DE102014203266B4

DE102014203266B4 - Zusammensetzung mit FRET-Paar in definierter Geometrie

Info

Publication number: DE102014203266B4
Application number: DE102014203266.0A
Authority: DE
Inventors: Anne Enzenberg; Christine Boeffel; André Laschewsky; Erik Wischerhoff
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2014-02-24
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2018-07-19
Anticipated expiration: 2034-02-25
Also published as: WO2015124690A1; DE102014203266A1; EP3111217A1

Abstract

Eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten, umfassend- zumindest ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar,- zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül, das eine Molmasse von weniger als 300 g/mol aufweist, gebildet wird, wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit den Donor und den Akzeptor miteinander verbindet, und entweder der Donor oder der Akzeptor über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten.
Hochempfindliche Systeme, die über eine spezifische Erkennungsreaktion biologischer Bindungspartner (z. B. ein Antikörper-Antigen-Paar) die Anwesenheit eines Analyten bis hin zu sehr geringen Konzentrationen optisch anzeigen können, sind von hoher Bedeutung in der Sensorik. Besonders in der biomedizinischen Forschung, Biologie, Medizin und Biochemie ist eine mit dem bloßen Auge oder allenfalls mit einfachen Hilfsmitteln erkennbare Analytdetektion erwünscht, um z.B. Krankheiten schneller und kostengünstiger diagnostizieren zu können. Ein spezielles Problem liegt darin, dass die zu detektierenden Mengen häufig sehr gering und die Analytkonzentrationen sehr niedrig sind. Daher benötigen derartige Nachweise eine hohe Empfindlichkeit.
Eine zum Beispiel in immunchromatographischen Schnelltests weit verbreitete Möglichkeit, die Gegenwart eines Analyten visuell anzuzeigen, ist die Nutzung eines sogenannten Sandwich-Immunassays. Hier dienen an einem festen Träger immobilisierte Erkennungseinheiten, meist Antikörper, als „Fänger“ für das nachzuweisende Antigen (den Analyten); mit dem bloßen Auge sichtbar gemacht wird die Anwesenheit des Analyten durch einen markierten Sekundärantikörper. Als Markierungsreagenz werden z. B. Goldnanopartikel oder farbige Latexpartikel verwendet. Das Prinzip findet kommerziell in großem Umfang Anwendung, z. B. in Massenartikeln wie Schwangerschaftstests für die Heimanwendung. Es setzt jedoch voraus, dass pro Analyt zwei unterschiedliche Erkennungsgruppen zur Verfügung stehen.
Alternativ dazu gibt es auch sogenannte Verdrängungsassays. Hier wird ein markierter Analyt-kompetitiver Binder, der an eine immobilisierte Erkennungseinheit gebunden ist, von Analytmolekülen verdrängt. Nachteil ist hierbei, dass ein eindeutiger Nachweis der Bindungsereignisse bei kleinen Analytkonzentrationen schwierig ist, da dann nicht alle markierten kompetitiven Binder verdrängt werden.
Eine weitere Möglichkeit, Detektion mit dem bloßen Auge zu ermöglichen, bieten photonische Kristalle [Asher, S.A. Clinical Chemistry 2004, 50, 2353]. Darauf basierende Nachweise sind aber zum einen nicht sehr empfindlich, da die Verschiebung der Absorptionswellenlänge proportional zur Zahl der Bindungsereignisse ist; zum anderen ist die Methode bisher nur für kleine Analytmoleküle wie z. B. Glukose anwendbar.
Bei einer weiteren Strategie zur visuellen Anzeige einer Analytbindung, die sich nach dem Stand der Technik nur für Polynukleotide (DNA / RNA) einsetzen lässt, werden komplementäre Polynukleotidstränge an Positionen markiert, die nach Basenpaarung (also dem Erkennungsvorgang) einen so geringen Abstand aufweisen, dass ein effizienter Energietransfer stattfinden kann, siehe z.B. Didenko, V.V. Biotechniques 2001, 5, 1106. Es werden dabei Donor-Akzeptor-Paare verwendet, zwischen denen ein strahlungsfreier Energietransfer stattfinden kann. Beispielsweise kann es sich bei Donor und Akzeptor um unterschiedliche Fluorophore handeln. Alternativ kann der Donor beispielsweise ein Fluorophor sein, während der Akzeptor ein Fluoreszenzlöscher ist. Weisen Donor und Akzeptor auf den komplementären Polynukleotidsträngen einen ausreichend geringen Abstand auf, so kommt es zu einem strahlungsfreien Energietransfer vom Donor zum Akzeptor. Als Folge dieses Energietransfers zeigt der Donor keine Fluoreszenz mehr, während der Akzeptor entweder die transferierte Energie strahlungsfrei emittiert und somit als Fluoreszenzlöscher fungiert oder seinerseits in der für ihn charakteristischen Wellellänge fluoresziert. Werden die komplementären Polynukleotidstränge und damit auch Donor und Akzeptor räumlich voneinander separiert, ist ein strahlungsfreier Energietransfer vom Donor zum Akzeptor nicht mehr möglich, was dazu führt, dass der Donor wieder fluoresziert.
In der heutigen Praxis wird diese Markierung häufig mit Fluoreszenzfarbstoffen vorgenommen. Andere Methoden wie z.B. das Markieren mit Nanopartikeln oder Quanten-Punkten werden ebenfalls bereits häufig angewendet. Besonders in der Biochemie ist die Bindung von markierter DNA/RNA durch Basenpaarung eine wichtige Nachweismethode [Didenko, V.V. Biotechniques 2001, 5, 1106.]. Die Methode besitzt vor allem dann den Vorteil hoher Empfindlichkeit, wenn einer der komplementären Polynukleotidstränge einen Fluoreszenzlöscher trägt und der andere fluoreszenzmarkiert ist. Wird dann der Strang mit dem Fluoreszenzlöscher durch eine stärker bindende unmarkierte DNA/RNA-Sequenz aus einer Probe verdrängt, äußert sich dies in dem Übergang von einem dunklen in einen fluoreszierenden Zustand. Derartige Übergänge sind optisch sehr gut zu erfassen.
Die Nutzung dieses Messprinzips unter Verwendung von Akzeptor-Donor-Paaren, zwischen denen ein strahlungsfreier Resonanzenergietransfer stattfinden kann, ist bisher auf DNA/RNA beschränkt, da die für den Energietransfer erforderliche geometrische Nähe der Marker nur bei Polynukleotiden gewährleistet ist [Bao, G.; Rhee, W., J.; Tsourkas, A. Ann Rev. Biomed. Engineering 2009, 11, 25-47.]. Wichtige Analyten wie z. B. Proteine oder Polysaccharide sind mit diesem Meßprinzip bisher nicht zu erfassen.
DE 603 10 032 T2 beschreibt lumineszierende anorganische Nanopartikel, umfassend (a) einen Kern, hergestellt aus einem ersten Metallsalz oder -oxid, umgeben von (b) einer Hülle, die hergestellt ist aus einem luminiszierenden Metallsalz und die keine Halbleitereigenschaften aufweist.
DE 101 53 829 A1 beschreibt einen Assay auf der Basis eines Resonanz-EnergieTransfers (RET), umfassend eine erste Molekülgruppe A, die mit mindestens einem Energie-Donor (Donor) markiert ist, und mindestens eine zweite Molekülgruppe B, die mit mindestens einem Energie-Akzeptor (Akzeptor) markiert ist, wobei der Donor ein Molekül oder Teilchen umfasst, das durch eine äußere Strahlungsquelle energetisch anregbar und fluoreszenzfähig ist, der Akzeptor ein Molekül oder Teilchen umfasst, das durch Energietransfer über den Donor unter teilweiser oder vollständiger Löschung der Donor-Fluoreszenz anregbar ist.
EP 1 592 813 B1 beschreibt ein homogenes Assay-Verfahren zum Detektieren eines Donor-Produktes einer enzymatisch katalysierten Gruppentransferreaktion, wobei das homogene Assay-Verfahren umfasst:

(a) Kombinieren des Donor-Produktes mit einem ersten Komplex, der einen Antikörper umfasst,
(b) kompetitives Verdrängen der detektierbaren Markierung des ersten Komplexes durch das Donorprodukt unter Erzeugung eines zweiten Komplexes,
(c) Detektieren einer Änderung bei dem beobachtbaren Resultat.

DE 10 2010 025 496 A1 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Detektion mindestens einer Genveränderung, wobei das Verfahren mittels asymmetrischer Polymerase-Kettenreaktion unter kombinierter Verwendung mindestens einer detektierbaren mutationspezifischen Hybridisierungssonde (Sensorsonde) einerseits und mindestens eines die Anbindung der Sensorsonde an die Wildtypgene inhibierenden wildtypspezifischen Blockierungsmittels durchgeführt wird.
US 2002/0118870 A1 beschreibt ein Verfahren für das Transformieren eines Ausgangsbilds eines biologischen Materials in ein bearbeitetes Bild, wobei in dem Ausgangsbild mindestens zwei Bildbereiche ausgewählt und eine Farbraumtransformation durchgeführt werden, so dass ein bearbeitetes Bild erhalten wird.
DE 10 2005 051 978 A1 beschreibt ein Verfahren zur Untersuchung der enzymatischen Spaltbarkeit von Substraten, dadurch gekennzeichnet, daß man a) Verbindungen bereitstellt, die - an eine erste Festphase gebunden sind oder auf dieser synthetisiert werden; - eine Komponente 1 aufweisen, die der ersten Festphase zugewandt ist und quantifiziert werden kann; - einen auf enzymatische Spaltbarkeit zu analysierenden Abschnitt aufweisen; - eine Komponente 2 aufweisen, die von der ersten Festphase abgewandt ist und direkt oder über einen Bindungspartner an eine zweite Festphase binden kann; b) die Verbindungen nach Abspaltung von der ersten Festphase in Lösung mit einem Enzym oder Enzymge misch in Kontakt bringt; c) die gespaltenen und ungespaltenen Verbindungen anschließend an eine zweite Festphase bindet, die identisch mit der ersten Festphase sein kann, wobei die Bindung über Komponente 2 erfolgt, die direkt an die zweite Festphase oder an einen auf der zweiten Festphase aufgebrachten Bindungspartner bindet; d) die nichtimmobilisierten Bestandteile von der zweiten Festphase abtrennt; e) die Menge der ungespaltenen Verbindungen nachweist, indem man Komponente 1 quantifiziert; und f) die Spaltbarkeit bestimmt, indem man die Menge der ungespaltenen Verbindungen vor und nach der Spaltungsreaktion vergleicht.
DE 698 11 724 T2 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Phosphorylierungsaktivität eines Enzyms, das die folgenden Stufen umfasst:

(a) Kombination des Enzyms mit
1. (i) einem Reportermolekül, das eineFluoreszenzmarkierung und eine phosphorylierte Aminosäure umfasst;
2. (ii) einem Substratmolekül;
3. (iii) einem Antikörper und
4. (iv) einer Phosphatquelle;
(b) Messung von FQ oder FCS des Reporters anschließend an Stufe (a) und
(c) Verwendung der FQ- oder FCS-Messung zur Bestimmungder Aktivität des Enzyms.

DE 103 43 375 A1 beschreibt ein Verfahren zur Detektion und quantitativen und/oder qualitativen Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, umfassend die Verfahrensschritte a) proteolytische Freisetzung mindestens eines Proteins mit mindestens einer detektierbaren Eigenschaft aus einer Protein-Protein-Interaktion und b) Detektion und gegebenenfalls Quantifizierung des mindestens einen freigesetzten Proteins an Hand seiner detektierbaren Eigenschaften.
DE 101 08 263 A1 beschreibt ein Verfahren zur Analyse von Modifizierungen von Proteinen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein Zielprotein, (ii) mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem mindestens einen Zielprotein und dem mindestens einen Ubiquitin-verwandten Protein bewirken; (iv) ATP und/oder ein ATP- Derivat, und in Kontakt bringen der Bestandteile (i)-(iv) und
b) Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitinverwandtem Protein durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.

DE 600 16 898 T2 beschreibt einen lumineszierenden Lanthaniden-Metall-Chelatkomplex, umfassend ein Metall-Ion der Lanthaniden-Reihe und ein komplexierendes Mittel, das wenigstens eine 2-Hydroxyisophthalamidyl-Einheit umfasst.
DE 600 12 485 T2 beschreibt einen lumineszierenden Lanthanidenmetall-Chelatkomplex, umfassend ein Metall-Ion der Lanthaniden-Reihe und ein komplexierendes Mittel, das wenigstens eine Salicylamidyl-Einheit umfasst.
DE 600 01 531 T2 beschreibt eine Verbindung der folgenden Formel
sowie ein Verfahren zum Nachweis einer Veränderung des Trennungsabstands zwischen einem oder mehreren Donor-Luminophoren und Akzeptor-Quencher-Verbindungen in einer Probe, worin wenigstens eine Quencher-Verbindung die oben angegebene Formel aufweist.
DE 10 2007 018 833 A1 beschreibt ein Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuresequenz eines Nukleinsäureanalyten, umfassend die Schritte: (a) in-situ-Synthese wenigstens einer Oligonukleotidsonde in einer miniaturisierten Flusszelle; (b) Zugabe wenigstens eines Nukleinsäureanalyten zu den miniaturisierten Flusszellen; (c) Ligation oder sequenzspezifische Hybridisierung des Nukleinsäureanalyten an die Oligonukleotidsonde; und (d) wenigstens ein templatabhängiger Nukleinsäuresyntheseschritt, der mit einer Änderung in einem optischen oder elektrischen Signal einhergeht.
US 2006/0292581 A1 beschreibt eine Zusammensetzung für den Nachweis eines Analyten, wobei die Zusammensetzung ein gereinigtes Protein, eine gereinigte Nukleinsäure sowie ein Detektionssystem, das eine Bindungsänderung zwischen dem Protein und der Nukleinsäure in Anwesenheit des Analyten anzeigt, umfasst.
WO 2007/016665 A2 beschreibt ein Assaysystem für den einmaligen Gebrauch zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei das Assaysystem intrinsisch fluoreszierende Nanokristallite umfasst.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung, die die Anwesenheit eines Analyten (bevorzugt im Bereich der Biologie, Medizin oder Biochemie) bis hin zu sehr geringen Konzentrationen optisch anzeigen kann, wobei die Analytdetektion mit dem bloßen Auge oder allenfalls mit einfachen Hilfsmitteln erfolgen kann, ohne das der Analyt selber markiert werden muß.
Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten, umfassend

- zumindest ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar,
- zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül (d.h. einem Molekül mit mindestens zwei funktionellen Gruppen), das eine Molmasse von weniger als 300 g/mol aufweist, gebildet wird,

In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird ein zumindest bifunktionelles Molekül (d.h. ein Molekül, das zumindest zwei funktionelle Gruppen aufweist) als Verknüpfungseinheit verwendet. Diese durch das zumindest bifunktionelle Molekül (nachfolgend auch als verknüpfendes Molekül bezeichnet) geschaffene Verknüpfungseinheit bringt Donor und Akzeptor des FRET-Paares in eine definierte räumliche Nähe, so dass ein strahlungsfreier Energietransfer stattfinden kann. Wie nachfolgend noch eingehender beschrieben wird, kann eine funktionelle Gruppe des Verknüpfungsmoleküls ausreichend sein, um die Anbindung des FRET-Paares zu ermöglichen (z.B. im Fall einer cyclischen Säureanhydridgruppe oder einer Epoxidgruppe). In diesem Fall steht zumindest noch eine zweite funktionelle Gruppe für eine weitere Reaktion zur Verfügung, beispielsweise um eine Anbindung an ein Substrat (beispielsweise ein Polymer) zu ermöglichen. Alternativ kann die Anbindung des FRET-Paares an das verknüpfende Molekül über zwei funktionelle Gruppen erfolgen. In dieser Anordnung kommt es zu einem strahlungsfreien Energietransfer zwischen Donor und Akzeptor des FRET-Paares und der Donor zeigt daher keine Lumineszenz (z.B. in Form von Fluoreszenz oder Phosphoreszenz). In Abhängigkeit von der Art des Akzeptors zeigt die Zusammensetzung dann entweder keine Lumineszenz (d.h. Akzeptor ist ein Löscher) oder es luminesziert in der für den Akzeptor charakteristischen Wellenlänge. Da entweder der Donor oder der Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen mit dieser Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkenden Analyt-kompetitiven Binder verbunden ist, kann die Anwesenheit des Analyten und dessen Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit eine Ablösung des Donors oder Akzeptors von der Verknüpfungseinheit bewirken. Dies führt zu einer räumlichen Separierung des FRET-Donor-Akzeptor-Paares, wodurch die Lumineszenzstrahlung des Donors in Anwesenheit des Analyten wieder aktiviert wird.
Um die räumliche Separierung von Donor und Akzeptor in Anwesenheit des Analyten weiter zu verbessern, umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung bevorzugt noch ein Substrat, wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit mit diesem Substrat verbunden ist. In dieser bevorzugten Ausführungsform verbindet also die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül gebildete Verknüpfungseinheit Donor, Akzeptor und Substrat miteinander. Wird entweder der Donor oder alternativ der Akzeptor in Anwesenheit des Analyten von der Verknüpfungseinheit abgetrennt, bleibt die verbleibende Komponente des FRET-Paares am Substrat immobilisiert. Wie nachfolgend noch ausführlicher beschrieben wird, kann es sich bei dem Substrat beispielsweise um ein Polymer oder eine Festkörperoberfläche handeln. Das Polymer kann beispielsweise auf einer Festkörperoberfläche immobilisiert sein (z.B. in Form einer Beschichtung). Durch eine solche dauerhafte direkte oder indirekte (z.B. über ein Polymer erfolgende) Immobilisierung der Verknüpfungseinheit auf einer Festkörperoberfläche wird die räumliche Separierung von Donor und Akzeptor in Anwesenheit des Analyten noch weiter verbessert.
Wie dem Fachmann bekannt ist, steht „FRET“ für „Förster-Resonanzenergietransfer“. Bei dem Donor des FRET-Paares handelt es sich um einen Luminophor (z.B. einen organischen oder anorganischen Fluorophor oder eine organische bzw. anorganische phosphoreszierende Komponente), der im angeregten Zustand Energie strahlungsfrei auf den Akzeptor transferiert, sofern sich Donor und Akzeptor ausreichend nahe sind. Der Abstand, in dem ein strahlungsfreier Resonanzenergietransfer zwischen Donor und Akzeptor noch möglich ist, kann maximal einige Nanometer betragen. Ein geeigneter Abstand eines gegebenen FRET-Donor-Akzeptor-Paares, in dem ein strahlungsfreier Resonanzenergietransfer noch möglich ist, ist dem Fachmann entweder grundsätzlich bekannt (z.B. anhand bekannter Förster-Radien bzw. Förster-Abstände) oder kann vom Fachmann über Routineversuche bestimmt werden.
Der Akzeptor kann ebenfalls ein Luminophor oder auch ein Lumineszenzlöscher (z.B. ein Fluoreszenzlöscher), also eine Komponente, die die auf sie transferierte Energie nicht in Form von Lumineszenz emittiert, sein.
Geeignete FRET-Donor-Akzeptor-Paare sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt.
Der Donor kann ein organischer oder anorganischer Luminophor sein. Der Luminophor kann beispielsweise fluoreszierend (d.h. ein Fluorophor), phosphoreszierend, chemolumineszierend oder biolumineszierend sein.
Ein geeigneter FRET-Donor, der Fluoreszenz zeigen kann, ist dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Beispielhaft können Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Xanthenfarbstoffe (beispielsweise Rhodamine, Fluoreszein), Naphthalimide, Cumarine, Cyanin-Farbstoffe, Oxazine, Pyrene, Porphyrine, Acridine, konjugierte Oligomere oder Polymere (d.h. Oligomere bzw. Polymere mit konjugierten Doppelbindungen wie z.B. Oligothiophene) genannt werden. Solche Fluoreszenzfarbstoffe sind kommerziell oder über herkömmliche, dem Fachmann bekannte Syntheseverfahren erhältlich. Auch fluoreszierende Nanopartikel, beispielsweise fluoreszierende halbleitende Nanopartikel bzw. fluoreszierende Quantenpunkte, können als Donor im FRET-Paar verwendet werden. Beispielhaft können als fluoreszierende Nanopartikel solche Nanopartikel genannt werden, die CdSE, CdS oder Indiumphosphid enthalten. Der mittlere Durchmesser solcher fluoreszierender Nanopartikel kann über einen breiten Bereich variieren und beträgt beispielsweise 1 nm - 15 nm oder auch 1,5 nm - 10 nm. Solche fluoreszierenden Nanopartikel sind kommerziell oder über herkömmliche, dem Fachmann bekannte Herstellungsverfahren erhältlich.
Ein geeigneter FRET-Donor, der Phosphoreszenz zeigen kann, ist dem Fachmann ebenfalls grundsätzlich bekannt. Beispielhaft können Tris[2-(4-MethylPhenyl)pyridyl]Iridium, Tris[9,9-Dihexyl-2-pyridinyl-2')fluorenyl] Iridium und phosphoreszierende Nanopartikel wie z.B. ZnS-Nanopartikel genannt werden. Der mittlere Durchmesser phosphoreszierender Nanopartikel kann über einen breiten Bereich variieren und beträgt beispielsweise 1 nm - 15 nm oder auch 1,5 nm - 10 nm.
Wie bereits oben erwähnt, kann es sich bei dem Akzeptor des FRET-Paares um einen Luminophor oder einen Lumineszenzlöscher handeln.
Geeignete Luminophore, die als Akzeptor in einem FRET-Paar fungieren können, sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. In diesem Zusammenhang kann auf die oben genannten bevorzugten Donor-Luminophore verwiesen werden, wobei Donor und Akzeptor unterschiedlich sind. Bevorzugt werden Donor und Akzeptor so ausgewählt, dass sich die Wellenlängen der vom Donor und Akzeptor emittierten Lumineszenzstrahlung (z.B. Fluoreszenzstrahlung oder Phosphoreszenzstrahlung) möglichst stark unterscheiden und der Wellenlängenunterschied somit bevorzugt vom Betrachter mit bloßem Auge wahrnehmbar ist. Alternativ ist es aber auch möglich, dass der Akzeptor ein Lumineszenzlöscher (z.B. Fluoreszenzlöscher oder Phosphoreszenzlöscher) ist, d.h. eine Komponente, die keine Lumineszenzstrahlung emittiert. Solche Löscher sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Geeignete Fluoreszenzlöscher sind beispielsweise Metall-Nanopartikel wie z.B. Gold-Nanopartikel, Silber-Nanopartikel, organische Verbindungen, die Viologen-Strukturen enthalten, oder organische Verbindungen, die Nitroaromaten enthalten. Der mittlere Durchmesser von Nanopartikeln, die als Lumineszenzlöscher fungieren, kann über einen breiten Bereich variieren und beträgt beispielsweise 1-10 nm.
Wie oben ausgeführt, enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül (d.h. einem Molekül mit mindestens zwei funktionellen Gruppen) gebildet wird. Über die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül erhaltene Verknüpfungseinheit sind der FRET-Donor, der FRET-Akzeptor und, sofern vorhanden, das Substrat miteinander verbunden, wobei entweder der Donor oder der Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen mit dieser Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkenden Analyt-kompetitiven Binder verbunden ist. Bevorzugt handelt es sich bei dem verknüpfenden Molekül um ein organisches Molekül. Für die Anbindung des FRET-Paares kann eine funktionelle Gruppe ausreichend sein (beispielsweise eine Epoxidgruppe oder eine cyclische Anhydridgruppe). Die Anbindung des FRET-Paares kann aber auch über zwei funktionelle Gruppen erfolgen. Weiterhin kann eine funktionelle Gruppe des verknüpfenden Moleküls ausreichend sein, um die Anbindung an das Substrat zu bewirken. Alternativ kann die Anbindung an das Substrat auch über zwei oder mehr funktionelle Gruppen erfolgen (beispielsweise zwei OH-Gruppen in dem verknüpfenden Molekül, die über eine Polykondensation einen Einbau des verknüpfenden Moleküls in eine Polymerkette bewirken). Bevorzugt enthält das verknüpfende Molekül 2-4 oder 2-3 funktionelle Gruppen.
Wie bereits oben erwähnt, weiß der Fachmann (z.B. anhand bekannter Förster-Radien bzw. -Abstände für bestimmte FRET-Paare) oder kann der Fachmann über Routineversuche bestimmen, bis zu welchem Abstand zwischen Donor und Akzeptor noch ein Resonanzenergietransfer möglich ist. Auf der Basis dieser Kenntnis kann der Fachmann zumindest bifunktionelle Moleküle geeigneter Größe auswählen, die sicher stellen, dass Donor und Akzeptor nach ihrer Anbindung an die Verknüpfungseinheit nicht zu weit voneinander entfernt sind. Beispielsweise kann es sich um ein Molekül handeln, bei dem der jeweilige Abstand zwischen den funktionellen Gruppen kleiner ist als der Förster-Radius bzw. Förster-Abstand oder sogar kleiner als der halbe Förster-Radius des verwendeten FRET-Donor-Akzeptor-Paares. Bei dem verknüpfenden Molekül handelt es sich um ein Molekül (bevorzugt ein organisches Molekül) mit relativ geringer Molmasse von weniger als 300 g/mol, bevorzugt weniger als 250 g/mol oder sogar weniger als 200 g/mol. Indem FRET-Donor und FRET-Akzeptor an die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit gebunden sind, befinden sich diese in einer definierten räumlichen Anordnung bzw. geometrischen Konfiguration zueinander.
Geeignete funktionelle Gruppen des verknüpfenden Moleküls, bevorzugt des verknüpfenden organischen Moleküls, kann der Fachmann ohne weiteres auswählen. Es kann sich beispielsweise um eine funktionelle Gruppe, die ein oder mehrere Heteroatome (z.B. O, N oder S) enthält, oder auch um eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung oder-Dreifachbindung handeln. Beispielhafte funktionelle Gruppen sind Carbonsäuren oder deren Salze, Säureanhydride (bevorzugt cyclische Säureanhydridgruppen), Hydroxy- (Alkohole oder Phenole), Thiol-, Amino- oder Ethergruppen (bevorzugt cyclische Ethergruppen wie z.B. Epoxid), Thiocarbonsäuren oder deren Salze, Sulfonsäuren oder deren Salze, Sulfoxide, Nitrile, Aldehyde, Thioaldehyde, Thioether (bevorzugt cyclische Thioethergruppen), Carbonsäurehalogenide, Thiocarbonsäurehalogenide, Sulfonsäurehalogenide, Ketone, Carbonsäureester, Thiocarbonsäureester, Imine oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen oder -Dreifachbindungen. Mindestens zwei dieser beispielhaften funktionellen Gruppen sind in dem verknüpfenden Molekül vorhanden.
Beispielhaft können als verknüpfende, zumindest bifunktionelle Moleküle, aus denen die Verknüpfungseinheit in der Zusammensetzung erhalten wird, unter anderem funktionelle Aminosäuren (wie z.B. Serin Lysin, Asparagin, Glutamin oder Cystein), funktionelle Epoxide (wie z.B. Glycidylmethacrylat), funktionelle Anhydride wie z.B. Maleinsäureanhydrid, Itaconsäureanhydrid oder Allylbernsteinsäureanhydrid, und Acrylverbindungen wie z. B. 2-Acrylamido-2-hydroxyessigsäure genannt werden.
Da entweder der Donor oder der Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder verbunden ist, kann die Anwesenheit des Analyten und dessen Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit eine Ablösung dieses Donors oder Akzeptors von der Verknüpfungseinheit bewirken.
Sobald der zu detektierende Analyt festgelegt ist, kann der Fachmann aufgrund seines allgemeinen Fachwissens eine geeignete Analyt-spezifische Erkennungseinheit auswählen. Beispielhaft können unter anderem kleinere Gruppen wie Biotin, Zucker, Aminosäuren, aber auch größere Einheiten wie Peptide, Proteine, Polysaccharide, Antikörper, F_ab-Fragmente von Antikörpern, Enzyme, Enzymfragmente, Coenzyme, prosthetische Gruppen und Aptamere genannt werden. Letztgenannte sind als Erkennungseinheiten vor allem für die Detektion von Krankheitserregern wie Bakterien oder Viren von großem Interesse.
Die Verwendung von Analyt-kompetitiven Bindern im Zusammenspiel mit Analyt-spezifischen Erkennungseinheiten und Analyten ist dem Fachmann grundsätzlich aus Verdrängungsassays bzw. kompetitiven Assays bekannt. Sobald also der zu detektierende Analyt festgelegt ist, kann der Fachmann aufgrund seines allgemeinen Fachwissens nicht nur eine geeignete Analyt-spezifische Erkennungseinheit, sondern auch einen geeigneten Analyt-kompetitiven Binder auswählen. Als beispielhafte kompetitive Binder können unter anderem kleinere Gruppen wie Biotin, Zucker, Aminosäuren, Nukleinsäuren, aber auch Peptide, Proteine, Nukleotide, Oligosaccharide oder Polysaccharide genannt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet also der Begriff „Analytspezifische Erkennungseinheit“, in Übereinstimmung mit dem allgemeinen Verständnis des Fachmanns, eine Einheit oder Gruppe, die aufgrund ihrer chemischen Struktur eine ausreichend starke Wechselwirkung mit dem Analyten zeigt und diesen dadurch an sich binden kann. Weiterhin bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung der Begriff „Analyt-kompetitiver Binder“, in Übereinstimmung mit dem allgemeinen Verständnis des Fachmanns, eine Einheit oder Gruppe, die aufgrund ihrer chemischen Struktur eine ausreichend starke Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit zeigt, um aufgrund dieser Wechselwirkung an diese gebunden sein zu können, jedoch in Anwesenheit des Analyten von dieser Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wieder abgetrennt wird. Sowohl der Analyt wie auch der Analyt-kompetitive Binder können also mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirken und dadurch an diese gebunden sein, wobei jedoch der Analyt im Vergleich zum Analyt-kompetitiven Binder eine stärkere Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit zeigt und daher den Analyt-kompetitiven Binder verdrängen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass der FRET-Donor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, der Analyt-kompetitive Binder mit dem FRET-Akzeptor markiert ist und durch seine Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit den FRET-Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung des Analyt-kompetitiven Binders mit dem FRET-Akteptor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind. Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein (beispielsweise ein oder mehrere Analyt-kompetitive Binder, die auf der Oberfläche eines als FRET-Akzeptors fungierenden Nanopartikels vorliegen).
Alternativ ist es möglich, dass der FRET-Donor und der Analyt-kompetitive Binder kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, die Analyt-spezifische Erkennungseinheit mit dem FRET-Akzeptor markiert ist und durch ihre Wechselwirkung mit dem Analyt-kompetitiven Binder den FRET-Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit mit dem FRET-Akteptor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind. Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein (beispielsweise ein oder mehrere Analyt-spezifische Erkennungseinheiten, die auf der Oberfläche eines als FRET-Akzeptors fungierenden Nanopartikels vorliegen).
Alternativ ist es möglich, dass der FRET-Akzeptor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, der Analyt-kompetitive Binder mit dem FRET-Donor markiert ist und durch seine Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit den FRET-Donor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung des Analyt-kompetitiven Binders mit dem FRET-Donor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind. Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein (beispielsweise ein oder mehrere Analyt-kompetitive Binder, die auf der Oberfläche eines als FRET-Donor fungierenden Nanopartikels vorliegen).
Alternativ ist es möglich, dass der FRET-Akzeptor und der Analyt-kompetitive Binder kovalent an die Verknüpfungseinheit gebunden sind, die Analyt-spezifische Erkennungseinheit mit dem FRET-Donor markiert ist und durch ihre Wechselwirkung mit dem Analyt-kompetitiven Binder den FRET-Donor mit der Verknüpfungseinheit verbindet. Die Markierung der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit mit dem FRET-Donor kann erfolgen, indem diese beiden Komponenten über eine kovalente Verbindung miteinander verbunden sind. Alternativ können diese beiden Komponenten auch nicht-kovalent miteinander verbunden sein (beispielsweise ein oder mehrere Analyt-spezifische Erkennungseinheiten, die auf der Oberfläche eines als FRET-Donors fungierenden Nanopartikels vorliegen).
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann prinzipiell für die Detektion einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten eingesetzt werden. Bevorzugte Analyten sind beispielsweise Biooligomere, Biopolymere oder biologische Partikel. Beispielhafte Biooligomere sind Oligopeptide, Oligosaccharide und Oligonucleotide. Beispielhafte Biopolymere sind Polypeptide, Proteine, Polysaccharide, Polynucleotide und Nucleinsäuren. Beispielhafte biologische Partikel sind Viren und Bakterien.
Wie oben bereits ausgeführt, ist die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit bevorzugt auch mit einem Substrat verbunden und immobilisiert dadurch das FRET-Donor-Akzeptor-Paar.
Bevorzugt ist das Substrat durch eine Reaktion mit einer der funktionellen Gruppen des zumindest bifunktionellen Moleküls kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden.
Bei dem Substrat kann es sich beispielsweise um ein organisches oder anorganisches Polymer handeln. Es kann sich auch um eine Festkörperoberfläche handeln. Wenn das Substrat ein Polymer ist, kann es bevorzugt sein, dieses Polymer wiederum auf einer Festkörperoberfläche zu immobilisieren. Diese direkte oder indirekte (z.B. über das auf der Festkörperoberfläche aufgebrachte Polymer) Immobilisierung bietet den Vorteil, daß der durch den Analyten verdrängte Akzeptor (oder alternativ der durch den Analyten verdrängte Donor) durch Spülen vollständig aus dem System entfernt werden kann. So können Intensitätsverluste dadurch, dass der dann frei bewegliche verdrängte Akzeptor zufällig wieder in unmittelbare Nähe des Donors gerät, vermieden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Verknüpfungseinheit als Wiederholeinheit in einem Polymer vor. In diesem Fall wird eine funktionelle Gruppe des zumindest bifunktionellen Moleküls für eine Polymerisation mit weiteren Monomeren genutzt und das zumindest bifunktionelle Molekül wird in die Polymerkette eingebaut. Dabei können beispielsweise zunächst der Donor und der Akzeptor mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden werden und dieses bereits das FRET-Donor-Akzeptor-Paar tragende Molekül wird anschließend zusammen mit weiteren Monomeren polymerisiert. Alternativ ist es beispielsweise auch möglich, zunächst nur den FRET-Donor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit (alternativ: den Analyt-kompetitiven Binder) kovalent an das verknüpfende Molekül zu binden, dieses Molekül dann mit weiteren Monomeren zu polymerisieren und anschließend den mit dem Analyt-kompetitiven Binder (kovalent oder nicht-kovalent) verbundenen FRET-Akzeptor zuzugeben. Aufgrund der hohen Nachweisempfindlichkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann der Anteil der Monomere, die ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar bzw. zunächst nur den FRET-Donor oder FRET-Akzeptor aufweisen, recht gering gehalten werden, beispielsweise weniger als 5 Mol% oder sogar weniger als 2 Mol%, bezogen auf die Gesamtmenge der Monomere.
Wenn das zumindest bifunktionelle Molekül in eine Polymerkette einpolymerisiert werden soll, handelt es sich zumindest bei einer der funktionellen Gruppen um eine polymerisierbare Gruppe, beispielsweise um eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung. Prinzipiell ist auch möglich, dass das verknüpfende Molekül noch eine weitere funktionelle Gruppe aufweist und die Polymerisation unter Mitwirkung dieser weiteren funktionellen Gruppe realisiert wird (z.B. eine Polykondensation, die die Anwesenheit von zwei OH-Gruppen in dem verknüpfenden Molekül erfordert).
Die das FRET-Donor-Akzeptor-Paar tragende Verknüpfungseinheit kann als Wiederholeinheit in einer Vielzahl unterschiedlicher Polymere vorliegen. Beispielhaft können Vinyl-Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidone oder Polyvinylcaprolactame, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyolefine wie Polyethylen oder Polypropylen oder auch Poly(meth)acrylate genannt werden. Bei dem Polymer kann es sich auch um ein Hydrogel handeln. Dieses kann optional quervernetzt sein. Bei dem Hydrogel kann es sich optional auch um ein responsives Hydrogel, beispielsweise ein thermoresponsives Hydrogel handeln.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, dass die das FRET-Donor-Akzeptor-Paar tragende Verknüpfungseinheit auf eine Polymerkette aufgepfropft ist. Hinsichtlich möglicher Polymere kann auf die obigen Ausführungen verwiesen werden.
Das Polymer, in dem die Verknüpfungseinheit als Wiederholeinheit vorliegt, oder auf das die Verknüpfungseinheit aufgepfropft ist, kann auf einer Festkörperoberfläche immobilisiert sein.
Die Verknüpfungseinheit kann an eine Vielzahl unterschiedlicher Festkörperoberflächen gebunden sein. Es kann sich dabei sowohl um organische (z.B. ein Polymer) wie auch anorganische Festkörperoberflächen handeln. Wenn auf einer Festkörperoberfläche reaktive Gruppen vorliegen (beispielsweise eine funktionalisierte Oberfläche mit reaktiven Gruppen wie -NH₂, -SH, -OH, -COOH oder Epoxy), können diese mit einer funktionellen Gruppe des zumindest bifunktionellen Moleküls reagieren und somit eine kovalente Verbindung der Verknüpfungseinheit mit dem Substrat realisieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Verknüpfungseinheit als Wiederholeinheit in einem Polymer vor, das seinerseits auf einer Festkörperoberfläche vorliegt (z.B. in Form einer Polymerbeschichtung).
In den 1a und 1b ist das Funktionsprinzip der vorliegenden Erfindung anhand von zwei bevorzugten Ausführungsformen schematisch dargestellt.
Die linke Hälfte der 1a zeigt eine aus einem zumindest bifunktionellen Molekül erhaltene Verknüpfungseinheit 001, die ein Polymer 002, einen FRET-Donor 003 und FRET-Akzeptor 004 miteinander verbindet. Bei dem FRET-Donor 003 kann es sich beispielsweise um einen Fluorophor handeln. Die Verbindung des FRET-Akzeptors 004 mit der Verknüpfungseinheit 001 wird über einen kompetitiven Binder 005 und eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 vermittelt. Die Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 ist kovalent an die Verknüpfungseinheit 001 gebunden und wechselwirkt mit dem Analyt-kompetitiven Binder 005, der wiederum mit dem FRET-Akzeptor 004 verbunden ist. Bei dem FRET-Akzeptor 004 kann es sich beispielsweise um ein Gold-Nanopartikel handeln, auf dessen Oberfläche der kompetitive Binder 005 vorliegt und durch seine Wechselwirkung mit der Erkennungseinheit 006 die Verbindung des FRET-Akzeptors 004 mit der Verknüpfungseinheit 001 vermittelt. Durch die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül gebildeten Verknüpfungseinheit 001 werden Donor 003 und Akzeptor 004 in einem definierten Abstand gehalten, der ausreichend gering für einen strahlungsfreien Resonanzenergietransfer vom Donor 003 zum Akzeptor 004 ist. Daher zeigt die Zusammensetzung in diesem Zustand keine Fluoreszenz.
Nach Zuführung des Analyten 007 wechselwirkt dieser mit der Analyt-spezifischen Erkennungsgruppe 006 und verdrängt den Analyt-kompetitiven Binder 005. Daher wird der als Fluoreszenzlöscher fungierende FRET-Akzeptor 004 zusammen mit dem auf seiner Oberfläche vorliegenden Analyt-kompetitiven Binder 005 von der Verknüpfungseinheit 001 abgetrennt. Das FRET-Paar wird getrennt, ein Energietransfer vom Donor 003 zum Akzeptor 004 ist nicht mehr möglich und die Fluoreszenz des Donors 003 wird aktiviert. Dies ist in der rechten Hälfte der 1a gezeigt.
Auch in der 1b zeigt die linke Hälfte eine aus einem zumindest bifunktionellen Molekül erhaltene Verknüpfungseinheit 001, die ein Polymer 002, einen FRET-Donor 003 und FRET-Akzeptor 004 miteinander verbindet. Wiederum wird die Verbindung des Akzeptors 004, der als Fluoreszenzlöscher fungiert, mit der Verknüpfungseinheit 001 über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 und einen Analyt-kompetitiven Binder 005 vermittelt. Im Unterschied zu 1a ist allerdings der Analyt-kompetitive Binder 005 kovalent an die Verknüpfungseinheit 001 gebunden, während Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 an den Akzeptor 004 gebunden ist. Nach Zuführung des Analyten 007 verdrängt dieser den Analyt-kompetitiven Binder 005 von der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit 006, wodurch der Akzeptor 004 von der Verknüpfungseinheit 001 abgetrennt wird. Dies ist in der rechten Hälfte der 1b gezeigt. Das FRET-Paar wird getrennt, ein Energietransfer vom Donor 003 zum Akzeptor 004 ist nicht mehr möglich und die Fluoreszenz des Donors 003 wird aktiviert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Zusammensetzung, umfassend die Anbindung eines FRET-Donors und eines FRET-Akzeptors an ein zumindest bifunktionelles Molekül, wobei entweder die Anbindung des FRET-Akzeptors oder die Anbindung des FRET-Donors an das zumindest bifunktionelle Molekül über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder erfolgt.
Bevorzugt umfasst das Verfahren außerdem die Anbindung des zumindest bifunktionellen Moleküls an ein Substrat.
In einer bevorzugten Ausführungsform reagieren (entweder gleichzeitig oder nacheinander) der FRET-Donor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit mit dem zumindest bifunktionellen Molekül, gefolgt von der Zugabe des Analyt-kompetitiven Binders, der (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET-Akzeptor markiert ist. Da der Analyt-kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET-Akzeptor über diese beiden Komponenten, also Analyt-kompetitiven Binder und Analyt-spezifische Erkennungseinheit, mit dem verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET-Donors und des FRET-Akzeptors an das verknüpfende Molekül. Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET-Donor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe des Analyt-kompetitiven Binders, der (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET-Akzeptor markiert ist. Die Teilschritte der kovalenten Anbindung eines Fluorophors, das als FRET-Donor fungiert, und einer Analyt-spezifischen Erkennungseinheit an ein bifunktionelles Molekül (in diesem Beispiel Maleinsäureanhydrid, das als funktionelle Gruppen eine cyclische Säureanhydridgruppe und eine C=C-Doppelbindung aufweist) sind schematisch in 2 dargestellt.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass der FRET-Donor und der Analyt-kompetitive Binder (entweder gleichzeitig oder nacheinander) mit dem zumindest bifunktionellen Molekül reagieren, gefolgt von der Zugabe der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit, die (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET-Akzeptor markiert ist. Da der Analyt-kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET-Akzeptor über diese beiden Komponenten, also Analyt-kompetitiven Binder und Analyt-spezifische Erkennungseinheit, mit dem verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET-Donors und des FRET-Akzeptors an das verknüpfende Molekül. Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET-Donor und der Analyt-kompetitive Binder an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe der mit dem FRET-Akzeptor markierten Analyt-spezifischen Erkennungseinheit.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass der FRET-Akzeptor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit (gleichzeitig oder nacheinander) mit dem zumindest bifunktionellen Molekül reagieren, gefolgt von der Zugabe des Analyt-kompetitiven Binders, der (kovalent oder nicht-kovalent) mit dem FRET-Donor markiert ist. Da der Analyt-kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET-Donor über diese beiden Komponenten, also Analyt-kompetitiven Binder und Analyt-spezifische Erkennungseinheit, mit dem verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET-Akzeptors und des FRET-Donors an das verknüpfende Molekül. Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET-Akzeptor und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe des mit dem FRET-Donor markierten Analyt-kompetitiven Binders.
Alternativ kann es bevorzugt sein, dass der FRET-Akzeptor und der Analyt-kompetitive Binder (entweder gleichzeitig oder nacheinander) mit dem zumindest bifunktionellen Molekül reagieren, gefolgt von der Zugabe der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit, die mit dem FRET-Donor markiert ist. Da der Analyt-kompetitive Binder mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit wechselwirkt, ist der FRET-Donor über diese beiden Komponenten, also Analyt-kompetitiven Binder und Analyt-spezifische Erkennungseinheit, mit dem verknüpfenden Molekül verbunden. Das zumindest bifunktionelle Molekül wird über eine weitere funktionelle Gruppe mit einem Substrat verbunden, beispielsweise in einer Polymerisationsreaktion und durch Aufpfropfen auf ein Polymer. Der Zeitpunkt für diese Anbindung an das Substrat kann variiert werden. Beispielsweise kann das zumindest bifunktionelle Molekül zunächst an das Substrat gebunden werden und anschließend folgt die Anbindung des FRET-Akzeptors und des FRET-Donors an das verknüpfende Molekül. Alternativ können beispielsweise zunächst der FRET-Akzeptor und der Analyt-kompetitive Binder an das zumindest bifunktionelle Molekül gebunden werden, gefolgt von der Anbindung des verknüpfenden Moleküls an das Substrat (z.B. durch Polymerisation oder Aufpfropfen) und anschließend der Zugabe der mit dem FRET-Donor markierten Analyt-spezifischen Erkennungseinheit.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Detektion eines Analyten, wobei die Vorrichtung die oben beschriebene Zusammensetzung enthält.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung enthält einen Signalumwandler und/oder einen elektrischen Verstärker.
Da jedoch die erfindungsgemäße Zusammensetzung bei Anbindung des Analyten an die Erkennungseinheit eine deutliche Änderung des Lumineszenzverhaltens zeigt, die auch mit dem bloßen Auge gut erkennbar sein kann, ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, dass die Vorrichtung weder einen Signalumwandler noch einen elektrischen Verstärker aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der oben beschriebenen Zusammensetzung für den Nachweis eines Analyten.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann prinzipiell für die Detektion einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten eingesetzt werden. Bevorzugte Analyten sind beispielsweise Biooligomere, Biopolymere oder biologische Partikel. Beispielhafte Biooligomere sind Oligopeptide, Oligosaccharide und Oligonucleotide. Beispielhafte Biopolymere sind Polypeptide, Proteine, Polysaccharide, Polynucleotide und Nucleinsäuren. Beispielhafte biologische Partikel sind Viren und Bakterien.
Für ein Detektionsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist eine Markierung des Analyten nicht erforderlich. Bevorzugt erfolgt die Verwendung daher für den Nachweis eines nicht markierten Analyten.
Anhand der nachfolgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung eingehender erläutert.
Beispiele
In dem nachfolgend beschriebenen Beispiel fungiert Maleinsäureanhydrid als bifunktionelles Molekül, das in der Zusammensetzung die Verknüpfungseinheit für Akzeptor, Donor und Substrat ausbildet. Die Bifunktionalität des Maleinsäureanhydrids resultiert aus der cyclischen Säureanhydridgruppe sowie der Kohlenstoff-Doppelbindung.
Als FRET-Donor wird Rhodamin B (ein Fluoreszenzfarbstoff) verwendet. Gold-Nanopartikel fungieren als Fluoreszenz-löschender FRET-Akzeptor.
Der Rhodamin-Farbstoff wird kovalent an das Maleinsäureanhydrid gebunden.
Als Test-Analyt wird Amantadin-Hydrochlorid verwendet.
Der Akzeptor (d.h. ein Gold-Nanopartikel) ist über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder mit der Verknüpfungseinheit verbunden. Als Analyt-spezifische Erkennungseinheit wird Cyclodextrin verwendet, während Adamantan als Analyt-kompetitiver Binder fungiert. Der Analyt-kompetitive Binder wird kovalent an das Maleinsäureanhydrid gebunden. Das Cyclodextrin ist auf der Oberfläche der Gold-Nanopartikel immobilisiert, wodurch eine mit dem FRET-Akzeptor (d.h. Gold-Nanopartikel) markierte Analyt-spezifische Erkennungseinheit (Cyclodextrin) erhalten wird. Durch die Wechselwirkung zwischen der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit und dem Analyt-kompetitiven Binder ist der Gold-Nanopartikel (d.h. der Akzeptor) mit der aus dem Maleinsäureanhydrid gebildeten Verknüpfungseinheit verbunden. In Anwesenheit des Analyten (d.h. Amantadin) wird der Akzeptor (d.h. der Gold-Nanopartikel) von der Verknüpfungseinheit abgelöst, da es zwischen der Analyt-spezifischen Erkennungsgruppe und dem Analyten zu einer stärkeren Wechselwirkung kommt als zwischen der Analyt-spezifischen Erkennungsgruppe und dem Analyt-kompetitiven Binder.
A Anbindung des optischen Sensors an den Abstandshalter
In diesem Ausführungsbeispiel wurde das Fluorophor Rhodamin B als FRET-Donor gewählt. Die Synthese der Rhodamin B-Piperazin-Vorstufe 1 zur Anbindung an Maleinsäureanhydrid ist in der Literatur beschrieben [Nguyen, T.; Francis, M. B. Organic Letters 2003, 5, 3245.]. Im ersten Syntheseschritt erfolgt die kovalente Anbindung des Fluorophors an Maleinsäureanhydrid (d.h. das bifunktionelle Molekül). Rhodamin B-Piperazin 1 wird mit Maleinsäureanhydrid zu Rhodamin B-(3-carboxyacryloyl)piperazin 2 umgesetzt.
Synthesevorschrift Rhodamin B-(3-carboxyacryloyl)piperazin 2
Rhodamin B-piperazin 1 (2 g, 3,66 mmol, 1 eq.) und Maleinsäureanhydrid (0,36 g, 3,66 mmol, 1 eq.) werden in 40 mL DMF/CH₂Cl₂ 2:1 gelöst und 48 h bei Raumtempertaur gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand mit K₂CO_3aq (1 mol/L) aufgenommen. Die wässrige Phase wird 3 x mit Ethylacetat ausgeschüttelt, mit NaCl gesättigt und anschließend mit Isopropanol/CH₂Cl₂ 2:1 ausgeschüttelt, bis die wässrige Phase nur noch leicht pink verbleibt. Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wird mit CHCl₃ aufgenommen und filtriert, um unlösliche Salze zu entfernen. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Feststoff im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 1,50 g, 2,33 mmol (64 %); lila Feststoff.
B Anbindung des kompetitiven Binders an das bifunktionelle Molekül
Adamantan diente als Analyt-kompetitiver Binder. Dabei wird Aminomethyladamantan an die zweite Carbonsäure-Funktion des Maleinsäure-Abstandshalters angebunden.
Synthese von Rhodamin B-piperazin-maleinsäurediamid-methyladamantan 3
Rhodamin B-(3-carboxyacryloyl)piperazin 2 (0,45 g, 0,70 mmol, 1 eq.) und 1-[Bis(dimethylamino)methylen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium3-oxidhexafluorophosphat (HATU) (0,4 g, 1,05 mmol, 1,5 eq.) werden in 10 mL trockenem CH₂Cl₂ unter Argon gelöst. Diisopropylethylamin (DIEA) (0,14 g, 0,18 mL, 1,05 mmol, 1,5 eq.) und 1 -Adamantyl-methylamin (0,13 g, 86 µL, 0,77 mmol, 1,1 eq.) werden zugefügt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird gegen 3 x 0,1 mol/L HCl ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wird in wenig Methanol gelöst und mit einem großen Überschuss Diethylether ausgefällt. Der Feststoff wird abgesaugt und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 0,43 g; 0,54 mmol (78 %); lila Feststoff.
C Immobilisierung des Systems
Die in B hergestellte Einheit aus bifunktionellem Molekül, FRET-Donor und kompetitivem Binder soll über die weitere funktionelle Gruppe des Moleküls (d.h. die C=C-Doppelbindung) immobilisiert werden. So wird im späteren Analyseverfahren eine einfache Entfernung nicht bindender Analyten und Erkennungseinheiten mit Fluoreszenzlöschern möglich. Die Entfernung der Fluoreszenzlöscher gewährleistet eine höhere Signalintensität Im hier aufgeführten Beispiel wird das verknüpfende Molekül über die polymerisierbare Doppelbindung der Maleinsäure in ein Polymerrückgrat eingebunden. Eine andere Möglichkeit zur Immobilisierung kann z.B. Anbindung an eine funktionalisierte Oberfläche (NH₂-, SH-, COOH-, Epoxy) sein. Maleinsäure-Monomere können mit verschiedenen Monomeren zur Immobilisierung copolymerisiert werden (u. a. N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylcaprolactam, N-Isopropylacrylamid). Die so hergestellten Polymere können auch zu Hydrogelen mit Hilfe von Quervernetzern umgesetzt werden. Des Weiteren kann zur Immobilisierung die Doppelbindung der Maleinsäure mit verschiedenen oberflächengebundenen Nukleophilen umgesetzt werden (NH₂-, SH-).
Beispiel einer typischen Copolymerisation mit N-Vinylpyrrolidon:
N-Vinylpyrrolidon, Rhodamin B-piperazin-maleinsäurediamid-methyladamantan 3 (0,1 - 1 mol%) und Azo-bis-(isobutyronitril) AIBN (1 mol%) werden in Methanol (25 gew% Feststoffgehalt) gelöst und 15 min mit Argon gespült. Es wird auf 60 °C Ölbadtemperatur erhitzt und 24 h polymerisiert. Anschließend wird 7 Tage gegen Wasser dialysiert (M_w 12000-14000 g/mol) und das entstandene Polymer gefriergetrocknet.
D Anbindung des FRET-Akzeptors an das bifunktionelle Molekül über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und den Analyt-kompetitiven Binder
In dem hier beschriebenen Beispiel werden Gold-Nanopartikel (Au-NP) als Fluoreszenz-Löscher mit β-Cyclodextrinen (β-CD) als Analyt-spezifische Erkennungseinheiten für Adamantan synthetisiert [Lui, J.; Ong, W.; Roman, E.; Lynn, M. J.; Kaifer, A. E. Langmuir, 2000, 16, 3000-3002.].
Bei Zugabe des mit den Gold-Nanopartikeln markierten Cyclodextrins zu dem in Schritt C hergestellten Polymer kommt es zu einer Wechselwirkung zwischen dem Adamantan (d.h. dem kompetitiven Binder) und dem Cyclodextrin (d.h. der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit). Über diese Wechselwirkung wird der FRET-Akzeptor (d.h. das Gold-Nanopartikel) mit der aus dem Maleinsäureanhydrid gebildeten Verknüpfungseinheit verbunden.
Fluoreszenz-Löschungs Messungen
Nachfolgend wird ein Beispiel für Fluoreszenz-Löschung durch Analytbindung mit anschließender kompetitiver Verdrängung des Analyten ausgeführt.
Die in C beschriebenen hergestellten Polymere dienen als Matrix für die Fluoreszenz-Löschungs-Experimente. β-CD (Cyclodextrin)-funktionalisierte Au-NP (Nanopartikel) werden als Bindungspartner für die Adamantan-Erkennungseinheiten im Copolymer zu einer wässrigen Lösung des Polymers gegeben. Über die Wechselwirkung zwischen Cyclodextrin (d.h. der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit) und Adamantan (d.h. dem kompetitiven Binder) wird der als Fluoreszenzlöscher fungierende FRET-Akzeptor (d.h. das Gold-Nanopartikel) an die Verknüpfungseinheit gebunden. Da nun FRET-Donor (Rhodamin-Fluorophor) und FRET-Akzeptor (Gold-Nanopartikel) durch die aus dem Maleinsäureanhydrid gebildeten Verknüpfungseinheit in einem definierten geringen Abstand gehalten werden, ist ein strahlungsfreier Resonanzenergietransfer und somit eine Fluoreszenzlöschung möglich.
Der Verlauf der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der zugegebenen Menge der mit Cyclodextrin funktionalisierten Gold-Nanopartikel wird in 3 gezeigt. Als Referenz zeigt 3 auch den Verlauf der Fluoreszenzintensität bei der Zugabe von Au-Nanopartikeln, die mit PVP funktionalisiert wurden. Da PVP im Vergleich zu Cyclodextrin keine signifikante Wechselwirkung mit der als kompetitivem Binder fungierenden Adamantan-Gruppe zeigt, können FRET-Donor und FRET-Akzeptor nicht in einen definierten geringen Abstand gebracht werden, wie er für einen strahlungsfreien Resonanzenergietransfer notwendig wäre. Die β-CD-Au-NP zeigen eine deutlich höhere Löschungseffizienz im Vergleich zu PVP-Au-NP.
Da bei dem hier beschriebenen System Erkennungseinheit und Analyt variabel austauschbar sind, ist dieser Sensor für eine Vielzahl an Bindungspartnern einsetzbar und nicht nur auf wenige Bindungspaare beschränkt. Dies bietet einen großen Vorteil, besonders für Erkennungsreaktionen von biologisch relevanten Strukturen, wie Peptiden oder Proteinen durch Bakterien oder Viren, da hier eine hohe Sensitivität der Erkennung essentiell ist. Die Effizienz der Fluoreszenz-Löschung in dem hier angeführten Beispiel liegt für die mit der Erkennungseinheit markierten Fluoreszenz-Löscher um fast 50 % höher, als für die Referenz Fluoreszenz-Löscher ohne Erkennungseinheit. Da Analyt und Erkennungseinheit dabei variabel austauschbar sind, kann so ein Fluoreszenz-Löschungs-Assay synthetisiert werden, welches nicht auf die Abfolge definierter biologischer Sequenzen festgelegt ist.
Durch Zugabe des Analyten zu dem nicht fluoreszierenden Zustand kann der Fluoreszenz-Löscher verdrängt werden und die Fluoreszenz wieder verstärkt werden. 4 zeigt die Fluoreszenzverstärkung in Abhängigkeit von der Zeit nach Zugabe des Analyten Amantadin-Hydrochlorid. Da dieser Analyt eine stärkere Wechselwirkung mit der auf den Gold-Nanopartikeln vorliegenden Analyt-spezifischen Erkennungseinheit (d.h. dem Cyclodextrin) zeigt als der Analyt-kompetitive Binder, kommt es zu einer Ablösung der Gold-Nanopartikel (also des FRET-Akzeptors) von der Verknüpfungseinheit. Dadurch wird die Fluoreszenz des Fluorophors (also des FRET-Donors) wieder aktiviert und es kommt zu einer signifikanten, mit dem bloßen Auge wahrnehmbaren Fluoreszenzverstärkung. Die hier im aufgeführten Beispiel-Experiment erzielte Verstärkung der Fluoreszenz nach Fluoreszenz-Löschung beträgt für die Erkennungsgruppen-markierten Au-NP etwa 30 %. Auch hier zeigt das Referenz-Experiment mit PVP-Au-NP ohne Erkennungsgruppen, dass keine nennenswerte Fluoreszenzverstärkung auftritt. Diese Fluoreszenz-Verstärkung ist sehr leicht durch Anregung des Substrats mit einer UV-Handlampe mit bloßem Auge sichtbar.
Dieser Vorgang ist in 5 nochmals schematisch dargestellt. Zunächst sind nur der FRET-Donor 003 und der kompetitive Binder 005 kovalent an die aus dem zumindest bifunktionellen Molekül gebildeten Verknüpfungseinheit 001 gebunden. Die Verknüpfungseinheit 001 ist außerdem an ein Polymer 002 gebunden. Da noch kein FRET-Akzeptor anwesend ist, fluoresziert der FRET-Donor 003 und damit die Zusammensetzung (Gefäß A). Anschließend erfolgt die Zugabe von Gold-Nanopartikeln, auf deren Oberfläche Cyclodextrin immobilisiert ist. Die Goldnanopartikel fungieren als Fluoreszenz-löschende FRET-Akzeptoren 004 und das Cyclodextrin fungiert als Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 (d.h. eine mit einem FRET-Akzeptor 004 markierte Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006). Über den Analyt-kompetitiven Binder 005 und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006, die miteinander wechselwirken, wird der FRET-Akzeptor 004 an die Verknüpfungseinheit 001 gebunden. Durch die Anbindung an die Verknüpfungseinheit 001 befinden sich FRET-Donor 003 und FRET-Akzeptor 004 in einem definierten Abstand, der gering genug ist für den strahlungsfreien Resonanzenergietransfer. Es kommt zur Fluoreszenzlöschung. Die Zusammensetzung fluoresziert nicht mehr (Gefäß B). Wird ein Analyt 007 (Amantadin-Hydrochlorid) zugegeben, so bindet dieser an die Analyt-spezifische Erkennungseinheit 006 und bewirkt dadurch die Abtrennung des FRET-Akzeptors 004 von der Verknüpfungseinheit 001. Durch die Trennung des FRET-Paares wird die Fluoreszenz des FRET-Donors 003 wieder aktiviert, die Zusammensetzung fluoresziert wieder (Gefäß C).

Claims

Eine Zusammensetzung für die Detektion eines Analyten, umfassend - zumindest ein FRET-Donor-Akzeptor-Paar, - zumindest eine Verknüpfungseinheit, die durch ein zumindest bifunktionelles Molekül, das eine Molmasse von weniger als 300 g/mol aufweist, gebildet wird, wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit den Donor und den Akzeptor miteinander verbindet, und entweder der Donor oder der Akzeptor über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein Substrat, wobei die durch das zumindest bifunktionelle Molekül gebildete Verknüpfungseinheit auch mit dem Substrat verbunden ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Donor des FRET-Paares und, sofern vorhanden, das Substrat kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden sind, und der Akzeptor über die spezifische Erkennungseinheit und den Analyt-kompetitiven Binder mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist; oder der Akzeptor des FRET-Paares und, sofern vorhanden, das Substrat kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden sind, und der Donor über die Analyt-spezifische Erkennungseinheit mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist, und der Analyt-kompetitive Binder entweder mit dem FRET-Donor oder dem FRET-Akzeptor markiert ist und durch seine Wechselwirkung mit der Analyt-spezifischen Erkennungseinheit den FRET-Donor oder den FRET-Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet; oder der Analyt-kompetitive Binder kovalent mit der Verknüpfungseinheit verbunden ist, und die Analyt-spezifische Erkennungseinheit entweder mit dem FRET-Donor oder dem FRET-Akzeptor markiert ist und durch ihre Wechselwirkung mit dem Analyt-kompetitiven Binder den FRET-Donor oder den FRET-Akzeptor mit der Verknüpfungseinheit verbindet.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Donor des FRET-Paares ein organischer oder anorganischer Luminophor ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Akzeptor des FRET-Paares ein organischer oder anorganischer Luminophor ist.
Die Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Akzeptor des FRET-Paares ein Lumineszenzlöscher ist.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das Substrat ein organisches oder anorganisches Polymer oder eine Festkörperoberfläche ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Verknüpfungseinheit als eine Wiederholeinheit in einem Polymer vorliegt; oder die Verknüpfungseinheit auf ein Polymer aufgepfropft ist.
Ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-9, umfassend die Anbindung eines FRET-Donors und eines FRET-Akzeptors an ein zumindest bifunktionelles Molekül, das eine Molmasse von weniger als 300 g/mol aufweist, wobei entweder die Anbindung des FRET-Akzeptors oder die Anbindung des FRET-Donors an das zumindest bifunktionelle Molekül über eine Analyt-spezifische Erkennungseinheit und einen Analyt-kompetitiven Binder erfolgt.
Das Verfahren nach Anspruch 10, weiterhin umfassend die Anbindung des zumindest bifunktionellen Moleküls an ein Substrat.
Das Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei entweder der FRET-Donor oder der FRET-Akzeptor über die Analyt-spezifische Erkennungseinheit und den Analyt-kompetitiven Binder mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden wird, indem zunächst die Analyt-spezifische Erkennungseinheit kovalent mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden wird und anschließend der mit dem FRET-Donor oder -Akzeptor markierte Analyt-kompetitive Binder zugegeben wird, oder alternativ indem zunächst der Analyt-kompetitive Binder kovalent mit dem zumindest bifunktionellen Molekül verbunden wird und anschließend die mit dem FRET-Donor oder - Akzeptor markierte Analyt-spezifische Erkennungseinheit zugegeben wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, wobei das zumindest bifunktionelle Molekül als Monomer in einer Polymerisation verwendet wird oder auf ein Polymer aufgepfropft wird.
Eine Vorrichtung für die Detektion eines Analyten, umfassend die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-9, einen Signalumwandler und/oder einen elektrischen Verstärker.
Die Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-9 zur Detektion eines Analyten.