오스 측정용 FRET 바이오센서로부터 나오는 ECFP (Blue)와 EYFP(Green) 형광신호의 파형을 나타낸 것이다. 형광신호는 여기광이 켜진 경우와 꺼진 경우의 각각에 대하여 평균을 계산한 후, 두 값의 차를 이용하여 계산하였다. 이 방법은 전원 노이즈 및 기타 노이즈 성분을 효과적으로 제거하는 장점이 있다.

실시예 3. 형광신호의 여기광 세기 의존성 분석

여기광의 파워가 지나치게 큰 경우, FRET 바이오센서의 광탈색(bleaching)으로 인하여 형광신호가 감소하는 현상이 나타날 수 있다. 이러한 현상은 비가역적인 현상으로 시료의 상태를 영구히 변화시키게 되므로 FRET신호인 Green/Blue ratio가 어떻게 변화할지는 불분명하다. 따라서 FRET 바이오센서는 광탈색이 일어나지 않는 영역에서 사용하는 것이 바람직하다.

도 8은 휴대용 형광 측정장치를 이용하여 말토오스 측정용 FRET 바이오센서의 여기광 세기에 대한 형광신호의 세기 및 비율을 나타낸 결과이다. Channel A는 순수한 0.2μM의 말토오스 측정용 FRET 바이오센서로부터 측정된 ECFP(Blue)와 EYFP(Green)의 형광신호이고, channel B는 1 mM의 말토오스로 포화된 FRET 바이오센서의 ECFP(Blue)와 EYFP(Green)의 형광신호이며, Green/Blue ratio는 channel A와 channel B에서 측정한 ECFP(Blue)와 EYFP(Green) 형광신호의 Green/Blue ratio를 보여준다. 도 8에서 보면 FRET 바이오센서의 형광신호의 크기가 여기광의 크기에 정비례하고, 광탈색의 징후는 없음을 알 수 있었다. 도 8의 여기광 세기에 대한 각 형광신호의 기울기와 형광신호 및 형광신호의 비율의 선형성을 직선에서 벗어나는 양의 rms평균으로 계산한 값을 표 1에 나타내었다. 결과적으로 형광신호의 기울기는 두 시료의 경우 모두 2%이하의 rms편차를 가지는 좋은 선형성을 보인다. 또한 두 형광신호의 비율은 여기광의 세기의 변화에도 일정하며 rms 편차 0.7%이내에서 일정함을 관찰하였다. 이 결과로부터 형광신호의 비는 여기광의 영향을 받지 않고 말토오스의 농도에만 의존한다는 중요한 특징을 확인하였다. 따라서 Green/Blue ratio로 신호를 규격화하는 것이 FRET 바이오센서의 형광신호 분석에 적합함을 알 수 있었다.

휴대용 형광 측정장치로 분석한 FRET 바이오센서의 형광신호

시료	항목	ECFP(Blue) 신호기울기 (V/W)	EYFP(Green) 신호기울기 (V/W)	Green/Blue ratio
말토오스 FRET 바이오센서	평균값	7.65	1.62	4.73
말토오스 FRET 바이오센서	rms deviation	1.5%	2%	0.65%
1 mM 말토오스로 포화된 FRET 바이오센서	평균값	8.94	1.48	5.93
1 mM 말토오스로 포화된 FRET 바이오센서	rms deviation	1.45%	1.54%	0.52%

실시예 4. 형광 진단장비의 데이터모델 및 선형성

도 9는 휴대용 형광 측정장치를 이용하여 FRET 바이오센서의 말토오스 농도에 대한 EYFP/ECFP(Green/Blueo) ratio를 측정한 결과이며, Dose response curve모델을 사용한 fitting결과도 함께 나타내었다.

사용된 Dose-response curve의 수식(I) 및 fitting 상수는 아래와 같으며, fitting에는 데이터의 유효성을 고려하여 1μM~1mM 농도 범위만이 사용하였다.

(I)

A₁=6.150, A₂=9.157, log₁₀x₀=1.857, p=0.9352

위 식에서 A₂, A₁은 각각 말토오스의 농도가 0일 경우와 포화된 경우의 ratio이며, x₀는 EYFP/ECFP ratio가 50%에 해당하는 말토오스의 농도이고, p는 기울기로서 1또는 -1에 가까운 값임을 확인하였다. 이 모델의 타당성은 실험데이터와 모델에 의한 데이터가 벗어나는 양을 rms deviation으로 나타내어 평가할 수 있으며, 앞의 모델 변수에 대하여 0.4%의 값으로 계산되었다.

일반적으로 형광신호인 EYFP/ECFP ratio는 농도에 대하여 비선형성을 보이므로, Dose-response 모델을 사용하여 보정(calibration)하고, 이를 이용하여 측정된 EYFP/ECFP ratio로부터 수식(II)을 이용하여 계산하였다.

(II)

여기서 y는 측정된 EYFP/ECFP ratio이고, x는 말토오스의 농도이다. 앞의 데이터를 이용하여 보정에 사용된 말토오스의 농도와 EYFP/ECFP ratio에서 모델을 이용하여 얻어진 계산값의 차이분포를 가지고 측정값의 선형성을 평가할 수 있었다.

도 10은 말토오스의 농도에 대하여 모델에 의한 값과 보정에서 사용된 측정값을 그린 것이며, 형광 진단장치를 사용하여 측정한 FRET 바이오센서는 25μM~1mM의 말토오스 영역에서 좋은 선형성을 보임을 알 수 있었다.

이상으로 본 고안 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 고안의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 고안의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 고안에 따른 휴대용 FRET 형광측정 장치의 개념도이다.

도 2는 본 고안에 따른 휴대용 FRET 형광측정 장치의 광학부의 개략도이다.

도 3은 광원이 405nm LED일때 광원의 각도에 따른 파워의 분포를 나타낸 것이다.

도 4는 광원(405nm LED) 및 FRET 바이오센서를 포함하는 발광계를 시뮬레이션한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 대역통과필터(band pass filter, BPF) 및 실리콘 광검출기(Si Photodiode, Si-PD)를 포함하는 수광계를 시뮬레이션한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 고안에 따른 휴대용 FRET 형광측정 장치의 사진이다.

도 7은 시제품으로 제작된 휴대용 FRET 형광측정 장치의 여기광의 파형과 FRET 바이오센서로부터 측정되는 두 형광신호의 파형을 측정한 그래프이다.

도 8은 시제품으로 제작된 휴대용 FRET 형광측정 장치의 여기광의 세기에 따른 FRET 바이오센서의 두 형광신호의 변화 및 비율을 측정한 그래프이다.

도 9는 시제품으로 제작된 휴대용 FRET 형광측정 장치를 이용하여 말토오스 농도에 따른 FRET 바이오센서의 형광신호비(EYFP/ECFP ratio)의 변화를 측정한 그래프이다.

도 10은 도 9의 말토오스 농도에 따른 FRET 바이오센서의 측정값과 모델값을 비교한 그래프이다.

Claims (6)

1. 다음을 포함하는, 고감도의 휴대용 FRET 형광측정 장치:

   (a) (i) 광원 및 상기 광원을 이용하여 시료를 측정하는 FRET 바이오센서를 포함하는 발광계; 및 (ii) 상기 FRET 바이오센서로부터 시료 측정 후 형광신호를 통과시키는 대역통과필터(Band Pass Filter, BPF) 및 상기 대역통과필터를 통과한 형광신호를 검출하는 광검출기를 포함하는 수광계;를 포함하는 광학부;

   (b) 상기 광학부의 작용을 제어하기 위한 제어회로를 포함하는 제어부; 및

   (c) 상기 광학부 및 제어부에 전원을 공급하는 전원공급회로 및 배터리를 충전시키기 위한 배터리 충전회로를 포함하는 전원부.
2. 제1항에 있어서, 상기 광원은 주 파장대역이 400~450nm인 것을 특징으로 하는 휴대용 FRET 형광측정 장치.
3. 제2항에 있어서, 상기 광원은 LED인 것을 특징으로 하는 휴대용 FRET 형광측정 장치.
4. 제1항에 있어서, 상기 수광계는

   발광계에서 발생된 형광신호를 포집하여 평행광신호로 변환시키는 대물렌즈;

   상기 평행광신호를 분할하는 광분할기(beam splitter, BS);

   상기 분할된 평행광신호 중 1차 형광의 파장만을 통과시키는 제1 대역통과필터(band pass filter, BPF), 상기 제1 대역통과필터를 통과한 1차 형광신호를 제1 광검출기로 집속시키는 제1 렌즈, 및 상기 제1 렌즈를 통과한 형광신호를 검출하는 제1 광검출기를 포함하는 제1 광검출 광학계; 및

   상기 분할된 평행광 신호 중 2차 형광의 파장만을 통과시키는 제2 대역통과필터, 상기 제2 대역통과필터를 통과한 2차 형광신호를 제2 광검출기로 집속시키는 제2 렌즈 및 상기 제2 렌즈를 통과한 형광신호를 검출하는 제2 광검출기를 포함하는 제2 광검출 광학계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 휴대용 FRET 형광측정 장치.
5. 제4항에 있어서, 상기 1 광검출 광학계의 형광 파장대역은 465?510nm이고, 2광검출 광학계의 형광 파장대역은 520?560nm인 것을 특징으로 하는 휴대용 FRET 형광측정 장치.
6. 제4항에 있어서, 상기 광검출기는 실리콘 광검출기(Si Photodiode, Si-PD)인 것을 특징으로 하는 휴대용 FRET 형광측정 장치.

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