JP2002506521A

JP2002506521A - マイクロスコピーにおける蛍光共鳴エネルギー伝達の較正

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Publication number: JP2002506521A
Application number: JP50280299A
Authority: JP
Inventors: ユアン，ダグラス，シー．; シルヴァ，クリストファー，エム．; ビリナ，エドワード，ジェイ．; コールマン，ウィリアム，ジェイ．; ディルワース，マイケル，アール．; ヤン，マリー，エム．
Original assignee: カイロスサイエンティフィックインコーポレーテッド
Priority date: 1997-06-05
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2002-02-26
Also published as: US20020118870A1; US6661909B2; EP0987985A4; WO1998055026A9; CA2291730A1; WO1998055026A1; EP0987985A1; US6456734B1

Abstract

(57)【要約】エピ蛍光顕微鏡（１）内にてドナー分子とアクセプター分子との間で生ずる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の量を可視化し、定量化するための画像化ハードウエア、ソフトウエア、検量器および方法が提供されている。良く特徴づけられた蛍光ビードを標準として、放射測定的に較正された画像処理技術と関連させて、ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴスペクトル間のオーバーラップがこのマイクロＦＲＥＴシステムにより補償されるようになっている。このマイクロＦＲＥＴシステムは、正確に加工されたエピ蛍光キューブ（４）を提供し、これによりサンプルがドナーおよびアクセプター励起波長で照射されたとき（３）、正しい画像整合が維持されるようになっている。画像を擬似着色に着色し、ドナー（青）、アクセプター（緑）およびＦＲＥＴ（赤）からの放射測定的に修正された蛍光放射を表す画素を表示するアルゴリズムが開示されている。この方法は、ヒスチジン−タグによりＮｉキレート化ビードの表面に結合されたグリーン蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）の遺伝子的に工作された誘導体間でＦＲＥＴを示すサンプルについて実証されている。

Description

【発明の詳細な説明】マイクロスコピーにおける蛍光共鳴エネルギー伝達の較正連邦政府後援のリサーチに関する声明本発明は、連邦政府のエネルギー省の資金で少なくとも一部分案出した。連邦政府は、この発明の一定の権利を有することができる。優先権の請求本願は、１９７７年６月５日出願の米国特許出願第６０／０４８，６９６号と、１９９７年９月４日出願の米国特許出願第６０／０５７，９３１号とに対する優先権を米国特許法第１１９（ｅ）条に基づいて請求するものである。技術分野本発明は、一般に、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）に関し、さらに詳細には、ＦＲＥＴの較正基準に関する。背景蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）は、光子を伴わずに蛍光ドナー分子のエネルギーをアクセプター分子に伝達する非放射プロセスである。前記ドナー分子を励起すると、比較的長い波長のアクセプター分子の蛍光放射（即ち、増感アクセプター放射）が強まる。これに伴ってドナー蛍光放射の量子効率が減少する。エネルギー伝達の効率は、ドナーとアクセプターの間の距離に対する強い逆依存性を有するので、ＦＲＥＴはマイクロスコピーの貴重なツールになった。したがって、ＦＲＥＴの外観は、２つの分子の近似性の非常に明確なインジケータである。このことが、ＦＲＥＴ効率を、分子の距離を測定する「分光定規」として使用することにつながった。細胞を観察する通常のＦＲＥＴ実験は、特定の分子を蛍光染料で明確に分類すること、及び、前記色素を選定励起及び放射波長範囲にわたって検出すること、を伴う。一般に、当該範囲は、特定の発蛍光団の「チャンネル」と呼ばれる。蛍光分類は、細胞内分子の場合よりも細胞外分子の場合の方が行い易い。細胞内分子の場合、染料共役分子を細胞の中に注入して観察する必要があるか、又は、分類した分子を透過性固定組織の薄肉部位に重置することができるか、どちらかである。但し、最近、シフト励起及び放射スペクトルを伴う生の蛍光蛋白質（ＧＦＰ）突然変異体の可用性によって、ＧＦＰタグを細胞内マーカとして使って蛋白質と蛋白質の間の相互作用を測定することが可能となった。ＧＦＰタグ付き蛋白質キメラは、細胞内で表示され、蛍光になる化学処理を必要としない。また、ＦＲＥＴは、青の放射ＧＰＦ変体と緑の放射ＧＰＦ変体の融解物の間に発生することもある。ＦＲＥＴマイクロスコピーは、当該システムにおいて広域に使用される分析道具になる可能性を有するが、標準のエピ蛍光・マイクロスコピーによるＦＲＥＴの正確な定常測定は、以下を含む複数の制約によって阻止されてきた。即ち、 (1) スペクトル・オーバラップに起因するＦＲＥＴチャンネル中へのドナー（及び隔離されたアクセプター）蛍光放射のブリードスルー（Ｂｌｅｅｄ− ｔｈｒｏｕｇｈ）又はスピルオーバ（Ｓｐｉｌｌｏｖｅｒ）。スペクトル・オーバラップの補償には、修正係数を判定する正確な較正基準の使用が必要である。 (2) 画像位置合わせ。スペクトル・オーバラップのために画像中の各々のピクセルを修正するには、３つのエピ蛍光キューブ（即ち、ドナー放射、アクセプター放射、及び増感アクセプター放射）の各々で３つの分離画像を撮る必要がある。３つ全部のエピ蛍光キューブの表面が正確に平行でない場合には、画像位置合わせが失われ、また、その結果生じた幾何学的歪を修正する必要がある。画像位置合わせを失うと、修正手続きが非常に煩雑になり、修正データの精度全体が低下する。 (3) 増感放射によるＦＲＥＴの算出は、ＦＲＥＴ効率が低い場合、大きな不確実性を有する。 (4) 計測中にドナーを光漂白すると、サンプル中のＦＲＥＴの評価が異常に低くなる。上記制約は、ＧＰＦ以外に、その他の蛍光ＦＲＥＴペアにも適用する。細胞生物学者は、最近の「染色体ペインティング」の進歩のため、複数の染料に関する情報を同時に得るためにマルチバンドパスフィルタを利用するエピ蛍光顕微鏡に精通するようになってきている。当該機器の一部は、干渉法を採用し、その他の機器は、特定の励起バンドを選択するために励起経路中のフィルタホイールを使用する。いずれの場合も、一定の波長の励起によって次の最も赤い送信バンドから放射が生じることを前提とする。マルチバンドキューブは、分離可能な染料の画像位置合わせ問題を解決するのに役立つが、大型又は可変のストークスシフトを伴う蛍光現象を特定することはできない。ＦＲＥＴ放射チャンネルは、次の（比較的赤い）放射バンドではなく、したがって、ドナーの放射と識別することができないので、ＦＲＥＴを検出するためにマルチバンドシステムを使用することはできない。したがって、発明者は、近似画像位置合わせに対応するとともに、低いＦＲＥＴ効率と、光漂白と、スペクトル・オーバラップと、を最小限に押さえたり又は修正したりする改良型ＦＲＥＴシステムの必要性が存在すると判定した。本発明は、かかるシステムを提供する。要約この発明は、生物学的物質の初期画像であって、各々のピクセルが３つの色空間座標を有する、１組のピクセルで表示される前記初期画像を処理画像に変換する方法を提供する。この変換方法は、（ａ）初期画像中の少なくとも２つの画像領域であって、各々の画像領域が少なくとも１つのピクセルを含むとともに、前記２つの画像領域が少なくとも２つの識別可能なスペクトル範疇を限定する、前記２つの画像領域を選択するステップと、（ｂ）処理画像を生成するために、選択した画像領域の内の各々の画像領域における各ピクセルの色空間座標に基づいて、初期画像上で色空間変換を実施するステップと、（ｃ）色の改良空間分散の可視指示に対する処理画像を吟味するステップと、を含む。さらに、この発明は、生物学的物質の初期ＦＲＥＴ画像を修正ＦＲＥＴ画像に色空間変換する定量方法を提供するとともに、他の画像修正を応用することも含む。また、この発明は、ＦＲＥＴに対する１組の較正目標を提供する。この１組の較正目標は、（ａ）ドナー分子だけに結合する純粋なドナー目標と、（ｂ）アクセプター分子だけに結合する純粋なアクセプター目標と、（ｃ）ＦＲＥＴを呈示するドナー分子とアクセプター分子の混合物に結合するドナーとアクセプターの目標と、を含む。特定の実施例において、この１組の較正目標は、ヒスチジン− タグによるＮｉキレートビードの表面に結合したＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）の遺伝子工学派生物である。この発明の１つ以上の実施例の詳細を添付図面と以下の説明とに記載する。この発明のその他の特徴や目的及び長所は、以下の説明及び図面から、且つ、特許請求の範囲から、明白になるであろう。図面の説明図１ａは、本発明との併用に適合した空間相互位置合わせ電子画像を獲得するＦＲＥＴ画像形成顕微鏡の一実施例を示すブロック図である。図１ｂは、エピ蛍光・フィルタ・キューブの線図である。図２のパネルＡは、ヒスチジン−タグを介してキレートセファロースビードに装着したＢＦＰ１１（青）とＲＳＧＦＰ４（緑）蛋白質の蛍光励起（細線）と蛍光放射（太線）スペクトルを図示するものである。パネルＢは、キレートビードに結合したＢＦＰ１１とＲＳＧＦＰ４ＦＲＥＴペアの蛍光放射（太線）と、次に来るキレートビードからの脱離（細線）と、の間の比較である。図３は、ＭｉｃｒｏＦＲＥＴグラフィカルユーザインターフェースの出力であり、表１に記載のドナー、アクセプター、及びＦＲＥＴのエピ蛍光キューブを使って撮ったビード混合物の３つの白黒画像を図示するものである。この３つの画像は、スペクトル・オーバラップによって３つのビードタイプの間で完全に見分けがつくわけではないＲＧＢ画像を生成するために合成した。各ウインドウ：右下（Ｃ₁）、左下（Ｃ₂）、右上（Ｃ₃）、左上（ＲＧＢ）。図４は、赤緑青（ＲＧＢ）ディスプレイのカラー軸線の直交正規化である。このカラー修正アルゴリズムによって、カラー軸線が、従来のＲＧＢディスプレイ（左下）のドットの矢印から正規直交画像（右上）の固形軸線に再限定される。このプロセスによって、原色（赤、緑、青）が夫々３つのピクセル又はビードタイプ（ＦＲＥＴ、アクセプター、ドナー）に割り当てられる。したがって、図３に示すＲＧＢ素画像の貧弱な区分色（Ｆ、Ａ、Ｄ）を、直交正規化で純粋な赤（Ｆ'）、緑（Ａ'）、青（Ｄ'）に変換する。図５は、ドナーとアクセプターとＦＲＥＴの各ビードのスペクトル・オーバラップ修正と直交正規化を図示するものである。図６は、水平な黒線で表示したキレートビードの表面を図示するものであり、ＧＦＰドナーとアクセプター（例えば、ＢＦＰとＲＳＧＦＰ）を夫々青と緑の垂直線で図示している。考えうる６種類の相互作用をＡ〜Ｆに分類している。この図面では、隣接する分子だけを効率的なＦＲＥＴ距離の範囲内と見なす。図７は、ＧＦＰの青放射派生物（即ち、ＢＦＰ１１）と、赤シフト励起を伴う緑放射派生物（即ち、ＲＳＧＦＰ４）と、ＦＲＥＴにて効率的なＢＦＰ１１/ＲＳＧＦＰ４融解蛋白質と、を表すＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ感染のＳｆ９細胞を図示する１組の空間相互位置合わせカラーコード画像である。ドナーとアクセプターとＦＲＥＴの各信号は、選択候補Ｄ、Ａ、Ｆのピクセルに基づく定量ＭｉｃｒｏＦＲＥＴ画像形成システムによって、夫々、青と緑と赤に擬似着色されて分離したものである。図８のパネルＡは、蛋白質のヒスチジン−タグを介してＮｉ／ＮＴＡセファロースビードにキレートした青（ＢＦＰ１１）と緑（ＲＳＧＦＰ４）のＧＦＰ派生物の蛍光励起（細線）と蛍光放射（太線）の各スペクトルを図示するものである。当該スペクトルは、実質的に、溶液中の対応する純化蛋白質のスペクトルと判別不可能である。パネルＢは、ビードに結合したＢＦＰ１１／ＲＳＧＦＰ４ＦＲＥＴペアの蛍光放射（ドナーの波長３７０ｎｍで励起を伴う）（太線）と、イミダゾールを使った処理による次に来る脱離（細線）と、の間の比較である。図８に示すスペクトルによって、ＦＲＥＴビードからの蛍光放射がエネルギー伝達によるものであることが確認されるとともに、２つのＧＦＰ変体のスペクトル特性がＮｉ／ＮＴＡセファロースビードとの結合によって変化しなかったということが確認される。図９は、梗塞を含む心臓組織の薄肉の染色部位のヘマトキシリンとエオシン( Ｈ＆Ｅ)の各スライドを図示するものである。左のパネルは、４５０ｎｍと５５０ｎｍと６５０ｎｍのＨ＆Ｅ染色組織の３つの分離白黒画像を合成することによって生成した真カラー画像を図示するものである。右のパネルは、この発明による直交正規化後の前記画像を図示するものである。詳細な説明概説この発明は、エピ蛍光・マイクロスコピーに基づくＦＲＥＴ画像形成マイクロスコピーの新しいシステムを提供する。ＭｉｃｒｏＦＲＥＴシステムとして知られる好適な実施例では、スペクトル・オーバラップの修正ができるようにするために、正確に機械加工したエピ蛍光キューブを使用し、適正な画像位置合わせを維持する。また、ＭｉｃｒｏＦＲＥＴシステムは、高性能のセファロースビードに逆に拘束される蛍光蛋白質基準を利用する。また、新たに設計したソフトウェアは、ドナーとアクセプターとＦＲＥＴのピクセル情報の処理済ピクセル画像をディスプレイすることができる。タグ付きビードから得られる較正パラメータは、画像獲得の条件が同一である他の画像に応用することができる。また、この新しい設計によって一定のピクセル内で比較的少量のＦＲＥＴを検出することができるが、この理由は、算術修正が従来可能であった算術修正よりも非常に簡単（したがって、比較的正確）だからである。従来のマイクロスコピーを使った増感放射による細胞の定常ＦＲＥＴ画像形成は、従来、空間の精度を保ちながらスペクトル・オーバラップを修正することができないという痛手を受けた。現在まで、修正値を生成するために使用せねばならない３つのエピ蛍光キューブ（ドナー、アクセプター、及びＦＲＥＴ）は、厳密に平行でない光学表面で製造した。この欠点によって、画像を合成した後に画像に幾何学的歪（即ち、ピクセルの偏移）が発生する。この発明は、正確な公差に合わせて機械加工したエピ蛍光キューブを利用するので、画面全部に対して空間相互位置合わせが維持される。また、この発明は、較正基準として有用なビードを提供するので、スペクトル・オーバラップを修正することができ、ドナー放射とアクセプター放射とドナー増感アクセプター放射（ＦＲＥＴ）とをディスプレイする画像内で特徴を認定することができる。引き続き直交正規化アルゴリズム（「ピクセル純化」）を適用することによって、純正ドナーと純正アクセプターとＦＲＥＴの各ビードを夫々、青、緑、赤、に処理する。この処理は、３つの蛍光構成要素の各々の空間分布を判定しようとする細胞生物学者にとって有用である。従来のマイクロスコピーを使った増感放射に係わるもう１つの関心事は、励起光によってドナーを光漂白する場合があり、これによってＦＲＥＴ信号の見かけの強度が低下することであった。但し、この発明の増感放射技法は、高感度カメラを利用することによって、ＦＲＥＴ信号が約５％超の分だけ低下することはない。この発明は、共焦顕微鏡等の立体画像形成システムにおける定量ＦＲＥＴ技法を提供する。定量ＦＲＥＴマイクロスコピーの潜在的な用途は、殆ど無数にあり、細胞生物学の基本の機械的態様から新しい製薬の発見まで生物学における複数の学科分野にまたがる。この発明の装置とＦＲＥＴマイクロスコピーの改良方法によって、タグ付き蛋白質に係わる細胞生物学の実験（例えば、蛋白質と蛋白質の間の相互作用）が容易になり、その他に、薬の発見（蛋白質と小分子の間の相互作用）も容易になるが、この場合、２つの分子が相互作用する程度を定量化する必要がある。この発明は、立体画像形成に適用可能であって、その他に、体積要素を較正するソフトウェアも適用可能なビード基準を含む。ここで使用する技術用語と科学用語は、全部、特に定めない限り、本発明が属する技術の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。ここで記述した方法と材料に類似又は等価の方法と材料を本発明の実施又はテストに使用することができるが、適切な方法と材料を後述する。ここに述べた公報、特許出願、特許、及びその他の引例は、全部、そっくりそのまま引例によって含まれる。不一致の場合、限定を含む本願が統括する。また、ここに記述した材料と方法は、例示にすぎず、これに限定するものではない。この発明のその他の特徴と長所は、以下の詳細な説明と、図面と、特許請求の範囲と、から明白になるであろう。光学計装この発明の方法は、空間相互位置合わせ電子画像を獲得する光学装置を使用する。例えば、この光学機器は、顕微鏡とデジタルカメラでよい。この顕微鏡は、定常波長スキャニング蛍光顕微鏡でよい（即ち、時間解像式システムでもなく、干渉計を基本とするシステムでもない）。また、この光学機器は、バックグランド減算と、スペクトル・オーバラップ修正と、設定した３つのチャンネルから赤、緑、青の原色で限定した色空間へのデータ変換と、に対応することができる。このデータ変換によって、ＦＲＥＴとアクセプターとドナーの各ピクセルが比較的明瞭に区分されて、それに応じて擬似着色された強調画像が生成する。図１Ａは、本発明との併用に適合する空間相互位置合わせ電子画像を獲得するＦＲＥＴ画像形成顕微鏡の一実施例を示すブロック図である。この構造物は、顕微鏡１と、検出力メラ２と、光源３と、相互交換可能な３個１組のエピ蛍光キューブ４（ドナー、アクセプター、及びＦＲＥＴ）と、画像処理装置５と、画像出力装置６と、を含む。特定の実施例では、ＭｉｃｒｏＦＲＥＴ機器は、ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６０（直立）又はＩＸ７０（倒立）エピ蛍光顕微鏡１を基本とする。検出カメラ２は、顕微鏡１の三眼鏡ポートに結合したＫＡＩＲＯＳＰｅｌｔｉｅｒ冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（モデルＫ７、１６ビット、解像度７６０×５１０、又はモデルＫ８、１６ビット、解像度１３４０×１０３７）を使用する。顕微鏡に連結した検出カメラ２は、ＯｌｙｍｐｕｓＵ−ＰＭＴＶＣとＯｌｙｍｐｕｓＵ− ＳＰＴのリレーチューブ（２.５倍率の突起アイピースを格納）のＣマウントを介して作られている。この螺刻Ｕ−ＰＭＴＶＣマウントは、検出カメラ２を接眼鏡と同一焦点になるように調節することができる。本研究に使用するその他のハードウェアの構成要素には、１０倍率／０.４０の対物レンズ(Ｕプランアポ(Ａｐｏ)無限大／０.１７)が含まれる。励起照射の光源３は、顕微鏡１に直接連結した７５ワットのクォーツ・タングステン・ハロゲン（ＱＴＨ）の光源によって設けることができるが、所要に応じて他の光源を使うこともできる。露出時間は、検出カメラ２中の電子シャッターが制御する。通常の露出時間は、０.１５秒〜２秒である。画像中の低い光線量の使用は、露出時間と輝度を超感度のＣＣＤカメラで最小限度に抑えることによって、且つ、広域バンド放射フィルタと狭小バンド励起フィルタでエピ蛍光キューブ４を慎重に選択することによって可能となる。スペクトル解析アルゴリズムによって前記広域バンド放射フィルタが容易に修正される。図１Ｂは、エピ蛍光フィルタ・キューブ４の線図である。各々のエピ蛍光キューブ４は、励起フィルタ１０と、放射フィルタ１１と、ダイクロイックミラー１２と、を含む。励起フィルタ１０は、光源からの短い波長の光だけを通過させるバンドパス又はハイパスフィルタである。放射フィルタ１１は、波長が比較的短い励起光による照射に応じて被写体が放射した波長の長い光だけを通過させるバンドパス又はローパスフィルタである。ダイクロイックミラー１２は、励起光を被写体に反射させるとともに、次に、被写体から放射した光を通過させるビームスピリッタである。一般に、ダイクロイックミラー１２の「カットオン」波長は、簡単な構造において、励起フィルタ１０と放射フィルタ１１の各伝達バンドの間にある。この発明の方法は、正確な公差に合わせて機械加工したエピ蛍光キューブ４を使用するので、全ての画像に対して空間相互位置合わせが保たれる。また、この設計によって、一定の画像ピクセル内で比較的少量のＦＲＥＴを検出することができるが、その理由は、算術修正が、従来可能であった算術修正よりも非常に簡単（したがって比較的正確）だからである。エピ蛍光キューブ４は、このエピ蛍光キューブ中のダイクロイックミラーと放射フィルタの各々の２つの平坦面間の偏差が５アークセカンド未満なるように正確にフライス削りして製作している。このダイクロイックミラーと放射フィルタの各々の２つの平坦面間の低い偏差によって、高度な画像位置合わせが得られる。画像の位置合わせと歪は、ダイクロイックミラーと放射フィルタの各表面内の正確な表面平行度に非常に左右されるので、３つ全部のキューブのダイクロイックミラーと放射フィルタを、表面平行度の測定（オートコリメータを使用）と、表面の平坦度の測定（干渉計を使用）と、を行ったところ、ウェッジ平行度が１５アークセカンド以下であり、約１０ウェーブの平坦度であることが分かった。適切な特性を有するエピ蛍光キューブは、２ウェーブ未満の平坦度で５アークセカンド未満のウェッジという仕様に合わせてＣｈｒｏｍａＩＮＣ.（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｅ，ＶＴ）が製造した。比較的低品質のエピ蛍光キューブは、ソフトウェアに組み込んだ焦点合わせ/位置合わせ獲得ループを使って実行時間中に各画像を相互位置合わせするために、ドナー（Ｄ）とアクセプター（Ａ）とＦＲＥＴ（Ｆ）の各キューブと併用して光学センタリング調整（ＯＣＡ）装置（Ｏｌｙｍｐｕｓ製，Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）で修正することができる。目標は、３つ全部のチャンネル中で可視であるとともにこの３つのチャンネル間の相互位置合わせにおける１つのピクセルに位置合わせした蛍光ビード（サイズ＝ポイントソース）でよい。これは、ＦＲＥＴに対する斬新なＯＣＡ使用法である。表１に、好適なエピ蛍光キューブの仕様を記載している。Ｃ₁チャンネル（任意に青に割り当て）は、ドナー（Ｄ）放射を選択的に励起させて画像形成するように図るものであり、Ｃ₂チャンネル（任意に緑に割り当て）は、アクセプター（Ａ）放射を選択的に励起させて画像形成するように図り、Ｃ₃チャンネル（任意に赤に割り当て）は、ＦＲＥＴ（Ｆ）放射を可視化するように図るが、この理由は、励起がドナー励起のときであったからであり、且つ、励起がアクセプター放射のときに画像形成したからである。従来のエピ蛍光キューブは、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｍａｇｉｎｇＭｉｃｒｏ−Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＦＩＭＳ）テクノロジーに置換したり、又は３個１組の固定波長装置を使用しないほかの方法に置換したりすることができる。ＦＩＭＳにおいては、放射フィルタは連続的に可変であり、励起波長をモノクロメータ等の別の装置で選択することができる。ＦＩＭＳテクノロジーの説明は、本発明の譲受人に譲渡された「ＯｐｔｉｃａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＨａｖｉｎｇａＶａｒｉａｂｌｅＯｐｔｉｃａｌＦｉｌｔｅｒ」と称する１９９８年２月１０日出願の米国特許出願第０８／８３３，３５１号に記載している。画像処理装置５は、適切にプログラム化したパーソナルコンピュータでよい。画像出力装置６は、コンピュータモニター（例えば、ＣＲＴ又はＬＣＤディスプレイ）又はプリンタでよい。操作においては、照射サンプルの白黒画像を顕微鏡１を介して検出カメラ２で撮り、デジタル化したピクセル画像として画像処理装置５に入力する。次に、各チャンネル（ドナー、アクセプター、及びＦＲＥＴ）からの３個１組の当該画像を３つの空間相互位置合わせ画像として処理したり、又は、各々のピクセルが白黒の波長に対応する３つの色空間座標を有する単一画像として処理したりすることができる。この発明の方法は、エピ蛍光顕微鏡に限定するものではない。マイクロタイタ・トレイ又はペトリディッシュ（生物学）又はソリッドステートデバイス（物質科学）等の巨視的視界にわたってＦＲＥＴ検出と定量を得るために、巨視的レンズを基本とするシステムを顕微鏡の対物レンズの代わりに使用することができる。ＦＲＥＴ自然科学ＦＲＥＴを説明する基本的な等式であるフォースター等式は、エネルギー伝達率定数（κ_t）の式と、伝達効率（Ｅ）の式と、いわゆるフォースター半径又は臨界距離（Ｒ_o、単位ｃｍ）の式と、スペクトル・オーバラップ積分（Ｊ（λ））の式と、ドナーの正規化蛍光放射スペクトル（Ｆ（λ））の式と、を含む。ｒは、ドナーとアクセプターの発色団間の中心から中心までの距離（単位ｃｍ）であり、τ_dは、エネルギー伝達が無い場合のドナーの蛍光寿命であり、κ²は、双極子から双極子の配向係数であり、Ｑ_Dは、アクセプターが無い場合のドナーの蛍光量子収量であり、ｎは、中間媒体の屈折率であり、Ｆ_D（λ）は、一定の波長λ（単位ｃｍ）のドナーの蛍光放射輝度であり、∈_A（λ）は、アクセプター発色団（単位ｃｍ^-1Ｍ^-1）の消衰係数である。したがって、Ｊ（λ）は、ドナーの正規化蛍光スペクトルを表すとともに、Ｍ^-1ｃｍ³の単位を有する。距離ｒの分だけ分離した、無作為に配向した分子の場合、ｒ＝Ｒ_oのとき、エネルギー伝達の効率は５０％であり、ドナー蛍光の寿命は、２分の１だけ減少する。Ｒ_oの値は、約１０オングストロームである。ＦＲＥＴ効率は、Ｒ_oで正規化された距離の６乗に反比例して下がる。ドナー分子とアクセプター分子の間の距離をＲ_oから２Ｒ_oに２倍にすると、ＦＲＥＴ効率は、６乗に反比例する依存関係、即ち（０.５）⁶、のために５０％から約１％に減少する。したがって、ＦＲＥＴは、２つの分子が近似しているか否かの判定を行う非常に有用なツールである。このことは、分子の半径が蛍光タグの実Ｒ_o値とサイズが類似する相互作用する巨大分子の場合に特に当てはまる。ドナー放射がアクセプターによって消光される程度は、ＦＲＥＴ効率をフォースター等式の内の１つの等式にしたがって算出するために使用することができる。即ち、ここで、Ｉ_DとＩ_DAは、夫々、アクセプターが無い場合と、アクセプターが有る場合と、のドナーの蛍光輝度である。これは、ドナーの総濃度で除算した、ＦＲＥＴを実行するドナーの濃度を求めることに等しい。大部分の細胞生物学者にとって有用な計測は、カラーコード画像内のＥからＲまでの関係である。この発明は、Ｅをドナーとアクセプターの間の距離（Ｒ）に変換する簡単なモデルを提供する。スペクトル・オーバラップの修正一実施例においては、発明力のある方法によってドナーとアクセプターの各チャンネル間のスペクトル・オーバラップを修正する（選択した励起と放射の波長範囲、上記参照）。このスペクトル・オーバラップ修正の数学原理を以下のように述べる。即ち、（７）ここで、Ｘは、「Ｄ」、「Ａ」、又は「Ｆ」に置き換えることができ、ドナー、アクセプター又はＦＲＥＴの各チャンネルを夫々介して獲得した白黒蛍光画像の内の１つの画像から画像ピクセルを表示する。下付き文字「ｕ」は、「ｄ」、「ａ」又は「ｆ」に置き換えることができ、画像中のドナー、アクセプター又はＦＲＥＴビードのいずれかのピクセルを表す。実質的なスペクトル・オーバラップがあるので、２つ以上のビードタイプを各々の未処理チャンネル中に見出すことができる（図３）。以下の等式（８）と（９）における上付き文字「ｙ」は「ｂ」に置き換えられ、スペクトル・オーバラップ修正を実施する前に白黒画像をバックグランド減算したことを表示する。 - ＝各々の白黒画像上のバックグランド減算後の「純正ドナー」ピクセルの場合、ＦＲＥＴチャンネル輝度のドナーチャンネル輝度に対する比率。（８）- ＝各々の白黒画像上のバックグランド減算後の「純正アクセプター」ピクセルの場合、ＦＲＥＴチャンネル輝度のアクセプターチャンネル輝度に対する比。（９）上記比率は、夫々、ＦＲＥＴチャンネル中へのドナーとアクセプターの分数「ブリード」又はスペクトル・オーバラップである。次に、当該比率を、ＦＲＥＴチャンネルピクセル輝度を修正するために使用する。修正したＦＲＥＴチャンネル画像（Ｆ^C）中の各々のピクセルは、以下の式で表示する。即ち、バックグランドとスペクトル・オーバラップを修正した白黒画像を各チャンネル毎に得た後、３つの画像を合成ＲＧＢ画像に組み込んで、修正したＦＲＥＴ画像を生成する。この例示した実施例では、アクセプターブリードの場合、ドナーチャンネルを修正せず、ドナーブリードの場合、アクセプターチャンネルを修正しないが、その理由はいずれの効果も極小だからである。スペクトル・オーバラップの修正は、次のように行う。即ち、バックグランド修正後の「純正ドナー」ピクセルの場合、ＦＲＥＴチャンネル輝度のドナーチャンネル輝度に対する比率を求める。また、バックグランド修正後の「純正アクセプター」ピクセルの場合、ＦＲＥＴチャンネル輝度のアクセプターチャンネル輝度に対する比率を求める。次に、上記比率を、各ピクセル毎にＦＲＥＴチャンネル値を修正するために使用する。直交正規化一実施例において、この方法は、ドナーとアクセプターとＦＲＥＴの各信号を固有の色に変換するために直交正規化を使用する。例えば、ドナーとアクセプターとＦＲＥＴの各信号をＢ（青）、Ｇ（緑）、及びＲ（赤）に変換する。修正画像を質的に強調させる直交正規化の手順は、後述する。上述したスペクトル・オーバラップアルゴリズムに加えて、直交正規化変換に基づくＲＧＢ画像の構築によって更に画像を強調することができる。このプロセスによって、ＦＲＥＴ、アクセプター、及びドナーの各ピクセルが、夫々、赤、緑、及び青の純粋な原色によって擬似着色される。これを行うために、前回処理した白黒画像の各々から選択したピクセル値を、Ａ行列と呼ばれる３×３行列を構築するのに使用することができる。即ち、［Ａ］の縦列は、前回処理した３つの白黒画像を表し、横列は、選択ピクセルを表す。例えば、Ａ₁₁は、ＦＲＥＴビードの位置に相当するＦＲＥＴ画像中のピクセル値に等しい。Ａ₁₂とＡ₁₃は、夫々、この同じ位置におけるアクセプターとドナーの各画像中のピクセル値に等しい。直交正規化演算の目標は、Ａ行列を以下の行列に変換することである。即ち、ここでＣ₁₁、Ｃ₂₂、及びＣ₃₃は、考え得る最大ピクセル値に設定している。この変換は、以下のように表記することができる。即ち、［Ａ］［Ｂ］＝［Ｃ］（１３）［Ａ］と［Ｃ］が分かると、等式（１３）の両辺をＡの逆行列で乗算することによってＢ行列を求めることができる。即ち、［Ａ］^-1［Ａ］［Ｂ］＝［Ｂ］＝［Ａ］^-1［Ｃ］（１４）Ａ行列は、選択したピクセルが独立軸線を限定することを条件にして反転させることができる。一旦、Ｂ行列が求められると、各々のＲＧＢピクセル値三つ組をＢ行列で乗算し、新しい三つ組を求める。この変換で一部のグレー値がマイナスになる場合があるので、当該グレー値の絶対値を常用する。また、この変換でグレー値が考え得る最大値を超過する場合もある。したがって、ＲＧＢ画像中の最大グレー値が考え得る最大グレー値に等しくなるように新しいグレー値を全部基準化する。これでこの純化プロセスは完了する。直交正規化は、プロセスステップの点で以下のように実施することができる。即ち、 (1) 初期画像中の少なくとも２つの画像領域であって、各々の画像領域が少なくとも１つのピクセルを含むとともに前記少なくとも２つの画像領域が少なくとも２つの識別可能なスペクトル範疇を区画する、前記少なくとも２つの画像領域を選択すること。 (2) 処理画像を生成するために、選択した前記画像領域の各々におけるピクセルの色空間座標に基づいて前記初期画像上で直交正規化等の色空間変換を実施すること。（所望により、直交正規化を動的シリーズの初期画像上で順次実施することができ、又は、一連の収集デジタル画像を全部同時に修正することができる。） (3) カラー改良空間配分の可視表示のために前記処理画像を評価すること。この評価ステップは、既知の標準目標に適正に分離する前記カラー改良空間配分を基本にしたり、又は、生物学的構造に分離する前記カラー改良空間配分を基本にしたりすることができる。立体空間情報を観察するためには、共焦顕微鏡を使用して上記評価を実施することが望ましい。この直交正規化ステップは、ドナー、アクセプター、及びＦＲＥＴの代表として候補ピクセルを繰り返し選択する場合がある細胞生物学者にとって有用である。この人的介在は、画像からデータを抽出する際の重要な要素であり、この結果生じた擬似着色画像の形態によってピクセル選択の質が評価される。例えば、ＦＲＥＴがスペクトル・オーバラップ修正後に特定の構造内で観察される場合、候補の「赤」ピクセルを再選択することによってこの構造内の各種ピクセルをテストすることが有利である。上記アルゴリズム方法（画像形成を伴うか否か）は、フローシステムにおけるフロー血球計算（イメージング・イン・フロー法を含む）又は細胞選別に適合できる。定量ＦＲＥＴ測定一実施例において、この発明の定量方法は、定量ＦＲＥＴ測定と分析を行う。ＦＲＥＴ画像データは、蛍光顕微鏡中の標準フィルタセットで得られる。定量ＦＲＥＴの１組の等式を後述する（等式１５Ａ〜等式３０）。当該等式は、ここでは引用で含めるＧｏｒｄｏｎらのＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲｅｓｏｎａｎｃｅＥｎｅｒｇｙＴｒａｎｓｆｅｒＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓＵｓｉｎｇＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ、第７４巻、１９９８年５月、２７０２：２７１３に記載のＦＲＥＴ修正等式と類似する又は前記ＦＲＥＴ修正等式から得られるものである。前記等式に使用する２つの文字記号と３つの文字記号は、以下の意味を有する。即ち、Ａａは、アクセプターフィルタセットによるアクセプターのみの試料からの信号である。Ｄｄは、ドナーフィルタセットによるドナーのみの試料からの信号である。Ｆａは、ＦＲＥＴフィルタセットによるアクセプターのみの試料からの信号である。Ｆｄは、ＦＲＥＴフィルタセットによるドナーのみの試料からの信号である。Ａｄは、アクセプターフィルタセットによるドナーのみの試料からの信号である。Ｄａは、ドナーフィルタセットによるアクセプターのみの試料からの信号である。Ｄｆは、ドナーフィルタセットによる「アクセプタープラスドナー」試料からの信号である。Ｆｆは、ＦＲＥＴフィルタセットによる「アクセプタープラスドナー」試料からの信号である。Ａｆは、アクセプターフィルタセットによる「アクセプタープラスドナー」試料からの信号である。Ｄｆｄは、ドナーとアクセプターの両方が存在するときのドナーフィルタセットによるドナー信号のみを指す。Ｄｆａは、ドナーとアクセプターの両方が存在するときのドナーフィルタセットによるアクセプター信号のみを指す。Ｆｆｄは、ドナーとアクセプターの両方が存在するときのＦＲＥＴフィルタセットによるドナー信号のみを指す。Ｆｆａは、ドナーとアクセプターの両方が存在するときのＦＲＥＴフィルタセットによるアクセプター信号のみを指す。Ａｆｄは、ドナーとアクセプターの両方が存在するときのアクセプターフィルタセットによるドナー信号のみを指す。Ａｆａは、ドナーとアクセプターの両方が存在するときのアクセプターフィルタセットによるアクセプター信号のみを指す。合のドナーフィルタセットによるドナー信号を指す。クセプターフィルタセットによるアクセプター信号を指す。以下の等式に使用するＦＲＥＴ記号は、次の意味を有する。即ち、ＦＲＥＴ１は、３フィルタセットを使用する方法においてドナーフィルタセットによるＦＲＥＴに起因するドナー信号の損失である。度である。ｆｄ×Ａｆａ）はＦＲＥＴＮに等しい。ＦＲＥＴ４は、２フィルタセットを使用する方法においてドナーフィルタセットによるＦＲＥＴに起因するドナー信号の損失である。Ｇは、ドナーフィルタセットにおけるＦＲＥＴに起因のドナー放射の損失をＦＲＥＴフィルタセットにおけるＦＲＥＴに起因のアクセプター放射の利得に関連付ける係数である。なお、２フィルタシステムにおいて、以下の代入を行うことができる。即ち、Ｄｄ'は、Ｄｄに類似するが、アクセプター濃度はドナー濃度に比例する。Ｆｄ'は、Ｆｄに類似するが、アクセプター濃度はドナー濃度に比例する。Ａｄ'は、Ａｄに類似するが、アクセプター濃度はドナー濃度に比例する。Ｄａ'は、Ｄａに類似するが、アクセプター濃度はドナー濃度に比例する。Ｆａ'は、Ｆａに類似するが、アクセプター濃度はドナー濃度に比例する。Ａａ'は、Ａａに類似するが、アクセプター濃度はドナー濃度に比例する。Ｆ^Cの追加修正を以下の等式１５Ａ〜３０から得ることができるが、ここで、等式（１０）を、等式（１５）として上記で定めた条件で書き直す。即ち、Ｆ^C＝Ｆｆ−Ｄｆ（Ｆｄ／Ｄｄ）−Ａｆ（Ｆａ／Ａａ）（１５）特に、Ｆ^Cは、（１）アクセプター放射チャンネルを介したドナー蛍光の検出及び/又はドナー放射チャンネルを介したアクセプター蛍光の検出、によって生じるクロストークの場合に修正することができ（例えば、ＡｄとＤａの非ゼロ値の場合に修正できる）、（２）望ましくは１／Ｄｆの修正を適用することによってドナーの濃度に対して正規化することができ、（３）望ましくは１／ＡＦの修正を適用することによってアクセプターの濃度に対して正規化することができ、（４）望ましくは１／（Ｄ_f×Ａ_f）の修正を適用することによってドナーとアクセプターの濃度に対して正規化することができ、（５）クロストークの場合に修正できるとともに正規化することができる。また、初期のＦＲＥＴ画像は、感度の良いカメラと早い露出時間とを使うことによって光漂白に関して改善される。較正基準としてのＦＲＥＴビードこの発明は、広域に使用されるＦＲＥＴペアに適用可能な各種「ＦＲＥＴビード」を含む１組の較正目標を提供する。また、この発明は、従来の３チャンネル（即ち、３キューブ）エピ蛍光・マイクロスコープにおけるＦＲＥＴ基準を画像形成する方法であって、ドナー濃度［Ｄ］、アクセプター濃度［Ａ］、及びＦＲＥＴ効率［Ｅ］の各値を未知のサンプル上で求めることができるようにＦＲＥＴ較正アルゴリズムを適用する方法を提供する。溶液を基本とする技法よりもむしろＦＲＥＴカリブラント（Ｃａｌｉｂｒａｎｔｓ）のようなビード等の表面を使用する利点は、ビード等の表面を使用すると、シングレット−シングレット消滅 (ｓｉｎｇｌｅｔ−ｓｉｎｇｌｅｔａｎｎｉｈｉｌａｔｉｏｎ)等の物理化学に係わる各種現象による不快な干渉が無くなるということにある。その他の効果は、励起子が形成されるにつれて表面上のＦＲＥＴを強調させる場合がある。この発明は、一実施例において、ドナー分子とアクセプター分子の間、例えば、青発光（ＢＦＰ）と緑発光ＧＦＰの各派生物間、に効率的なＦＲＥＴが得られるくらい高い表面濃度で、Ｎｉ／ＮＴＡ派生（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）セファロースビードにヒスチジン−タグ付きＧＦＰ派生物付きＦＲＥＴビードを提供する。当該ＦＲＥＴビードは、水溶液（摂氏４度で数ヶ月間安定）中に当該ヒスチジン−タグ付き蛋白質を非常に堅固に係合（拘束）する表面を提供するが、但し、イミダゾールを添加することによって直ちに蛋白質を解離させてビードから脱離させることができる。ビードから脱離すると、ドナー分子とアクセプター分子のＦＲＥＴ特性が変調する（即ち、ＦＲＥＴ効率がゼロになる）。この処理は、同一蛍光計キュベットにおいて実施することができ、脱離前後に取得したスペクトルの差異は、ＦＲＥＴ効率の直接表示である。従来、ＦＲＥＴパラメータを取得するのは極めて困難であったので、例えば、高濃縮のドナーとアクセプターの溶液を微小毛細血管に注入する等の代行手順によってアーチファクトを発生させることができる。選択的脱離を伴うＦＲＥＴビードの発明によって上記パラメータを測定することが取るに足らないものになる。１Ｍイミダゾールを添加するという簡単な手順によって、ドナーとアクセプターの濃度と効率を正確に判定することができ、これによって定量ＦＲＥＴマイクロスコピーにおける較正基準の原理が備わる。かかる較正ビードは、機器の反応を判定するために使用するとともに、各種サンプルと併用するエピ蛍光顕微鏡のハードウェアとソフトウェアを標準化するために使用する。この発明は、一実施例において、現在、細胞生物学にとって注目されている緑・フルオーレスサント・プロテイン(ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ)の派生物を生じる一連のＦＲＥＴビードを提供する。当該派生物は、青/緑のペア（３８０ｎｍ励起／５１０ｎｍ励起）と、シアン/「黄」ペア（４５０ｎｍ励起／５３０ｎｍ励起）を含む。このＧＦＰの２つの派生物は、スペクトル特性に基づいてＦＲＥＴ標準に使用する。Ｌｏｓｓａｕらが組合せ突然変異誘発を使って構成した突然変異体ＢＦＰ１１（Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｃｓ．２１３：１-１６、１９９６年）は、突然変異種Ｆ６４Ｍ／Ｙ６６Ｈを含有する。ＢＦＰ１１は、野生型ＧＦＰ（図２）に対して青シフト励起及び放射の各最大値を有する。組合せ突然変異誘発で生成した突然変異体ＲＳＧＦＰ４（Ｄｅｌａｇｒａｖｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３:１５１-１５４、１９９５年）は、突然変異種Ｆ６４Ｍ／Ｓ６５Ｇ／Ｑ６９Ｌを含有する。ＲＳＧＦＰ４は、Ｈｅｉｍらが報告する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１:１２５０１-１２５０４、１９９４年）Ｓ６５Ｔ突然変異体に類似のスペクトル特性を有する。ＦＲＥＴペア中のアクセプターとして、Ｓ６５ＴとＲＳＧＦＰ４は、両方とも、ＲＳＧＦＰ８（Ｆ６４Ｌ＋Ｓ６５Ｔ）等の他の赤シフト励起突然変異体よりも優れているが、この理由はＲＳＧＦＰ８（Ｆ６４Ｌ＋Ｓ６５Ｔ）等の他の赤シフト励起突然変異体が紫中に有効な励起を有するからである。同一視界において較正基準を含まないサンプル（即ち、純正ドナー、アクセプター、又はＦＲＥＴビード）の今後の正規化と修正のために較正値をコンピュータに記憶させることができる。一旦、限定した光学ベンチ内で特定のキューブセットに合致する特定の発蛍光団ペアに対して較正すると、当該正規化係数は、安定し、前記発蛍光団を含む未知のものに適用可能である。ＦＲＥＴビードは、人がアクセプター蛍光増感の測定輝度を対応する量のドナー消光に関連付けることができる媒体を提供する。この較正係数Ｘ_Fは、機器反応だけでなくＦＲＥＴ量子収量の概念までも具体化する。係数Ｘ_Fによって、ＦＲＥＴを実施するドナーの量の判定が簡素化し、ドナーをフォトディストラクトしたり（Ｐｈｏｔｏｄｅｓｔｒｕｃｔ）又はドナーをアクセプターから物理的に分離したりする必要がない。また、この較正係数は、吸収断面積、励起強度、及び検出効率、の差異を補償する。従来の蛍光測定法の測定値Ｅで求めたＥ値と、定量画像形成と、を組み合わせることによって、Ｘ_FがＦＲＥＴ較正ビードから得られる。即ち、ここで、Ｃ₁はＣ₁チャンネルの輝度であり、Ｃ₃'は、後述する等式（３８）でスペクトル・オーバラップ修正を行った後のＣ₃ＦＲＥＴチャンネルの輝度である。次に、この値を、サンプル未知数におけるＦＲＥＴパラメータの計算に適用することができる。Ｅは、等式（６）から、ドナーの総数で除算した、ＦＲＥＴを実施するドナーの数を求めることに等しい。フォースター等式が単一のドナーとアクセプターのペアに適用するので、ＦＲＥＴを実施するドナーの量を、測定した増感アクセプター放射に直接関係付けることができる。３キューブ顕微鏡システムでは、ＦＲＥＴサンプルのＥは、ビード較正係数（Ｘ_DとＸ_F）を組み込むとともにＣ₁とＣ₃のチャンネル情報を組み合わせることによって求めることができる。即ち、したがって、ＦＲＥＴビードと併用する等式（３４）と等式（３５）によって、消光したドナー放射と互換性のある単位に増感アクセプター放射を変換することが非常に容易になり、ＦＲＥＴを実行するドナーの量と、ドナーの総量と、ＦＲＥＴ効率と、を容易に定量する能力が得られる。図８に示すビードの場合、ｙ軸の値から、Ｉ_D＝０.６３でありＩ_DA＝０.２４である。エネルギー伝達効率Ｅは、等式（６）に代入することによって求められる。即ち、Ｅの測定によって、ドナーとアクセプターの間の中間分離距離（Ｒ）をフォースター等式の内の別の等式を使って算出することができる。即ち、ここで、Ｒ_Oは、エネルギー伝達の効率が５０％であるフォースター半径又は臨界距離である。Ｒ_Oは、準実験的方法と以下（等式（３）を参照）とによって求めることができる。即ち、等式（３７）中のパラメータは、スペクトル・オーバラップ積分Ｊを含むとともに、このスペクトル・オーバラップ積分Ｊは、図式上、ドナーの蛍光放射スペクトルとアクセプターのグランド状態吸収スペクトルとの間に占める集約面積に等しく、両スペクトルとも１つに正規化されている。他のパラメータは、アクセプターが無い場合のドナーの蛍光量子収量Ｑ_Dと、細胞系の場合、通常（１.３〜１.４）の屈折率Ｎと、双極子から双極子の配向係数κ²と、を含む。図８に示すＢＦＰ１１／ＲＳＧＦＰ４ペアのスペクトル・オーバラップを考慮すると、無作為配向係数Ｒ_Oは、約４０Åである。Ｒ_OとＥを等式（３６）に代入すると、上述したＦＲＥＴビード上のＢＦＰ１１とＲＳＧＦＰ４の間の分離距離ｒが３７Åになる。このＢＦＰ１１からＲＳＧＦＰ４までの距離は、発蛍光団間の考え得る最小距離がＧＦＰ二量体のＸ線構造で示すように〜２５Åであることを考慮すると合理的である。また、この発明は、ドナー濃度［Ｄ］とアクセプター濃度［Ａ］とＦＲＥＴ効率［Ｅ］とに関する基準を生成するために、単位表面積毎にドナー分子とアクセプター分子の抑制量で一連のビードを（従来の蛍光測定法によって）特徴づける方法を提供する。ＦＲＥＴの存在する場合（Ｉ_DA）と不在の場合（_DＩ）におけるドナー輝度であって、ドナー濃度に対して正規化した前記ドナー輝度の判定は、生物学的サンプル上の定量ＦＲＥＴを実施する大きな難関の１つである。イミダゾールは、ＧＦＰ発蛍光団のＮｉ／ＮＴＡキレートビードからの脱離を媒介し、これを実質的に１ステップで達成するようになっている。スペクトル・オーバラップの存在は、各々の白黒画像が２つ以上のビードタイプを示すことを観察することによって気がつく。Ｃ₃チャンネルでは、スペクトル・オーバラップは、ドナーの放射テールがアクセプター放射バンドにブリードスルーすることによるものである。また、アクセプターの直接励起が一定の波長（例えば、３７０ｎｍ）で発生する場合があるが、これは、当該波長での少量のアクセプター吸収に起因する。Ｃ₃チャンネルのスペクトル修正は、以下のように等式（１０）を書き直すことによって行うことができる。即ち、ここで、- ＝各白黒画像上のバックグラウンド減算後の「純正ドナー」ピクセルの場合、ＦＲＥＴチャンネル輝度のドナーチャンネル輝度に対する比率であり、- ＝各白黒画像上のバックグラウンド減算後の「純正アクセプター」ピクセルの場合、ＦＲＥＴチャンネル輝度のアクセプターチャンネル輝度に対する比率である。溶液測定から発蛍光団の表面濃度を得たので（等式（４０）を参照）、ドナー表面濃度を、以下の等式を介して純正ドナービードのＣ₁画像中のドナー放射輝度に関連付けることができる。即ち、（３９）ここでＸ_Dは、ドナー較正係数として定義され、単位面積毎に各分子毎のグレー値の単位を有する。同様に、アクセプター較正係数Ｘ_Aは、Ｃ₂チャンネルを介して画像形成された純正アクセプタービードから求めることができる。立体発蛍光団コートビードを平方画像形成面上に投影させるので、輝度（グレースケール）測定に使用するピクセルを選択する際は、慎重に行う必要がある。前記ビードのサイズと光学濃度を考慮すると、各ビードの中心ピクセル上の輝度に基づくとともに２の係数で除算することは合理的である。この理由は、顕微鏡中のビードを見下ろすと、立体から平面への投影のためにビード表面の底と頂部の両方から蛍光（等方性である）が見えるからである。Ｘ_AとＸ_Dを求める際に、蛍光量子収量と機器反応修正は、全て、この較正係数の範囲内で具体化されることに留意することが重要である。一連のビードを特徴づけながら構築することによってこの関係の線形又は線形範囲の限界が求められる。例えば、発色団間の分離（ｒ）、配向係数（κ²）、及びＦＲＥＴ効率（Ｅ）等、ＦＲＥＴ輝度を左右する他の要素は、機器を較正することによって実験的に求めることができる。当該較正によって、ユーザは、上記係数の大きさと空間配分をディスプレイした画像を生成することができる。例えば、ドナーとアクセプターの間の吸収断面積の差異の修正と、励起強度と検出器効率の差異の修正と、を加えることによって、最初の２つの変数の値を求めることができる。κ²の値は、固定した配向で発色団を含有する較正基準を使って求めることができる。較正とテストサンプル通常の分析においては、純正ドナーと純正アクセプターとＦＲＥＴビードの混合物を生じる較正スライドの場合、Ｃ₁、Ｃ₂、及びＣ₃を使った３つの画像が得られる。蛍光ビードを顕微鏡のスライドの表面上で空気乾燥させて画像形成する。記録された画像は、全て、ライトマイナスダーク減算を使用し、ダークカウントのペディスタル（Ｐｅｄｅｓｔａｌ）を修正する。次に、前記較正スライドを、バックグランド減算スペクトル・オーバラップ修正比の他にＸ_A、Ｘ_D、及びＸ_F も得るために使用する。このスライドは、当該測定を行った後に取り除いてテストサンプルと交換し、このテストサンプルから３つの追加画像が同一実験条件下で得られる。当該白黒画像を、各々、バックグランド減算するとともにオーバラップ修正を適用する。画像基本型の顕微鏡システムは、場面におけるあらゆるピクセルの分析を大量に平行に実施する。これは、解像度１０００×１０００の画像の場合、１０⁶同時シングルスポット測定と同等である。等式（３５）によるエネルギー伝達効率と、等式（３６）による距離配分画像と、を生成するために、各々のピクセルを、Ｒ_Oが既知であることを条件にして処理することができる。［Ａ］画像は、Ｃ₂チャンネルのＸ_Aに対する比率から求めることができ、また、［Ｄ］画像も得ることができる。一旦、顕微鏡を特定のＦＲＥＴペアに対して較正すると、このシステムは、かかるタイプの発蛍光団を格納する他のサンプル全部に対して、較正された状態のままである。顕微鏡のハードウェアを変更する（例えば、エピキューブを変える）場合に限って、又は異なるＦＲＥＴペアを研究する場合に、再較正が必要である。ＦＲＥＴ信号の定量化は、ビード又はその他の目標に基づいてＭｉｃｒｏＦＲＥＴ装置中で行う測定を、蛍光計中で行う従来の測定と相関関係化することによって達成することができる。例えば、実例２に記載のようにドナーとアクセプターの全体を定量化するために、キュベット内のビードからの発蛍光団のイミダゾール脱離を使用することができる。コンピュータ履行：マイクロＦＲＥＴシステムはデジタル画像化分光（ＤＩＳ）ソフトウェアを備え、これは、ドナーエミッションのブリード・スルーをアクセプターチャンネルに修正するため、ドナー励起波長でのアクセプターの励起を修正するため、更にドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴ画素を強調する新規なＲＧＢ軸セットを生じさせるための画像の代数的操作をサポートする。このシステムは更に、１６ビットモノクローム画像および２４ビットＲＧＢ画像の双方のための画像処理およびディスプレイを提供するものである。スペクトル重複のための修正は以下のように行われた。ＦＲＥＴチャンネル強度のドナーチャンネル強度に対する割合は、バックグラウンドの修正の後、“純粋ドナー”画素について決定される。ＦＲＥＴチャンネル強度のアクセプターチャンネル強度に対する割合も、バックグラウンドの修正の後、“純粋アクセプター”画素について決定される。これらの割合は、ついで各画素について、式（１０）を用いてＦＲＥＴチャンネル値を修正するのに用いられる。この３つのチャンネルの夫々についてグレー値画像を得た後、この３つの測定が複合ＲＧＢ画像へと再組立てされる。しかし、スペクトル重複のための修正ファクターがこの３つのチャンネルのそれぞれについて計算されたとしても、種々のドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴビードは必ずしも純粋な青、緑、赤として現れない。なぜならば、最初のＲＧＢ画像に表示されるカラーは未だに直交正規化されていないからである。マイクロＦＲＥＴはユーザーがこの問題を修正することを可能にする。すなわち、ユーザーがオーバーラップ修正画像から最高の赤、緑および青を含む画素を選択することができるようになっている。このプログラムはこの画像を、選択された画素についての赤、緑および青のグレー値により赤、緑および青軸が規制されたカラーシステムに数学的に変換させる（図４）。より具体的に述べると、マイクロＦＲＥＴにおいて使用されたアルゴリズムにより、赤、緑および青のカラーシステムからのＲＧＢ画像が、３つのユーザー規制のＲＧＢトライアッドに規制されたカラーシステムに変換される。複合ＲＧＢ画像がすでに図３に記載されており、図５にパネルＡとして再生されている。図５のパネルは拡大されていて、図３の画像の上方四分円のみが示されている。ブリード修正および図５（パネルＡ−Ｆ）に示す未修正ＲＧＢ画像の直交正規化における工程は、以下のようにして行なわれる。パネル５Ａ−ＲＧＢ：図３からのモノクローム画像が、青、緑および赤チャンネルの夫々についてのウインドーＤ１，Ａ１およびＦ１に示される画像を用いて、組合わされてパネル５Ａを発生させる。この３つの全てのカラーチャンネルについての色濃度範囲はこの組合わされた３画像セットの最小および最大画素値に基づいている。パネル５Ｂ−スケーリング修正：この３つのチャンネル間における蛍光信号強度は、ドナーとアクセプターとの間の量子収量および減衰率の差により変化し得る。信号強度も、光源の照明強度や異なる波長での検出器感度などの機器のパラメータに左右される。もし、画素値の範囲がチャンネル間でかなり異なるときは、最大の画素値読出しを有するチャンネルのカラーを、より低い画素値読出しを有するチャンネルのカラーに対し優先させることができる。パネル５Ｂは、この３つのチャンネルのそれぞれのカラー強度を個々、その最小および最大画素値に再スケーリングした後の擬似着色画像を示している。パネル５Ｃ−バックグラウンド修正：パネル５Ｃは各画素がバックグラウンド信号のために修正された後の擬似着色画像を示している。マイクロＦＲＥＴソフトウエアは、画像をクリックすることにより５つのバックグラウンド画素の位置を選択するようユーザーを促する。これらの画素値は平均化され、自動的に減じられる。この減じられた値のあるものがマイナスのときは、それはゼロに設定される。パネル５Ｄ−スペクトル・オーバラップ修正：図３に表されたデータはエピ蛍光画像間でかなりのスペクトル・オーバラップがあることを示している。しかし、マイクロＦＲＥＴ機器におけるエピ蛍光キューブが正確な画像整合を維持しているので、ＦＲＥＴ画像（および他の画像）に対する汚染寄与を全ての画素から減ずることができる。ＦＲＥＴチャンネルについて、この修正はＦＲＥＴチャンネルにおけるドナーおよびアクセプタービード画素値を小さくする式（１０）に従って行われ、従ってこれらの値はゼロに近付く。ＦＲＥＴを行うビードからの画素のみがこの修正後もこのチャンネル（赤）においてかなりの信号強度を維持する。パネル５Ｄはこのオーバラップ修正後の擬似着色画像を示している。純粋なドナーおよび純粋なアクセプタービードからの“赤色寄与”は除去される。このドナービードは今や紫でなく青を示し、アクセプタービードは緑を示す。パネル５Ｅ−強調ＦＲＥＴ：スペクトル・オーバラップを更に実証するため、緑および青色チャンネルを、ブリード修正画像において止める。これによりＦＲＥＴが行われている“赤色”画素の識別が簡素化される。この方法は、簡単なタブ付きダイアログボックスを用い実時間で容易に行うことができ、この場合、この各タブはユーザーが特定のチャンネルを選択的に高コントラスト化することを可能にする。パネル５Ｅに示すように、ＦＲＥＴに相当する赤色ビードのみが観察される。パネル５Ｆ−直交正規化：ドナー、アクセプター又はＦＲＥＴエミッションを含むサンプルにおける領域の識別を可能にするため、上記ソフトウエアによりユーザー規制基準に基づいて画像を擬似着色化することができる。パネル５ｄにおいてビードの３つの型（すなわち、ドナー、アクセプター又はＦＲＥＴ）のそれぞれを表す画素上にコンピュータマウスをクリックすることにより、ユーザーはカラー指定をリセットし、純粋な青に修正されたドナーからのエミッション、純粋な緑に修正されたアクセプターからのエミッション、および赤に修正されたＦＲＥＴからのエミッションを表示することができる（パネル５Ｆ）。本発明の態様を示すこのコンピュータ履行は以下のように要約することができる。１．ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴチャンネルについて最適化された３つのエピ蛍光キューブを選択する。２．キューブを１画素解像内に光学的に整合させる；もし、ＯＣＡ装置を使用する場合は、ランタイム（実行時間）ソフトウエア捕捉ループを３つのチャンネルの全てに見える蛍光ビードに適用して整合を行う。３．上記３つのキューブを介して得た画像を組合せて１つのＲＧＢ画像にする。４．工程９にスキップするか、工程５−８を行う。５．ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴ画素を表す画素を選択することにより、上記ＲＧＢ画像を直交正規化する。６．候補の画素の選択が、生物学的形態又は標準にとって色描写が劣るものであるときは、工程５を繰返す。７．適宜、直交正規化テンプレートを後の画像への適用のために記憶させる。８．直交正規化されたＲＧＢ画像において、Ｒ，Ｇ，Ｂのコントラストを向上させる。終了。９．バックグラウンドのため、ＲＧＢ画像を修正する。１０．Ｆ°に関する式に従ってスペクトル・オーバラップのための修正を更に行う。１１．修正されたＲＧＢ画像において、Ｒ，Ｇ，Ｂのコントラストを向上させる。１２．適宜、工程５，６，７，８を行う。本発明のこれら態様は、ハードウエア、ソフトウエア、あるいはこれらの組合せで履行することができる。しかし、好ましくは、本発明のアルゴリズムおよびプロセスを、プログラム組込み可能なコンピュータを用い１又はそれ以上のコンピュータプログラムで履行する。この場合、各コンピュータは、少なくとも１個のプロセッサーと、少なくとも１個のデータ記憶システム（揮発性又は不揮発性メモリーおよび／又は記憶素子を含む）と、少なくとも１個の入力装置と、少なくとも１個の出力装置とを具備してなる。プログラムコードが入力データに適用されて本明細書に記載された機能が実行され、出力情報が発生する。この出力情報は１又はそれ以上の出力装置に対し公知の方法で適用される。各プログラムは、コンピュータシステムとの通信のための所望のコンピュータ言語（マシン、アセンブリ、高レベル手続又はオブジェクト指向プログラミング言語）により実装することができる。いずれの場合も、言語はコンパイル言語でもインタープリタ言語でもよい。このようなコンピュータプログラムの夫々は、好ましくは、プログラム組込み可能な汎用又は専用コンピュータにより読出し可能な記憶媒体又は装置(例えば、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、磁気ディスケット)に記憶させ、そこに記載された手法を実行するためコンピュータにより記憶媒体又は装置を読取らせてコンピュータを構成させたり、操作させたりする。本発明のシステムは、コンピュータプログラムにより構成されたコンピュータ読取り可能な記憶媒体として履行させることも考えられる。この場合、コンピュータが特定の予め決められた方式で操作され、かつ、そこに記載された機能を実行するよう、この記憶媒体を構成させることができる。実施例：このマイクロＦＲＥＴの性能は、２つの広く使用された蛍光タンパクタグの一対を用いることにより、実施例で実証されている。シフトした励起および放射スペクトルを有する多くのＧＦＰ変異体が作られることから、細胞生物研究におけるこの機器のより広い範囲の適用が可能である。ＧＦＰ誘導体以外の他の蛍光分子および蛍光団も、エピ蛍光キューブの適当なセットを単に選択することにより、この機器により分析することができる。この場合、ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴキューブは励起および放射スペクトルに基づいて信号を分別するようになっている。更に、このシステムは、有機染料又はランタニド金属のような非タンパク発色団又はこれらの組合せの全てを用いて使用することもできる。この特定の蛍光団対ビード結合技術は、アガロースビード、ヒス−タッギング（Ｈｉｓ−ｔａｇｇｉｎｇ）、ニッケル誘導体化、又は蛍光タンパクに頼らない他の化学分野をも包含するよう拡張することができる。すなわち、これらビードはＦＲＥＴペア（例えば、フルオレセインおよびローダミン）として作用すると共に、蛍光団を溶液中に選択的に解放させる機能を維持する２つの有機分子を持たせることができる。従って、以下の実施例は、単に説明のためのもので、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。実施例１（蛍光タンパクおよびビード）この実施例はＦＲＥＴ較正基準（標準）を作る手法のアウトラインを説明するものである。これにはビードの３つの型の合成が含まれる。すなわち、純粋なドナー、純粋なアクセプター、およびドナーおよびアクセプター分子の双方を担持するＦＲＥＴビードである。各ビードの型は一連のものとして合成され、ここで［Ｄ］、［Ａ］およびＥの値は変化する。これら一連のビードを作るため、Ｎｉ／ＮＴＡ競合バインダー（スペーサーについて“Ｓ”）（ヒス−タグ（His-tagg ed）され，上記ドナーおよびアクセプターと同じ大きさ、形状を有する）が用いられる。ＧＦＰ誘導体の場合、数個の非蛍光変異体が工作され、これは“無益” の蛍光表現型を表すが、それにも拘らず、発色団が不足した大量のタンパク質を発現する（例えば、点変異Ｒ９６Ｍ）。このようなヒス−タグ誘導体は、他のスペクトル的に活性なＧＦＰ誘導体の中でも、Ｎｉ／ＮＴＡビードの表面上での良好なスペーサとなる。このビードに、Ｄ，Ａ，Ｓがシステム的に変化させたタンパク質溶液を担持させることができる。以下に説明する手法によりＧＦＰ吸着ビード・標準が作られた。たんぱく質の精製および後のＮｉ−セファロースビードへの付着を容易にするため、ＢＦＰ１１，ＲＳＧＦＰ４およびＲ９６Ｍ変異体を工作して、これらのアミノ末端にＨｉｓ６タグを含めるようにした。組換え突然変異誘発を用いて作られたＢＦＰ１１は突然変異体Ｆ６４Ｍ／Ｙ６６Ｈ（Lossauら、Chem．Physics．213:1-16，1996 ）を含み、Heimら（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:12501-12504，1994）の変異体に似ている。これは野生型ＧＦＰに対し青シフトされた励起およびエミッション最大を有している（図２および下記表２）。Delagraveらにより組換え突然変異誘発を用いて発生させた変異体ＲＳＧＦＰ４（Bio/Technology，13:151-154 ，1995）は変異体Ｆ６４Ｍ／Ｓ６５Ｇ／Ｑ６９Ｌを含んデータ。このＲＳＧＦＰ４はHeimらにより報告されたＳ６５Ｔ変異体（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91: 12501-12504，1994）に類似するスペクトル特性を有する。ＦＲＥＴペア（対）におけるアクセプターとして、Ｓ６５ＴおよびＲＳＧＦＰ４の双方は、ＲＳＧＦＰ８（Ｆ６４Ｌ＋Ｓ６５Ｔ）のような他の赤シフトされた励起変異体より優れている。なぜならば、後者の変異体は紫においてかなりの励起を示す。これらたんぱく質が大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現され、２４時間成育され、フレンチプレス内で破断され、Novagen HisBind精製カラムに適用し、１Ｍイミダゾール内で溶出させ、透析を行った。最終たんぱく質濃度はブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により判定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い、透析された分画の純度および大きさを確認した(データは示されていない) 。蛍光励起および放射スペクトルは、フォトン・テクノロジーＱＭ−１蛍光計上に記録させた。ハイトラップ金属キレート化セファロースビードは、製造メーカー(Pharmacia Biotech)の指示書に従ってビードを５０ｍＭのＮｉＳＯ₄で洗浄することにより洗浄することにより充填した。このビードはついで５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）でよく洗浄し、錯合されなかったニッケルイオンの痕跡を除去去した。ついで５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液に、精製たんぱく質を約０．４ｍｇ／ｍＬの全タンパク濃度となるようにして溶し、溶液を作った。この希釈濃度の液を用いて、溶液中にＧＦＰダイマーが形成するのを回避した。この混合物の１．５ｍＬを５０μＬのビードスラリーに添加し、しばしば撹拌しながら氷上で１時間、培養した。過剰のたんぱく質は、ビードが十分に担持されるのを確実にする。非特異的に結合されたたんぱく質（もし、あれば）を除去するため、懸濁液を、５ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス−ＨＣｌを含む緩衝液で２回洗浄し、続いて５０ｍＭトリス−ＨＣｌで１回洗浄した。この洗浄の全てはビードを１，０００×Ｇで３０秒間、マイクロ遠心機中で遠心分離し、更に適当な緩衝液中にペレットを再懸濁することにより行われた。このビードの平均粒径は約３４ミクロンであった。図６は、水平黒色ラインで表されたキレート化ビードの表面を示している。この場合、ＧＦＰドナーおよびアクセプター（例えば、ＢＦＰおよびＲＳＧＦＰ）は青および緑の垂直線でそれぞれ示されている。可能な６種の異なる相互作用の型がＡ−Ｆでラベルされている。この図において、近傍の分子のみが効率的ＦＲＥＴ距離内にあるものと考えられる。最も著しく担持されたビードが光学密度が０．１未満となるようにして作られた（飽和条件下で）。従って、光子媒介の自明なエネルギー転移又は再吸収は考慮する必要はない。更に、ビードの寸法は十分に大きいため、表面共鳴効果を無視することができる。実施例２（ＧＦＰラベル付きＦＲＥＴビードに対する従来の蛍光測定）ＦＲＥＴビードからの蛍光放射が実際にＦＲＥＴであることを確認するため、並びに２つのＧＦＰ変異体のスペクトル特性がセファロースビードへの結合によっても変化しないことを確認するため、ビードの各型のサンプルをたんぱく質を解放させるイミダゾールで処理した。ＦＲＥＴビードについての蛍光放射スペクトルが図２および８に示されている。Ｂパネルの太い線は、３７０ｎｍで励起されたＦＲＥＴビード懸濁液の放射スペクトルを示している。また、Ｂパネルの細い線は、イミダゾールでの処理によりＲＳＧＦＰ８およびＢＦＰ−１１の双方がビードから解放された後の同一のビードからの放射スペクトルを示している。ドナーにおける放射の減少およびアクセプターにおける放射の増大はＦＲＥＴを特徴づけるものである。この効果はこの２つのたんぱく質がビードから解放されたときは逆転する。一連の各ビードについて［Ｄ］および［Ａ］を判定するため、イミダゾールでの処理により解放させた後の溶液中のドナーおよびアクセプターの濃度を最初に測定した。これは最も好ましくは公知の標準でなく公知の吸光係数を用い、分光学的に行うことができる。なぜならば、単純なたんぱく質分析ではＤ，ＡおよびＳを区別することができないからである。Ｓの表面濃度は重要でない。なぜならば、それが単にスペーサーとして使用されていて、可視吸収又は蛍光についてのスペクトル特性を有しないからである。イミダゾールの添加に原因する容積の増大（一般に、５Ｍ溶液の１／４容量添加の後、１．２５の係数を掛ける）についての修正を行ったのち、純粋なドナービード上のドナー分子の表面濃度が以下のようにして求められる。ここで、ｄは製造メーカーにより与えられたビードの直径、又はステージマイクロメータおよび既知の倍率を用いて測定されたビードの直径である。ｍＬ当たりの粒子単位のビード濃度（[Ｂ]）は細胞分別機を用いて非常に正確に判定することができる。これは飽和蛍光団の条件下で、既に３つのビードスラリーについて行われた。蛍光団の濃度の測定は、式（４０）に類似する式を用い、純粋なアクセプターおよびＦＲＥＴビードについて行うことができる。ＦＲＥＴビードの場合、総ドナー濃度および総アクセプター濃度は解放処理後に判定することができる。実施例３（ＧＦＰラベル付きビードについてのデータ取得）図３はラベル付きセファデックスビードの混合物について得たモノクローム画像の１セットを示している。個々のビードが、（１）ＢＦＰ−１１のみ（ドナービード）、（２）ＲＳＧＦＰ８のみ（アクセプタービード）又は（３）ドナーおよびアクセプターの２：１混合物（ＦＲＥＴビード）で塗布された。図３の右下方には、ドナーの励起スペクトルに相当する光により励起されたときの、ドナー放射チャンネル中での全てのビードにより放射された蛍光強度が示されている。図３の左下方には、アクセプターの吸収スペクトルに相当する光により励起されたときの、アクセプターチャンネル中での同一のビードにより放射された蛍光強度が示されている。図３の右上方には（ＦＲＥＴチャンネル）、ドナーの励起スペクトルに相当する光により励起されたときの、アクセプターチャンネル中で放射された蛍光強度が示されている。これらのモノクローム画像からの結果は擬似着色画像で一緒に表示され、ここで、ドナーチャンネルからの蛍光信号は青色が指定され、アクセプターチャンネルからの蛍光信号は緑色が指定され、ＦＲＥＴチャンネルからの信号は赤色が指定される（図３の左上方）。この画像中、３つのチャンネルのそれぞれにおける色強度は、最も高いグレー値を有する画素（この３つのチャンネルのいずれかからの画素）に比例させる（ＤＥＦＡＵＬＴセッティング）。このＦＲＥＴビードは、そのビードが３つのチャンネルの全てにおいて蛍光寄与しているため、金色に見える。純粋なドナービードは、そのビードがドナー（青）およびＦＲＥＴ（赤）チャンネルからの蛍光寄与を有するため、紫（青−赤）に見える。純粋なアクセプタービードは、そのビードがアクセプター（緑）およびＦＲＥＴ（赤）チャンネルからの蛍光寄与を有するため、僅かに赤味を有するほぼ緑に見える。これらの画像から、ドナーおよびアクセプター放射のＦＲＥＴチャンネルへのかなりのブリード・スルーがあることは明らかである。実施例４（ＧＦＰラベル付きビードについての画像取得）３つのエピ蛍光キューブのセットを用いて３つのモノクローム画像が得られ（表１参照）、これにより蛍光ビードの３つの異なる型の混合体を画像化された（表２参照）。これらエピ蛍光キューブおよびビード型は、ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴとラベルし、これらキューブおよびビードがスペクトル的に合致していることを強調した。このドナービードは、長波ＵＶに最大励起を有し、青の放射を有するＧＦＰ誘導体（ＢＦＰ１１）を担持している。アクセプタービードは、シアンで最大に励起され、緑の蛍光を有するＲＳＧＦＰ４を担持している。これらの励起および放射波長はドナーおよびアクセプターキューブに適合している。ＦＲＥＴビードは、この青および緑の双方のＧＦＰ誘導体を担持しており、対応するＦＲＥＴキューブは、エネルギー転移が発生した後、青色ドナーを励起し、緑色アクセプターを画像化するよう最適化されている。ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴキューブを用いて得た画像は、それぞれＤ１、Ａ１およびＦ１画像として表されている。ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴビード間のスペクトルの混合は、図３の空間的に位置合せしたモノクロームおよびＲＧＢ画像に見ることができる。Ｄ１画像において、ドナービードは最も明るいが、ディマーＦＲＥＴビードも観察することができる。Ａ１画像において、アクセプタービードは最も明るいが、ディマーＦＲＥＴビードも観察することができる。Ｆ１画像において、ＦＲＥＴビードは最も明るいが、ディマードナービードも観察することができる。これは図２に示す蛍光スペクトルおよび表２に示すパラメータと符合するものである。図３の擬似着色の左上画像（ＲＧＢ１）は、これらモノクローム画像のそれぞれの画素値を、この画像の赤、緑および青成分のそれぞれについての強度（値）に符号化した結果を示すものである。Ｆ１は赤色チャンネルにロードされ、Ａ１は緑色チャンネルにロードされ、Ｄ１は青色チャンネルにロードされている。スペクトルの重複のため、種々のビード型がこのＲＧＢ画像でははっきり見えず、あるいは明確に画成されていない。ドナーおよびアクセプターの放射スペクトルを注意深く観察すると、この２つの蛍光団の分離が可能な波長は見当たらない。例えば、５５０ｎｍでの非常に狭い帯域放射フィルターの使用は、この２つの蛍光団の放射を分離することができないだけでなく、顕微鏡の集光能力の殆どを失わせることになる。この損失を補償するためより高い強度の照射を使用することも、光漂白をもたらすことになる。これと対照的に、本発明では広い帯域放射フィルターと比較的低い強度の励起源を使用している。実施例５（バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞のカラーコード化画像）ＢＦＰ１１、ＲＳＧＦＰ４、およびＢＦＰ１１／ＲＳＧＦＰ４融合たんぱく質を発現するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を試験した（図７に示すように）。ＦＲＥＴビードを用いたこのシステムの正しい較正後において、［Ｄ］値はＲＳＧＦＰ４感染細胞においてゼロに等しく、［Ａ］値はＢＦＰ１１感染細胞においてゼロに等しいものであった。ＢＦＰ１１／ＲＳＧＦＰ４融合たんぱく質感染細胞におけるＦＲＥＴ効率は、たんぱく質分解の程度に左右されるが、溶液で測定された単離融合たんぱく質についての効率と等しいか、あるいはそれよりも小さいものであった。光漂白および光異性体化の程度は、先に同様のキューブ、光源およびＣＣＤカメラを用いて、マイクロＦＲＥＴシステムについて測定したように５％未満であった。実施例６（ドナー光漂白の測定）従来の顕微鏡を用いた増感放射による細胞の定常状態のＦＲＥＴ画像化は、空間的整合を維持しつつスペクトル重複を修正できないという問題があった。現在まで、修正値を発生させるのに使用されなければならなかった３つのエピ蛍光キューブ（ドナー、アクセプターおよびＦＲＥＴ）は、厳密には平行でない光学的表面により作られてきた。この欠点が、画像組合せ後の像の幾何学的歪み（すなわち、画素のずれ）を生じさせた。マイクロＦＲＥＴ機器は正確な公差に加工されたエピ蛍光キューブを使用し、従って、空間的整合が全ての画像について維持される。このような設計により、或る画素内における比較的小さな量のＦＲＥＴを検知することが可能となる。なぜならば、その数学的修正が以前の場合よりも著しく簡単になる（従って、より正確になる）からである。これらの修正の有効性が、ＢＦＰ１１、ＲＳＧＦＰ４又はこの２つの一定の混合物（ＦＲＥＴを発生させることが知られている）で担持させたセファロースビードの画像を得ることにより実証された。これらのビードを較正基準として使用することにより、スペクトル重複が修正され、ドナー放射、アクセプター放射およびドナー増感アクセプター放射（ＦＲＥＴ）を表示している画像内で特徴が識別された。後に、直交正規化アルゴリズム（画素浄化）を適用することにより、純粋なドナー、純粋なアクセプターおよびＦＲＥＴビードがそれぞれ、青、緑および赤として擬似着色化された。この増感放射技術を使用する他の関心事は、この励起光がドナーを光漂白し、それによりＦＲＥＴ信号の見掛け強度が減少することである。しかし、本発明の方法を用いることにより、この増感放射技術によるＦＲＥＴ信号の減少は高々５％である。光漂白は主たる問題ではない。なぜならば、Ｋ７カメラの高感度によって長い時間の露出を必要としなくなるからである。例えば、この実験での蛍光信号のグレースケール強度は、カメラの動的範囲の約１／３（最大＝６５５３５ビット）を使用した。それにも拘らず、これらの露出条件下で、ドナー信号の５％未満が光漂白された。露出時間は容易に１０分の１に減少させることができるが、依然として信号を検知することが可能である。ＦＲＥＴ測定の間のＢＦＰ−１１の光漂白の最大限度は、励起光に対し３０秒間繰返して露光させたドナービードのサンプルからの蛍光放射の強度をモニターすることにより判定された。平均グレースケール値は多数回の露光後の１０個のランダムに選択された画素について判定された。ついで、これらの値が最初の３０秒間の露光後の同じビードについての値と比較された。励起光に対する繰返し露光後の蛍光放射の測定強度は初期レベルの９５％を超えるものであった。実施例７（定量的ＦＲＥＴ顕微鏡検査）この実施例の目的は、顕微鏡視野において、全ての画素についてドナー濃度、アクセプター濃度、エネルギー転移効率およびドナー分子とアクセプター分子との間の距離パラメータを判定することにより定量的ＦＲＥＴ顕微鏡検査を行うことが可能であることを示すことである。定量的画像化は、ＧＦＰ誘導体の励起および放射スペクトルに適合させた３つのキューブを備えたオリンパスＡＸ７０エピ蛍光顕微鏡を用いて行った(表３)。これらのキューブは単一画素精度に空間的に位置合せさせた。各キューブで得られた画像は３つのチャンネルの入力を形成するもので、これらは後の画像処理のために使用された。ここで、Ｃ₁チャンネルはドナー放射を選択的に励起し、画像化するようになっており、Ｃ₂チャンネルはアクセプター放射を選択的に励起し、画像化するようになっており、Ｃ₃チャンネルはＦＲＥＴを可視化するようになっている。なぜならば、励起はドナー励起でのものであり、アクセプター放射で画像化されるからである。実施例８（発色性染料の直交正規化）色空間変形アルゴリズムは、非常に微妙な又は重複する色差を有する画像において、画素のグループ又は特徴を急速に識別、顕著化するのに有用である。例えば、図９は梗塞を含む心臓組織の染色薄片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）スライドを示している。左側パネルは、Ｈ＆Ｅ染色組織の４５０ｎｍ、５５０ｎｍおよび６５０ｎｍでの３つの別々のモノクローム画像を組合せることにより形成された真カラー画像を示している。右側パネルは、直交正規化後のこの画像を示している。この特別の場合、直交正規化のための候補画素は、核、薄い着色のエオシンおよび濃い着色のエオシンの領域から、それぞれＲ、ＧおよびＢとして取上げられた。得られた画像は親エオシン組織の２つの異なる型を示している。このようなエオシンによる染色の分化は非向上化画像においては見ることが困難である。エオシンにおける微妙な色の差は、組織内のコラーゲンの存在など種々の症状と相関するものと思われる。この向上した画像は各別々のＲ、ＧおよびＢカラーチャンネルのコントラスト向上により更に向上させることができる。実施例９（タイムコース・イメージの修正）洗練された画像の色空間座標を計算するために用いられる候補画素又は特徴は、例えば事象の時系列を含む一連の空間的に位置合せされた画像から選択することができる。この態様において、一連の画像は、“停止”、“開始”、“進む” および“時間遅延”パラメータを有するウインドウ内に表示される。この一連の画像は非常に早いタイムコース（ビデオ速度；１フレーム当り数ミリ秒）に亘って得たとしても、プレイヤーにより最終ユーザーが可視化プロセスを十分に遅くして、色空間変形のためのベースとして候補画素を取上げることが可能である。これらの特定の変形に対する係数を画像列中の全てのフレームに適用することができる。すなわち、ユーザー希望形態の自己発見によりグラフィック・ユーザー・インターフェースを利用して候補画素が好ましい選択であったか否かを評価することもできる。この方法は生きた細胞のレイショ−メトリック（ｒａｔｉｏ− ｍｅｔｒｉｃ）動的画像化において非常に重要であり、この場合、たんぱく質、イオン、他の細胞成分の動きが蛍光発光およびＦＲＥＴを介して報告される。候補画素が正しい選択であったか否かを判定する他の評価基準として、色を既知の標準ターゲットへ分別するようにしてもよい。既知の基準を含む画像を利用して未処理画像から処理画像へ変換する間に決定された数学的係数を記憶させ、基準を含まない画像へ適用することもできる。基準化テンプレートを呼び戻し、係数を用いて、照明、光学的濾過および記録について同様の条件下で得た後の画像を修正することもできる。本発明の多くの態様について説明したが、その他、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形例も可能であろう。例えば、本発明の上記記載のものは、特定のビードについてのＧＦＰ誘導体のＦＲＥＴ分析に限定されるものでなく、これらの実験は、ＦＲＥＴを検知できる画像化分光光度計および方法の実行に応用できることを実証するものである。従って、その他の態様も下記請求の範囲に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ビリナ，エドワード，ジェイ. アメリカ合衆国 95148 カリフォルニア州，サンホセ，ボンボンドライブ 2629 (72)発明者コールマン，ウィリアム，ジェイ. アメリカ合衆国 94043 カリフォルニア州，マウンテンビュー，ショアラインブルーバード 750 エヌ．，アパートメント 10 (72)発明者ディルワース，マイケル，アール. アメリカ合衆国 95062 カリフォルニア州，サンタクラツ，32エヌディードライブ 220 (72)発明者ヤン，マリー，エム. アメリカ合衆国 95136 カリフォルニア州，サンホセ，コビントンコート 176 【要約の続き】て実証されている。

Claims

【特許請求の範囲】１．各々が３つの色空間座標を有する画素のセットで表された生物学的物質の初期画像を、処理された画像に変形するための方法であって、その方法が以下の工程を含むことを特徴とするもの：（ａ）初期画像において少なくとも２つの画像領域を選択する工程であって、各画像領域が少なくとも１つの画素を含み、該画像領域が少なくとも２つの区別可能なスペクトルカテゴリーを規定するものと；（ｂ）選択された画像領域の夫々の画素の色空間座標に基づいて、該初期画像に対し色空間変形を行い、処理された画像を発生させる工程と；（ｃ）この処理された画像を、改良された色の空間分布の可視指標について評価する工程と；を具備してなる方法。２．上記色空間変形が直交正規化であり、選択された画素のグレー値が下記行列を作るための使用され、これが下記行列に変換されることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。３．上記色空間変形が空間的重複修正である請求の範囲１記載の方法。４．上記色空間変形が以下の式のスペクトル重複修正である請求の範囲１記載の方法。５．上記画像領域が光を吸収する物質を含む請求の範囲１記載の方法。６．上記画像領域が蛍光物質を含む請求の範囲１記載の方法。７．少なくとも１つの画像領域がＦＲＥＴを表す物質を含む請求の範囲１記載の方法。８．該評価する工程が、既知の標準ターゲットに正しく分別する改良された色の空間的分布に基づくものである請求の範囲１記載の方法。９．該評価する工程が、生物学的構造に分別する改良された色の空間的分布に基づくものである請求の範囲１記載の方法。１０．該画像変形方法が、初期画像の動的連続の使用を含むものである請求の範囲１記載の方法。１１．該評価する工程が、共焦顕微鏡の使用を含むものである請求の範囲１記載の方法。１２．該画像が、全て同時に修正された一連の画像内にある請求の範囲１記載の方法。１３．該評価する工程が、較正ターゲットの１セットの使用を含むものである請求の範囲１記載の方法。１４．該画像が、組織の染色された薄片のものである請求の範囲１記載の方法。１５．ドナーおよびアクセプター分子を担持すると共に、光学的機器を較正してＦＲＥＴ測定を行わせるのに使用される既知のＦＲＥＴ特性を備えたＦＲＥＴ標準。１６．該ＦＲＥＴ特性が効率Ｅである請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。１７．該ＦＲＥＴ標準が、アクセプター蛍光増感の測定強度を、下記式に従って消光するドナーの相当量へ関連づけるものである請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。１８．該ＦＲＥＴ特性が、ドナーおよびアクセプター分子の結合および解離により変調されるものである請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。１９．該標準のＦＲＥＴ特性が、ドナーおよびアクセプター分子の結合および解離を変調することにより判定されるものである請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。２０．該標準のＦＲＥＴ効率が、ドナーおよびアクセプター分子の結合および解離を変調することにより判定されるものである請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。２１．ＦＲＥＴ較正ターゲットのセットへのドナーおよびアクセプター分子の結合が可逆的である請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。２２．該ドナーおよびアクセプター分子が蛍光たんぱく質である請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。２３．該ＦＲＥＴ標準が、顕微鏡ビードに結合された少なくとも１つの蛍光物質を含む請求の範囲１５記載のＦＲＥＴ標準。２４．各々が３つの色空間座標を有する画素のセットで表された初期ＦＲＥＴ画像を、処理されたＦＲＥＴ画像に変形するための方法であって、その方法が以下の工程を含むことを特徴とするもの：（ａ）修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを得るため、下記変形式を適用することによりスペルトル重複を修正することにより初期画像から修正されたＦＲＥＴ画像を発生させる工程と；（ｂ）修正されたＦＲＥＴ画像において少なくとも２つの画像領域を選択する工程であって、各画像領域が少なくとも１つの画素を含み、該画像領域が少なくとも２つの区別可能なスペクトルカテゴリーを規定するものと；（ｃ）選択された画像領域の夫々の画素の色空間座標に基づいて、該修正画像に対し色空間変形を行い、処理された画像を発生させる工程と；（ｄ）この処理された画像を、改良された色の空間分布の可視指標について評価する工程と；を具備してなる方法。２５．修正されたＦＲＥＴ画像を更に、アクセプター放射チャンネルを介してのドナー蛍光の検知から生じるクロストークについて、およびドナー放射チャンネルを介してのアクセプター蛍光の検知から生じるクロストークについて修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。２６．修正されたＦＲＥＴ画像を更に、アクセプターフィルターセットを使用するドナーのみの試料からの信号であるＡｄの非ゼロ値、およびドナーフィルターセットを使用するアクセプターのみの試料からの信号であるＤａの非ゼロ値について修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。２７．修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを更に、ドナーの濃度について正規化することにより修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。２８．修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを更に、１／Ｄｆ（ここで、Ｄｆは生物学的物質中にドナーおよびアクセプターの双方が存在するときドナーフィルターセットを介して発生する信号である）の修正を適用することによりドナーの濃度がほぼ正規化されるように修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。２９．修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを更に、アクセプターの濃度について正規化することにより修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。３０．修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを更に、１／Ａｆ（ここで、Ａｆは生物学的物質中にドナーおよびアクセプターの双方が存在するときアクセプターフィルターセットを介して発生する信号である）の修正を適用することによりアクセプターの濃度がほぼ正規化されるように修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。３１．修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを更に、ドナーおよびアクセプターの双方の濃度について正規化することにより修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。３２．修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを更に、１／（Ｄｆ×Ａｆ）（ここで、Ｄｆはドナーおよびアクセプターの双方が存在するときドナーフィルターセットを介して発生する信号であり、Ａｆはドナーおよびアクセプターの双方が存在するときアクセプターフィルターセットを介して発生する信号である）の修正を適用することによりドナーおよびアクセプターの双方の濃度がほぼ正規化されるように修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。３３．修正されたＦＲＥＴ画像を更に、アクセプター放射チャンネルを介してのドナー蛍光の検知から生じるクロストークについて、およびドナー放射チャンネルを介してのアクセプター蛍光の検知から生じるクロストークについて修正することにより、およびドナーおよびアクセプターの双方の濃度を正規化することにより修正する工程を含む請求の範囲２４記載の方法。３４．初期ＦＲＥＴ画像が約５％未満の光漂白を有する請求の範囲２４記載の方法。３５．ＦＲＥＴを測定するための光学機器であって、ドナー分子およびアクセプター分子を有するＦＲＥＴ標準で較正され、アクセプター分子蛍光増感の測定強度を、消光するドナー分子の相当量へ関連づけるようにした光学機器。３６．既知のＦＲＥＴ特性を有するドナー分子およびアクセプター分子を担持するＦＲＥＴ標準を使用して、光学機器を較正し、ＦＲＥＴ測定を行えるようにした請求の範囲３５記載の光学機器。３７．該ＦＲＥＴ測定を、ＦＲＥＴ効率Ｅが生じるよう処理できるようにした請求の範囲３５記載の光学機器。３８．該ＦＲＥＴ測定を、ドナー分子およびアクセプター分子を分離する距離ｒが生じるよう更に処理できるようにした請求の範囲３５記載の光学機器。３９．エピ蛍光キューブ内のフィルターを、ウエッジ・パラレリズムが１５アーク秒以下で、ウエーブ平面度が１０以下の光学表面に基づいて、選択した請求の範囲３５記載の光学機器。４０．各々が３つの色空間座標を有する画素のセットで表された生物学的物質の初期画像を、処理された画像に変形するための、コンピュータ読取り可能な媒体に依存するコンピュータプログラムであって、該コンピュータプログラムが、以下の工程をコンピュータに行わせることを特徴とするもの：（ａ）初期画像において少なくとも２つの画像領域を選択する工程であって、各画像領域が少なくとも１つの画素を含み、該画像領域が少なくとも２つの区別可能なスペクトルカテゴリーを規定するもの；（ｂ）選択された画像領域の夫々の画素の色空間座標に基づいて、該初期画像に対し色空間変形を行い、処理された画像を発生させる工程；および（ｃ）この処理された画像を、改良された色の空間分布の可視指標について評価する工程。４１．各々が３つの色空間座標を有する画素のセットで表された初期ＦＲＥＴ画像を、処理されたＦＲＥＴ画像に変形するための、コンピュータ読取り可能な媒体に依存するコンピュータプログラムであって、該コンピュータプログラムが、以下の工程をコンピュータに行わせることを特徴とするもの：（ａ）修正されたＦＲＥＴチャンネル画像Ｆ^Cを得るため、下記変形式を適用することによりスペルトル重複を修正することにより初期画像から修正されたＦＲＥＴ画像を発生させる工程；（ｂ）修正されたＦＲＥＴ画像において少なくとも２つの画像領域を選択する工程であって、各画像領域が少なくとも１つの画素を含み、該画像領域が少なくとも２つの区別可能なスペクトルカテゴリーを規定するものと；（ｃ）選択された画像領域の夫々の画素の色空間座標に基づいて、該修正画像に対し色空間変形を行い、処理された画像を発生させる工程；および（ｄ）この処理された画像を、改良された色の空間分布の可視指標について評価する工程。