KR101320097B1 - 고유 형광 공명 에너지 전이용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따른 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치는, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부; 상기 광 조사부에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료 상에 입사하게 하는 대물 렌즈; 및 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부를 포함하며, 여기서 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합 부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이다.
Description
본 발명은 iFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징 방법에 관한 것이다.
유전체 칩 등의 바이오 칩의 형광 분석을 비롯한 다양한 생체 의학 분야에서 형광을 이용한 미세 시료의 상세 관찰을 위해 광학 장비인 형광(fluorescence) 현미경이 널리 사용된다. 형광 현미경은 마이크로 객체인 시료에 광을 조사하고, 조사된 광에 의하여 시료에서 여기(excitation) 및 형광 방출 과정을 거쳐 방출되는 형광을 포착하여 마이크로 객체의 이미지 등 정보를 관측하는 장치이다. 통상, 형광 현미경 이용시 측정 가능하게 하기 위해서는 측정되는 시료 상에 다양한 탐침자 또는 리포터가 삽입된다.
한편, 생명과학과 관련된 많은 분야에서 다양한 물질들이 생체 내 또는 외에서 생체 물질을 분석하기 위한 탐침자 또는 리포터로 활용되고 있다. 이러한 탐침자 또는 리포터 시스템은 크게 특정 기질 자체 또는 기질이 효소 반응에 의해 분해 또는 변형되어 나타나는 착색, 발색, 발광을 측정하는 방법과 형광이나 착색능을 지닌 물질 자체를 관찰하는 것으로 구분할 수 있다.
전자의 방법들은 목적하는 단백질에 융합된 형태로 단백질의 발현량, 프로모터의 세기 측정, 재조합 균체의 선별 등의 세포 내 관찰뿐만 아니라 웨스턴/노던 블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)등의 세포 외 관찰에도 활용되고 있으며, 대표적인 예로는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 크산틴옥시다아제(xanthine oxidase) 등의 효소와 기질로서 루미놀(luminol), 루시게닌(lucigenin), 아크리디늄에스테르(acridinium ester), 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디옥시제닌(dioxigenin) 등의 화합물이 이용되고 있다.
그러나, 이들이 세포 내에서 발현될 경우 생체 내 대사경로들을 교란시켜 성장을 저해하거나 세포사멸을 유도하는 등의 위험성이 존재하는 단점을 갖는다. 또한, 상기 효소들의 촉매 특성에 기인하는 문제뿐만 아니라 사용되는 기질의 낮은 안정성은 실험오차의 주요한 원인이 되며, 이들 대부분이 생물소재가 아닌 화학 합성물이기 때문에 세포에 유해할 수 있는 가능성이 있어 생체 내에서 지속적인 관찰이 어렵다는 단점도 상존한다. 따라서 전술한 탐침자 또는 리포터의 대부분은 생체 내 보다는 생체 외 탐침에 주로 이용되고 있다.
따라서, 상기 문제점을 개선하기 위하여 단백질 자체가 탐침자로서 작용하는 리포터에 관한 연구가 활발히 진행되었다. 단백질 자체가 탐침자인 대표적인 예로는 특정 파장의 빛을 받아 흡수하여 활성화된 형광단이 낮은 에너지를 지닌 정상상태로 되돌아가는 과정에서 방출되는 에너지가 빛의 형태로 나타나는 특성을 갖는 형광 단백질이 있다. 대표적인 예로는 해파리(jellyfish)인 Aequorea victoria로부터 유래한 녹색형광을 나타내는 GFP(green fluorescent protein)와, Discocosoma 종에서 유래한 DsRed(Discosoma red fluorescent protein)가 존재한다.
상기 형광 단백질은 기질이나 보조인자 없이 단백질 자체가 형광을 나타내기 때문에 전자의 경우처럼 대사교란 및 세포생리학적 인자들에 대한 간섭이 적어, 전자의 효소들이 활용되는 여러 탐침 분야와 그 외의 분야 즉, 효소 및 기질이 지닌 단점으로 인해 적용하기 힘든 분야에서도 활용이 가능하다. 특히 단백질이 특정 파장의 빛에 의해 생성하는 고유한 파장을 갖는 형광을 통하여 세포나 생물체를 파괴하지 않고 정상생리를 유지하는 살아있는 상태에서 특정 단백질의 이동과 활성 경로, 세포분열 및 분화과정 등과 같이 세포 내부에서 일어나는 복잡한 변화들을 직접 모니터링 하는 것에 있어 현존하는 어떠한 방법보다도 우수한 요소로 인정받고 있다.
또한, 단백질 공학 기술을 활용하여 야생형 형광 단백질과 다른 파장의 빛을 방출하도록 개량된 적색의 RFP, 노란색의 YFP, 청록색의 CFP, 청색의 BFP 등을 조합하여 활용하는 경우에는 여러 현상들을 동시에 관찰할 수 있으며, 다른 파장의 빛을 방출하는 형광 단백질들이 인접하거나 융합된 형태로 발현되었을 때 일어나는 FRET 현상을 활용하여 시료 내 특정 물질의 존재 여부 탐색, 단백질간의 상호작용 관찰 등의 연구 목적에 다양하게 활용 될 수 있는 장점을 갖는다.
한편, 형광 공명 에너지 전이란, 단파장 형광 단백질(shorter wavelength dye)인 에너지 공여체(donor)가 외부에서 에너지를 흡수하면 공여체의 여기에너지가 빛 에너지로 방출되는 대신, 소정의 거리 안에 위치한(<10 nm) 장파장 형광 단백질(longer wavelength excitation dye)인 에너지 수용체(acceptor)로 발광없이(radiationless) 전달되어, 수용체의 장파장 형광만이 방출되는 현상을 말한다. Miyawaki 등(Miyawaki et al., Nature, 1997, 388:882-887)은 FRET 원리를 이용하여 칼모둘린(calmodulin)과 칼모둘린 결합 펩티드(calmodulin-binding peptide)간의 상호작용을 분석하면서, 새로운 개념의 단백질 상호작용 분석 시스템을 개발하였다. 형광 단백질은 서로 다른 고유한 파장 영역의 빛을 흡수하여 여기(excitation)되며, 그 에너지가 빛 또는 열로 발산되고 나면 기저 상태로 회복되면서 형광단백질 마다 독특한 파장대의 빛을 발산(emission)하게 된다. 형광 공명에너지 전이 원리는 서로 다른 두 형광단백질이 10~100 Å 내에 있을 경우, 단파장 형광단백질이 여기된 후 방출하는 빛이 장파장 형광단백질의 여기를 유도하여 형광을 발산하는 현상이다. 즉 상호작용을 알아보고자 하는 두 단백질 뒤에 서로 다른 두 형광단백질을 각각 부착시킨 후, 단백질 상호작용에 의해 두 형광단백질이 10~100 Å 이내로 가까워졌을 때 일어나는 형광 공명에너지 전이 현상에 의한 형광을 탐지함으로써 단백질 상호작용을 분석할 수 있는 것이다.
예를 들면, 488 nm 파장의 빛으로 여기되는 형광단백질은 520 nm 파장대의 형광을 발산하게 되며, 이는 다시 짝을 이룬 다른 형광단백질을 자극하는 파장으로 작용하게 되고 630 nm 파장대의 형광을 발산하게 된다. 따라서 488 nm로 여기시키고 630 nm 파장대의 형광을 탐지함으로써 두 단백질의 상호작용을 분석할 수 있다. 이 시스템은 살아있는 세포내에서 단백질의 동적인 상호작용 분석이 가능한 장점이 있지만, 두 형광단백질의 거리가 매우 가까이 있어야만 탐지가 가능하고 미묘한 형광 파장의 변화를 감지하기 위해서는 단백질의 과량발현이 필요한 경우가 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 최근 단백질 고유 형광을 이용하려는 연구가 진행되어 아미노산 중 하나인 트립토판을 FRET에 응용할 수 있음이 보고되었고(Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4562-4588), 트립토판 결합 도메인 및 이를 검출할 수 있는 형광 부분을 이용하여 FRET를 측정하는 다중결합 트립토판 바이오센서 기술이 알려져 있다(미국공개특허 제2008/0311047호).
그러나, 현재까지 알려진 단백질 고유 형광을 이용한 FRET 기술에 사용되는 탐침들은 단백질 자체와 형광 분자의 발광 파장이 서로 중첩되어 불필요한 신호가 측정되어지고, 이로 인해 측정 결과의 민감도와 특이성이 저해되는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 광범위하게 활용되고 있는 탐침 시스템들이 갖는 근본적인 문제를 해결하고자 지속적인 연구를 수행한 결과, 단백질 고유 형광을 이용하는 새로운 형광 분자들을 확인하고, 이들을 표적 단백질 결합 부위와 결합한 탐침 시스템들을 개발하였으며, iFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 단백질 검출 또는 이미징 방법을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치; 및 본 발명에 따른 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치로서, 상기 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합 부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이고, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부; 상기 광 조사부에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료 상에 입사하게 하는 대물 렌즈; 및 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부를 포함하는, 현미경 장치를 제공한다.
상기 현미경 장치는 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)을 더 구비하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법으로서, 상기 iFRET용 탐침을 표적 단백질이 함유된 시료 내에 도입하는 제1 단계; 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 번갈아 제1단계에서 제조된 시료에 조사하는 제2단계; 및 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 제3단계를 포함하는 것이 특징인 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 iFRET용 탐침을 사용하면 기존의 FRET 방법과 달리 단백질 내의 아미노산을 형광 공여체로 사용하므로 표적단백질에 인위적인 표지(형광단백질 등)가 필요 없을 뿐 아니라, 하나의 형광물질만 사용하여도 되고, iFRET용 탐침은 단백질고유 형광과 분리된 발광파장을 가지므로 높은 특이성과 민감도를 가져, 다양한 단백질의 양, 활성 및 기작 등을 보다 쉽고 정확하게 분석할 수 있으며, 상기 표적 단백질과 관련된 질병의 진단 및 치료제의 개발에 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 현미경 장치를 사용하면, iFRET용 탐침이 결합된 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법을 용이하게 수행할 수 있으며; 본 발명에 따른 표적 단백질의 검출 또는 이미지화 방법에 의해, 표적 단백질의 양, 표적 단백질의 활성, 표적 단백질의 작용기전 또는 이동 경로를 확인 또는 추적할 수 있다.
또한, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 표적 단백질 함유 시료에 조사하여, 정확한 표적 단백질 정량 분석이 가능하고; 또한 일정간격으로 제1광 및 제2광을 번갈아 시료에 조사하면, 표적 단백질의 거동을 동영상으로도 관찰할 수 있다.
도 1은 본 발명의 제 1 실시예로서 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치에 대한 구성도,
도 2는 본 발명의 제 2 실시예로서의 현미경 장치에 대한 구성도,
도 3은 본 발명의 제 3 실시예로서의 현미경 장치에 대한 구성도,
도 4는 본 발명에 사용되는 시료 상에 내재되는 iFRET용 탐침을 통한 광 여기 및 발산 과정을 도시한 도면, 및
도 5는 본 발명의 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미징 과정을 시계열적으로 도시한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 제 2 실시예로서의 현미경 장치에 대한 구성도,
도 3은 본 발명의 제 3 실시예로서의 현미경 장치에 대한 구성도,
도 4는 본 발명에 사용되는 시료 상에 내재되는 iFRET용 탐침을 통한 광 여기 및 발산 과정을 도시한 도면, 및
도 5는 본 발명의 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미징 과정을 시계열적으로 도시한 순서도이다.
본 발명의 상기와 같은 목적, 특징 및 다른 장점들은 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예를 상세히 설명함으로써 더욱 명백해질 것이다. 기술되는 실시예는 발명의 설명을 위해 예시적으로 제공되는 것이며, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 iFRET용 탐침을 이용한 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치를 이루는 각 구성요소들은 필요에 따라 일체형으로 제조되거나 각각 분리되어 제조될 수 있다. 또한, 사용 형태에 따라 일부 구성요소를 생략하여 사용이 가능하다.
본 발명에서 "FRET"이란 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질 사이에서 발생하는 비방사성 (non-radiative) 에너지 전이현상으로, 여기(excitation)된 상태의 형광 공여체의 여기 준위 에너지가 형광 받게로 전달되어 형광수용체로부터 발광 (emission)이 관찰되거나, 형광 공여체의 형광감소(quenching)가 관찰되는 현상을 의미한다(Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999).
FRET은 일반적으로 형광 공여체로부터 방출되는 파장이 형광 수용체의 흡광스펙트럼과 겹치며, 광자(photon)의 출현 없이 발생하기 때문에 공명 에너지 전이라 하고, 이는 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 장거리쌍극자 상호작용에 의한 결과이다. FRET의 에너지전이 효율은 형광 공여체의 발광스펙트럼과 형광 수용체의 흡광스펙트럼이 겹치는 범위와 형광 공여체의 양자효율, 형광 공여체와 형광 수용체의 전이쌍극자들(transition dipoles)의 상대적 방향(relative orientation), 그리고 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 거리에 따라 달라진다. 따라서 FRET의 에너지전이 효율은 형광 공여체와 형광 수용체의 거리와 상대적 방향에 따라 다르게 나타나는데, Forster의 수식에 따르면 다음과 같이 표현된다.
E=R0 6 /(R6 +R0 6 ) [수식 1]
상기의 수식에서 E는 FRET 효율을 나타내며, R은 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 거리로서 형광 물질에 따라 차이는 있지만 통상 2-9 nm 이내로 정의된다. 또한 R0는 FRET 효율이 50%가 되는 형광 공여체와 형광 수용체 사이의 거리를 말하며, 일반적으로 Forster distance 또는 Forster radius로 불려진다. R0는 다음의 수식으로 표현된다.
R0=0.211[k 2 n -4 Q D J(λ)]1/6 (in Å) [수식 2]
상기의 수식에서 k 2 는 방향계수 (orientation factor)로 통상 2/3로 계산하며, 형광 공여체 발광과 형광 수용체 흡광의 상대적 방향에 따라 0~4 범위의 값을 갖는다. n은 매질의 굴절율로 통상 25℃의 물은 ~1.334이며, Qn는 형광 공여체의 양자효율이다. J(λ)는 형광 공여체의 발광과 형광 수용체의 흡광스펙트럼상의 겹침(overlap) 정도로 M-1cm-1nm4의 단위 값을 갖는다 (Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed., New York:Plenum Press, 1999; Patterson et al., Anal. Biochem. 284: 438, 2000; Patterson et al., J. of Cell Sci. 114: 837, 2001).
본 발명에서 "형광 공여체"는 단백질의 고유 형광을 발휘하는데 관여하는 아미노산이다. 대부분의 단백질은 고유 형광(intrinsic fluorescence)을 발휘하는데, 이때 방향족고리 구조를 갖는 아미노산들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 그 예로는 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 및 페닐알라닌(Phenylalanine) 등이 있다. 이러한 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌은 260 ~ 300 nm 파장의 빛에 의해 여기되어 290 ~ 400 nm의 파장의 빛을 발광하고, 그 빛이 440 nm 파장까지 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 "형광 받게" 및 "형광 수용체"는 혼용하여 사용되며, 단백질의 고유 형광에 의해 여기되어 발광하는 형광분자를 의미한다.
본 발명에 따른 iFRET용 탐침(155)은, 표적 단백질에 특이적인 결합 부위 또는 상기 결합부위를 갖는 분자(이하 '결합분자'로 약칭함, 156)와 iFRET 받게 기능을 갖는 형광분자(158)를 포함하며, 상기 결합분자와 형광분자가 직접 또는 링커를 통해 결합되어 있다. 상기 결합분자 부위는 iFRET용 탐침이 표적 단백질에 특이적인 결합을 하도록 유도한다(도 3 참조).
본 발명에 따른 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 형광분자(158)는 상기 단백질의 고유 형광을 나타내는 아미노산인 트립토판, 티로신 및/또는 페닐알라닌의 발광 파장인 300 ~ 400 nm의 빛에 의해 여기되는 것이 바람직하고, 단백질 고유 형광과 분리되는 파장인 450 nm 이상의 발광 파장을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
iFRET용 탐침이 발광하는 빛을 확인 또는 추적시 iFRET용 탐침이 발광하는 모든 영역의 파장대를 측정할 수 있으나, iFRET용 탐침이 방출하는 빛 중 450nm 또는 그 이상의 장파장의 빛을 측정하는 것이 바람직하다. 세포 혹은 조직(tissue)에는 260~400 nm의 빛에 의하여 형광을 내는 세포자가형광(cellular autofluorescence)물질인 핵산, NAD(P)H나 콜라겐, 혹은 세포단백질 등이 존재하며, 이들이 생성하는 형광 발광파장이 주로 300~450 nm에 걸쳐 존재한다. 따라서, 본 발명의 iFRET용 탐침은 세포 이미징에 사용되거나 세포추출물 혹은 조직염색(tissue staining)에 사용될 경우 이들의 간섭을 피하기 위하여 본 발명의 iFRET용 탐침은 발광영역이 450 nm 이상인 것이 바람직하다.
일례로, 본 발명에서 사용되는 iFRET용 탐침에서 단백질의 고유 형광에 대한 받게 기능을 갖는 형광분자(158)로 하기 화학식 I의 1-나프틸디아민 (1-naphthyldiamine)을 사용하는 경우, LED (light-emitting diode)에 효과적으로 검출 가능하여 형광탐침자로 사용될 수 있으며, 여기 파장이 340 nm 내지 380 nm이고, 발광 파장이 400 nm 내지 600 nm이므로 공지된 형광체와 비교하여 발광(emission) 파장대가 높아 세포의 자가 형광과 분리되어 측정될 수 있다.
[화학식 I]
한편, 본 발명에서 "시료"란, 표적 단백질을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 관찰 대상물을 의미하며, 표적 단백질 자체, 세포, 혈액, 뇨, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내, 동식물 조직 및 생물체 자체 중 어느 하나 이상에서 수집된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
표적 단백질에 본 발명에 따른 iFRET용 탐침을 처리하는 경우, 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 빛을 조사하여 발광하는 iFRET용 탐침을 확인하기 위해, 통상의 형광 물질 처리 조건을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 물, 완충용액, 탄소수 1 ~ 6의 저급알콜 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 매질내, 혹은 바이오칩이나 (극)미세입자 상, 혹은 세포나 조직(tissue)를 대상으로 수행되어질 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치 및 이를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법을 상세히 설명하기로 한다.
표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치(100)의 전체적인 구성 설명
먼저, 도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 현미경 장치(100)는 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부(110), 상기 광 조사부(110)에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료(150) 상에 입사하게 하는 대물 렌즈(140), 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부(160)를 포함한다. 시료(150)가 놓이는 시료 스테이지(152)는 x,y,z 3방향으로 운동을 함으로써 시료(150)의 3차원 구동을 가능하게 한다.
본 발명의 현미경 장치는 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제1 발광신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광을 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제2 발광신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 비율계량 모듈(170,ratiometric measurement module) 을 더 구비하는 것이 바람직하다. 비율계량 모듈(170)은 모듈 구동 및 계산용 프로그램을 구비할 수 있다.
광 조사부(110)로부터 생성된 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142)은 대물 렌즈(140)에서 집광되어 시료(150)로 전달되고, 시료(150) 내에서 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제1 발광(146)과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 제2 발광(146)은 인식부(160)에서 인식된다.
시료(150)에는 일반적으로 표적 단백질(154) 및 상기 표적 단백질에 결합된 iFRET 용 탐침(155)이 함유될 수 있다. iFRET용 탐침(155)은, 표적 단백질에 특이적인 결합 분자(156)와 iFRET 받게 기능을 갖는 형광분자(158)가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것으로, 상기 결합분자 부위는 iFRET용 탐침이 표적 단백질에 특이적인 결합을 하도록 유도하여, iFRET을 통해 표적 단백질의 정량이 가능하게 할 뿐만 아니라, iFRET용 탐침이 표적 단백질과 함께 이동하게 하여 표적 단백질의 거동을 확인할 수 있게 한다.
따라서, 제1 발광 신호값, 제2 발광 신호값 및 제3 발광 신호값은 시료의 2차원 각 지점에 대응되는 2차원적인 영상값일 수 있다.
한편, 본 발명은 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광(142a) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광(142b)을, 표적 단백질 및 이에 결합된 iFRET용 탐침이 함유된 시료(150)에 번갈아 조사하는 것이 특징이다.
iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)은 표적단백질 내 아미노산을 여기하지 아니하고 iFRET용 탐침의 형광분자를 직접 여기시키는 광이다.
비율 계량 모듈(170, ratiometric measurement module)은, 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출할 수 있다.
제3 발광 신호값은 측정시료(예: 세포, 검액 등)에 존재하는 iFRET용 탐침 (제2 발광 신호값)의 양에 대한 표적 단백질에 결합한 iFRET용 탐침의 양(제1 발광 신호값)의 비로서, 측정의 시간적 공간적 변화에 관계없이 늘 기준값(제2 발광 신호값)이 제공되어 표적단백질과 iFRET용 탐침의 결합을 정량화하는 것을 가능하게 한다. 또한, 비율계량법(ratiometric measurement)을 사용하면, 시료에 조사되는 빛의 량이 변해도 보정가능하다.
제3 발광 신호값은 다음과 같은 식에 의하여 계산될 수 있다.
제3 발광 신호값 = 제1 발광 신호값÷ 제2 발광 신호값 [수식 3]
비율 계량법에 따라 제2 발광 신호값을 기준값(reference)으로 사용하여 제1 발광 신호값의 세기를 제3 발광 신호값으로 환산함으로써, iFRET용 탐침의 편재화(localization)에 따른 측정오차를 최소화하며, 선명한 이미지를 얻을 수 있어서, 표적단백질의 양과 표적 단백질에 대한 약물결합의 정량적 측정, 표적단백질의 공간적 이동 추적 등이 가능하다.
제3 발광 신호값은 기존의 비율계량법(ratiometric measurement) 소프트웨어를 사용하여 계산될 수 있다.
광조사부(110)에서 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1광의 파장 범위는 260㎚ 내지 300㎚이고, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2광의 파장 범위는 300㎚ 내지 400㎚인 것이 바람직하다.
광 조사부(110)는, 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 교대로 조사할 수 있는 레이저 전원 조절장치일 수 있다.
도 2를 참조하여 본 발명의 제 2 실시예에 따른 현미경 장치(100')를 설명하면 다음과 같다. 하기에서는 제 1 실시예(100)와 비교하여 차별적인 부분에 대해서만 설명하고 동일한 부분에 대해서는 생략한다.
광 조사부(110)는, 도 2에 도시된 바와 같이, 광원(111); 및 상기 광원으로부터의 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 선택적으로 필터링하는 여기 필터 모듈(130, exitation filter module) 를 구비할 수 있다.
상기 광원은 Xe/Hg(크세논/수은) 램프일 수 있다. 수은 증기에 크세논 가스를 이용하는 방식의 메탈 할라이드 램프는 발광 효율을 높일 수 있고 소비전력을 20% 이하로 감소시킬 수 있다.
광 조사부(110)는 상기 광원으로부터의 광 일부를 반사를 통해 여기 필터 모듈에 안내하는 하나 이상의 제1 평행광 미러(121, collimate mirror)를 더 구비할 수 있다. 제1 평행광미러(121)는 제1 특정 파장값(>600 nm)보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제1 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시킴으로써 광원으로부터 필터에 대한 과도한 열전달을 차단함으로써 필터의 손상을 방지하며, 적외선 흡수필터 등으로 대체도 가능하다. 상기 제1 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장대인 것이다. 제 1 평행광 미러(121)는 광원(111)에서 생성되는 광범위한 파장의 광 중 본 발명에는 적용할 필요 없는 파장 영역을 1차적으로 제거한다. 즉, 600 nm이하 파장 대역의 광을 여기 필터 모듈(130)로 전송하게 한다.
여기 필터 모듈(130)은 복수의 광 윈도우(135,136)가 설치된 광 분리판(134), 제 1 평행광 미러(121)로부터의 반사 광을 수신하는 광 입수부(131), 및 광을 보내는 광 출수부(132)를 포함한다.
여기 필터 모듈(130)은 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142a)과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)을 선택적으로 투과시킬 수 있는데, 이는 광 분리판(134)을 주기적으로 회전구동하는 과정을 통해 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 투과하는 제 1 광 윈도우(135) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 투과하는 제 2 광 윈도우(136)가 광 유입부(131)와 광 배출부(132)를 연결하는 광로 상에 배치될 수 있다. 광 배출부(132)로 나오는 광 성분은 광 연결 라인(136)을 통해 광 노즐(138)로 토출될 수 있다. 광 연결 라인(136)은 플렉시블한 재질로 구성됨으로써 광 노즐(138)의 자유로운 위치 선정을 가능하게 한다. 혹은 적절한 방법으로 광배출부(132)와 제2 평행광 미러를 수평 배열하는 것도 가능하다.
대물 렌즈(140)는 시료(150)에서 방출되는 광을 집광하여 상을 형성하게 한다. 대물 렌즈(140)는 예를 들어, 석영 또는 fused silica 로 제조될 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 광조사부(110)로부터 대물렌즈(140)를 연결하는 광 경로 상에 제2 평행광 미러(125, collimate mirror)가 설치될 수 있다. 이때, 제2 평행광 미러(125)는 제2 특정 파장값 보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제2 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시키며, 상기 제2 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장이고, 검출하고자하는 iFRET 용 탐침에서 생성되는 발광의 파장대 보다는 단파장인 것이다. 제2 특정 파장값은 400nm이 바람직하며, 단백질의 흡수파장이 260~300nm, iFRET용 탐침의 흡수파장이 300~400nm 이고 iFRET용 탐침의 최종 발광파장이 400nm 이상이기 때문이다.
제2 평행광 미러(125)는 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광, 또는 둘다를 반사시켜 대물 렌즈(140)를 통해 제1광 또는 제2광을 시료에 입사시킬 수 있다. 한편, 시료에 조사된 제1 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 또는, 시료에 조사된 제2 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광은 제2 평행광 미러(140)를 투과하여 인식부(160)에 입사되어 각각 제1 발광신호 또는 제2 발광신호로 검출될 수 있다.
한편, 광 조사부가 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하는 경우, 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값(A1, A2, A3,…)과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값(B1, B2, B3,…)으로부터 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값(C1, C2, C3,…)이 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)에서 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되므로, 시간에 따른 표적 단백질의 위치, 양 또는 둘다의 변화를 확인할 수 있다. 따라서, 시간에 따른 표적 단백질의 변화가 동영상으로 산출될 수도 있다. 이로부터, 시간에 따른 표적 단백질의 세포내 위치와 공간적 이동, 양적변화, 활성변화, 약물의 결합정도, 또는 상기한 모든 변화를 확인할 수 있다.
그외에는 통상의 형광 측정법에 이용되어지는 기술, 예컨대 필터방식 및 모노크롬 방식의 형광분광기에 사용되는 기술이 적용될 수 있다.
도 3을 참조하여 본 발명의 제 3 실시예에 따른 현미경 장치(100'')를 설명하면 다음과 같다. 하기에서는 제 2 실시예(100')와 비교하여 차별적인 부분에 대해서만 설명하고 동일한 부분에 대해서는 설명을 생략한다.
본 실시예에서는 광원(111)으로부터의 광 일부를 반사를 통해 여기 필터 모듈(130)에 안내하는 제 1 파장선택미러(126, dichroic mirror)를 구비할 수 있다. 상기 제 1 파장선택미러(126)는 제1 평행광미러(121)와 동일하게 제1 특정 파장값(600 nm)보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제1 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시킴으로써 광범위한 파장의 광 중 본 발명에는 적용할 필요 없는 파장 영역을 1차적으로 제거한다.
여기 필터 모듈(130)의 광 배출부(132)를 통해 나오는 광 성분은 릴레이 렌즈 시스템(relay lens system,144), 제 2 파장선택미러(146), 대물 렌즈(140'), 및 제 3 파장선택미러(148)를 거쳐 인식부(160)에서 검출된다.
릴레이 렌즈 시스템(144)은 여기 필터 모듈(130)을 통해 필터링된 광을 제 2 파장선택미러(146), 또는 대물 렌즈(140')로 집중하게 한다. 제 2 파장선택미러(146)는 입사되는 모든 파장의 광을 반사한다.
대물 렌즈(140')는 시료(150)의 전단에 배치되는 제 1 대물 렌즈(141) 및 시료(150)의 후단에 배치되는 제 2 대물 렌즈(145)를 포함한다. 제 1 대물 렌즈(141)는 석영(Quartz) 또는 반사(reflecting) 대물 렌즈일 수 있고, 여기 작용을 용이하게 하도록 시료(150) 상으로 광을 집중하게 한다.
한편, 제 2 대물 렌즈(145)는 시료(150)로부터 나오는 광 성분 중 340nm 이상의 광을 투과하게 하는 동시에, 시료(150)의 확대를 가능하게 한다. 상기 제 2 대물 렌즈(145)는 fused silica 로 제조되는 것이 바람직할 수 있다.
제 3 파장선택미러(148)는 310nm 파장 이하의 광을 필터링하여 제거한다. 이를 통해 광원(111)으로부터 공급되는 과정 중에 잔존할 수 있는 불필요한 광성분을 제거함으로써 인식부(160)에서의 잔상을 최소화한다.
한편, 제 3 파장선택미러(148)를 거친 광이 인식부(160)에 도달하기 전에 별도의 배출 필터(emission filter,149)가 구비될 수 있다.
현미경 장치(100)를 이용한 세포 단백질
이미징
방법 설명
이하, 도 2, 도 4 및 도 5를 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 이미징 방법을 설명한다.
먼저, 광원(111)에서는 가시광선 또는 비가시광선을 포함한 전 영역의 광을 생성한다(S10).
생성된 광은 제 1 평행광 미러(121) 및 여기 필터 모듈(130)를 거치는 과정을 통해 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142a) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)으로 분리된다(S20).
상기 S20 단계에서 필터링으로 분리 선택된 파장의 광은 대물 렌즈(140)를 통해 집광된다(S30). 이 경우에 다양한 배율 조정을 통해 분해능을 향상할 수 있다.
대물 렌즈(140)에서 시료(150) 상으로 조사된 광 성분이 시료(150)에 내재된 iFRET 용 탐침(155)을 통해 여기되어 가시광 영역의 파장으로 발광한다(S40). 여기에서, 상기 iFRET 용 탐침(155)을 여기시키는 광은 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광(142a) 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광(142b)이 교대로 반복되는 것일 수 있다.
인식부(160)는 iFRET 용 탐침(155)에서 생성되는 발광 신호를 검출한다(S50). 인식부(160)는 CCD 카메라 모듈일 수 있다. 상기 CCD 카메라 모듈은 밀폐된 공간에 있는 집광 장치들의 배열을 가지며, 입사되는 광자 에너지의 패턴을 이산적인 아날로그 신호로 변환하게 한다.
표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값은 비율 계량법(ratiometric measurement)을 수행하여 제3 발광 신호값을 산출한다(S60).
본 발명에 따른 이미지화 방법은 자동화 워크스테이션에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
iFRET용 탐침과 관련하여, 동일자로 출원된 본 발명자의 한국출원(iFRET용 탐침 및 이의 용도) 은 본 발명의 명세서 일부로 통합된다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 첨부된 특허청구범위의 사상 및 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대한 다수의 변경 및 수정이 가능하며, 그러한 모든 적절한 변경 및 수정의 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야 할 것이다.
100 : 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치
110 : 광 조사부
120 : 평행광 미러
121 : 제 1 평행광 미러
125 : 제 2 평행광 미러
130 : 여기 필터 모듈
131 : 광 입수부
132 : 광 출수부
134 : 광 분리판
135 : 제 1 광 윈도우
136 : 제 2 광 윈도우
140 : 대물 렌즈
142 : 여기 파장
142a : 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광
142b : iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광
146 : iFRET 용 탐침에서 생성되는 발광
150 : 시료
153 : 공명 에너지 전이
154 : 표적 단백질
155 : iFRET 용 탐침
156 : 결합 분자
158 : 형광 분자
160 : 인식부
170 : 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)
110 : 광 조사부
120 : 평행광 미러
121 : 제 1 평행광 미러
125 : 제 2 평행광 미러
130 : 여기 필터 모듈
131 : 광 입수부
132 : 광 출수부
134 : 광 분리판
135 : 제 1 광 윈도우
136 : 제 2 광 윈도우
140 : 대물 렌즈
142 : 여기 파장
142a : 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광
142b : iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광
146 : iFRET 용 탐침에서 생성되는 발광
150 : 시료
153 : 공명 에너지 전이
154 : 표적 단백질
155 : iFRET 용 탐침
156 : 결합 분자
158 : 형광 분자
160 : 인식부
170 : 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)
Claims (16)
- 고유 형광 공명 에너지 전이(iFRET)용 탐침을 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 현미경 장치로서,
상기 iFRET용 탐침은 표적 단백질에 특이적인 결합 부위(binding site) 또는 상기 결합부위를 갖는 분자; 및 표적 단백질의 고유 형광(intrinsic fluorescence)에 대한 받게(acceptor)기능을 갖는 형광 분자가 직접 또는 링커를 통해 결합된 것이고,
표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하는 광 조사부;
상기 광 조사부에서 조사되는 광을 iFRET용 탐침이 도입된 시료 상에 입사하게 하는 대물 렌즈; 및
표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호와, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호를 검출하는 인식부;
를 포함하는,
현미경 장치.
- 제 1 항에 있어서,
표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 비율 계량 모듈(ratiometric measurement module)을 더 구비하는 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 2 항에 있어서, 제1 발광 신호값, 제2 발광 신호값 및 제3 발광 신호값은 시료의 2차원 각 지점에 대응되는 2차원적인 영상값인 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 1 항에 있어서, 제1광의 파장 범위는 260㎚내지 300㎚이고,
제2광의 파장 범위는 300㎚ 내지 400㎚인 것이 특징인,
현미경장치.
- 제 1 항에 있어서,
표적 단백질의 고유 형광을 발휘하는 아미노산은 트립토판(Tryptophan), 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(Phenylalanine) 또는 이들의 조합인 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 1 항에 있어서,
상기 광 조사부는,
광원; 및 상기 광원으로부터의 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광과 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 선택적으로 필터링하는 여기 필터 모듈(excitation filter module) 를 구비하는 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 6 항에 있어서,
상기 광원으로부터의 광 일부를 반사를 통해 여기 필터 모듈에 안내하는 하나 이상의 제1 평행광 미러(collimate mirror)를 더 구비하고,
제1 평행광 미러는 제1 특정 파장값보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제1 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시키는 것으로,
상기 제1 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장대인 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 6 항에 있어서,
상기 대물 렌즈는 상기 시료의 전단에 배치되는 제 1 대물 렌즈 및 상기 시료의 후단에 배치되는 제 2 대물 렌즈를 포함하며, 상기 제 1 대물 렌즈는 석영(Quartz) 또는 반사(reflecting) 대물 렌즈일 수 있고, 상기 제 2 대물 렌즈는 fused silica 대물 렌즈인 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 1 항에 있어서,
광조사부로부터 대물 렌즈를 연결하는 광 경로 상에 제2 평행광 미러(collimate mirror)가 설치되고,
제2 평행광 미러는 제2 특정 파장값보다는 장파장대의 광은 투과시키고, 상기 제2 특정 파장값보다 단파장대의 광은 반사시키는 것으로,
상기 제2 특정 파장값은 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광보다 장파장대이고, 검출하고자 하는 iFRET 용 탐침에서 생성되는 발광의 파장대 보다는 단파장인 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 9 항에 있어서,
제2 평행광 미러는 표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광, 또는 둘다를 반사시켜 대물 렌즈를 통해 제1광 또는 제2광을 시료에 입사시키고,
시료에 조사된 제1 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 또는, 시료에 조사된 제2 광으로부터 유래된 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광은 제2 평행광 미러를 투과하여 인식부에 입사되어 각각 제1 발광신호 또는 제2 발광신호로 검출되는 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 2 항에 있어서,
광조사부는 표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하는 것이고,
표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제1 발광신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의제2 광을 조사하여 iFRET용탐침에서생성되는제2 발광신호값으로부터비율계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값이비율계량 모듈(ratiometric measurement module)에서 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되어, 시간에 따른 표적 단백질의 위치, 양 또는 둘다의 변화를 확인할 수 있는 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 11 항에 있어서,
시간에 따른 표적 단백질의 변화는 동영상으로 산출되는 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 1 항에 있어서,
시료는 표적단백질 자체, 용액, 세포, 혈액, 뇨, 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내, 동식물 조직 또는 생물체 자체인 것이 특징인,
현미경 장치.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 하나의 항에 기재된 현미경 장치를 이용한 표적 단백질 검출 또는 이미지화 방법으로서,
상기 iFRET용 탐침을 표적 단백질이 함유된 시료 내에 도입하는 제1 단계;
표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 번갈아 제1단계에서 제조된 시료에 조사하는 제2단계; 및
표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값을 분석하여, 제1 발광 신호값과 제2 발광 신호값의 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값을 산출하는 제3단계;
를 포함하는 것이 특징인,
방법.
- 제 14 항에 있어서,
표적 단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광 및 iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 일정한 시간 간격으로 번갈아 조사하고,
표적단백질 내 아미노산을 여기하는 파장대의 제1 광을 시료 상에 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제1 발광 신호값과, iFRET용 탐침의 형광분자를 여기하는 파장대의 제2 광을 조사하여 iFRET 용 탐침에서 생성되는 제2 발광 신호값으로부터 비율 계량법(ratiometric measurement)에 의해 제3 발광 신호값이 일정한 시간 간격으로 산출되고 축적되어, 시간에 따른 표적 단백질의 변화를 확인할 수 있는 것이 특징인,
방법.
- 제 15 항에 있어서,
시간에 따른 표적 단백질의 변화는 동영상으로 산출되는 것이 특징인,
방법.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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