DE60016898T2 - Phthalamid-lanthanid komplexe zur verwendung als lumineszenzmarker - Google Patents

Phthalamid-lanthanid komplexe zur verwendung als lumineszenzmarker Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Es gibt einen kontinuierlichen und steigenden Bedarf für schnelle, hochspezifische Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung chemischer, biochemischer und biologischer Substanzen als zu analysierender bzw. analytisch zu bestimmender Stoffe in Mischungen im Bereich der Forschung und Diagnostik. Von besonderem Wert sind Verfahrensweisen zur Messung kleiner Mengen von Nucleinsäuren, Peptiden, pharmazeutischen Stoffen, Metaboliten, Mikroorganismen und anderen Materialien von diagnostischem Wert. Beispiele solcher Materialien schließen ein: kleine molekulare bioaktive Materialien (z.B. Narkotika und Gifte, für therapeutische Zwecke verabreichte Arzneimittel, Hormone), pathogene Mikroorganismen und Viren, Antikörper und Enzyme sowie Nucleinsäuren, besonders diejenigen, die in Krankheitszustände impliziert sind.
  • Das Vorhandensein einer speziellen, zu analysierenden Substanz kann oft nachgewiesen werden durch Bindungsverfahren, die den hohen Grad an Spezifität ausnutzen, der viele biochemische und biologische Systeme kennzeichnet. Häufig angewendete Verfahrensweisen basieren beispielsweise auf Antigen-Antikörper-Systemen, Nucleinsäure-Hybridisierungs-Techniken und Protein-Ligand-Systemen. Bei diesen Verfahren wird das Vorhandensein eines Komplexes von diagnostischem Wert typischerweise angezeigt durch das Vorhandensein oder Fehlen eines beobachtbaren „Labels" bzw. einer beobachtbaren Markierung, die an eines oder mehrere der in Wechselwirkung zueinander tretenden Materialien gebunden wurde. Das gewählte spezielle Markierungsverfahren diktiert oft die Nützlichkeit und Vielseitigkeit eines speziellen Systems zum Nachweis einer zu analysierenden Substanz von Interesse. Bevorzugte Markierungen sind preiswert, sicher und sind in der Lage, wirksam an eine große Vielzahl von chemischen, biochemischen und biologischen Materialien gebunden zu werden, ohne signifikant die wichtigen charakteristischen Bindungs-Eigenschaften dieser Materialien zu verändern. Die Markierung sollte ein hochgradig charakteristisches Signal ergeben und sollte selten, vorzugsweise nie, in der Natur gefunden werden. Die Markierung sollte stabil und in wässrigen Systemen über Zeiträume nachweisbar sein, die bis hinauf zu Monaten reichen. Ein Nachweis der Markierung ist vorzugsweise schnell, empfindlich und ohne das Erfordernis teurer, spezialisierter Anlagen oder die Notwendigkeit spezieller Vorsichtsmaßnahmen zum Schutz von Personen reproduzierbar. Die quantitative Bestimmung der Markierung ist vorzugsweise relativ unabhängig von Variablen wie Temperatur und Zusammensetzung der zu untersuchenden Mischung.
  • Eine große Vielzahl von Markierungen wurde entwickelt, jede mit besonderen Vorteilen und Nachteilen. Beispielsweise sind radioaktive Markierungen recht vielseitig und können in sehr niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden; solche Markierungen sind jedoch teuer, gefährlich, und ihre Verwendung erfordert hochentwickelte Anlagen und trainiertes Personal. Damit besteht ein großes Interesse an nicht-radioaktiven Markierungen, besonders an Markierungen, die durch spektrophotometrische-, Kernspin-Resonanz- und Lumineszenz-Verfahren beobachtbar sind, und an reaktiven Materialien wie beispielsweise Enzymen, die solche Moleküle produzieren.
  • Markierungen, die unter Anwendung von Fluoreszenz-Spektroskopie nachweisbar sind, sind von besonderem Interesse, und zwar wegen der großen Zahl solcher Markierungen, die im Stand der Technik bekannt sind. Darüber hinaus ist die Literatur voll mit Synthesen von Fluoreszenz-Markierungen, die so derivatisiert sind, dass sie ein einfaches Binden an andere Moleküle erlauben, und viele derartige Fluoreszenz-Markierungen sind im Handel erhältlich.
  • Über die Tatsache hinaus, dass sie direkt nachgewiesen werden können, arbeiten viele Fluoreszenz-Markierungen derart, dass sie die Fluoreszenz einer benachbarten zweiten Fluoreszenz-Markierung quenchen. Wegen seiner Abhängigkeit von der Entfernung und der Größe der Wechselwirkung zwischen dem Quencher und dem Fluorophor liefert das Quenchen einer Fluoreszenz-Spezies einen empfindlichen Nachweis einer molekularen Konformation oder von Bindungs-Wechselwirkungen oder anderen Wechselwirkungen. Ein ausgezeichnetes Beispiel der Verwendung von Fluoreszenz-Reporter-Quencher-Paaren wird gefunden beim Nachweis und der Analyse von Nucleinsäuren.
  • Ein alternatives Nachweis-Schema, das theoretisch empfindlicher als eine Autoradiographie ist, ist die Zeit-aufgelöste Fluorimetrie. Gemäß diesem Verfahren wird ein chelatisiertes Lanthaniden-Metall mit einer langen Strahlungs-Lebensdauer an ein Molekül von Interesse gebunden. Eine Impuls-Anregung, kombiniert mit einem gegateten Nachweis-System, ermöglicht eine wirksame Diskriminierung gegenüber einer kurzlebigen Hintergrund-Emission. Beispielsweise wurde unter Verwendung dieses Ansatzes der Nachweis und die quantitative Bestimmung von DNS-Hybriden über einen mit Europium markierten Antikörper gezeigt (Syvanen et al., Nucleic Acids Research 14: 1017 – 1028 (1986)). Darüber hinaus wurde eine biotinylierte DNS in Mikrotiter-Plattenvertiefungen unter Verwendung von mit Eu markiertem Strepavidin gemessen (Dahlen, Anal. Biochem. 164: 78 – 83 (1982)). Jedoch ist es ein Nachteil dieser Arten von Assays, dass die Markierung von der Nachweis-Sonde gewaschen werden und ihre Fluoreszenz in einer Verstärkungs-Lösung entwickelt werden muss. Ein weiterer Nachteil war die Tatsache, dass die erzeugte Fluoreszenz nur im Bereich von Nanosekunden (ns) lag; dies ist ein allgemein unannehmbar kurzer Zeitraum für einen adäquaten Nachweis der markierten Moleküle und für eine Diskriminierung gegenüber einer Hintergrund-Fluoreszenz.
  • Im Hinblick auf die voraussagbaren praktischen Vorteile wurde es allgemein gewünscht, dass die verwendeten Lanthaniden-Chelate eine verzögerte Fluoreszenz mit Zerfallszeiten von mehr als 10 μs zeigen sollten. Die Fluoreszenz vieler der bekannten Fluoreszenz-Chelate neigt dazu, durch Wasser inhibiert zu werden. Da Wasser allgemein in einem Assay zugegen ist, insbesondere in einem Immunoassay-System, werden Lanthaniden-Komplexe, die einer Inhibierung der Fluoreszenz in Gegenwart von Wasser unterliegen, als in gewisser Weise unvorteilhaft oder unpraktisch für viele Anwendungen angesehen. Darüber hinaus werden die kurzen Fluoreszenz-Zerfallszeiten als Nachteil dieser Verbindungen angesehen. Diese Inhibierung beruht auf der Affinität der Lanthaniden-Ionen gegenüber koordinierenden Wasser-Molekülen. Wenn das Lanthaniden-Ion koordinierte Wasser-Moleküle aufweist, wird die absorbierte Licht-Energie (Anregungs-Energie) von dem Komplex auf das Lösungsmittel übertragen und wird nicht als Fluoreszenz emittiert.
  • Damit sind Lanthaniden-Chelate, insbesondere koordinativ gesättigte Chelate, die ausgezeichnete Fluoreszenz-Eigenschaften aufweisen, in hohem Maße erwünscht. Alternativ dazu sind auch koordinativ ungesättigte Lanthaniden-Chelate, die annehmbare Fluoreszenz in Gegenwart von Wasser zeigen, ebenfalls vorteilhaft. Derartige Chelate, die derivatisiert werden, um ihre Konjugation an eine oder mehrere Komponenten eines Assays zu ermöglichen, finden Verwendung in einem Bereich unterschiedlicher Assay-Formate. Die vorliegende Erfindung stellt diese und andere derartige Verbindungen und Assays unter Verwendung dieser Verbindungen bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Lumineszenz- (einschließlich Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-) Marker finden eine große Vielzahl von Anwendungen in der Wissenschaft, Medizin und Technik. In vielen Situationen liefern diese Marker kompetitiven Ersatz für Radiomarkierungen, chromogene, strahlungsdichte Farbstoffe usw.. Darüber hinaus haben Verbesserungen der fluorimetrischen Messinstrumente erreichbare Empfindlichkeiten erhöht und eine quantitative Analyse erlaubt.
  • Die Verwendung von Lanthaniden-Chelaten in Kombination mit der Zeit-aufgelösten Fluoreszenz-Spektroskopie ist ein allgemein akzeptiertes immunochemisches Werkzeug. Derzeit bevorzugte Lanthaniden-Ionen schließen ein: Dy3+, Sm3+, Tb3+, Er3+ und Eu3+ sowie Nd3+ und Yb3+. Andere Lanthaniden-Ionen wie beispielsweise La3+, Gd3+ und Lu3+ sind nützlich, jedoch allgemein weniger bevorzugt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Lanthaniden-Komplexe bereit, die extrem lumineszent sind und viele Merkmale besitzen, die für Fluoreszenz-Marker und -Sonden zum Gebrauch in Fluoreszenz-Assay-Systemen erwünscht sind. Unter diesen Vorteilen sind: 1) Liganden, die sowohl als Chelatoren als auch als Chromophor-Energieübertragungs- Einrichtungen dienen; 2) sehr hohe Quanten-Ausbeuten der Lanthaniden-Ionen-Fluoreszenz der vorliegenden Komplexe in Wasser ohne äußere Verstärkung, wie beispielsweise durch Micellen oder Fluorid; 3) hohe Stabilität und Löslichkeit dieser Komplexe in Wasser; 4) eine extrem leichte Synthese, die preiswerte Ausgangsmaterialien einsetzt; und 5) leichter Zugang zu vielen Derivaten zum Verknüpfen dieser Lumineszenz-Sonden mit beispielsweise einem immunoreaktiven Mittel oder festen Träger (z.B. Polymer).
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von Lanthaniden-komplexierenden Liganden bereit, die Hydroxyisophthalamidylsäure-Einheiten in ihre Strukturen einschließen, sowie lumineszierende Metallkomplexe dieser Liganden. Die Verbindungen gemäß der Erfindung schließen zweizähnige, vierzähnige und andere höher mehrzähnige Liganden auf Hydroxyisophthalamidylamid-Basis ein. Die Verbindungen gemäß der Erfindung werden leicht in guten Ausbeuten hergestellt.
  • So stellt in einem ersten Aspekt die vorliegende Erfindung ein lumineszierendes Lanthaniden-Metall-Chelat bereit, das ein Metall-Ion der Lanthaniden-Reihe und ein komplexierendes Mittel umfasst, das wenigstens eine 2-Hydroxyisophthalamidyl-Einheit umfasst.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung bereit, die eine Struktur gemäß Formel I aufweist:
  • Figure 00050001
  • In der Formel I sind R1, R2, R4, R5, R6, R7, R10 und und R20 Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin zwei oder mehrere der Reste R2, R4, R5, R7 und, wenn R3 eine substituierte Alkyl-Gruppe ist, ein Substituent von R3 gegebenenfalls benachbart sind von wenigstens einer Linker-Einheit unter Bildung wenigstens eines Ringes. Die Reste R3, R8 und R9 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl. R11, R12, R13, R21, R22 und R23 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR14R15, -NO2, -OR16, -COOR17, worin R14, R15, R16 und R17 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R12 gegebenenfalls einen Ring mit R11, R13 oder beiden bilden kann und R22 gegebenenfalls einen Ring mit R21, R23 oder beiden bilden kann. Die Ringe sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-, substituierten cyclischen Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Heteroaryl-, substituierten Heteroaryl-, Heterocyclyl- und gesättigten Heterocyclyl-Ringsystemen. Q1 für -OR18 steht; Q2 für -OR19 steht; worin R18 und R19 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung. Der Buchstabe a ist 0 oder 1, mit der Maßgabe, daß dann, wenn a gleich 0 ist, N2' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 2' gebunden ist, und dann, wenn z gleich 0 ist, N1' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 1' gebunden ist.
  • Zusätzlich zu den Liganden und den Lanthanid-Komplexen, stellt die vorliegende Erfindung auch eine Anzahl von Verfahren bereit, einschließlich Assays, die die Verbindungen der Erfindung nutzen. Die Assays der Erfindung nutzen vorzugsweise die Fluoreszenz der vorliegend beschriebenen Verbindungen, um den Gegenstand des Assays nachzuweisen. Die Verfahren der Erfindung erlauben den Nachweis von beispielsweise klein-molekularen bioaktiven Materialien und Biomolekülen in Spurenkonzentrationen ohne die Verwendung von radioaktiven Spezies.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist ein beispielhaftes Synthese-Schema, das zu dem Liganden H3 (zweifach gecapptes TRENSAM)·2HBr führt.
  • 2(A–B) sind experimetelle (A) und berechnete (B) Spektren von der Titration des zweifach gecappten TRENSAM mit EuCl3 in einer gepufferten wäßrigen Lösung. In 2A entsprechen die Spektren 1 bis 18 einer ansteigenden Konzentration an Lanthanid-Ion. In 2B, ist die durchgezogene Linie zweifach gecapptes TENSAM, ist die gepunktete Line Eu[zweifach gecapptes TRENSAM]2 und ist die gestrichelte Linie Eu[zweifach gecapptes TRENSAM].
  • 3 ist ein übereinandergelegter Plot eines experimentellen elektronischen Spektrums (durchgezogene Linie) and berechneten elektronischen Spektrums (gepunktete Linie) von Eu[zweifach gecapptes TRENSAM]2.
  • 4(A–B) sind strukturelle Diagramme, ORTEP (A) bei 20 %iger Ellipsoid-Wahrscheinlichkeit und Raumfüllung (B) für [Eu(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+. Wasserstoff-Atome, Lösungsmittel und Gegenion sind aus Gründen der Übersichtlichkeit ausgelassen.
  • 5(A–B) sind Struktur-Diagramme (ORTEP) des Metall-Zentrums in [Eu(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+. Der Metallzentrum-Koordinations-Polyeder ist ein leicht deformiertes quadratisches Antiprisma (A), wobei jede Fläche des Antiprismas gebildet wird durch einen der zweifach gecappten TENSAM-Liganden (B). Eine 50 %ige Ellipsoid-Wahrscheinlichkeit ist gezeigt.
  • 6 ist ein übereinandergelegter Plot eines Emissionsspektrums von freiem zweifach gecappten TENSAM (durchgezogene Linie; 4,24·10–4 M in Wasser (gereinigt mit Millipore)); von [Tb(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+ (gestrichelte Linie; 1,3·10–5 M in Wasser (gereinigt mit Millipore)); und von [Eu(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+ (gepunktete Linie; 1,08·10–4 M in Wasser (gereinigt mit Millipore)) mit 0,1 M KCl, 0,05 MES-Puffer, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,78 mit KOH.
  • 7(A–B) sind Strukturformeln beispielhafter Dendrimere gemäß Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung;
  • 8 ist ein repräsentatives Synthese-Schema, das zu einem exemplarischen vierfüßigen Liganden gemäß der Erfindung führt.
  • 9 ist ein repräsentatives Synthese-Schema, das zu einer exemplarischen Verbindung gemäß der Erfindung führt, die mit einem Linker-Arm derivatisiert ist, der einen Ort bereitstellt, um den Liganden an eine andere Spezies anzuhängen.
  • 10 ist ein respräsentatives Synthese-Schema, das zu exemplarischen Verbindungen gemäß der Erfindung hührt, die mit Alkylamin-Gruppen derivatisiert sind.
  • 11 ist ein repräsentatives Synthese-Schema, das zu exemplarischen Verbindungen gemäß der Erfindung mit Grundgerüsten unterschiedlicher Länge führt.
  • 12 ist ein repräsentatives Synthese-Schema, das zu einer exemplarischen Verbindung gemäß der Erfindung führt, die einen Linker auf dem Grundgerüst aufweist, der einen Ort bereistellt, um die Verbindung an ein anderes Molekül anzuhängen.
  • 13 ist ein normalisiertes Anregungs-Spektrum (gepunktete Line, λan = 417 nm) und Emissions-Spektrum (durchgehende Linie, λex = 350 nm) des Liganden H22IAM ~ 10–6 M in mit Millipore gereinigtem Wasser.
  • 14 ist ein UV/Vis-Spektrum von [Tb(H22IAM)]+ 8,2·10–7 M in mit Millipore gereinigtem Wasser, 1,000 cm-Zelle.
  • 15 ist ein normalisiertes Emissionsspektrum von [Tb(H22IAM)]+ und [Eu(H22IAM)]+ in mit Millipore gereinigtem Wasser. [Tb(H22IAM)]+ 8,2·10–7 M, λex = 354 nm; [Eu(H22IAM)]+ ~ 10–6 M, λex = 350 nm.
  • 16 ist ein übereinandergelegter Plot von Emissionsspektren des Komplexes [Tb(H22IAM)]+ in einem 0,01 M Phosphat-Puffer bei verschiedenen Konzentrationen, λex = 347 nm.
  • 17 ist ein übereinandergelegter Plot von normalisierten Emissionsspektren von [Tb(H22IAM)]+ bei verschiedenen Konzentrationen. λex = 335 nm (9,98·10–5 M) und λex = 347 nm für alle anderen Konzentrationen.
  • 18 ist ein übereinandergelegter Plot von normalisierten Emissionsspektren von [Tb(zweifach gecapptem H22IAM)]+ bei verschiedenen Konzentrationen. λex = 365 nm (9,19·10–5 M) und λex = 351 nm für alle anderen Konzentrationen.
  • 19 ist eine Tabelle, die beispielhafte Verbindungen gemäß der Erfindung angibt.
  • 20 ist ein schematisches Diagramm eines beispielhaften Multiplex-Assays gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 21 ist ein Synthese-Schema, das zu Verbindungen gemäß der Erfindung mit Grundgerüsten unterschiedlicher Länge führt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung und der bevorzugten Ausführungsformen
  • Abkürzungen
  • Gemäß der Verwendung bezieht sich „PL" auf von Phtahlamidyl abgeleitete Liganden gemäß der Erfindung. „PL" umfasst die Liganden gemäß der Erfindung sowohl im freien Zustand als auch dann, wenn sie an eines oder mehrere Metall-Ion(en) komplexiert wurden. Darüber hinaus schließt „PL" Liganden ein, die eine oder mehrere Phthalamidyl-Gruppen in Kombination mit einer oder mehreren Salicylamidyl-Gruppen einschließen („PSL").
  • Definitionen
  • Solange nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet werden, allgemein dieselben Bedeutungen, wie sie allgemein von einem Fachmann mit üblichem Sachverstand in diesem technischen Bereich verstanden werden, zu dem die vorliegende Erfindung gehört. Allgemein sind die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche verwendete Nomenklatur und die Labor-Verfahren im molekularbiologischen, organisch-chemischen und Nucleinsäure-chemischen Bereich sowie im Hybridisierungsbereich, wie sie nachfolgend beschrieben werden, die wohlbekannten und in diesem technischen Bereich allgemein verwendeten Standard-Verfahren. Standard-Verfahren werden zur Nucleinsäure-Synthese und Peptid-Synthese verwendet. Allgemein werden enzymatische Reaktionen und Reinigungs-Schritte nach den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. Die Techniken und Verfahrensweisen werden allgemein durchgeführt entsprechend in diesem technischen Bereich herkömmlichen Verfahrensweisen und verschiedenen allgemeinen Druckschriften (siehe allgemein: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), die durch die Inbezugnahme in die vorliegende Beschreibung übernommen werden, die im Rahmen des vorliegenden Dokuments geliefert werden. Die in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendete Nomenklatur und die Labor-Verfahren im Bereich der analytischen Chemie und organischen Synthese, wie sie nachfolgend beschrieben werden, sind diejenigen, die bekannt sind und in diesem technischen Bereich eingesetzt werden. Standard-Verfahrensweisen oder deren Modifikationen werden für chemische Synthesen und chemische Analysen verwendet.
  • Der Begriff „zu analysierende Substanz", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bedeutet irgendeine Verbindung oder irgendein Molekül von Interesse, für das ein diagnostischer Test durchgeführt wird, wie beispielsweise ein Biopolymer oder ein kleines molekulares bioaktives Material. Eine zu analysierende Substanz kann beispielsweise ein Protein, Peptid, Kohlehydrat, Polysaccharid, Glycoprotein, Hormon, ein Rezeptor, ein Antigen, ein Antikörper, ein Virus, ein Substrat, ein Metabolit, ein Übergangszustand-Analoges, ein Cofaktor, ein Inhibitor, ein Arzneimittel, ein Farbstoff, ein Nährstoff, ein Wachstumsfaktor usw. sein, ohne dass dies eine Beschränkung darstellt.
  • Der Begriff „Energie-Übertragung", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf das Verfahren, durch das die Fluoreszenz-Emission einer fluoreszierenden Gruppe durch eine die Fluoreszenz modi fizierende Gruppe verändert wird. Wenn die die Fluoreszenz modifizierende Gruppe eine Quenching-Gruppe ist, dann wird die Fluoreszenz-Emission von der fluoreszierenden Gruppe abgeschwächt (gequencht). Eine Energie-Übertragung kann stattfinden durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung oder durch direkte Energie-Übertragung. Die exakten Energie-Übertragungs-Mechanismen in diesen beiden Fällen sind unterschiedlich. Es versteht sich, dass irgendeine Bezugnahme auf „Energie-Übertragung" in der vorliegenden Anmeldung alle diese hinsichtlich ihres Mechanismus voneinander unterscheidbaren Phänomene umfasst.
  • Der Begriff „Energie-Übertragungs-Paar", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf zwei beliebige Moleküle, die an einer Energie-Übertragung teilnehmen. Typischerweise dient eines der Moleküle als fluoreszierende Gruppe, und das andere dient als die Fluoreszenz-modifizierende Gruppe. Das bevorzugte Energie-Übertragungs-Paar gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine fluoreszierende Gruppe und eine Quenching-Gruppe gemäß der Erfindung. Es gibt keine Beschränkung hinsichtlich der Identität der einzelnen Mitglieder des Energie-Übertragungs-Paars in dieser Anmeldung. Alles, was erforderlich ist, ist, dass sich die spektroskopischen Eigenschaften des Energie-Übertragungs-Paars als Ganzes in gewisser messbarer Weise ändern, wenn sich die Entfernung zwischen den einzelnen Gliedern um einen kritischen Betrag ändert.
  • Der Begriff „Energie-Übertragungs-Paar" wird verwendet, um sich auf eine Gruppe von Molekülen zu beziehen, die einen einzelnen Komplex bilden, innerhalb dessen eine Energie-Übertragung stattfindet. Solche Komplexe können beispielsweise umfassen: zwei Fluoreszenz-Gruppen, die von einander verschieden sein können, und eine Quenching-Gruppe, zwei Quenching-Gruppen und eine Fluoreszenz-Gruppe, oder mehrere Fluoreszenz-Gruppen und mehrere Quenching-Gruppen. In Fällen, in denen es mehrere Fluoreszenz-Gruppen und/oder mehrere Quenching-Gruppen gibt, können die einzelnen Gruppen voneinander verschieden sein.
  • Der Ausdruck „die Fluoreszenz modifizierende Gruppe", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül gemäß der Erfindung, das in irgendeiner Weise die Fluoreszenz-Emission von einer Fluoreszenz-Gruppe verändern kann. Eine die Fluoreszenz modifizierende Gruppe bewirkt dies allgemein durch einen Energie-Übertragungs-Mechanismus. In Abhängigkeit von der Identität der die Fluoreszenz modifizierenden Gruppe kann die Fluoreszenz-Emission eine Anzahl von Veränderungen eingehen, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) Abschwächung, vollständiges Quenching, Verstärkung, Verschiebung der Wellenlänge, Verschiebung der Polarität und Änderung der Fluoreszenz-Lebensdauer. Ein Beispiel einer die Fluoreszenz modifizierenden Gruppe ist eine Quenching-Gruppe.
  • Der Begriff „Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung" oder „FRET" wird austauschbar mit dem Begriff „FET" verwendet und bezieht sich auf ein Energie-Übertragungs-Phänomen, bei dem das Licht, das von der angeregten Fluoreszenz-Gruppe emittiert wird, wenigstens teilweise von einer die Fluoreszenz modifizierenden Gruppe gemäß der Erfindung absorbiert wird. Wenn die die Fluoreszenz modifizierende Gruppe eine Quenching-Gruppe ist, dann strahlt diese Gruppe vorzugsweise einen wesentlichen Bruchteil der absorbierten Energie nicht als Licht einer unterschiedlichen Wellenlänge ab und leitet ihn vorzugsweise als Wärme ab. Die Erscheinung der FRET hängt von einer Überlappung zwischen dem Emissions-Spektrum der Fluoreszenz-Gruppe und dem Absorptions-Spektrum der Quenching-Gruppe ab. FRET hängt auch von der Entfernung zwischen der Quenching-Gruppe und der Fluoreszenz-Gruppe ab.
  • Der Begriff „Einheit" bezieht sich auf das Radikal bzw. den Rest eines Moleküls, der/das an eine andere Einheit gebunden ist.
  • Der Begriff „Nucleinsäure", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bedeutet DNS, RNS, einsträngig, doppelsträngig oder höher aggregierte Hybridisierungs-Motive und irgendwelche chemischen Modifikationen davon. Modifikationen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf solche, die chemische Gruppen liefern, die in die Nucleinsäure-Ligand-Basen oder in den Nuclein säure-Ligand als Ganzes zusätzliche Ladung, Polarisierbarkeit, Wasserstoff-Bindung, elektrostatische Wechselwirkung und Fluktuierung einschließen. Solche Modifikationen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Peptid-Nucleinsäuren, Phosphodiester-Gruppen-Modifikationen (z.B. Phosphorothioate, Methylphosphonate), Zucker-Modfikationen in 2'-Position, Pyrimidin-Modifikationen in 5-Position, Purin-Modifikationen in 8-Modifikation, Modifikation an exocyclischen Aminen, Substitution von 4-Thiouridin, Substitution von 5-Brom- oder 5-Iod-Uracils, Grundgerüst-Modifikationen, Methylierungen, unübliche Basen-Paarungs-Kombinationen wie beispielsweise die Isobasen, Isocytidin und Isoguanidin und dergleichen. Modifikationen können auch Modifikationen in 3'- und 5'-Position wie beispielsweise das Capping mit einer PL, einem Fluorophor oder einer anderen Einheit einschließen.
  • Der Begriff „Quenching-Gruppe", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf irgendeine die Fluoreszenz modifizierende Gruppe gemäß der Erfindung, die wenigstens teilweise das Licht abschwächen kann, das von einer Fluoreszenz-Gruppe emittiert wird. Diese Abschwächung wird nachfolgend als „Quenching" bezeichnet. Damit führt die Illumination der Fluoreszenz-Gruppe in Gegenwart der Quenching-Gruppe zu einem Emissions-Signal, das weniger intensiv als erwartet oder sogar vollständig abwesend ist. Ein Quenching tritt üblicherweise durch Energie-Übertragung zwischen der Fluoreszenz-Gruppe und der Quenching-Gruppe auf.
  • Der Begriff „Peptid" bezieht sich auf ein Polymer, indem die Monomere Aminosäuren sind und über Amid-Bindungen miteinander verbunden sind und das alternativ auch als „Polypeptid" bezeichnet wird. Wenn die Aminosäuren α-Aminosäuren sind, kann entweder das optische L-Isomer oder das optische D-Isomer verwendet werden. Zusätzlich sind auch unnatürliche Aminosäuren wie beispielsweise β-Alanin, Phenylglycin und Homoarginin eingeschlossen. Allgemein angetroffene Aminosäuren, die nicht Genkodiert sind, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden. Alle Aminosäuren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können entweder das D- oder das L-Isomer sein. Die L-Isomere sind allgemein bevorzugt. Darüber hinaus sind auch andere Peptidomimetica nützlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Für eine allgemeine Übersicht wird verwiesen auf „A. F. Spatola; in: Chemistry and Biochemistry of Aminoacids, Peptides and Proteins; B. Weinstein (Hrsg.), Marcel Dekker, New York, Seite 267 (1983)".
  • Der Begriff „Alkyl" wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche verwendet, um sich auf verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte einwertige Kohlenwasserstoff-Reste zu beziehen, die allgemein von etwa 1 bis etwa 30 Kohlenstoffatome aufweisen und vorzugsweise von 4 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen und noch mehr bevorzugt von 6 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Wenn die Alkyl-Gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, wird sie als „Niederalkyl" bezeichnet. Geeignete Alkyl-Reste schließen beispielsweise Strukturen ein, die einen oder mehrere Methylen-, Methen- und/oder Methin-Gruppen aufweisen. Verzweigte Strukturen weisen ein Verzweigungsmotiv auf, das ähnlich in Resten i-Propyl, t-Butyl, i-Butyl, 2-Ethylpropyl usw. ist. Der Begriff, wie er im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Patentansprüche verwendet wird, umfasst auch „substituierte Alkyl-Reste" und „cyclische Alkyl-Reste".
  • Der Begriff „substituiertes Alkyl" bezieht sich auf Alkyl-Reste, wie sie gerade vorher beschrieben wurden, die einen oder mehrere Substituenten einschließen, wie beispielsweise Niederalkyl, Aryl, Acyl, Halogen (d.h. Alkylhalogen-Reste, z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Thioamido, Acyloxy, Aryloxy, Aryloxyalkyl, Mercapto, Thia, Aza, Oxo, sowohl gesättigte als auch ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffe, Heterocyclen und dergleichen. Diese Gruppen können an irgendein Kohlenstoffatom oder einen Substituenten der Alkyl-Einheit gebunden sein. Darüber hinaus können diese Gruppen von der Alkyl-Kette ausgehen oder integral in diese eingebunden sein.
  • Der Begriff „Aryl" wird in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet, um sich auf einen aromatischen Substituenten zu beziehen, der ein einzelner aromatischer Ring oder mehrere aromatische Ringe sein kann, die miteinander annel liert sind, kovalent aneinander gebunden sind oder an eine gemeinsame Gruppe wie beispielsweise eine Methylen- oder Ethylen-Einheit gebunden sind. Die gemeinsame Bindungs-Gruppe kann auch eine Carbonyl-Gruppe sein, wie beispielsweise in Benzophenon. Der/die aromatische(n) Ring(e) kann/können einschließen: Phenyl, Naphthyl, Biphenyl, Diphenylmethyl und Benzophenon, unter anderen Resten. Der Begriff „Aryl" umfasst auch „Arylalkyl" und „substituiertes Aryl".
  • Der Begriff „substituiertes Aryl" bezieht sich auf Aryl-Reste, wie sie gerade oben beschrieben wurden, einschließlich einer oder mehrerer funktioneller Gruppe(n) wie beispielsweise Niederalkyl, Acyl, Alkylhalogen-Reste (z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Acyloxy, Phenoxy, Mercapto und sowohl gesättigte als auch ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffe, die an den/die aromatischen Ring(e) annelliert sind, kovalent gebunden sind oder an eine gemeinsame Gruppe wie beispielsweise eine Methylen- oder Ethylen-Einheit gebunden sind. Die verbindende Gruppe kann auch ein Carbonyl-Rest sein, wie beispielsweise in Cyclohexylphenylketon. Der Begriff „substituiertes Aryl" umfasst auch „substituiertes Arylalkyl".
  • Der Begriff „Arylalkyl" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf einen Untersatz von Resten der Definition „Aryl" zu beziehen, in denen die Aryl-Gruppe an eine andere Gruppe über eine Alkyl-Gruppe gebunden ist, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert wurde.
  • Der Begriff „substituiertes Arylalkyl" definiert einen Untersatz von Gruppen mit der Bezeichnung „substituiertes Aryl", in denen die substituierte Aryl-Gruppe an eine andere Gruppe über eine Alkyl-Gruppe gebunden ist, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert wurde.
  • Der Begriff „Acyl" wird verwendet, um einen Keton-Substituenten zu beschreiben, -C(O)R, worin R für Alkyl oder substituiertes Alkyl, ein Aryl oder substituiertes Aryl steht, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert sind.
  • Der Begriff „Halogen" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf Fluor-, Brom-, Chlor- und Iod-Atome zu beziehen.
  • Der Begriff „Hydroxy" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf die Gruppe -OH zu beziehen.
  • Der Begriff „Amino" wird verwendet für -NRR', worin R und R' unabhängig voneinander H, Alkyl, Aryl oder substituierte Analoge davon sind.
  • Der Begriff „Amino" umfasst „Alkylamino", was sekundäre und tertiäre Amine bezeichnet, und „Acylamino", was die Gruppe RC(O)NR' bezeichnet.
  • Der Begriff „Alkoxy" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um sich auf die -OR-Gruppe zu beziehen, worin R Alkyl oder ein substituiertes Analog davon ist. Geeignete Alkoxy-Reste schließen beispielsweise Methoxy, Ethoxy, t-Butoxy usw. ein.
  • Der Begriff „Aryloxy", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezeichnet aromatische Gruppen, die an eine andere Gruppe direkt über ein Sauerstoff-Atom gebunden sind. Dieser Begriff umfasst „substituierte Aryloxy"-Einheiten, in denen die aromatische Gruppe substituiert ist, wie dies oben für „substituiertes Aryl" beschrieben wurde. Beispielhafte Aryloxy-Einheiten schließen Phenoxy, substituiertes Phenoxy, Benzyloxy, Phenethyloxy, usw. ein.
  • Der Begriff „Aryloxyalkyl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, definiert aromatische Gruppen, die über ein Sauerstoffatom an eine Alkyl-Gruppe gebunden sind, wie sie oben definiert wurde. Der Begriff „Aryloxyalkyl" umfasst „substituierte Aryloxyalkyl"-Einheiten, in denen die aromatische Gruppe substituiert ist, wie dies für „substituiertes Aryl" beschrieben wurde.
  • Der Begriff „Mercapto", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, definiert Einheiten der allgemeinen Struktur -S-R, worin R für H, Alkyl, Aryl oder heterocyclische Reste steht, wie sie in der vorliegenden Beschreibung definiert sind.
  • Der Begriff „gesättigter cyclischer Kohlenwasserstoff" bezeichnet Gruppen wie beispielsweise die Gruppen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl usw. und substituierte Analoge dieser Strukturen. Diese cyclischen Kohlenwasserstoffe können Ein-Ring- oder Mehr-Ring-Strukturen sein.
  • Der Begriff „ungesättigter cyclischer Kohlenwasserstoff" wird verwendet zur Beschreibung einer einwertigen nicht-aromatischen Gruppe mit wenigstens einer Doppelbindung, wie beispielsweise Cyclopenten, Cyclohexen usw. und substituierte Analoge davon. Diese cyclischen Kohlenwasserstoffe können Ein- oder Mehr-Ring-Strukturen sein.
  • Der Begriff „Heteroaryl", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf aromatische Ringe, in denen ein oder mehrere Kohlenstoffatom(e) des/der aromatischen Ring(e)s durch ein Heteroatom wie beispielsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel ersetzt sind. „Heteroaryl" bezieht sich auf Strukturen, die ein einzelner aromatischer Ring, mehrere aromatische Ringe oder ein oder mehrere aromatische Ringe, gebunden an einen oder mehrere nicht-aromatische(n) Ring(e), sein können. In Strukturen mit mehreren Ringen können die Ringe miteinander annelliert, kovalent aneinander gebunden oder an eine gemeinsame Gruppe wie beispielsweise eine Methylen- oder Ethylen-Einheit gebunden sein. Die gemeinsame Verbindungs-Gruppe kann auch eine Carbonyl-Gruppe sein, wie beispielsweise in Phenylpyridylketon. Entsprechend der Verwendung in der Beschreibung und in den Patentansprüchen werden Ringe wie beispielsweise Thiophen, Pyridin, Isoxazol, Phthalimid, Pyrazol, Indol, Furan usw. oder Bezo-annellierte Analoge dieser Ringe durch den Begriff „Heteroaryl" definiert.
  • Der Begriff „Heteroarylalkyl" definiert einen Untersatz der Reste mit der Bezeichnung „Heteroaryl", in denen eine Alkyl-Gruppe, wie sie oben definiert wurde, die Heteroaryl-Gruppe an eine andere Gruppe bindet.
  • Der Begriff „substituiertes Heteroaryl" bezieht sich auf Heteroaryl-Reste, wie sie gerade oben beschrieben wurden, in denen der Heteroaryl-Kern mit einer oder mehreren funktionellen Gruppe(n) substituiert ist, wie beispielsweise Niederalkyl, Acyl, Halogen, Alkylhalogen-Reste (z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Acyloxy, Mercapto usw.. Damit werden substituierte Analoge von heteroaromatischen Ringen wie beispielsweise Thiophen, Pyridin, Isoxazol, Phthalimid, Pyrazol, Indol, Furan usw. oder Bezo-annellierte Analoge dieser Ringe durch den Begriff „substituiertes Heteroaryl" definiert.
  • Der Begriff „substituiertes Heteroarylalkyl" bezieht sich auf einen Untersatz mit der Bezeichnung „substituiertes Heteoaryl", wie sie oben beschrieben wurden, in denen eine Alkyl-Gruppe, wie sie oben definiert wurde, die Heteroaryl-Gruppe an eine andere Gruppe bindet.
  • Der Begriff „heterocyclisch" wird in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet, um eine einwertige gesättigte oder ungesättigte nicht-aromatische Gruppe zu beschreiben, die einen einzelnen Ring oder mehrere kondensierte Ringe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und 1 bis 4 Heteroatomen aufweist, die gewählt sind aus Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoff innerhalb des Rings. Solche Heterocyclen sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Morpholin, Piperidin, Pyrrolidin usw..
  • Der Begriff „substituiert heterocyclisch", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, beschreibt einen Untersatz von Substituenten mit der Bezeichnung „heterocyclisch", in denen der Heterocyclen-Kern mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert ist, wie beispielsweise Niederalkyl, Acyl, Halogen, Alkylhalogen-Reste (z.B. CF3), Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkylamino, Acylamino, Acyloxy, Mercapto usw..
  • Der Begriff „Heterocycloalkyl" definiert einen Untersatz von Gruppen mit der Bezeichnung „heterocyclisch", in denen eine Alkyl-Gruppe, wie sie oben definiert wurde, die heterocyclische Gruppe an eine andere Gruppe bindet.
  • Einführung
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Klasse von lumineszierenden Sonden, die auf Metall-Chelaten von Liganden auf Phthalamidyl-Basis („PL") basieren, insbesondere Chelate der Lanthaniden-Reihe. Andere Verbindungen gemäß der Erfindung schließen sowohl Phthalamidyl-Einheiten als auch Salicylamidyl-Einheiten in einem einzigen Liganden („PSL") ein. Die Verbindungen gemäß der Erfindung emittieren Licht, oder sie können verwendet werden, um Licht zu absorbieren, das von einem Reporter-Fluorophor emitiert wird. Die Fluorophore gemäß der Erfindung können als kleine Moleküle in Lösungs-Assays verwendet werden, oder sie können verwendet werden als Markierung, die an eine zu analysierende Substanz oder eine Spezies gebunden wird, die mit einer zu analysieren Substanz in Wechselwirkung tritt und einen Nachweis und/oder eine quantitative Bestimmung der zu analysierenden Substanz erlaubt.
  • Fluoreszenz-Markierungen haben den Vorteil, dass sie wenig Vorsichtsmaßnahmen bei ihrer Handhabung erfordern und für Hoch-Durchlauf-Visualisierungstechniken zugänglich sind (optische Analyse, die eine Digitalisierung des Bildes zur Analyse in einem integrierten System einschließt, das einen Computer umfasst). Bevorzugte Markierungen sind typischerweise gekennzeichnet durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: hohe Empfindlichkeit, hohe Stabilität, geringer Hintergrund, lange Lebensdauern, geringe Umgebungs-Empfindlichkeit und hohe Spezifität bei der Markierung. Die Fluorophore gemäß der Erfindung können mit anderen Fluorophoren oder Quenchern als Komponenten von Energie-Übertragungs-Sonden verwendet werden. Viele Fluoreszenz-Markierungen sind nützlich in Kombination mit den PL und PSL gemäß der Erfindung. Viele derartige Markierungen sind im Handel erhältlich von beispielsweise den Firmen SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), Molecular Probes (Eugene, OR), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz) und Applied Biosystems (Foster City, CA) sowie viele andere kommerzielle Quellen, die Fachleuten in diesem Bereich bekannt sind. Weiter erkennen Personen mit Sachverstand in diesem technischen Bereich, wie man ein passendes Fluorophor für eine spezielle Anwendung auswählt und sind dann, wenn diese nicht einfach im Handel erhältlich ist, in der Lage, den erforderlichen Fluorophor de novo zu synthetisieren oder im Handel erhältliche Fluoreszenz-Verbindungen synthetisch zu modifizieren und so zu der gewünschten Fluoreszenz-Markierung zu kommen.
  • Zusätzlich zu Fluorophoren in Form kleiner Moleküle sind natürlich vorkommende Fluoreszenz-Proteine und durch Molecular Engineering hergestellte Analoge solcher Proteine nützlich mit den PLs und PSLs gemäß der vorliegenden Erfindung. Solche Proteine schließen beispielsweise ein: Grün-Fluoreszenz-Proteine von Önidarien (Ward et al., Photochem. Photobiol. 35: 803–808 (1982); Levine et al., Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77–85 (1982)), Gelb-Fluoreszenz-Protein von dem Stamm Vibrio fischeri (Baldwin et al, Biochemistry, 29: 5509–5515 (1990)), Peridinin-Chlorophyll von den Dinoflagellaten Symbiodinium sp. (Morris et al., Plant Molecular Biology, 24 : 673–677 (1994)), Phycobili-Proteine von marinen Cyanobakterien wie beispielsweise Synechococcus, z.B. Phycoerythrin und Phycocyanin (Wilbanks et al., J. Biol. Chem., 268: 1226–1235 (1993)) und dergleichen.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können verwendet werden als Sonden, als Werkzeuge zum Trennen spezieller Ionen von anderen gelösten Substanzen, als Sonden in der Mikroskopie, Enzymologie, klinischen Chemie, Molekularbiologie und Medizin. Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind auch nützlich als therapeutische Mittel in Modalitäten, wie beispielsweise photodynamische Therapie, und als diagnostische Mittel in Abbildungs-Verfahren wie beispielsweise der Magnetresonanz-Bildgebung. Darüber hinaus sind die Verbindungen gemäß der Erfindung nützlich als Komponente optischer Verstärker von Licht, Wave Guides und dergleichen. Weiter können die Verbindungen gemäß der Erfindung in Tinten und Farbstoffe wie beispielsweise solche einge arbeitet werden, die beim Drucken von Geldscheinen oder anderen handelbaren Instrumenten verwendet werden.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können zur Lumineszenz gebracht werden, indem man sie in irgendeiner Weise anregt, die in diesem technischen Bereich bekannt ist, einschließlich beispielsweise eine Anregung mit Licht oder mit elektrochemischer Energie (siehe beispielsweise Kulmala et al., Analytica Chimica Acta, 386: 1 (1999)). Im Fall chiraler Verbindungen gemäß der Erfindung kann die Lumineszenz circular polarisiert sein (siehe beispielsweise Riehl et al., Chem. Rev., 86: 1 (1986)).
  • Die Verbindungen, Sonden und Verfahren, die in den folgenden Abschnitten diskutiert werden, sind allgemein repräsentativ für die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung und die Verfahren, in denen solche Zusammensetzungen verwendet werden können. Die folgende Diskussion ist als beispielhaft für ausgewählte Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beabsichtigt und sollte nicht als den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränkend interpretiert werden.
  • Die Verbindungen
  • Die vorliegende Erfindung liefert eine Anordnung für Metall-chelatisierende Liganden („PL") auf Phthalamidyl-Basis, die wenigstens eine Phthalamidyl-Einheit innerhalb ihres Gitterwerks umfassen. Die PL-Verbindungen können auch eine oder mehrere Salicylamidyl-Einheiten) innerhalb ihres Rahmenwerks in Kombination mit einer oder mehreren Phthalamidyl-Einheiten) einschließen.
  • In einem Aspekt liefert die Erfindung einen lumineszenten Lanthaniden-Ionen-Komplex. Die chelatisierende Gruppe umfasst wenigstens eine Phthalamidyl-Gruppe, vorzugsweise zwischen 2 und 100 Phthalamidyl-Gruppen, noch mehr bevorzugt zwischen 3 und 75 Phthalamidyl-Gruppen und noch weiter bevorzugt zwischen 4 und 50 Phthalamidyl-Gruppen und noch mehr bevorzugt zwischen 5 und 25 Phthalamidyl-Gruppen. Der Komplex weist vorzugsweise auch eine Quantenausbeute von wenigstens etwa 0,1 auf. Noch weiter bevorzugt ist das Lanthaniden-Ion des Komplexes ein Ion, das gewählt ist aus Europimum, Terbium und Kombinationen daraus.
  • Die wenigstens eine Phthalamidyl-Gruppe der chelatisierenden Gruppe kann substituiert sein mit einer oder mehreren Elektronen abziehenden und/oder Elektronen liefernden Gruppe(n). Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich verstehen, welche Substituenten Elektronen abziehende oder Elektronen liefernde Eigenschaften zeigen, wenn sie an einen aromatischen Ring gebunden werden. Tabellen von Substituenten, die zum Einschluss in die PLs gemäß der Erfindung geeignet sind, können in der Literatur gefunden werden. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften: „Hammett, J. Am. Chem. Soc., 59: 96 (1937), Johnson, THE HAMMET EQUATION, Cambridge University Press, New York, 1973"; „Hansch et al., J. Med. Chem, 16: 1207 (1973)" und "Hansch et al., SUBSTITUENT CONSTANTS FOR CORRELATION ANALYSIS in CHEMISTRY AND BIOLOGY, Wiley, New York, (1979)".
  • Darüber hinaus können die Phthalamidyl-Gruppen des Komplexes mittels eines Grundgerüsts von im wesentlichen beliebiger Länge und chemischer Zusammensetzung verbunden sein, mit der Maßgabe, dass das Grundgerüst die Phthalamidyl-Ringe und andere Ringe in einer Weise orientieren sollte, die für ihre Komplexierung mit dem gewünschten Metall-Ion förderlich ist. Die Tatsache, dass das Grundgerüst bei den Bedingungen stabil ist, in denen der Komplex verwendet wird, ist ebenfalls allgemein bevorzugt. Als solches schließen beispielhafte Grundgerüste beispielsweise Alkyl-Gruppen, substituierte Alkyl-Gruppen, konjugierte ungesättigte Systeme, Aryl-Gruppen, Heteroaryl-Gruppen, Dendrimere, Polyether, Polyamide, Polyimine, Biopolymere und Grundgerüste ein, die eine Kombination aus mehr als einer dieser Gruppen sind. Andere nützliche Grundgerüst-Systeme sind Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich offensichtlich.
  • In einem zweiten Aspekt liefert die Erfindung eine Verbindung, die eine Struktur gemäß Formel I hat:
  • Figure 00230001
  • In der Formel I sind R1, R2, R4, R5, R6, R7, R10 und und R20 Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin zwei oder mehrere der Reste R2, R4, R5, R7 und, wenn R3 eine substituierte Alkyl-Gruppe ist, ein Substituent von R3 gegebenenfalls benachbart sind von wenigstens einer Linker-Einheit unter Bildung wenigstens eines Ringes. Die Reste R3, R8 und R9 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl, substituiertes Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl. R11, R12, R13, R21, R22 und R23 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR14R15, -NO2, -OR16, -COOR17, worin R14, R15, R16 und R17 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R12 gegebenenfalls einen Ring mit R11, R13 oder beiden bilden kann und R22 gegebenenfalls einen Ring mit R21, R23 oder beiden bilden kann. Die Ringe sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-, substituierten cyclischen Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Heteroaryl-, substituierten Heteroaryl-, Heterocyclyl- und gesättigten Heterocyclyl-Ringsystemen. Q1 für -OR18 steht; Q2 für -OR19 steht; worin R18 und R19 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung. Die Zahl, die durch a wiedergegeben wird, ist 0 oder 1, mit der Maßgabe, daß dann, wenn a gleich 0 ist, N2' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 2' gebunden ist. In ähnlicher Weise ist z gleich 0 oder 1, mit der Maßgabe, daß dann, wenn z gleich 0 ist, N1' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 1' gebunden ist.
  • Obowhl die Komplexierungsmittel der Erfindung jede nützliche Zahl von Phthalamidyl-Ringen aufweisen können, ist in einer bevorzugten Ausführungsform z gleich 0, das im allgemeinen zu einem Komplexierungsmittel mit drei Phthalamidyl-Ringen führt.
  • Wie oben diskutiert, kann das Grundgerüst, das in der vorliegenden Erfindung durch R3 wiedergegeben wird, jede nützliche Struktur und Größe haben, solange es dazu funktioniert, daß daran wenigstens eine Phtalamidyl-Gruppe angehängt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist R3 ein linearer C1- bis C6-Kohlenwasserstoff-Rest.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung bereit, die drei Phthalamidyl-Ringe aufweist. Die Verbindung hat eine Struktur gemäß Formel I, worin R8 für (CH2)P steht und P ausgewählt ist aus der Gruppe, die bsteht aus ganzen Zahlen zwischen 1 und 5 einschließlich. R4 stellt den dritten Phthalamidyl-Ring bereit und ist eine Alkyl-Gruppe, die mit einer Einheit substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel II aufweist:
  • Figure 00240001
  • In Formel II sind R29, R46 und R47 Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin zwei oder mehr der Reste R2, R7 und R29 gegebenenfalls von wenigstens einer Linker-Einheit benachbart sind und so wenigstens einen Ring bilden. R31, R32 und R33 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR24R25, -NO2, -OR26, -COOR27, worin R24, R25, R26 und R27 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R32 gegebenenfalls einen Ring mit R31, R33 oder beiden bilden kann. Die Ringe sind Ringe, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ringsystemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-Ringsystemen, substituierten cyclischen Alkyl-Ringsystemen, Aryl-Ringsystemen, substituierten Aryl-Ringsystemen, Heteroaryl-Ringsystemen, substituierten Heteroaryl-Ringsystemen, Heterocyclyl-Ringsystemen und gesättigten Heterocyclyl-Ringsystemen. R3 ist (CH2)x, worin X gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus aus ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich. Q3 steht für -OR28, worin R28 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung. In dieser Ausführungsform ist z in der Formel I gleich 0.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen gemäß der Erfindung makrocyclische oder polymakrocyclische Strukturen. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist eine Verbindung, deren Struktur die Einheit einschließt, die in den Formeln I und II dargelegt sind, und in der zwei oder mehrere der Gruppen R2, R7 und R29 von wenigstens einer Linker-Einheit unter Bildung wenigstens eines Rings benachbart sind, noch mehr bevorzugt die Gruppen R2, R7 und R29 zusammen eine einzelne Linker-Einheit umfassen.
  • Obwohl die Linker-Einheiten, die verwendet werden, um die makrocyclischen oer polymakrocyclischen Strukturen zu bilden, im wesentlichen jede nützliche Struktur aufweisen können, einschließlich beispielsweise Alkyl, substituiertes Alkyl, Arylalkyl, Heteroarylalkyl, konjugierte ungesättigte Systeme, Aryl-Gruppen, Heteroaryl-Gruppen, Dendrimere, Polyether, Polyamide, Polyimine, Biopolymere und Grundgerüste, die eine Kombination aus mehreren als einer dieser Gruppen sind, weist der derzeit bevorzugte Linker eine Struktur gemäß Formel III auf:
  • Figure 00250001
  • In Formel III sind b, e unf f Zahlen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus den ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich.
  • In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, die eine Struktur gemäß Formel IV aufweist:
  • Figure 00260001
  • In Formel IV sind b, b', e, e', f und f' Zahlen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus den ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich.
  • In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verbindungen bereit, die eine Struktur gemäß Formel V aufweisen:
  • Figure 00260002
  • Und noch mehr bevorzugt Formel VI:
  • Figure 00270001
  • In den Formeln V und VI geben R1, R2, R10 und Q1 dieselben Spezies wieder, wie diejenigen, die im Zusammenhang mit der Verbindung gemäß Formel I beschrieben wurden. In jeder der Formeln IV bis VI sind die Substituenten (Rn) im wesentlichen diejenigen, die oben beschrieben wurden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausüfhrungsform stellt die Erfindung eine Verbindung mit mindestens vier Phthalamidyl-Ringen bereit. Die Verbindung hat eine Struktur gemäß Formel I, worin R4 eine Alkyl-Gruppe ist, die mit einer Gruppe substituiert ist, die eine Struktur gemäß der obigen Formel II aufweist. Der vierte Phthalamidyl-Ring ist wiedergegeben durch den Rest R5, der eine Alkylgruppe ist, die mit einer Einheit substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel IX aufweist:
  • Figure 00270002
  • In der Formel IX sind R39, R40 und R45 Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl und substituiertem Alkyl. R41, R42 und R43 sind Gruppen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl, substituiertem Alkyl, H, -NR34R35, -NO2, -OR36, -COOR37, worin R34, R35, R36 und R37 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl, worin R42 gegebenenfalls einen Ring mit R41, R43 oder beiden bilden kann. Die Ringe sind Ringe, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ringsystemen, die besteht aus cyclischen Alkyl-Ringsystemen, substituierten cyclischen Alkyl-Ringsystemen, Aryl-Ringsystemen, substituierten Aryl-Ringsystemen, Heteroaryl-Ringsystemen, substituierten Heteroaryl-Ringsystemen, Heterocyclyl-Ringsystemen und gesättigten Heterocyclyl-Ringsystemen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, die eine Struktur gemäß Formel X aufweist:
  • Figure 00280001
  • In Formel X sind M, N, P und Z Zahlen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen zwischen 1 und 5 einschließlich.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, die die Struktur gemäß Formel XI aufweist:
  • Figure 00290001
  • Die Substituenten (R) in Formel XI haben im wesentlichen dieselbe Identität wie die identisch benannten Substituenten in den obigen Formeln.
  • In einem weiteren bevorzugten Beispiel stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, die die Formeln I, II und IX kombiniert und worin R1, R6, R29 und R39 zusammen eine einzelne Linker-Einheit umfassen. Der Linker hat vorzugsweise eine Struktur gemäß Formel XII:
  • Figure 00290002
  • In Formel XII sind b, e, f, g und h Zahlen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Zahlen zwischen 1 und 5 einschließlich.
  • In noch einer weiter bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Verbindung bereit, die eine Struktur gemäß Formel XIII aufweist.
  • Figure 00300001
  • In Figur XIII sind b und b' Zahlen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich; e, e', f, f', g, g', h und h' sind Zahlen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 0 bis 3. In jeder der Formeln X bis XIII sind die Substituenten (Rn) im wesentlichen dieselben, wie sie oben beschrieben wurden.
  • In noch einer weitere bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verbindungen bereit, die eine Struktur gemäß Formel XIV aufweisen:
  • Figure 00300002
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Grundgerüst der Verbindung ein Dendrimer. Auf diese Weise stellt die Erfindung Verbindungen bereit, die eine Struktur gemäß Formel XV aufweisen:
  • Figure 00310001
  • In Formel XV steht D für ein Dendrimer und w ist eine Zahl, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 4 bis 100 einschließlich, noch mehr bevorzugt zwischen 8 und 50 einschließlich.
  • Die PL der Erfindung können auch makrocyclische Liganden bilden, die an das Dendrimer gebunden sind oder die Komponenten des Dendrimers in das makrocyclische Gerüst einbauen. Ein Beispiel solcher Verbindungen haben eine Struktur gemäß Formel XVI:
    Figure 00310002
    worin D und w dieselbe Bedeutung haben, wie dies oben dargelegt wurde. Einem Fachmann auf diesem Gebiet der Technik ist es offensichtlich, daß das Dendrimer und der Ligand an jede dieser Strukturen durch jeden Typ von Spacer-Arm gebunden werden kann, einschließlich beispielsweise eines Amins, wie beispielsweise die Grundgerüst-Amine der vorliegenden Erfindung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der Formeln XV und XVI ist das Dendrimer ein Polypropylenimin-Dendrimer, vorzugsweise der Generation 2 bis Generation 10 einschließlich.
  • In noch einer weiter bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung polymakrocyclische Verbindungen bereit. Eine beispielhafte Struktur einer Verbindung dieser Ausführungsform gemäß der Erfindung ist in Formel XVII wiedergegeben:
  • Figure 00320001
  • R-Gruppen
  • Zum Erreichen von Klarheit der Veranschaulichung wird die Diskussion der Identität der verschiedenen R-Gruppen (z.B. R1, R2, R3 usw.), wie sie in den obigen Formeln angegeben sind, in diesem Abschnitt gesammelt. Diese Diskussion ist in gleicher Weise auf jede der in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen angegebenen Formeln anwendbar. Darüber hinaus versteht es sich trotz der Tatsache, dass sich die Diskussion auf bestimmte repräsentative Formeln fokussiert, dass dies eine Einrichtung ist, die verwendet wird, um die Diskussion der R-Gruppen zu vereinfachen, und dass diese nicht dazu dient, den Umfang der R-Gruppen zu beschränken.
  • Während Bezug auf die Formeln I und II in Kombination und das resultierende Komplexierungsmittel mit drei Phthalamidyl-Ringen Bezug genommen wird, ist die folgende Diskussion allgemein für jede beliebige Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung und jede R-Gruppe für jede Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung rele vant. Darüber hinaus ist die Diskussion besonders relevant für die R-Gruppen R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47. Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich ist es offenbar, dass dann, wenn zusätzliche Phthalamidyl-Ringe, Verbindungs-Gruppen und Grundgerüste in eine Verbindung gemäß der Erfindung einbezogen werden, die folgende Diskussion in gleicher Weise für diese relevant ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist/sind eine oder mehrere der oben genannten R-Gruppe(n) eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, C1- bis C10-Alkyl und substituiertem C1- bis C10-Alkyl und ist noch mehr bevorzugt eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, C2- bis C6-Alkyl und substituiertem C2- bis C6-Alkyl.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist/sind eine oder mehrere der oben genannten R-Gruppe(n) eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H, Aryl, substituiertem Aryl und Kombinationen daraus.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist/sind eine oder mehrere der oben genannten R-Gruppe(n) eine Gruppe, die unabhängig gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H und Alkyl, das mit polycyclischen Aryl-Gruppen substituiert ist, vorzugsweise mit Naphthyl-Gruppen.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist/sind eine oder mehrere der oben genannten R-Gruppe(n) eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus H und einem primären Alkylamin, vorzugsweise einer C1- bis C10-Alkyl-Kette, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt, noch mehr bevorzugt eine C2- bis C6-Alkyl-Kette, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist/sind eine oder mehrere der oben genannten R-Gruppe(n) ein Polyether, vorzugsweise eine Verbindung, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomere und Kombinationen daraus, die ein Molekulargewicht von etwa 60 Dalton bis etwa 10.000 Dalton aufweisen und noch mehr bevorzugt ein Molekulargewicht von etwa 100 Dalton bis etwa 1.000 Dalton aufweisen.
  • Repräsentative Substituenten auf Polyether-Basis schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die folgenden Strukturen:
    Figure 00340001
    worin j eine Zahl von 1 bis 100 einschließlich ist. Andere funktionelle Gruppen tragende Polyether sind Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt, und viele sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Shearwater Polymers, Inc. (Alabama).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst eine oder umfassen mehrere der oben genannten R-Gruppen eine reaktive Gruppe zum Konjugieren der Verbindung an eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Molekülen und Oberflächen. Repräsentative nützliche reaktive Gruppen werden nachfolgend weiter im Einzelnen in dem folgenden Abschnitt diskutiert. Weitere Informationen über nützliche reaktive Gruppen sind Fachleuten mit Sachverstand in diesem technischen Bereich bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschrift „Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, (1996)".
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine oder sind mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Gruppe, die gewählt ist aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus; noch mehr bevorzugt hat die R-Gruppe eine Struktur, gemäß Formel VII:
  • Figure 00350001
  • In Formel VII ist X eine Gruppe, die gewählt ist aus O, S und NR50. R50 ist vorzugsweise eine Gruppe, die gewählt ist aus H, Alkyl und substituiertem Alkyl. Y ist vorzugsweise eine Gruppe, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und j und k sind vorzugsweise Zahlen, die unabhängig gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat eine oder haben mehrere der oben genannten R-Gruppen eine Struktur gemäß Formel VIII:
    Figure 00350002
    worin Y im wesentlichen die Bedeutung hat, wie sie oben für Formel VII genannt wurde.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann einer oder können mehrere der R-Gruppen charakteristische Eigenschaften einer oder mehrerer der oben genannten Gruppen kombinieren. Beispielsweise kombiniert eine bevorzugte R-Gruppe sowohl die Attribute eines Polyethers als auch einer reaktiven Gruppe:
    Figure 00350003
    worin j eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 einschließlich ist. Andere derartige „chimäre" R-Gruppen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Einheiten wie beispielsweise Zucker (z.B. ein Polyol mit reaktiver Hydroxyl-Gruppe), Aminosäuren, Aminoalkohole, Carboxyalkohole, Aminothiole und dergleichen.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform haben die Verbindungen gemäß der Erfindung mehr als einen Typ von R-Gruppe in einem einzelnen Molekül. Beispielsweise kann ein einzelnes Molekül eine R-Gruppe, die ein Polyether ist, und eine R-Gruppe, die ein Amin ist, einschließen. Viele andere derartige Kombinationen von verschiedenen Substituenten sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offenbar. Repräsentative Strukturen gemäß dieser Ausführungsform werden nachfolgend aufgeführt:
    Figure 00360001
    worin n eine ganze Zahl zwischen 0 und 6 und vorzugsweise zwischen 1 und 3 ist.
  • Eine Veranschaulichung der Strukturen von bestimmten beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung ist in 19 dargelegt.
  • Beispielhafte Lanthaniden-Chelate gemäß der Erfindung haben eine Struktur gemäß Struktur 1:
    Figure 00370001
    worin s zwischen 1 und 5 einschließlich ist. Beispielhafte bevorzugte Verbindungen sind in Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 1
    Figure 00370002
  • Für alle Verbindungen in Tabelle 1 sind R', R'' und R''' H und R0 und R'''' Amide;
    3(M)Li = 2,2-Dimethyl-1,3-diaminopropan;
    5LI = 1,5-Diaminopentan;
    TREN = Tris-(2-aminoethyl-)amin;
    2-AMN = 2-Aminomethylnaphthalin;
    H22 = Tetrakis-(2-aminoethyl-)ethylendiamin.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen gemäß der Erfindung mit einem weiteren Molekül durch eine schwache Wechselwirkung (z.B. van der Waals-Wechselwirkung) assoziiert und bilden so eine Spezies wie beispielsweise einen Einschluss-Komplex. Bevorzugte Moleküle, die mit den PLs in Wechselwirkung treten, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Dendrimere, Makrocyclen, Cyclodextrine und dergleichen.
  • Reaktive funktionelle Gruppen
  • Bestimmte Verbindungen gemäß der Erfindung tragen eine reaktive funktionelle Gruppe wie beispielsweise eine Komponente eines Bindungs-Arms, der an jeder beliebigen Position an irgendeinem Aryl-Kern oder an einer Kette angeordnet sein kann, wie beispielsweise eine Alkyl-Kette, die an den Aryl-Kern oder an das Grundgerüst des chelatisierenden Mittels gebunden ist. Diese Verbindungen werden nachfolgend bezeichnet als „reaktive Liganden". Wenn die reaktive Gruppe an eine Alkyl-Kette oder eine substituierte Alkyl-Kette gebunden ist, die ihrerseits an einen Aryl-Kern gebunden ist, ist die reaktive Gruppe vorzugsweise an einer terminalen Position einer Alkyl-Kette angeordnet. Reaktive Gruppen und Klassen von Reaktionen, die nützlich für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, sind allgemein diejenigen, die im technischen Bereich der Biokonjugat-Chemie wohlbekannt sind. Zur Zeit favorisierte Klassen von Reaktionen, die mit reaktiven Liganden gemäß der Erfindung erhältlich sind, sind diejenigen, die unter relativ milden Bedingungen ablaufen. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf nucleophile Substitutionen (z.B. Reaktionen von Aminen und Alkoholen mit Acylhalogeniden, aktiven Estern), elektrophile Substitutionen (z.B. Enamin-Reaktionen) und Additions-Reaktionen an Kohlenstoff-Kohlenstoff- und Kohlenstoff-Heteroatom-Mehrfachbindungen (z.B. Michael-Reaktion, Diels-Alder-Addition). Diese und andere nützliche Reaktionen werden beispielsweise diskutiert in dem Druckwerk „March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, 1985; in dem Druckwerk Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; und in dem Druckwerk Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS, Advances in Chemistry Series, Band 198, American Chemical Society, Washington, D.C., (1982)".
  • Nützliche reaktive funktionelle Gruppen schließen beispielsweise ein:
    • (a) Carboxyl-Gruppen und verschiedene Derivate davon, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf N-Hydroxysuccinimid-Ester, N-Hydroxybenztriazol-Ester, Säurehalogenide, Acylimidazole, Thioester, p-Nitrophenylester, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- und aromatische Ester;
    • (b) Hydroxyl-Gruppen, die in Ester, Ether, Aldehyde usw. umgewandelt werden können;
    • (c) Halogenalkyl-Gruppen, in denen das Halogenid später durch eine nucleophile Gruppe wie beispielsweise ein Amin, ein Carboxylat-Anion, ein Thiol-Anion, ein Carboxylgruppe-Anion oder ein Alkoxid-Ion ersetzt werden kann, was zur kovalenten Bindung einer neuen Gruppe an der Stelle des Halogen-Atoms führt;
    • (d) Dienophiele Gruppen, die in der Lage sind, an Diels-Alder-Reaktionen teilzunehmen, wie beispielsweise Maleimid-Gruppen;
    • (e) Aldehyd- oder Keton-Gruppen, so dass eine anschließende Derivatisierung möglich ist über die Bildung von Carbonyl-Derivaten wie beispielsweise von Iminen, Hydrazonen, Semicarbazonen oder Oximen oder über solche Mechanismen wie Grignard-Addition oder Alkyllithium-Addition;
    • (f) Sulfonylhalogenid-Gruppen für anschließende Reaktion mit Aminen, beispielsweise unter Bildung von Sulfonamiden;
    • (g) Thiol-Gruppen, die umgewandelt werden können in Disulfide oder umgesetzt werden können mit Acylhalogeniden;
    • (h) Amin- oder Sulfhydryl-Gruppen, die beispielsweise acyliert, alkyliert oder oxidiert werden können;
    • (i) Alkene, die beispielsweise Cycloadditionen, Acylierungs-Reaktionen, eine Michael-Addition usw. eingehen können;
    • (j) Epoxide, die beispielsweise mit Aminen und Hydroxyl-Verbindungen reagieren können; und
    • (k) Phosphoramidite und andere standardisierte funktionelle Gruppen, die in der Nucleinsäure-Synthese nützlich sind.
  • Die reaktiven funktionellen Gruppen können so gewählt werden, dass sie nicht an den Reaktionen teilnehmen oder diese nicht stören, die erforderlich sind, um den reaktiven Liganden aufzubauen. Alternativ kann eine reaktive funktionelle Gruppe davor, an der Reaktion teilzunehmen, durch die Gegenwart einer Schutzgruppe geschützt werden. Fachleute in diesem technischen Bereich verstehen, wie eine bestimmte funktionelle Gruppe so geschützt werden kann, dass sie einen gegebenen Satz von Reaktionsbedingungen nicht stört. Für Beispiele nützlicher Schutzgruppen wird beispielsweise verwiesen auf „Greene et al., PROTECTNE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, (1991)".
  • Donor- und Akzeptor-Einheiten
  • Einer der Vorteile der Verbindungen gemäß der Erfindung ist, dass sie mit einem großen Bereich von Energie-Donor- und -Akzeptor-Molekülen zur Konstruktion von Fluoreszenz-Energie-Übertragungs-Sonden verwendet werden können. Eine riesige Gruppe von Fluorophoren, die nützlich zur Verbindung mit den PLs sind, sind Fachleuten in diesem technischem Bereich bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Cardullo et al., Proc. Natl, Acad. Sci., USA, 85: 8790–8794 (1988)"; "Dexter, D. L., J. of Chemical Physics, 21: 836–850 (1953)"; "Hochstrasser et al., Biophysical Chemistry, 45: 133–141, (1992)"; "Selvin, P., Methods in Enzymology, 246: 300–334 (1995)"; "Steinberg, I., Ann. Rev. Biochem, 40: 83–114 (1971);" „Stryer, L., Ann. Rev. Biochem., 47: 819–846 (1978)"; „Wang et al., Tetrahedon Letters, 31: 6493–6496 (1990)"; „Wang et al., Anal. Chem., 67: 1197–1203 (1995)".
  • Eine nicht-beschränkende Liste von beispielhaften Donoren, die in Verbindung mit den Quenchern gemäß der Erfindung verwendet werden können, wird in Tabelle 2 angegeben.
  • Tabelle 2
  • Geeignete Einheiten, die als Donoren oder Akzeptoren in FET-Paaren gewählt werden können
    • 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure Acridin und Derivate: Acridin Acridin Isothiocyanat
    • 5-(2'-Aminoethyl-)aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS)
    • 4-Amino-N-[3-vinylsulfonylphenyl-]naphthalimid-3,5-disulfonat
    • N-(4-Anilino-1-naphthyl-)maleimid
    • Anthranilamid
    • BODIPY
    • Brilliant-Gelb
    • Coumarin und Derivate: Coumarin 7-Amino-4-methylcoumarin (AMC Coumarin 120) 7-Amino-4-trifluormethylcoumarin (Coumarin 151)
    • Cyanin-Farbstoffe
    • Cyanosin
    • 4',6-Diaminidino-2-phenylindol (DAPI)
    • 5',5''-Dibrompyrogallol-sulfonaphthalein (Brompyrogallol-Rot)
    • 7-Diethylamino-3-(4'-isothiocyanatophenyl-)4-methylcoumarin
    • Diethylentriaminpentaacetat
    • 4,4'-Diisothiocyanatodihydrostilben-2,2'-disulfonsäure
    • 4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure
    • 5-[Dimethylamino-]naphthalin-1-sulfonylchlorid (DNS, Dansylchlorid)
    • 4-(4'-Dimethylaminophenylazo-)benzoesäure (DABCYL)
    • 4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-isothiocyanat (DABITC)
    • Eosin und Derivate: Eosin Eosinisothiocyanat
    • Erythrosin und Derivate: Erythrosin B Erythrosinisothiocyanat
    • Ethidium
    • Fluorescein und Derivate: 5-Carboxylfluorescin (FAM) 5-(4,6-Dichlortriazin-2-yl-)aminofluorescein (DTAF) 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE) Fluorescein Fluoresceinisothiocyanat QFITC (XRITC)
  • Tabelle 2 (Fortsetzung)
    • Fluorescamin
    • IR 144
    • IR1446
    • Malachit-Grün-isothiocyanat
    • 4-Methylumbelliferon
    • ortho-Cresolphthalein
    • Nitrotyrosin
    • Pararosanilin
    • Phenol-Rot
    • b-Phyctocoerythrin
    • o-Phthaldialdehyd
    • Pyren und Derivate: Pyren Pyrenbutyrat Succinimidyl-1-pyrenbutyrat
    • Quantum Dots
    • Reaktiv-Rot-4 (CibacronTM Brilliant-Rot 3B-A)
    • Rhodamin und Derivate: 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX) 6-Carboxyrhodamin (R6G) Lissamin-rhodamin-B-sulfonylchloridrhodamin (Rhod) Rhodamin B Rhodamin 123 Rhodamin-X-isothiocyanat Sulforhodamin B Sulforhodamin 101 Sulfonylchlorid-Derivat von Sulforhodamin 101 (Texas-Rot) N, N, N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA) Tetramethylrhodamin Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)
    • Riboflavin
    • Rosolsäure
    • Lanthaniden-Chelat-Derivate
  • Es gibt eine große Zahl praktischer Anleitungen, die in der Literatur erhältlich ist, um passende Donor-Akzeptor-Paare für spezielle Sonden auszuwählen, wie sich beispielhaft anhand der folgenden Druckschriften ergibt: „Pesce et al., (Hrsg.), FLUORESCENCE SPECTOSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971)"; „White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970)"; und dergleichen. Die Literatur schließt auch Druckschriften ein, die er schöpfende Listen von fluoreszierenden und chromogenen Molekülen und ihre relevanten optischen Eigenschaften bereitstellen, um Reporter-Quencher-Paare auszuwählen (siehe beispielsweise: „Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2. Ausgabe (Academic Press, New York, 1971)"; "Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976)"; "Bishop, Hrsg., INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972)"; "Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992)"; "Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949)"; und dergleichen. Weiter gibt es extensive Anleitungen in der Literatur zum Derivatisieren von Reporter- und Quencher-Molekülen zur kovalenten Bindung über leicht erhältliche reaktive Gruppen, die an ein Molekül addiert werden können.
  • Die Vielfalt und Brauchbarkeit chemischer Wege, die dafür erhältlich sind, Fluorophore an andere Moleküle und Oberflächen zu konjugieren, wird beispielhaft angegeben durch den umfangreichen Bestand an Literatur zur Herstellung von mit Fluorophoren derivatisierter Nucleinsäuren. Es wird beispielsweise Bezug genommen auf „Haugland (a.a.O.)"; „Ullman et al., US-Patent Nr. 3,996,345"; „Khanna et al., US-Patent Nr. 4,351,760". Damit liegt es sehr wohl innerhalb der Fähigkeiten von mit diesem technischen Gebiet vertrauten Fachleuten, ein Energie-Austausch-Paar zur speziellen Anwendung auszuwählen und die Verbindungen dieses Paars an ein Sonden-Molekül zu konjugieren, wie beispielsweise ein niedermolekulares bioaktives Material, eine Nucleinsäure, ein Peptid oder ein anderes Polymer.
  • In einem FET-Paar ist es allgemein bevorzugt, dass eine Absorptions-Bande des Akzeptors wesentlich mit einer Fluoreszenz-Emmissions-Bande des Donors überlappt. Wenn der Donor (das Fluorophor) eine Komponente einer Sonde ist, die Gebrauch von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung macht (FRET) werden die Donor-Fluoreszenz-Einheit und der Quencher (Akzeptor) gemäß der Erfindung vorzugsweise so gewählt, dass die Donor- und die Akzeptor-Einheit eine Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung zeigen, wenn die Donor-Einheit angeregt wird. Ein Faktor, der bei der Auswahl des Fluorophor-Quencher-Paars beachtet werden muss, ist die Effizienz der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung zwischen den beiden Gliedern des Paars. Vorzugsweise ist die Effizienz der FRET zwischen der Donor-Einheit und der Akzeptor-Einheit wenigstens 10 %, noch mehr bevorzugt wenigstens 50 % und noch weiter bevorzugt wenigstens 80 %. Die Effizienz der FRET kann leicht empirisch getestet werden unter Anwendung der Verfahren, die sowohl in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind als auch aus dem Stand der Technik bekannt sind.
  • Die Effizienz der FRET zwischen dem Donor und dem Akzeptor des Paars kann auch eingestellt werden durch Ändern des Vermögens des Donors bzw. Akzeptors zur Dimerisierung oder nahen Assoziation. Wenn es bekannt ist oder bestimmt wird, dass die Donor-Einheit und die Akzeptor-Einheit eng miteinander assoziieren, kann eine Erhöhung oder Absenkung der Assoziation dadurch gefördert werden, dass man die Länge einer Verbindungs-Einheit oder Linker-Einheit oder der Sonde selbst zwischen den beiden Fluoreszenz-Proteinen entsprechend einstellt. Das Vermögen des Donor-Akzeptor-Paars zur Assoziation kann erhöht oder erniedrigt werden durch Einstellen der hydrophoben oder ionischen Wechselwirkungen oder der sterischen Abstossungen in dem Sonden-Konstrukt. So können die intramolekularen Wechselwirkungen, die für die Assoziation des Donor-Akzeptor-Paars verantwortlich sind, verstärkt oder abgeschwächt werden. So kann beispielsweise die Assoziation zwischen dem Donor-Akzeptor-Paar beispielsweise dadurch erhöht werden, dass man einen Donor, der eine insgesamt negative Ladung trägt, und einen Akzeptor mit einer insgesamt positiven Ladung verwendet.
  • Zusätzlich zu Fluorophoren, die direkt an eine Sonde gebunden sind, können die Fluorophore auch auf indirektem Wege gebunden werden. In dieser Ausführungsform wird vorzugsweise ein Liganden-Molekül (z.B. Biotin) kovalent an die Sonden-Spezies gebunden. Der Ligand wird dann an weitere Moleküle (z.B. ein Streptavidin-Molekül) gebunden, das entweder inhärent nachweisbar ist oder kovalent an ein Signal-System wie beispielsweise eine Fluoreszenz-Verbindung gemäß der Erfindung kovalent gebunden ist oder an ein Enzym gebunden ist, das eine Fluoreszenz-Verbindung durch Umwandlung einer nicht-fluoreszierenden Verbindung produziert. Nützliche Enzyme von Interesse als Markierungen schließen beispielsweise Hydrolasen, speziell Phopshatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreduktasen, insbesondere Peroxidasen ein. Fluoreszierende Verbindungen schließen ein: Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw., wie sie oben diskutiert wurden. Für eine Übersicht über verschiedene markierende oder ein Signal produzierende Systeme, die verwendet werden können, wird verwiesen auf das US-Patent Nr. 4,391,904.
  • Derzeit bevorzugte Fluorophore zur Verwendung im Zusammenhang mit den Komplexen gemäß der Erfindung schließen beispielsweise ein: Xanthen-Farbstoffe, einschließlich Fluoresceine, und Rhodamin-Farbstoffe. Viele geeignete Formen dieser Verbindungen sind in weitem Umfang im Handel erhältlich, und zwar mit Substituenten an ihren Phenyl-Einheiten, die als Stelle zum Binden oder als Bindungs-funktionelle Gruppe zum Binden einer Nucleinsäure verwendet werden können. Eine andere Gruppe bevorzugter fluoreszierender Verbindungen sind die Naphthylamine, die eine Amino-Gruppe in der alpha- oder beta-Position aufweisen. Eingeschlossen bei solchen Naphthylamino-Verbindungen sind 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalinsulfonat und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalinsulfonat. Andere Donoren schließen 3-Phenyl-7-isocyanatocumarin, Acridine wie beispielsweise 9-Isothiocyanatoacridin und Acridin-Orange, N-(p-(2-Benzoxazolyl-)phenyl-)maleimid, Benzoxadiazole, Stilbene, Pyrene und dergleichen ein.
  • Aus Gründen der Klarheit der Veranschaulichung fokussiert sich die nachfolgende Diskussion auf das Binden der Komplexe gemäß der Erfindung und anderer Fluorophore an Nucleinsäuren. Das Fokussieren auf Nucleinsäure-Sonden soll nicht den Umfang der Sonden-Moleküle beschränken, an die die Komplexe gemäß der Erfindung gebunden werden können. Fachleute mit technischem Sachverstand in diesem Bereich erkennen, dass die Komplexe der Erfindung auch an kleine Moleküle (z.B. niedermolekulare bioaktive Mittel), Proteine, Peptide, synthetische Polymere, feste Träger und dergleichen unter Anwendung von Standard-Verfahren der synthetischen Chemie oder deren Modifikationen gebunden werden können.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform, bei der die Sonde eine Nucleinsäure-Sonde ist, ist das Akzeptor-Molekül ein Rhodamin-Farbstoff. Die Rhodamin-Einheit ist vorzugsweise entweder an das 3'-Ende oder das 5'-Ende der Nucleinsäure gebunden, obwohl auch innenliegende Stellen einer Derivatisierung von PLs zugänglich sind und Nutzen für ausgewählte Zwecke haben. An welches Ende das Rhodamin-Derivat auch gebunden ist, ist der Komplex gemäß der Erfindung allgemein an dessen Antipoden oder an eine Position im Inneren der Nucleinsäure-Kette gebunden. Der Rhodamin-Akzeptor wird vorzugsweise unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Amidits eingeführt. Verschiedene Donor-Gruppen gemäß der Erfindung werden auch vorzugsweise unter Verwendung eines reaktiven Derivats (z.B. eines Amidits) des Donors eingeführt. Alternativ dazu können die reaktive Gruppen (z.B. Isothiocyanate, aktive Ester usw.) umfassenden Donor-Gruppen über eine Reaktion mit einer reaktiven Einheit an einer Bindungsgruppe oder einem Verbindungsarm eingeführt werden, der an die Nucleinsäure gebunden ist (z.B. Hexylamin).
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Donor-Einheit am 3'-Terminus einer Nucleinsäure durch die Verwendung eines derivatisierten Synthese-Trägers gebunden werden. Beispielsweise wird ein Komplexierungsmittel gemäß der Erfindung an einen festen Träger gebunden, der mit einem Analog des Komplexes derivatisiert ist. Solche derivatisierten Träger sind in diesem technischen Bereich wohlbekannt, und ein Beispiel dafür liefert ein TAMRA-Derivat (Tetramethylrhodamincarbonsäure-Derivat), das an einen Nucleinsäure-3'-Terminus unter Verwendung eines im Handel erhältlichen festen Trägers gebunden ist, der mit einem Analog des TAMRA-Fluorophors (Biosearch Technologies, Inc.) derivatisiert ist.
  • Im Hinblick auf die gut entwickelte Literatursammlung betreffend die Konjugation kleiner Moleküle an Nucleinsäuren, sind viele andere Verfahrensweisen der Bindung von Donor-/Akzeptor-Paaren an Nucleinsäuren Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich. Beispielsweise werden Rhodamin- und Fluorescein-Farbstoffe passenderweise an das 5'-Hydroxyl-Ende einer Nucleinsäure beim Abschluss einer Festphasen-Synthese mittels Farbstoffen gebunden, die mit einer Phosphoramidit-Einheit derivatisiert sind (siehe dazu beispielsweise „Woo et al., US-Patent Nr. 5,231,191" und „Hobbs, Jr., US-Patent Nr. 4,997,928").
  • Noch spezieller gibt es viele Verbindungs-Einheiten und Verfahren zum Binden von Gruppen an das 5'- oder 3'-Ende von Nucleinsäuren, wie dies beispielhaft erläutert wird durch die folgenden Druckschriften: „Eckstein, Hrsg., Nucleic Acids and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991)"; „Zuckerman et al., Nucleic Acids Research, 15: 5305–5321 (1987) (3-Thiol-Gruppe an Nucleinsäure)"; „Sharma et al., Nucleic Acids Research, 19: 3019 (1991) (3'-sulihydryl)"; „Giusti et al., PCR Methods and Applications, 2: 223–227 (1993)" und „Fung et al., US-Patent Nr. 4,757,141 (5'-Phosphoamino-Gruppe über Aminolink TM II, verfügbar durch P. E. Biosystems, CA.)"; „Stabinsky, US-Patent Nr. 4,739,044 (3-Aminoalkylphosphoryl-Gruppe)"; „Agrawal et al., Tetrathedron Letters, 31: 1543–1546 (1990) (Bindung über Phosphoramidate-Bindungen)"; „Sproat et al., Nucleic Acids Reserach, 15: 4837 (1987) (5-Mercapto--Gruppe)", „Nelson et al., Nucleic Acids Research, 17: 7187-7194 (1989) (3'-Amino-Gruppe)" und dergleichen.
  • Mittel zum Nachweis von Fluoreszenz-Markierungen sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. So können beispielsweise Fluoreszenz-Markierungen nachgewiesen werden durch Anregen des Fluorophors mit der passenden Licht-Wellenlänge und Nachweis der resultierenden Fluoreszenz. Die Fluoreszenz kann visuell, mittels eines photographischen Films, unter Verwendung elektronischer Detektoren wie beispielsweise ladungsgekoppelter Vorrichtungen (charge coupled devices; CCDs) oder Photovervielfachern und dergleichen nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen nachgewiesen werden durch Bereitstellen der passenden Substrate für das Enzym und Nachweisen des resultierenden Reaktionsprodukts.
  • Synthese
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung werden synthetisiert durch eine passende Kombination allgemein wohlbekannter synthetischer Verfahren. Techniken, die nützlich bei der Synthese der Verbindungen gemäß der Erfindung sind, sind Fachleuten in dem relevanten technischen Bereich sowohl in einfacher Weise offensichtlich als auch zugänglich. Die nachfolgende Diskussion wird angeboten, um bestimmte der diversen Methoden, die zur Anwendung beim Zusammenbau der Verbindungen gemäß der Erfindung verfügbar sind, zu illustrieren, und es ist nicht beabsichtigt, den Umfang der Reaktionen oder Reaktions-Sequenzen zu beschränken, die nützlich bei der Herstellung der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können hergestellt werden als einzelnes Stereoisomer oder als Mischung von Stereoisomeren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen hergestellt als im wesentlichen ein einzelnes Isomer. Isomer-reine Verbindungen werden hergestellt unter Verwendung von synthetischen Zwischenstufen, die Isomer-rein sind, in Kombination mit Reaktionen, die entweder die Stereochemie an einem chiralen Zentrum unverändert lassen oder zu seiner vollständigen Umkehrung führen. Alternativ können das Endprodukt oder die Zwischenstufen entlang des Syntheseweges zu einem einzelnen Isomer geführt werden. Verfahrensweisen zum Umkehren oder Unverändert-Lassen eines speziellen sterischen Zentrums und Verfahrensweisen zum Auflösen von Mischungen von Stereoisomeren sind in diesem technischen Bereich wohlbekannt, und es liegt im Vermögen eines Fachmanns in diesem technischen Bereich, ein passendes Verfahren für eine spezielle Situation zu wählen. Allgemein wird verwiesen auf „Furniss et al. (Hrsg.), VOGEL'S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5. Auflage, Longman Scientific and Technical Ltd., Essex, 1991, Seiten 809–816" und "Heller, Acc. Chem. Res., 23: 128 (1990)".
  • Ein beispielhaftes Synthese-Schema, das zu einem zweifach gecappten Komplexierungsmittel gemäß der Erfindung führt, ist in Schema 1 (1) angegeben. Ein Isophthalsäure-Derivat wird an beiden Carboxyl-Positionen aktiviert durch Inkontaktbringen der Säure mit einer aktivierenden Gruppe wie beispielsweise 2-Mercaptothiazolin unter dehydratisierenden Bedingungen, unter Herstellung von Verbindung 1. Das aktivierte Carbonsäure-Derivat 1 wird an ein Grundgerüst gebunden, wie beispielsweise ein Polyamin durch Umsetzen eines Überschusses der Verbindung 1 mit der Grundgerüst-Verbindung, wobei man Verbindung 2 herstellt. Der Ligand 2 wird in ein makrocyclisches Analogon umgewandelt durch Umsetzung mit einem weiteren Grundgerüst-Molekül (z.B. einem Linker), welches das gleiche Grundgerüst oder verschieden von dem Grundgerüst sein kann, das verwendet wurde, um Verbindung 2 zu bilden.
  • Ein weiterer beispielhafter Syntheseweg ist in Schema 2 (8) angegeben. 2-Methoxyisophthaloylthiazolin 1 wird mit einem Polyamin-Ligand wie beispielsweise Tris-(2-aminoethyl-)amin („TRENSAM") unter Bedingungen hoher Verdünnung umgesetzt, um jedes der Amine des Liganden zu acylieren, wobei Verbindung 7 gebildet wird. Die Verbindung 7 wird anschließend mit einem Amin wie beispielsweise einem Methylamin unter Herstellung des Liganden 8 umgesetzt, umgesetzt.
  • Ein weiterer beispielshafter Syntheseweg ist in Schema 3 (9) angegeben. Verbindung 7 (Schema 2) wird mit einem Linker-Arm, der sowohl ein reaktives Amin als auch eine Carbonsäure-Gruppe 16 einschließt, unter Herstellung von Verbindung 17 behandelt. Die Verbindung 17 wird in einen komplexbildenden Liganden umgewandelt, durch Umsetzen mit einem Amin wie beispielsweise einem Methylamin, unter Herstellung von Verbindung 18.
  • Noch ein weiterer beispielshafter Syntheseweg ist in Schema 4 (10) angegeben. Verbindung 7 (Schema 2) wird mit einem mono-geschützten Diamin 21 unter Herstellung von Verbindung 23 behandelt. Ein Überschuß des Diamins wird verwendet, um sicherzustellen, daß jede der vorhandenen reaktiven Gruppen in das entsprechende Amid umgewandelt wird. Wie Fachleuten auf diesem Gebiet der Technik offensichtlich ist, kann der Grad der Umwandlung der reaktiven Gruppen durch Ändern der Bedingungen, wie beispielsweise die Konzentration der Reaktanden und die Stöchiometrie von Verbindung 21 zu Verbindung 2 gesteuert werden.
  • Ein Linker-Arm kann auch an das Grundgerüst des chelatisierenden Mittels angehängt werden. Beispielsweise wird in Schema 5 (11) ein Chelat-Bildner hergestellt, der ein Amin am terminalen Ende des Linker-Arms, eingebaut in das Grundgerüst, aufweist.
  • Die oben angegebenen Synthese-Schemata sollen beispielhaft für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung sein. Fachleute in diesem technischen Bereich erkennen, dass viele andere Synthese-Strategien zur Herstellung der Liganden gemäß der Erfindung erhältlich sind, ohne auf unnötig umfangreiches Experimentieren zurückgreifen zu müssen.
  • Die Substituenten an der Isophthalamidyl-Gruppe und die Substituenten an dem Grundgerüst, die an die Salicylamidyl-Gruppen gebunden werden, können selbst chelatisierende Liganden umfassen, die von einer Salicylamidyl-Gruppe verschieden sind. Vorzugsweise umfassen diese Chelat-Bildner eine Mehrzahl anionischer Gruppen wie beispielsweise Carboxylat- oder Phosphonat-Gruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese chelatisierenden Mittel des Nicht-PL-Typs gewählt aus Verbindungen, die selbst in der Lage sind, als Lanthaniden-Chelatisierungsmittel zu funktionieren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Chelat-Bildner Aminocarboxylate (d.h. EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA usw. und ihre Phosphonat-Analoga wie beispielsweise DTPP, EDTP, HDTP, NTP usw.).
  • Viele nützliche chelatisierende Gruppen, Kronenether, Cryptanden und dergleichen sind in diesem technischen Gebiet bekannt und können in die Verbindungen gemäß der Erfindung inkorporiert werden. Bezug genommen wird beispielsweise auf "Pitt et al., The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload", in "INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE; Martell, (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1980, Seiten 279–312"; „Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES, Cambridge University Press, Cambridge, 1989"; „Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, New York, 1989", und die darin in Bezug genommen Druckschriften.
  • Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Wegen, die das Anbinden chelatisierender Mittel, Kronenether und Cyclodextrine an andere Moleküle erlauben, Fachleuten in diesem technischen Bereich zugänglich. Siehe beispielsweise „Meares et al., Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides". In „MODIFICATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS; Feeney et al., (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, Seiten 370–387"; „Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9: 108–117 (1998)"; „Song et al., Bioconjugate Chem., 8: 249–255 (1997)".
  • In anderen Ausführungsformen sind Substituenten an der Isophthalamidyl-Gruppe oder an dem Grundgerüst Fluoreszenz-Sensibilisatoren. Beispielhafte Sensibilisatoren schließen ein: Rhodamin 560-, 575- und 590-Fluoresceine, 2- oder 4-Chinolone, 2- oder 4-Cumarine oder Derivate davon, beispielsweise Cumarin 445, 450, 490, 500, 503, 4-Trifluormethylcumarin (TFC), 7-Diethylaminocumarin-3-carbohydrazit usw. und speziell Carbostyril 124 (7-Amino-4-methyl-2-chinolon), Cumarin 120 (7-Amino-4-methyl-2-cumarin), Cumarin 124 (7-Amino-4-(trifluormethyl-)2-cumarin), Aminomethyltrimethylpsoralen, Naphthalin und dergleichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Sensibilisator eine Einheit, die eine Naphthyl-Einheit umfasst.
  • Nachdem das PL-Molekül gebildet und gereinigt wurde, wird der fluoreszierende Lanthaniden-Komplex synthetisiert, und zwar nach irgendeinem aus einer großen Zahl von im Stand der Technik bekannten Verfahrensweisen, einschließlich beispielsweise durch Inkubieren eines Salzes des Chelats mit einem Lanthaniden-Salz wie beispielsweise dem Lanthaniden-Trihalogenid, -Triacetat und dergleichen.
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung und ihre unkonjugierte Form sind nützlich als Sonden, Indikatoren, Trennungsmedien und dergleichen. Darüber hinaus können die Verbindungen gemäß der Erfindung an eine große Vielzahl von Verbindungen zur Schaffung spezieller Markierungen, Sonden, diagnostischer und/oder therapeutischer Reagenzien usw. konjugiert werden. Beispiele von Spezies, an die die Verbindungen gemäß der Erfindung konjugiert werden können, schließen beispielsweise Biomoleküle wie Proteine (z.B. Antikörper, Enzyme, Rezeptoren usw.), Nucleinsäuren (z.B. RNS, DNS usw.), bioaktive Moleküle (z.B. Arzneimittel, Toxine usw.), feste Substrate wie beispielsweise Glas oder Polymer-Kugeln, -Platten, -Fasern, -Membranen (z.B. Nylon, Nitrocellulose), Träger (z.B. Glas, Quarz) und Sonden usw. ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Spezies, an die die Verbindung konjugiert wird, ein Biomolekül. Bevorzugte Biomoleküle sind solche, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Antikörpern, Nucleinsäuren, Enzymen, Haptenen, Kohlenhydraten und Antigenen.
  • Assays und PL-tragende Sonden
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine PL bereit, die an ein anderes Molekül wie beispielsweise ein Sonden-Molekül gebunden ist, und Assays, die von diesen Sonden Gebrauch machen.
  • Assays
  • Die folgende Diskussion ist allgemein relevant für die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Assays. Diese Diskussion soll die Erfindung durch Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen veranschaulichen und sollte nicht als den Umfang der Sonden und Assay-Typen limitierend interpretiert werden, bei denen die Verbindungen gemäß der Erfindung Anwendung finden. Andere Assay-Formate, die von den Verbindungen gemäß der Erfindung Gebrauch machen, sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Assays, die auf spezifischen Bindungsreaktionen beruhen, werden zum Nachweis einer großen Vielzahl von Substanzen verwendet, wie beispielsweise von Arzneimitteln, Hormonen, Enzymen, Proteinen, Antikörpern und infektiösen Mitteln in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten und Gewebe-Proben. Im Allgemeinen bestehen die Assays aus einem zu bestimmenden Stoff, einer Erkennungs-Einheit für den zu bestimmenden Stoff und einer nachweisbaren Markierung. Kompetitive Assay-Ausführungsformen machen allgemein Gebrauch von einem Bindungs-Partner, zusätzlich zu diesen Komponenten. In einer beispielhaften Ausführungsform ist der Bindungs-Partner ein Molekül, das mit einer Erkennungs-Einheit unter Bildung eines Komplexes in Wechselwirkung tritt, der inhärent weniger stabil ist als ein ähnlicher Komplex, der zwischen der Erkennungs-Einheit und der zu analysierenden Substanz gebildet wird, und wird anschließend durch die dazukommende, zu analysierende Substanz verdrängt.
  • Da die Ergebnisse spezieller Bindungs-Wechselwirkungen häufig nicht direkt beobachtbar sind, wurde eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungen zur Bestimmung des Vorhandenseins einer Wechselwirkung entwickelt. Die Fluorophore gemäß der Erfindung werden nachgewiesen durch Verwendung von Fluoreszenz-Spektroskopie oder mit dem bloßen Auge. Eine Einführung in Markierungen, Markierungs-Verfahren und Nachweis von Markierungen wie beispielsweise solche, die nützlich bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, findet sich in „Polak et al., INTRODUCTION TO MONOCYTOCHEMISTRY, 2. Auflage, Springer Verlag, New York, (1977)" und in „Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, ein kombiniertes Handbuch und Katalog, veröffentlicht von der Firma Molecular Probes, Inc., Eugene, OR (1996)".
  • In bestimmten Ausführungsformen ist der Assay ein kompetitiver Assay. In der Praxis können die Komponenten des Assays (d.h. die Erkennungs-Einheit, der Bindungs-Partner und die zu analysierende Substanz) im wesentlichen jede beliebige chemische Struktur aufweisen. Jedoch sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Erkennungs-Einheit, der Bindungs-Partner und die zu analysierende Substanz Verbindungen, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus niedermolekularen bioaktiven Mitteln, Biomolekülen und Kombinationen daraus. Wenn eine Komponente des Assays ein Biomolekül ist, ist das Biomolekül vorzugsweise eine Verbindung, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Haptenen, Antikörpern, Antigenen, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren, Peptiden, Enzymen und Rezeptoren.
  • In einem kompetitiven Assay-Format wird eine oder werden mehr als eine der Komponenten mit einer Verbindung gemäß der Erfindung markiert. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform der Bindungs-Partner mit einer Verbindung gemäß der Erfindung markiert, und seine Verdrängung von einer immobilisierten Erkennungs-Einheit wird mittels des Erscheinens von Fluoreszenz in einer flüssigen Phase des Assay nachgewiesen. In einem anderen kompetitiven Assay-Format wird ein immobilisiertes Enzym mit einem Substrat komplexiert, das an eine Verbindung gemäß der Erfindung konjugiert ist. Der Komplex wird dann mit einem mutmaßlichen Antagonisten in Kontakt gebracht. Die Verdrängung von Fluoreszenz von dem immobilisierten Enzym in eine flüssige Phase des Assay ist ein Indikator einer Verdrängung des Substrats durch den mutmaßlichen Antagonisten. Diese Ausführungsformen werden nur beispielhaft angegeben, und es ist für einen Fachmann in diesem technischen Bereich einfach, dass viele andere kompetitive Assay-Formate von den Verbindungen gemäß der Erfindung Gebrauch machen und aus diesen Vorteile ziehen können.
  • Zusätzlich dazu, ein Bindungs-Ereignis sicherzustellen, ist es häufig erwünscht, die Größe der Affinität zwischen zwei oder mehreren Bindungs-Partnern quantitativ zu erfassen. So ist es auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, die im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche offenbarten Verbindungen als Träger für solche Assays zu verwenden.
  • Am meisten typisch wird die Menge einer zu analysierenden Substanz, die zugegen ist, dadurch gemessen, dass man quantitativ die Menge an Markierung erfaßt, die an einen Bindungs-Partner, an eine zu analysierende Substanz oder an eine Erkennungs-Einheit fixiert ist, und zwar im Anschluß an ein Bindungsereignis. Mittel zum Nachweis und zur quantitativen Erfassung von fluoreszierenden Markierungen sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Affinität zwischen zwei oder mehr Assay-Komponenten dadurch gemessen, dass man eine Population quantitativ erfaßt, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus dem Komplex aus zu analysieren der Substanz und Erkennungs-Einheit, einer freien, zu analysierenden Substanz, einem freien Bindungs-Partner, einem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit und Kombinationen daraus.
  • Das Format eines Assays zum Extrahieren von Affinitätsdaten für zwei Moleküle kann verstanden werden unter Bezugnahme auf eine Ausführungsform, in der ein Ligand, von dem es bekannt ist, dass er sich an einen Rezeptor bindet, durch einen Antagonisten zu dem Rezeptor verdrängt wird. Andere Variationen dieses Formats sind für Fachleute in diesem technischen Bereich offensichtlich. Das kompetitive Format ist Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Bezug genommen wird beispielsweise auf die US-Patentschriften Nrn. 3,654,090 und 3,850,752.
  • Das Binden eines Antagonisten an einen Rezeptor kann getestet werden durch ein kompetitives Bindungs-Verfahren unter Verwendung eines Liganden für den Rezeptor und den Antagonisten. Der Bindungs-Assay kann beispielsweise durchgeführt werden in einer 96 Vertiefungen aufweisenden Filtrationsplatten-Anordnung (Firma Millipore Corporation, Bedford, MA). Einer der drei Bindungs-Partner (d.h. der Ligand, ein Antagonist oder ein Rezeptor) wird allgemein an die Vertiefung oder ein in der Vertiefung enthaltendes teilchenartiges Material gebunden.
  • Kompetitions-Bindungsdaten können analysiert werden nach einer Anzahl von Verfahrensweisen einschließlich der Verfahrensweise des Einpassens an eine nicht-lineare Kurve der kleinsten Fehlerquadrate. Wenn der Ligand ein Antagonist für den Rezeptor ist, liefert dieses Verfahren den IC50-Wert des Antagonisten (Konzentration des Anatgonisten, die ein spezifisches Binden des Liganden zu 50 % im Gleichgewicht inhibiert). Der IC50-Wert wird in Beziehung zu der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante (Ki) des Antagonisten auf der Basis der Gleichung von Cheng und Prusoff gesetzt: Ki = IC50/(1 + L/Kd), worin L die Konzentration des Liganden, der in dem kompetitiven Bindungs-Assay verwendet wird, ist und Kd die Dissoziationskonstante des Liganden ist, bestimmt durch Scatchard-Analyse. Diese Assays sind beschrieben – neben anderen Stellen – in der Druckschrift „Maddox et al., J. Exp. Med., 158: 1211 (1983)"; „Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS, A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minnesota (1990)".
  • Die Assays gemäß der Erfindung können praktisch durchgeführt werden, wenn einige oder alle Komponenten in Lösung vorliegen. Alternativ dazu kann/können eine oder mehrere Komponente(n) im wesentlichen unlöslich in dem Assay-Medium sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind eine Verbindung oder mehrere Verbindungen, die gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus der Erkennungs-Einheit, dem Bindungs-Partner und der zu analysierenden Substanz, an eine Oberfläche gebunden. Nützliche Oberflächen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Glas oder Polymer-Kugeln, -Platten, -Fasern, -Membranen (z.B. aus Nylon, Nitrocellulose), Träger (z.B. aus Glas, Quarz) und dergleichen.
  • Der Assay kann auf einer großen Zahl von Wegen durchgeführt werden. Es liegt im Bereich des Vermögens eines in diesem technischen Bereich erfahrenen Fachmanns, beispielsweise zu wählen, wann der Fluoreszenz-Komplex durch Chelatisieren des Lanthanids gebildet werden soll, an welche Assay-Komponente das Chelat gebunden sein sollte, und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Fluoreszenz-Komplex vor dem Verdrängen des Bindungs-Partners aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit gebildet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Fluoreszenz-Komplex gebildet, nachdem der Bindungs-Partner aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit verdrängt wurde.
  • Im Anschluss an die Verdrängung des Bindungs-Partners aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit können die verbleibenden Schritte des Assays an der Mischung durchgeführt werden, die gebildet wurde durch die Verdrängung, oder es kann eine oder können mehrere der Komponenten der Mischung entfernt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter das Abtrennen des freien Bindungs-Partners aus einer Verbindung aus der Gruppe, die besteht aus dem Paar aus Erkennungs-Einheit und Bindungs-Partner, dem Paar aus zu analysierender Substanz und Erkennungs-Einheit und Kombinationen daraus.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Assays gemäß der Erfindung immunologische Assays. Immunologische Assays schließen Reaktionen zwischen Immunoglobulinen (Antikörpern) ein, die in der Lage sind, Bindungen mit spezifischen antigenen Determinanten verschiedener Verbindungen und Materialien (Antigenen) einzugehen. Andere Typen von Reaktionen schließen eine Bindung zwischen Avidin und Biotin, Protein A und Immunoglobulinen, Lectinen und Zucker-Einheiten und dergleichen ein. Verwiesen wird beispielsweise auf das US-Patent Nr. 4,313,734 (Leuvering), das US-Patent Nr. 4,435,504 (Zuk), die US-Patente Nr. 4,452,901 und 4,960,691 (Gordon) und das US-Patent Nr. 3,893,808 (Campbell).
  • Diese Assay-Verfahren liefern die Fähigkeit, sowohl das Vorhandensein als auch die Menge kleiner Mengen von zu analysierenden Substanzen nachzuweisen und sind beispielsweise nützlich bei der medizinischen Diagnose und forensischen Anwendungen. Bei den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die zu analysierende Substanz oder ihre Bindung an die Erkennungs-Einheit allgemein nachgewiesen durch die Verwendung einer Fluoreszenz-Markierung gemäß der Erfindung.
  • Immunologische Assays gehören drei allgemeinen Typen an. In einem beispielhaften kompetitiven Bindungs-Assay konkurrieren markierte Reagenzien und unmarkierte zu analysierende Verbindungen um Bindungsstellen an einem Bindungs-Material. Nach einer Inkubationsperiode werden nicht-gebundene Materialien herausgewaschen, und die Menge an markiertem Reagens, das an die Bindungsstelle gebunden ist, wird mit Referenz-Mengen zur Bestimmung der Konzentration an zu analysierender Substanz in der Probe-Lösung verglichen.
  • Ein zweiter Typ von immunologischem Assay ist bekannt als „Sandwich-Assay" und schließt allgemein ein In-Kontakt-Bringen einer eine zu analysierende Substanz umfassenden Probe-Lösung mit einer Oberfläche ein, die ein erstes Bindungs-Material umfasst, das immunologisch spezifisch für die zu analysierende Substanz ist. Eine zweite Lösung, die ein Bindungs-Material umfasst, das eine Verbindung gemäß der Erfindung desselben Typs (Antigen oder Antikörper) wie das erste Bindungs-Material umfasst, wird dann dem Assay zugesetzt. Das markierte Bindungs-Material bindet sich an eine beliebige zu analysierende Substanz, die an das erste Bindungs-Material gebunden ist. Das Assay-System wird dann einem Wasch-Schritt unterzogen und so markiertes Bindungs-Material entfernt, das sich nicht mit der zu analysierenden Substanz verbunden hat, und die zurückbleibende Menge an marktiertem Material ist gewöhnlich proportional zur Menge an gebundener zu analysierender Substanz.
  • Ein dritter Typ von immunologischem Assay-Verfahren schließt Agglutinations-Reaktions-Verfahren ein, und ein Beispiel hierfür sind die wohlbekannten Assays für Blut-Antigene und Serum-Typen. Eine immunologische Kreuz-Reaktivität zwischen Antikörpern im Serum und Antigenen, die auf Oberflächen von roten Blutzellen präsentiert werden, wird angezeigt durch die Bildung eines dreidimensionalen vernetzten Netzwerks aus roten Blutzellen und Antikörpern. Die Agglutination der Mischung aus Serum und roten Blutzellen führt zur Bildung eines Pellets, das sichtbar sein kann für das bloße Auge, und zwar über die Fluoreszenz einer Verbindung gemäß der Erfindung, die an eine oder mehrere Komponenten des Assays gebunden ist.
  • Die oben aufgezählten Assay-Verfahren wurden ursprünglich durchgeführt nach Verfahren der Flüssigphasen-Immunchemie, worin Reaktionen zwischen Enzymen und radiomarkierten Substanzen in flüssiger Lösung in einer Vorrichtung wie beispielsweise in Mikrotiter-Platten durchgeführt wurden. Neuerdings wurden Techniken und Verfahrensweisen zur Durchführung von „Festphasen"-Assays angepasst, worin die Reaktionen zwischen Enzymen und immunologischen Komponenten in Lösung an immobilisierenden Substraten durchgeführt wurden.
  • Diese Typen von Assays, die allgemein als „immunochromatographische Immuno-Assays" bezeichnet werden, können in einer beliebigen Zahl von Formaten entwickelt werden, wobei die Prinzipien der Assays des kompetitiven Typs, des Sandwich-Typs oder des Agglutinations-Typs eingesetzt werden. Sie können auch entweder ein Strömen über das immobilisierende Substrat oder ein Strömen entlang des immobilisierten Substrats einschließen. Im allgemeinen zeigen diese Sandwich-Assays den größten Nut zen beim Nachweis zu analysierender Substanzen aus großen Proteinen oder Antikörpern. Die Assays des Überström-Typs wurden höchst extensiv in Assays des Sandwich-Typs verwendet.
  • Ein beispielhaftes immunochromatographisches Sandwich-Immuno-Assay-Verfahren unter Verwendung der Fluoreszenz-Mittel gemäß der Erfindung macht Gebrauch von einer porösen Oberfläche und einem Mittel gemäß der Erfindung als visuelle Markierung, die an eine Verbindung eines Bindungs-Paars gebunden ist (z.B. Antigen oder Antikörper). Die poröse Oberfläche ist allgemein eine flache Platte und besteht üblicherweise aus Nylon, Nitrocellulose, Glasfasern oder dergleichen. In einem typischerweise immunochromatographischen Format wird ein Bereich oder eine kleine Fläche der porösen Oberfläche eine die feste Phase haltende Oberfläche durch Immobilisieren einer Verbindung eines Bindungs-Paars direkt auf die Oberfläche einer porösen Membran oder durch indirektes Binden der Verbindung an Einfang-Teilchen (d.h. aus Latex oder Glas), die an der Oberfläche einer porösen Membran immobilisiert sind. Eine direkte Immobilisierung des Bindungs-Paars an einer porösen Membran oder an Einfang-Teilchen erfolgt über elektrostatische Wechselwirkung (d.h. Unterschiede in der Ionen-Ladung), hydrophobe Wechselwirkung oder kovalentes Binden. In den Fällen, in denen Einfang-Teilchen verwendet werden, kann die Immobilisierung von Einfang-Teilchen an porösen Membranen auch über dieselben Phänomene oder über Größenausschluß erfolgen, der ein Wandern der Teilchen durch die Poren oder Fasern der Membran verhindert. Viele andere Typen von Assays können unter Verwendung der Verbindungen gemäß der Erfindung durchgeführt werden.
  • In einem typischen nicht-kompetitiven immunochromatographischen Assay muss eine Test-Probe eines biologischen Fluids wie beispielsweise Blut, Serum, Plasma, Speichel, Urin usw. in einem ausreichenden Volumen vorliegen und eine ausreichende Konzentration an zu analysierender Substanz aufweisen, um das Vorliegen einer ausreichenden Wechselwirkung zwischen der zu analysierenden Substanz von Interesse, den markierten Teilchen und der einfangenden festen Phase zu ermöglichen. Um die Reaktions-Kinetiken zu beschleunigen, wird die Konzentration an Teilchen-markierter Verbindung eines Bindungs-Paars und die Konzentration an Bindungs-Paar an der Oberfläche der porösen Membran oder der einfangenden Teilchen optimiert und so soviel spezifische Bindung wie möglich produziert und gleichzeitig irgendwelche nicht-spezifische Bindung minimiert. Die Konzentration an Teilchen-markierter Verbindung muss derart sein, dass sie keine Prozon-Phänomene im Bereich der Konzentrationen an zu analysierender Substanz produziert, die von Interesse sind. Eine derartige Konzentrations-Optimierung liegt im Bereich des Vermögens eines in diesem technischen Bereich erfahrenen Fachmanns.
  • Immunochromatographische Assays können in Form von Streifen oder Schichten aus den mehrschichtigen Materialien gemäß der Erfindung vorliegen, die Gebrauch von einem hydrophoben Träger machen (z.B. Mylar, Polystyrol, Polypropylen, Glas usw.), worin eine oder mehrere Verbindungen) gemäß der Erfindung oder mit einer Verbindung gemäß der Erfindung funktionalisierte Einheiten entweder direkt oder indirekt mit einem Bindemittel wie beispielsweise einem Leim an dem Träger fixiert ist/sind. Wenn es erwünscht ist, können hydrophobe Träger und Gehäuse verwendet werden, um eine Verdampfung der Fluid-Phase zu reduzieren, während die Immuno-Reagenzien miteinander in Kontakt gebracht werden.
  • In einem beispielhaften nicht-kompetitiven Assay in Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung wird eine zu analysierende Substanz solubilisiert, abgeschieden und auf dem teilchenförmigen Material gebunden. Das teilchenförmige Material wird dann hydratisiert und anschließend mit primären Antikörpern und Enzym-konjugierten sekundären Antikörpern in Kontakt gebracht, die für die primären Antikörper spezifisch sind, wobei zwischendurch Wasch-Schritte stattfinden, wo dies geeignet ist. Enzym-Konzentrationen werden dann beispielsweise durch Substrat-Umwandlungs-Protokolle bestimmt, wie sie in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind, und die Menge an primären Antikörpern kann so unter Bezugnahme auf einen Standard gemessen werden, der parallel mitläuft.
  • Darüber hinaus kann eine Bindungs-Domain eines Rezeptors beispielsweise als Fokussierungs-Punkt für ein Arzneimittel-Entdeckungs-Assay dienen, bei dem beispielsweise der Rezeptor immobilisiert wird und sowohl mit Mitteln (d.h. Liganden), die bekannt dafür sind, mit der Bindungs-Domain in Wechselwirkung zu treten, und einer Menge eines speziellen Arzneimittels oder inhibitorischen Mittels, das getestet werden soll, inkubiert wird. Eine der Inkubations-Komponenten ist mit einer Verbindung gemäß der Erfindung markiert. Das Ausmaß, in dem sich das Arzneimittel an den Rezeptor bindet und damit die Bildung eines Komplexes aus Rezeptor und Ligand inhibiert, kann dann gemessen werden. Solche Möglichkeiten für Arzneimittel-Entdeckungs-Assays kommen erfindungsgemäß in Betracht und werden als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend angesehen. Andere Fokussierungspunkte und passende Assay-Formate sind für Fachleute mit Sachverstand in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Die Verbindungen und Verfahrensweisen gemäß der Erfindung können auch zum Sequenzieren von Nucleinsäuren und Peptiden verwendet werden. Fluoreszenz-markierte Oligo-Nukleotid-Primer werden anstelle von radiomarkierten Primern für einen empfindlichen Nachweis von DNS-Fragmenten verwendet (US-Patent Nr. 4,855,225; Smith et al.). Darüber hinaus können DNS-Sequenzierungsprodukte mit fluoreszierenden Deoxy-Nucleotiden (US-Patent Nr. 5,047,519; Prober et al.) oder durch direktes Einarbeiten eines Fluoreszenz-markierten Deoxy-Nucleotids (Voss et al.; Nucl. Acids Res., 17: 2517 (1989)) markiert werden. Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind nützlich in diesen beiden Formaten. Gemäß derzeitiger Praxis umgehen Fluoreszenz-Sequenzierungs-Reaktionen viele der mit der Verwendung von Radionucliden verbundenen Probleme.
  • Wie oben diskutiert, kann der fluoreszierende Komplex in im wesentlichen jedem Schritt des Assays gebildet werden. Dies trifft in gleicher Weise in denjenigen Ausführungsformen zu, in denen eine oder mehrere Komponente(n) der Assay-Mischung im Anschluß an die Verdrängung des Bindungs-Partners entfernt werden. In einer bevor zugten Ausführungsform wird der Fluoreszenz-Komplex im Anschluß an die Abtrennung gebildet.
  • Verbindungen gemäß der Erfindung können verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge eines Enzyms in einer Mischung anzuzeigen. Beispielsweise ist in bestimmten Ausführungsformen Q1 eine enzymatisch labile Gruppe, und die Präsenz der labilen Gruppe an dem phenolischen Sauerstoff der Hydroxyisophtalamidyl-Gruppe verhindert die Bildung eines stabilen Komplexes eines Lanthaniden-Ions. Diese Situation wird umgekehrt, und ein stabiler Lanthaniden-Komplex wird gebildet, wenn das Hydroxyisophtalamidyl-Chelat in Kontakt mit einem Enzym gebracht wird, das in der Lage ist, die labile Gruppe abzuspalten und damit das phenolische Sauerstoff-Anion zu befreien. In ähnlicher Weise zu den Ausführungsformen, die oben diskutiert wurden, kann die Assay-Mischung mit dem Enzym zu jedem beliebigen Zeitpunkt während des Assay-Verfahrens in Kontakt gebracht werden. Darüber hinaus kann/können dann, wenn eine Komponente von der Reaktionsmischung abgetrennt wird (z.B. der befreite Bindungs-Partner), die separierte Komponente und/oder die zurückbleibende Komponente mit dem Enzym in Kontakt gebracht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, in der Q1 eine enzymatisch labile Gruppe ist, schließt das Verfahren weiter das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung mit einem Enzym ein, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus dem Komplex aus Bindungs-Partner und Erkennungs-Einheit, dem freien Bindungs-Partner und Kombinationen daraus, so dass dadurch die enzymatisch labile Gruppe entfernt wird.
  • Eine Anordnung von enzymatisch entfernbaren Gruppen ist in diesem technischen Bereich bekannt, und es liegt im Bereich des Vermögens eines in diesem technischen Bereich erfahrenen Fachmanns, eine passende enzymatisch labile Gruppe für eine spezielle Anwendung auszuwählen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die enzymatisch labile Gruppe eine Komponente einer Verbindung, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Phosphat-Gruppen, Sulfat-Gruppen, Acyl-Gruppen und Glycosid- Gruppen. Enzyme, die in der Lage sind, diese Gruppen zu entfernen, schließen beispielsweise Esterasen, Phosphatasen, Glycosidasen und dergleichen ein.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Entfernung der enzymatisch labilen Gruppe und die anschließende Bildung eines fluoreszierenden Komplexes dazu verwendet, die Gegenwart eines Enzyms nachzuweisen, das in der Lage ist, die enzymatisch labile Gruppe zu entfernen. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschrift „Drevin et al., US-Patent Nr. 5,252,462, erteilt am 12. Oktober 1993".
  • Obwohl die Verbindungen gemäß der Erfindung an jede beliebige Komponente des Assays gebunden werden können, werden sie am allgemeinsten an den Bindungs-Partner gebunden. In dieser Ausführungsform können die Verbindungen gemäß der Erfindung an den Bindungs-Partner über eine reaktive Gruppe an einer Phthalamidyl-Einheit, am Grundgerüst oder am Amid-Substituenten gebunden werden. Alternativ dazu können sie an den Bindungs-Partner über eine reaktive Gruppe an dem aromatischen Kern einer oder mehrerer Hydroxyisophthalamidyl-Einheiten der Verbindungen gebunden werden. Wie oben diskutiert, sind viele geeignete reaktive Gruppen Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt, und ein Fachmann mit Sachverstand in diesem Bereich ist in der Lage, ein Hydroxyisophtalamidyl-Chelat zu wählen und herzustellen, das passend mit einer funktionellen Gruppe für eine bestimmte Anwendung versehen ist.
  • Es ist allgemein bevorzugt, dass die Bindung zwischen den Hydroxyisophthalamidyl-Chelaten und dem Bindungs-Partner unter den Bedingungen des Assay stabil ist. Viele stabile Bindungen können zwischen dem Bindungs-Partner und dem Hydroxyisophthalamidyl-Chelat gebildet werden, einschließlich beispielsweise Amiden, Aminen, Ethern, Harnstoffen und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung zwischen dem Bindungs-Partner und einer Verbindung gemäß der Erfindung eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Amid-Bindungen, Thioamid-Bindungen, Thioharnstoff-Bindungen und Carbamat-Bindungen. Geeignete reaktive Gruppen und Verbindungen wurden oben im einzelnen diskutiert.
  • Im allgemeinen ist es zum Bestimmen der Konzentration eines Ziel-Moleküls wie beispielsweise einer Nucleinsäure bevorzugt, zuerst Referenz-Daten zu erhalten, bei denen konstante Mengen einer Sonde und eines Nucleinsäure-Liganden mit variierenden Mengen eines Ziel-Moleküls in Kontakt gebracht werden. Die Fluoreszenz-Emission jeder der Referenz-Mischungen wird dazu verwendet, eine Graphik oder eine Tabelle abzuleiten, in der eine Ziel-Konzentration mit einer Fluoreszenz-Emission verglichen wird. Beispielsweise könnte eine Sonde, die (a) mit einem Zielmolekül-freien Nucleinsäure-Liganden hybridisiert und (b) eine Stamm-Schleife-Architektur aufweist, wobei das 5'-Ende und 3'-Ende die Stellen der Fluoreszenz-Gruppe- und PL-Markierungen sind, zum Erhalt solcher Referenz-Daten verwendet werden. Eine derartige Sonde liefert ein charakteristisches Emissions-Profil, in dem die Fluoreszenz-Emission zurückgeht, wenn die Ziel-Molekül-Konzentration ansteigt, und zwar in Gegenwart einer konstanten Menge an Sonde und Nucleinsäure-Ligand. Anschließend wird eine Test-Mischung mit einer unbekannten Menge an Ziel-Molekül mit derselben Menge an erstem Nucleinsäure-Liganden und zweiter Sonde in Kontakt gebracht, und die Fluoreszenz-Emission wird bestimmt. Der Wert der Fluoreszenz-Emission wird dann mit den Bezugsdaten verglichen und so die Konzentration des Ziel-Moleküls in der Test-Mischung erhalten.
  • Vielfach-Analysen
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Quencher gemäß der Erfindung als Komponente einer oder mehrerer Sonden verwendet, die in einem Assay verwendet werden, der so ausgelegt ist, dass man damit mehrere Spezies in einer Mischung nachweisen kann. Ein Assay, der zum Nachweis von zwei oder mehr Spezies verwendet wird, indem man wenigstens zwei Sonden verwendet, die unterschiedliche Fluorophore tragen, wird nachfolgend bezeichnet als „Mehrfach-Analyse" („multiplex analysis"). Ein schematisches Diagramm einer derartigen Mehrfach-Analyse unter Verwendung eines PL wird in 20 gezeigt.
  • Sonden, die die Verbindungen gemäß der Erfindung einschließen, sind auch nützlich bei der Durchführung von Analysen und Assays des Mehrfach-Typs. In einer typischen Mehrfach-Analyse werden zwei oder mehr einzelne Spezies (oder Bereiche von einer oder mehreren Spezies) unter Verwendung von zwei oder mehr Sonden nachgewiesen, wobei jede der Sonden mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert ist. Bevorzugte Mehrfach-Analysen, bei denen es auf einen Fluoreszenz-Energie-Transfers ankommt, erfüllen idealerweise einige Kriterien. Die Fluoreszenz-Spezies sollte klar und spektral gut aufgelöst sein, und der Energie-Transfer zwischen der Fluoreszenz-Spezies und dem Akzeptor sollte effizient sein.
  • Aufgrund der guten Verfügbarkeit von PLs gemäß der Erfindung, die unterschiedliche charakteristische Emissions-Eigenschaften aufweisen, sind die Verbindungen gemäß der Erfindung besonders gut geeignet für eine Verwendung in Mehrfach-Anwendungen bzw. Mulitplex-Anwendungen. Der Zugang zu PLs mit einem Bereich von charakteristischen Absorptions-Eigenschaften ermöglicht das Anlegen von FET-Sonden, bei denen die Akzeptor-Absorptions-Eigenschaften und die PL-Emissions-Eigenschaften aufeinander abgestimmt sind, wodurch ein nützlicher Grad der spektralen Überlappung erreicht wird.
  • Die gleichzeitige Verwendung von zwei oder mehr Sonden unter Anwendung einer FET ist in diesem technischen Bereich bekannt. Beispielsweise wurden Mehrfach-Assays unter Verwendung von Nucleinsäure-Sonden mit unterschiedlichen speziellen Sequenz-Eigenschaften beschrieben. Fluoreszenz-Sonden wurden zur Bestimmung verwendet, ob ein Individuum für eine spezielle Mutation Wildtyp-homozygot, Mutanten-homozygot oder heterozygot ist. Beispielsweise ist es unter Verwendung einer molekularen Bake, die Fluorescein-gequencht ist und die Sequenz des Wildtyps erkennt, und einer anderen molekularen Bake, die Rhodamin-gequencht ist und ein Mutanten-Allel erkennt, möglich, Individuen hinsichtlich des β-Chemokin-Rezeptors Genotyp-mäßig einzuteilen (Kostrikis et al.; Science 279: 1228–1229 (1989)). Das Vorhandensein nur eines Fluorescein-Signals zeigt an, dass das Individuum eines des Wildtyps ist, und das Vorhandensein nur des Rhodamin-Signals zeigt an, dass das Individuum ein homozygoter Mutant ist. Das Vorhandensein sowohl des Rhodamin-Signals als auch des Fluorescein-Signals ist ein diagnostisches Zeichen für einen Heterozygoten. „Tyagi et al., Natural Biotechnology, 16: 49–53 (1998)" haben die gleichzeitige Verwendung von vier unterschiedlich markierten molekularen Baken zur Allelen-Diskriminierung beschrieben, und „Lee et al., Biotechniques, 27: 342–349 (1999)" haben den 7-Farben-Homogen-Nachweis von sechs PCR-Produkten beschrieben.
  • Die PLs gemäß der vorliegenden Erfindung können in Mehrfach-Assays verwendet werden, die dafür ausgelegt sind, im wesentlichen jede beliebige Spezies nachzuweisen und/oder quantitativ zu bestimmen, einschließlich beispielsweise ganzen Zellen, Viren, Proteine (z.B. Enzyme, Antikörper, Rezeptoren), Glycoproteine, Lipoproteine, subcelluläre Teilchen, Organismen (z.B. Salmonella), Nucleinsäuren (z.B. DNS, RNS und deren Analoge), Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Lipide, Fettsäuren, nicht-biologische Polymere und kleine bioaktive Moleküle (z.B. Toxine, Arzneimittel, Pestizide, Metabolite, Hormone, Alkaloide, Steroide).
  • Erkennungs-Einheiten
  • Der Begriff „Erkennungs-Einheit", wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die mit einer zu analysierenden Substanz über entweder anziehende oder abstoßende Mechanismen in Wechselwirkung treten können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Erkennungs-Einheit an eine Verbindung gemäß der Erfingung konjugiert. In einer weiteren exemplarischen Ausführungsform bilden die zu analysierende Substanz und die Erkennungs-Einheit ein innig miteinander verbundenes Paar durch beispielsweise kovalente Bindung, Ionen-Bindung, Ionen-Paarung, van der Waals-Assoziierung und dergleichen. In einer weiteren exemplarischen Ausführungsform stehen die zu analysierende Substanz und die Erkennungs-Einheit in Wechselwirkung über einen Abstoßungs-Mechanismus wie beispielsweise inkompatible sterische charakteristische Eigenschaften, Ladungs-Ladungs-Abstoßung, hydrophil-hydrophob-Wechselwirkungen und dergleichen. Es versteht sich, dass es eine Überlappung zwischen den allgemeinen Begriffen „Erkennungs-Einheit" und „zu analysierende Substanz" gibt. In einer speziellen Anwendung kann eine Spezies eine zu analysierende Substanz sein, während in einer davon verschiedenen Anwendung die Spezies als Erkennungs-Einheit dient. In bestimmten Ausführungsformen dienen die Verbindungen gemäß der Erfindung als Erkennungs-Einheiten (z.B. wenn die zu analysierende Substanz ein Metall-Ion ist).
  • Erkennungs-Einheiten können gewählt sein aus einem großen Bereich kleiner bioaktiver Moleküle (z.B. Arzneimittel, Pestizide, Toxine usw.), organischer funktioneller Gruppen (z.B. Amine, Carbonyl-Verbindungen, Carboxylate usw.), Biomolekülen, Metallen, Metall-Chelaten und Metall-organischen Verbindungen.
  • Wenn die Erkennungs-Einheit ein Amin ist, geht die Erkennungs-Einheit in bevorzugten Ausführungsformen eine Wechselwirkung mit einer Struktur auf der zu analysierenden Substanz ein, die in der Weise reagiert, dass sie mit dem Amin (z.B. Carbonyl-Gruppen, Alkylhalogen-Gruppen) in Wechselwirkung tritt (z.B. eine Bindung eingeht oder einen Komplex bildet). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Amin durch eine saure Einheit auf der zu analysierenden Substanz von Interesse protoniert (z.B. eine Carbonsäure, eine Sulfonsäure).
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen geht dann, wenn die Erkennungs-Einheit eine Carbonsäure ist, die Erkennungs-Einheit eine Wechselwirkung mit der zu analysierenden Substanz beispielsweise durch Komplexierung ein (z.B. Metall-Ionen). In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform protoniert die Carbonsäure eine basische Gruppe auf der zu analysierenden Substanz (z.B. ein Amin).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit eine Arzneimittel-Einheit. Die Arzneimittel-Einheiten können Mittel sein, die bereits für eine klinische Anwendung akzeptiert sind, oder sie können Arzneimittel sein, deren Verwendung eine experimentelle Verwendung ist oder deren Aktivität oder Wirkungsmechanismus erforscht wird. Die Arzneimittel-Einheiten können eine bestätigte Wirkung in einem gegebenen Krankheits-Zustand aufweisen, oder es kann nur eine hypothetische Annahme sein, dass sie eine erwünschte Wirkung in einem gegebenen Krankheits- Zustand zeigen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Arzneimittel-Einheiten Verbindungen, die auf ihr Vermögen überprüft werden, mit einer zu analysierenden Substanz der Wahl eine Wechselwirkung einzugehen. Als solche schließen Arzneimittel-Einheiten, die nützlich als Erkennungs-Einheiten in der vorliegenden Erfindung sind, Arzneimittel von einem breiten Bereich von Arzneimittel-Klassen ein, die eine Vielzahl pharmakologischer Aktivitäten aufweisen.
  • Klassen nützlicher Mittel schließen beispielsweise ein: antiinflammatorische Arzneimittel des Nicht-Steroid-Typs (NSAIDS); das NSAIDS kann beispielsweise gewählt sein aus den folgenden Kategorien: (z.B. Propionsäure-Derivate, Essigsäure-Derivate, Fenaminsäure-Derivate, Biphenylcarbonsäure-Derivate und Oxicame); antiinflammatorische Arzneimittel des Steroid-Typs einschließlich Hydrocortison und dergleichen, Antihistamin-Arzeimittel (z.B. Chlorpheniramin, Triprolidin), Anti-Husten-Arzneimittel (z.B. Dextromethorphan, Codein, Carmiphen und Carbetapentan); gegen Juckreiz wirkende Arzneimittel (z.B. Methidilizin und Trimeprizin); anticholinerge Arzneimittel (z.B. Scopolamin, Atropin, Homatropin, Levadopa); antiemetische- und Antinausea-Arzeimittel (z.B. Cyclizin, Meclizin, Chlorpromazin, Buclizin); anorektische Arzneimittel (z.B. Benzphetamin, Phentermin, Chlorphentermin, Fenfluramin); zentral stimulierende Arzneimittel (z.B. Amphetamin, Methamphetamin, Dextroamphetamin und Methylphenidat); antiarrhythmische Arzneimittel (z.B. Propanolol, Procainamid, Disopyraminde, Quinidin, Encainid); β-adrenerge Blocker-Arzneimittel (z.B. Metoprolol, Acebutolol, Betaxolol, Labetalol und Timolol); kardiotone Arzneimittel (z.B. Milrinon, Amrinon und Dobutamin); antihypertensive Arzneimittel (z.B. Enalapril, Clonidin, Hydralazin, Minoxidil, Guanadrel, Guanethidin); diurethische Arzneimittel (z.B. Amilorid und Hydrochlorthiazid); Vasodilator-Arzneimittel (z.B. Diltazem, Amiodaron, Isosuprin, Nylidrin, Tolazolin und Verapamil); Vasoconstrictor-Arzneimittel (z.B. Dihydroergotamin, Ergotamin und Methylsergid); Anti-Ulcus-Arzneimittel (z.B. Ranitidin und Cimetidin); anästhetische Arzneimittel (z.B. Lidocain, Bupivacain, Chlorprocain, Dibucain); antidepressive Arzneimittel (z.B. Imipramin, Desipramin, Amitryptilin, Noriryptilin); Tranquilizer und sedative Arzneimittel (z.B. Chlordiazepoxid, Benacytyzin, Benzquinamid, Fluorazepam, Hydroxyzin, Loxapin und Promazin); antipsychotische Arzneimittel (z.B. Chlorprothixen, Fluphenazin, Haloperidol, Molindon, Thioridazin und Trifluoperazin); antimikrobielle Arzneimittel (antibakterielle, Antipilz-, Antiprotozon- und Antiviren-Arzneimittel).
  • Antimikrobielle Arzneimittel, die zur Einarbeitung in die vorliegende Zusammensetzung bevorzugt sind, schließen beispielsweise pharmazeutisch annehmbare Salze von β-Lactam-Arzeimitteln, Chinolon-Arzneimitteln, Cipofloxacin, Norfloxacin, Tetracyclin, Erythromycin, Amikacin, Triclosan, Doxycyclin, Capreomycin, Chlorhexidin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Clindamycin, Ethambutol, Hexamidin, Isothionat, Metronidazol, Pentamidin, Gentamycin, Kanamycin, Lineomycin, Methacyclin, Methenamin, Minocyclin, Neomycin, Netilmycin, Paramomycin, Streptomycin, Tobramycin, Miconazol und Amanfadin ein.
  • Andere Arzneimittel-Einheiten zur Verwendung in der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung schließen antineoplastische Arzneimittel (z.B. Antiandrogene, z.B. Leuprolid oder Flutamid), cytocidale Mittel (z.B. Adriamycin, Doxorubicin, Taxol, Cyclophosphamid, Busulfan, Cisplatin, α-2-Interferon), Anti-Östrogene (z.B. Tamoxifen), Anti-Metabolite (z.B. Fluoruracil, Methotrexat, Mercaptopurin, Thioguanin) ein.
  • Die Erkennungs-Einheit kann auch umfassen: Hormone (z.B. Medroxyprogesteron, Östradiol, Leuprolid, Megesterol, Octreotid oder Somatostatin); Muskeln-entspannende Mittel (z.B. Cinnamedrin, Cyclobenzaprin, Flavoxat, Orphenadrin, Papaverin, Mebeverin, Idaverin, Ritodrin, Dephenoxylat, Dantrolen und Azumolen); antispasmodische Arzeimittel, Knochen-aktive Arzneimittel (z.B. Diphosphonat und Phosphonoalkylphosphinat-Arzneimittel-Verbindungen), endocrin-modulierende Arzneimittel (z.B. Contraceptiva (z.B. Ethinodiol, Ethinyl, Östradiol, Norethindron, Mestranol, Desogestrel, Medroxyprogesteron), Modulatoren für Diabetes (z.B. Glyburid oder Chlorpropamid); Anabolika wie beispielsweise Testolacton oder Stanozolol, Androgene (z.B. Methyltestosteron, Testosteron oder Fluoxymesteron), Antidiurethika (z.B. Desmopressin) und Calcitonine ein.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung finden Anwendung auch Östrogene (z.B. Die thylstilbesterol), Glucocorticoide (z.B. Triamcinolon, Betamethason usw.) und Progenstogene wie beispielsweise Norethindron, Ethynodiol, Norethindron, Levonorgestrel; Thyroid-Mittel (z.B. Liothyronin oder Levothyroxin) oder antithyroide Mittel (z.B. Methimazol); antihyperprolactinemische Arzneimittel (z.B. Cabergoline); Hormon-Supressoren (z.B. Danazol oder Goserelin), Oxytocin-Arzneimittel (z.B. Methylergonovin oder Oxytocin), und es können auch Prostaglandine wie beispielsweise Mioprostol, Alprostadil oder Dinoproston verwendet werden.
  • Andere nützliche Erkennungs-Einheiten schließen immunomodulierende Arzneimittel (z.B. Antihistamine), Mastzellen-Stabilisatoren wie beispielsweise Lodoxamid und/oder Cromolyn, Steroide (z.B. Triamcinolon, Beclomethazon, Cortison, Dexamethason, Prednisolon, Methylprednisolon, Beclomethason oder Clobetasol), Histamin-H2-Antagonisten (z.B. Famotidin, Cimetidin, Ranitidin), Immunosupressiva (z.B. Azathioprin, Cyclosporin) usw. ein. Gruppen mit enzündungshemmender Aktivität wie beispielsweise Sulindac, Etodolac, Ketoprofen und Ketorolac können ebenfalls verwendet werden. Andere Arzneimittel in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung sind für Fachleute in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Die oben aufgezählten (und andere) Moleküle können an die Verbindungen gemäß der Erfindung, an feste Substrate usw. gebunden werden, und zwar mittels Verfahrensweisen, die Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind. Breite Anleitung kann gefunden werden in der, beispielsweise, den Bereichen der Biokonjugat-Chemie und Arzneimittel-Verabreichung gewidmeten Literatur. Beispielsweise ist ein Fachmann mit Sachverstand in diesem technischen Bereich, der mit einem Arzneimittel konfrontiert ist, das ein zugängliches Amin umfaßt, in der Lage, aus einer Vielzahl von Amine derivatisierenden Reaktionen zu wählen, einen passend funktionalisierten Partner (z.B. ein mit einer Carbonsäure-Endgruppe versehenes Thiol) für die organische Schicht zu lokalisieren und die Partner unter Bedingungen umzusetzen, die so gewählt werden, dass sie die gewünschte Kopplung bewirken (z.B: dehydratisierende Mittel wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid). Bezug genommen wird beispielsweise auf „MODIFI CATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS; Feeney et al. (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, Seiten 370–387"; „POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, Dunn et al. (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1991 ".
  • Wenn die Erkennungs-Einheit ein chelatisierendes Mittel, Kronenether oder Cyclodextrin ist, dominiert eine Wirt-Gast-Chemie die Wechselwirkung zwischen der Erkennungs-Einheit und der zu analysierenden Substanz. Die Anwendung der Wirt-Gast-Chemie ermöglicht, dass ein hoher Grad von Spezifität zwischen Erkennungs-Einheit und zu analysierender Substanz in eine Verbindung oder ein Assay gemäß der Erfindung eingebaut wird. Die Verwendung dieser Verbindungen zum Binden spezifischer Verbindungen ist Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Bezug genommen wird beispielsweise auf „Pitt et al., „The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload, in INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE, Martell (Hrsg.); American Chemical Society, Washington, D.C., 1980, Seiten 279–312"; "Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES; Cambridge University Press, Cambridge, 1989"; "Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer Verlag, New York, 1989" und die darin zitierten Druckschriften.
  • Darüber hinaus ist eine Vielzahl von Wegen, die das Binden chelatisierender Mittel, Kronenether und Cyclodextrine an andere Moleküle erlauben, Fachleuten in diesem technischen Bereich verfügbar. Siehe beispielsweise "Meares et al., Properties of In vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides, in: MODIFICATION OF PROTEINS, FOOD, NUTRITIONAL AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS", "Feeney et al. (Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, Seiten 370–387"; „Kasina et al., Bioconjugate Chem., 9, 108–117 (1998)"; „Song et al., Bioconjugate Chem., 8, 249–255 (1997)".
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bildet die Erkennungs-Einheit einen Einschlußkomplex mit der zu analysierenden Substanz von Interesse. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit ein Cyclodextrin oder modi fiziertes Cyclodextrin. Cyclodextrine sind eine Gruppe von cyclischen Oligosacchariden, die durch zahlreiche Mikroorganismen produziert werden. Cyclodextrine haben eine Ringstruktur, die eine korbähnliche Form aufweist. Diese Form macht es möglich, dass Cyclodextrine viele Arten von Molekülen in ihren Innen-Hohlraum einschließen. Siehe beispielsweise „Szejtli, CYCLODEXTRINS AND THEIR INCLUSION COMPLEXES; Akademiai Klado, Budapest, 1982", und „Bender et al., CYCLODEXTRIN CHEMISTRY, Springer Verlag, Berlin, 1978".
  • Cyclodextrine sind in der Lage, Einschluß-Komplexe mit einer Anordnung bioaktiver Moleküle zu bilden, die beispielsweise Arzneimittel, Pestizide, Herbizide und Kampfmittel einschließen. Siehe „Tenjarla et al., J. Pharm., Sci., 87, 425–429 (1998)"; „Zughul et al., Pharm. Dev. Technol., 3, 43–53, (1998)"; und „Albers et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 12, 311–337 (1995)". Wichtigerweise sind Cyclodextrine in der Lage, zwischen Enantiomeren von Verbindungen in ihren Einschluß-Komplexen zu unterscheiden. So liefert in einer bevorzugten Ausführungsform die Erfindung den Nachweis eines speziellen Enantiomers in einer Mischung von Enantiomeren; siehe „Koppenhöfer et al., J. Chromatogr. A, 793, 153–164 (1998))".
  • Das Cyclodextrin oder irgendeine andere Erkennungs-Einheit kann an eine Verbindung gemäß der Erfindung, einen festen Träger und dergleichen entweder direkt oder über einen Spacer-Arm gebunden werden. Siehe, „Yamamoto et al., J. Phys. Chem. B, 101, 6855–6860 (1997)". Verfahren zum Binden von Cyclodextrinen an andere Moleküle sind Fachleuten im Bereich der chromatographischen und pharmazeutischen Wissenschaften bekannt; siehe „Sreenivasan, K. J., Appl. Polym. Sci., 60, 2245–2249 (1996)".
  • In einer anderen beispielhaften Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit ein Polyaminocaboxylat-Chelatisierungsmittel wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). Diese Erkennungs-Einheiten können beispielsweise an irgendeine Komponente einer Verbindung gemäß der Erfindung mit Amin-Endgruppen, in einen festen Träger oder einen Spacer-Arm gebunden werden, beispielsweise durch Verwendung des im Handel erhältlichen Dianhydrids (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI).
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit ein Biomolekül wie beispielsweise ein Protein, eine Nucleinsäure, ein Peptid oder ein Antikörper. Biomoleküle, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können von irgendeiner beliebigen Quelle abgeleitet werden. Die Biomoleküle können von natürlichen Quellen isoliert werden oder können durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Proteine können natürliche Proteine oder mutierte Proteine sein. Mutationen können bewirkt werden durch chemische Mutagenese, auf eine bestimmte Stelle gerichtete Mutagenese oder andere Mittel zum Induzieren von Mutationen, die Fachleuten mit Sachverstand in diesem technischen Bereich bekannt sind. Proteine, die nützlich bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, schließen beispielsweise Enzyme, Antigene, Antikörper und Rezeptoren ein. Antikörper können entweder polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Peptide und Nucleinsäuren können von natürlichen Quellen isoliert werden oder können vollständig oder teilweise synthetischen Ursprungs sein.
  • In diesen Ausführungsformen, in denen die Erkennungs-Einheit ein Protein oder Antikörper ist, kann das Protein an eine Verbindung gemäß der Erfindung, einen festen Träger oder ein Vernetzungsmittel gebunden werden, und zwar durch irgendeinen reaktiven Peptid-Rest, der auf der Oberfläche des Proteins verfügbar ist. In bevorzugten Ausführungsformen sind die reaktiven Gruppen Amine oder Carboxylate. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die reaktiven Gruppen ε-Amin-Gruppen von Lysin-Resten.
  • Erkennungs-Einheiten, die Antikörper sind, können verwendet werden, um zu analysierende Substanzen zu erkennen, die Proteine, Peptide, Nucleinsäuren, Saccharide oder kleine bioaktive Materialien sind, wie beispielsweise Arzneimittel, Herbizide, Pestizide, Industrie-Chemikalien oder Kampfmittel. Verfahren zum Aufziehen von Antikörpern für spezielle Moleküle sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Es wird Bezug genommen auf das US-Patent Nr. 5,147,786 (erteilt an Feng et al. am 15. September 1992), das US-Patent Nr. 5,334,528 (erteilt an Stanker et al. am 2. August 1994), das US-Patent Nr. 5,686,237 (erteilt an M.A.S. Al-Bayati am 11. November 1997) und das US-Patent Nr. 5,573,922 (erteilt an Hoess et al. am 12. November 1996). Verfahren zum Binden von Antikörper-Mitteln an Oberflächen sind in diesem technischen Bereich ebenfalls bekannt; es wird Bezug genommen auf „Delamarche et al., Langmuir, 12, 1944–1946 (1996)".
  • Eine Erkennungs-Einheit kann an eine Verbindung gemäß der Erfindung konjugiert werden durch irgendeines aus einer großen Zahl von in diesem technischen Bereich bekannten Anknüpfungsverfahren, wie sie oben diskutiert wurden. In einer Ausführungsform ist die Erkennungs-Einheit direkt an das Hydroxyisophtalamidyl-Chelat gebunden über eine Gruppe an dem aromatischen Hydroxyisophtalamidyl-Kern, dem Grundgerüst oder dem Amid-Substituenten. In einer weiteren beispielhaften Ausführungsform wird ein reaktives bifunktionelles Vernetzungs-Mittel an eine reaktive Gruppe auf einem PL gebunden, und dieses Konjugat wird anschließend an die Erkennungs-Einheit über die reaktive Gruppe an der Vernetzungs-Komponente und eine Gruppe komplementärer Reaktivität an der Erkennungs-Einheit gebunden. Viele nützliche Vernetzungs-Mittel können im Handel erworben werden (Pierce Rockford, IL) oder können synthetisiert werden unter Anwendung von Techniken, die in diesem technischen Bereich bekannt sind. Alternativ dazu sind die Erkennungs-Einheit und ein Vernetzungsmittel aneinander gebunden, bevor das Hydroxyisophtalamidyl-Chelat an die Erkennungs-Einheit gebunden wird.
  • Zu analysierende Substanzen
  • Die Materialien und Verfahrensweisen gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Nachweis irgendeiner zu analysierenden Substanz oder Klasse von zu analysierenden Substanzen verwendet werden, die mit einer Erkennungs-Einheit in einer nachweisbaren Weise in Wechselwirkung treten. Die Wechselwirkung zwischen der zu anaylsierenden Substanz und der Erkennungs-Einheit kann irgendeine physiko-chemische Wechselwirkung sein, einschließlich kovalenter Bindung, Ionen-Bindung, Wasserstoff-Bindung, van-der-Waals-Wechselwirkungen, elektronische abstoßende Wechselwirkungen, elektronische anziehende Wechselwirkungen und hydrophob-hydrophil-Wechselwirkungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wechselwirkung eine ionische Wechselwirkung. In dieser Ausführungsform ist eine Säure, eine Base, ein Metall-Ion oder ein Metall-Ionen bindender Ligand, die zu analysierende Substanz. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wechselwirkung eine Wasserstoff-Bindungs-Wechselwirkung. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die Hybridisierung einer Nucleinsäure an eine Nucleinsäure mit einer komplementären Sequenz nachgewiesen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Wechselwirkung eine solche zwischen einem Enzym oder Rezeptor und einem kleinen Molekül oder Peptid, das sich daran bindet.
  • In einer anderen Ausführungsform konkurriert die zu analysierende Substanz um die Erkennungs-Einheit mit einem anderen Mittel, das an die Erkennungs-Einheit vor der Einführung der zu analysierenden Substanz von Interesse gebunden wurde. In dieser Ausführungsform ist es das Verfahren oder Ergebnis der das vorher gebundene Mittel verdrängenden zu analysierenden Substanz, das die nachweisbaren Werte der Fluoreszenz von der Verbindung gemäß der Erfindung hervorruft. Geeignete Kombinationen von Erkennungs-Einheiten und zu analysierenden Substanzen sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • In derzeit bevorzugten Ausführungsformen ist die zu analysierende Substanz eine Verbindung, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Säuren, Basen, organischen Ionen, anorganischen Ionen, pharmazeutischen Substanzen, Herbiziden, Pestiziden und Biomolekülen. Jedes dieser Mittel kann – wo dies praktisch durchführbar ist – als Dampf oder als Flüssigkeit nachgewiesen werden. Diese Mittel können als Komponenten in Mischungen von strukturell nicht-verwandten Verbindungen, racemischen Mischungen von Stereoisomeren, nicht-racemischen Mischungen von Stereoisomeren, Mischungen von Diastereomeren, Mischungen von Positions-Isomeren oder als reine Verbindungen zugegen sein. Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis einer speziellen zu analysierenden Substanz von Interesse ohne Störung von anderen Substanzen innerhalb einer Mischung.
  • Organische Ionen, die im wesentlichen nicht sauer und nicht basisch sind (z.B. quaternäre Alkylammonium-Salze) können nachgewiesen werden durch eine markierte Erkennungs-Einheit gemäß der Erfindung. Beispielsweise ist eine PL-markierte Erkennungs-Einheit mit Ionenaustausch-Eigenschaften nützlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Ein spezielles Beispiel ist der Austausch eines Kations wie beispielsweise eines Dodecyltrimethylammonium-Kations gegen ein Metall-Ion wie beispielsweise Natrium. Erkennungs-Einheiten, die Einschluss-Komplexe mit organischen Ionen bilden, sind ebenfalls von Nutzen. Beispielsweise können Kronenether und Kryptanden zur Bildung von Einschluss-Komplexen mit organischen Ionen wie beispielsweise quaternären Ammonium-Kationen verwendet werden.
  • Anorganische Ionen wie beispielsweise Metall-Ionen und Komplex-Ionen (z.B. SO4 2–, PO4 3–) können auch unter Verwendung der PLs und Verfahren gemäß der Erfindung nachgewiesen werden. Metall-Ionen können beispielsweise nachgewiesen werden durch ihre Komplexierung oder Chelatisierung mit PLs oder chelatisierenden Mitteln, die an eine Verbindung gemäß der Erfindung gebunden sind. In dieser Ausführungsform kann die Erkennungs-Einheit eine einfache monovalente Einheit sein (z.B. Carboxylat, Amin, Thiol) oder kann ein strukturell mehr komplexes Mittel sein (z.B. Ethylendiaminpentaessigsäure, Kronenether, Aza-Kronen, Thia-Kronen).
  • Komplexe anorganische Ionen können über ihr Vermögen nachgewiesen werden, mit PLs um gebundene Metall-Ionen in Ligand-Metall-Komplexen zu konkurrieren. Wenn ein an eine PL gebundener Ligand einen Metall-Komplex mit einer thermodynamischen Stabilitäts-Konstante bildet, die geringer ist als diejenige des Komplexes zwischen dem Metall und dem Komplex-Ion, ruft das Komplex-Ion die Dissoziation des Metall-Ions von dem immobilisierten Liganden hervor. Wenn das Metall-Ion das komplexierte Lanthanid ist, geht die Fluoreszenz zurück. Verfahrensweisen zur Bestimmung von Sta bilitäts-Konstanten für Verbindungen, die zwischen Metall-Ionen und Liganden gebildet werden, sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt. Unter Verwendung dieser Stabilitäts-Konstanten können Chelate, die für spezielle Ionen spezifisch sind, hergestellt werden. Verwiesen wird auf die Druckschrift „A. E. Martell, R. J. Motekaitis; DETERMINATION AND USE OF STABILITY CONSTANTS, 2. Auflage, VCH Publishers, New York, 1992".
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Affinität der zu analysierenden Substanz zu einem speziellen Metall-Ion dadurch ausgenutzt, dass man eine Verbindung gemäß der Erfindung verwendet, die das spezielle Metall-Ion einschließt. Das Metall-Ion muss allgemein wenigstens eine unbesetzte Koordinations-Stelle verfügbar haben, an die sich die zu analysierende Substanz binden kann. Alternativ dazu muss wenigstens eine Bindung zwischen dem Metall und dem das Metall immobilisierenden Mittel in Gegenwart der zu analysierenden Substanz ausreichend labil sein, um die Verdrängung von wenigstens einer Bindung des immobilisierenden Reagens durch die zu analysierende Substanz zu ermöglichen. Die Wechselwirkung zwischen der zu analysierenden Substanz und dem Metall-Ion kann nachgewiesen werden durch die Verwendung einer Anzahl von in diesem technischen Gebiet bekannten Verfahrensweisen, einschließlich beispielsweise UV/Vis-Spektroskopie und Fluoreszenz-Spektroskopie.
  • Andere Kombinationen von zu analysierenden Substanzen und Erkennungs-Einheiten sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich.
  • Sonden
  • Die Erfindung liefert Sonden einschließlich PL-Einheiten, die mit beispielsweise einer Target-Spezies bzw. Ziel-Spezies, einem Liganden für eine Ziel-Spezies (z.B. Nucleinsäure, Peptid usw.), einem kleinen Molekül (z.B. Arzneimittel, Pestizid usw.) und dergleichen konjugiert sind.
  • Nucleinsäure-Sonden
  • Die PLs gemäß der Erfindung sind nützlich in Verbindung mit Nucleinsäure-Sonden, und sie können als Komponenten von Nachweis-Mitteln in einer Vielzahl von DNS-Vervielfältigungs-Strategien bzw. DNS-Quantifizierungs-Strategien verwendet werden, einschließlich beispielsweise 5'-Nuclease-Assay, Strand Displacement Amplification (SDA), Nucleinsäure-Sequenz-basierte Amplifikation (nucleic acid sequence-based amplification; NASBA), Rolling Circle Amplification (RCA) sowie zum direkten Nachweis von Ziel-Molekülen in Lösungs-Phase oder in fester Phase (z.B. Arrays) vorliegenden Assays. Weiter können die PL-derivatisierten Nucleinsäuren in Sonden von im wesentlichen jedem beliebigen Format verwendet werden, einschließlich beispielsweise eines Formats, das gewählt ist aus molekularen Baken, Skorpion-Sonden, Sunrise-Sonden, konformationsmäßig unterstützten Sonden (conformationally assisted probes), „Licht-an"-Sonden (light up probes) und TaqManTM-Sonden.
  • So liefert in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz. Das Verfahren schließt ein: (a) das In-Kontakt-Bringen der Ziel-Sequenz mit einer Detektor-Nucleinsäure; (b) das Hybridisieren der Ziel-Bindungs-Sequenz mit der Ziel-Sequenz unter Verändern der Konformation der Nachweis-Nucleinsäure und Hervorrufen einer Änderung im Zusammenhang mit einem Fluoreszenz-Parameter; und (c) das Nachweisen der Änderung des Fluoreszenz-Parameters und dadurch Nachweisen der Nucleinsäure-Ziel-Sequenz.
  • In den in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verfahrensweisen schließt – so lange nichts anderes angemerkt wird – eine bevorzugte Nachweis-Nucleinsäure eine einzelsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz ein. Die Bindungs-Sequenz weist daran gebunden auf: (i) ein Fluorophor; und (ii) eine PL gemäß der Erfindung. Darüber hinaus ist vor ihrer Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz die Nachweis-Nucleinsäure vorzugsweise in einer Konformation, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Fluorophor und der PL ermöglicht, wenn das Fluorophor angeregt ist. Weiter wird in jedem der in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahren eine Änderung der Fluoreszenz nachgewiesen als Hinweis auf die Gegenwart der Ziel-Sequenz und die genannte Änderung der Fluoreszenz wird vorzugsweise in Echtzeit nachgewiesen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein weiteres Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz. Das Verfahren schließt ein: (a) das Hybridisieren einer Nachweis-Nucleinsäure, die eine einzelsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekular assoziierte Sekundärstruktur in 5'-Position zu der Ziel-Bindungs-Sequenz aufweist, mit der Ziel-Sequenz, worin wenigstens ein Abschnitt der Ziel-Sequenz einen einzelsträngigen Schwanz ausbildet, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz zur Verfügung steht; (b) in einer Primer-Ausdehnungs-Reaktion das Synthetisieren eines komplementären Stranges unter Verwendung der intramolekular assoziierten Sekundär-Struktur als Matrize und dadurch das Dissoziieren der intramolekular assoziierten Sekundärstruktur und das Produzieren einer Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter; (c) das Nachweisen der Änderung des Fluoreszenz-Parameters und dadurch das Nachweisen der Nucleinsäure-Ziel-Sequenz.
  • Bei diesem Verfahren – und solange nichts anderes angegeben wird, in den anderen Verfahren, die in diesem Abschnitt beschrieben werden – kann die Nachweis-Nucleinsäure im wesentlichen jede beliebige intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur annehmen; jedoch ist diese Struktur vorzugsweise eine Struktur, die gewählt ist aus Haarnadeln, Stamm-Schleife-Strukturen, Pseudoknoten, Triple-Helices und konformationsmäßig unterstützten Strukturen. Darüber hinaus umfaßt die intramolekular Basen-gepaarte Sekundär-Struktur vorzugsweise einen Abschnitt der Ziel-Bindungs-Sequenz. Darüber hinaus schließt die intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur vorzugsweise eine vollständig oder teilweise einsträngige Endonuclease-Erkennungs-Stelle ein.
  • Der komplementäre Strang kann hergestellt werden nach irgendeinem in diesem technischen Bereich anerkannten Verfahren zur Herstellung solcher Stränge, wird jedoch vorzugsweise in einer Ziel-Amplifikations-Reaktion synthetisiert und wird noch mehr bevorzugt synthetisiert durch Extension der Ziel-Sequenz unter Verwendung der Nachweis-Nucleinsäure als Matrize.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Amplifikation einer Ziel-Sequenz. Das Verfahren schließt die Verwendung einer Amplifikations-Reaktion einschließlich der folgenden Schritte ein: (a) Hybridisieren der Ziel-Sequenz und einer Nachweis-Nucleinsäure; die Nachweis-Nucleinsäure schließt eine einzelsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekular assoziierte Sekundärstruktur in 5'-Stellung zu der Ziel-Bindungs-Sequenz ein; wenigstens ein Abschnitt der Ziel-Sequenz bildet einen einzelsträngigen Schwanz, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz zur Verfügung steht; (b) Ausdehnen der hybridisierten Nachweis-Nucleinsäure auf der Ziel-Sequenz mit einer Polymerase unter Herstellung eines Nachweis-Nucleinsäure-Ausdehnungs-Produkts und Abtrennen des Nachweis-Nucleinsäure-Ausdehnungs-Produkts von der Ziel-Sequenz; (c) Hybridisieren eines Primers mit dem Nachweis-Nucleinsäure-Ausdehnungs-Produkt und Ausdehnen des Primers mit der Polymerase, wodurch die intramolekular assoziierte Sekundär-Struktur linearisiert wird, und Erzeugen einer Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter; und (d) Nachweis der Änderung des Fluoreszenz-Parameters, wodurch die Ziel-Sequenz nachgewiesen wird.
  • In noch einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Sicherstellung, ob eine erste Nucleinsäure und eine zweite Nucleinsäure miteinander hybridisieren. In diesem Verfahren schließt die erste Nucleinsäure eine PL gemäß der Erfindung ein. Das Verfahren schließt ein: (a) das In-Kontakt-Bringen der ersten Nucleinsäure mit der zweiten Nucleinsäure; (b) das Nachweisen einer Veränderung einer Fluoreszenz-Eigenschaft einer Verbindung, die gewählt ist aus der ersten Nucleinsäure, der zweiten Nucleinsäure und einer Kombination daraus, wodurch sichergestellt wird, ob die Hybridisierung stattfindet.
  • Eine Sonde, die sowohl eine PL als auch ein Fluorophor trägt, kann verwendet werden, oder alternativ dazu kann/können eine oder mehrere der Nucleinsäuren einzeln mit einer PL oder einem Fluorophor markiert werden. Wenn eine Nucleinsäure, die einzeln mit einer PL markiert ist, die Sonde ist, kann die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Nucleinsäure nachgewiesen werden durch Beobachten des Quenchens der Fluoreszenz der nativen Nucleinsäure oder – noch mehr bevorzugt – des Quenchens der Fluoreszenz eines an die zweite Nucleinsäure gebundenen Fluorophors.
  • Zusätzlich zu ihrer allgemeinen Brauchbarkeit in Spezies, die dafür ausgelegt sind, eine Amplifikation, einen Nachweis und eine quantitative Bestimmung von Nucleinsäuren zu testen, können die vorliegenden PLs in im wesentlichen jedem beliebigen Nucleinsäure-Sonden-Format verwendet werden, das nun bekannt ist oder später entdeckt wird. Beispielsweise können die PLs gemäß der Erfindung eingearbeitet werden in Sonden-Motive wie beispielsweise TagMan Sonden („Held et al., Genome Res., 6, 986–994 (1996)", „Holland et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88, 7276–7280 (1991)", „Lee et al., Nucleic Acids Res., 21, 3761–3766 (1993)"), molekulare Baken („Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14, 303–308 (1996)", „Jayasena et al., US-Patent No. 5,989,823", erteilt am 23. November 1999), Skorpion-Sonden („Whitcomb et al., Nature Biotechnology, 17, 804–807 (1999)"), Sunrise-Sonden („Nazarenko et al., Nucleic Acids Res., 25, 2516–2521 (1997)", konformationsmäßig unterstützte Sonden („R. Cook; parallel anhängige und auf denselben Anmelder übertragene provisorische US-Patentanmeldung Nr. 60/138,376, eingereicht am 9. Juni 1999"), „Licht-an"-Sonden auf Basis von Peptid-Nucleinsäuren (PNA) („Kubista et al., WO 97/45,539, Dezember 1997"), Doppelstrangspezifische DNS-Farbstoffe („Higuchi et al., Bio/Technology, 10, 413–417 (1992)", „Wittwer et al., Bio Techniques, 22, 130–138 (1997)") und dergleichen. Diese und andere Sonden-Motive, mit denen die vorliegenden PLs verwendet werden können, werden beschrieben in der Druckschrift „NONISOTOPIC DNA PROBE TECHNIQUES, Academic Press, Inc., 1992."
  • Die Nucleinsäuren zur Verwendung in den Sonden gemäß der Erfindung können irgendwelche geeignete Größe aufweisen, und ihre Größe liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt im Bereich von etwa 10 bis etwa 80 Nukleotiden und noch mehr bevorzugt im Bereich von etwa 20 bis etwa 40 Nukleotiden. Die präzise Sequenz und Länge einer Nucleinsäure-Sonde gemäß der Erfindung hängt zum Teil von der Natur des Ziel-Polynukleotids ab, an die sie gebunden wird. Der Bindungs-Ort und die Länge können variiert werden, um passende Temper- und Schmelz-Eigenschaften für eine besondere Ausführungsform zu erzielen. Anleitungen zur Erreichung solcher Wahl-Möglichkeiten für die Zusammensetzung lassen sich in vielen in diesem technischen Bereich anerkannten Druckschriften finden.
  • Vorzugsweise wird das 3'-terminale Nukleotid der Nucleinsäure-Sonde blockiert oder einer Verlängerung durch eine Nucleinsäure-Polymerase unfähig gemacht. Ein derartiges Blockieren erfolgt herkömmlicherweise durch Binden eines Donor- oder Akzeptor-Moleküls an die terminale 3'-Position der Nucleinsäure-Sonde mittels einer Verbindungs-Einheit.
  • Die Nucleinsäure kann DNS, RNS oder chimäre Mischungen oder Derivate oder modifizierte Versionen davon umfassen. Sowohl die Sonde als auch die Ziel-Nucleinsäure können als Einzelstrang, Doppel-Strang, Dreifach-Strang usw. vorliegen. Zusätzlich dazu, mit einer Molekülenergie-Übertragungs-Donor-Einheit und einer Molekülenergie-Übertragungs-Akzeptor-Einheit markiert zu sein, kann die Nucleinsäure an der Basen-Einheit, Zucker-Einheit oder dem Phosphat-Grundgerüst mit anderen Gruppen wie beispielsweise radioaktiven Markierungen, „Minor Groove"-Bindemitteln, interkalierenden Mitteln und dergleichen modifiziert sein.
  • Beispielsweise kann die Nucleinsäure wenigstens eine modifizierte Basen-Einheit umfassen, die gewählt ist aus der Gruppe, die einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl-)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5- oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl-)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt die Nucleinsäure wenigstens eine modifizierte Zucker-Einheit, die gewählt ist aus der Gruppe, die einschließt, die jedoch nicht beschränkt ist auf Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Nucleinsäure wenigstens ein modifziertes Phosphat-Grundgerüst, das gewählt ist aus der Gruppe, die einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf ein Phosphorothioat, ein Phosphorodithioat, ein Phosphoramidothioat, ein Phosphoramidat, ein Phosphordiamidat, ein Methylphosphonat, einen Alkylphosphotriester, und ein Formacetal oder Analoges davon.
  • An Phosphodiester gebundene Nucleinsäuren gemäß der Erfindung können synthetisiert werden durch in diesem technischen Bereich bekannte Standard-Verfahren, beispielsweise durch Verwendung einer automatischen DNS-Synthese-Vorrichtung (wie beispielsweise einer solchen, wie sie im Handel erhältlich ist von der Firma P.E. Biosystems, usw.) unter Verwendung der im Handel erhältlichen Amidit-Chemie. Nucleinsäuren, die modifizierte Phosphodiester-Verknüpfungsgruppen enthalten, können nach in diesem technischen Bereich bekannten Verfahrensweisen synthetisiert werden. Beispielsweise können Phosphorothioat-Nucleinsäuren synthetisiert werden nach der Verfahrensweise von Stein et al. („Nucl. Acids Res., 16, 3209 (1988)"), und Methylphosphonat-Nucleinsäuren können hergestellt werden unter Verwendung von Glas-Polymer-Trägern mit gesteuerter Porengröße („Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 7448–7451 (1988)"). Andere Verfahrensweisen zum Synthetisieren sowohl von an Phosphodiester als auch an modifizierte Phosphodiester geknüpfte Nucleinsäuren sind Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich offensichtlich.
  • Nucleinsäure-Sonden gemäß der Erfindung können nach einer Anzahl von Ansätzen synthetisiert werden, z.B. „Ozaki et al., Nucleic Acids Research, 20, 5205–5214 (1992)"; „Agrawal et al., Nucleic Acids Research, 18, 5419–5423 (1990)" oder derglei chen. Die Nucleinsäure-Sonden gemäß der Erfindung werden aus Gründen der Bequemlichkeit auf einer automatisierten DNS-Synthese-Vorrichtung synthetisiert, z.B. einer Vorrichtung der Firma P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Kalifornien), Modell DNS/RNS-Synthesizer 392 oder 394, und zwar unter Anwendung standardisierter chemischer Verfahren wie beispielsweise der Phosphoramidit-Chemie (diese wird beispielsweise offenbart in den folgenden Druckschriften: „Beaucage et al., Tetrahedron, 48, 2223–2311 (1992)"; „Molko et al., US-Patent Nr. 4,980,460"; „Koster et al., US-Patent Nr. 4,725,677"; „Caruthers et al., US-Patente Nrn. 4,415,732, 4,458,066 und 4,973,679". Alternative chemische Verfahrenswege, die zu nicht natürlichen Grundgerüst-Gruppen wie beispielsweise Phosphorothioat, Phosphoramidat und dergleichen führen, können ebenfalls angewendet werden.
  • Wenn die Nucleinsäuren unter Verwendung einer automatischen Nucleinsäure-Synthese-Vorrichtung synthetisiert werden, werden die stabilisierende Einheit, die Energieübertragungs-Donor-Einheit und die Energieübertragungs-Akzeptor-Einheit vorzugsweise während der automatisierten Synthese eingeführt. Alternativ dazu kann eine oder können mehrere dieser Einheiten entweder vor oder nach dem Zeitpunkt eingeführt werden, zu dem das automatisierte Synthese-Verfahren begonnen hat. In einer weiteren beispielhaften Ausführungsform wird eine oder werden mehrere dieser Einheiten eingeführt, nachdem die automatisierte Synthese vollständig abgeschlossen wurde.
  • Die Donor-Einheit wird vorzugsweise von der PL um wenigstens etwa 10 Nukleotide und noch mehr bevorzugt um wenigstens etwa 15 Nukleotide getrennt. Die Donor-Einheit wird vorzugsweise entweder an das 3'-endständige Nukleotid oder das 5'-endständige Nukleotid der Sonde gebunden. Die PL-Einheit wird ebenfalls vorzugsweise entweder an das 3'-endständige Nukleotid oder das 5'-endständige Nukleotid der Sonde gebunden. Noch mehr bevorzugt werden die Donor- und Akzeptor-Einheiten an das 3'- und 5'-terminale Nukleotid oder das 5'- oder das 3' terminale Nukleotid der Sonde gebunden.
  • Sobald die gewünschte Nucleinsäure synthetisiert wurde, wird sie vorzugsweise von dem festen Träger, auf dem sie synthetisiert wurde, abgespalten und nach in diesem technischen Bereich bekannten Verfahrensweisen behandelt, um irgendwelche vorhandene Schutzgruppen zu entfernen (z.B. bei 60 °C für die Zeit von 5 h in konzentriertem Ammoniak). In solchen Ausführungsformen, in denen eine Basen-empfindliche Gruppe an die Nucleinsäuren gebunden ist (z.B. TAMRA), werden für die Entfernung der Schutzgruppe vorzugsweise mildere Bedingungen angewendet (z.B. Behandlung in Butylamin : Wasser, 1 : 3; 8 Stunden, 70 °C). Die Entfernung der Schutzgruppen unter diesen Bedingungen wird erleichtert durch die Verwendung von schnell Schutzgruppen abspaltenden Amiditen (z. B. dC-Acetyl, dG-dmf).
  • In Anschluss an die Abspaltung von dem Träger und die Entfernung der Schutzgruppen wird die Nucleinsäure nach irgendeiner Verfahrensweise, die in diesem technischen Bereich bekannt ist, gereinigt; dies schließt Verfahren der Chromatographie, Extraktion und Gel-Reinigung ein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nucleinsäure unter Verwendung von HPLC gereinigt. Die Konzentration und Reinheit der isolierten Nucleinsäure wird vorzugsweise bestimmt durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm in einem Spektrophotometer.
  • Peptid-Sonden
  • Peptide, Proteine und Peptid-Nucleinsäuren, die mit einem Fluorophor und einer PL gemäß der Erfindung markiert sind, können sowohl in in vivo- als auch in vitro-Enzym-Assays verwendet werden.
  • So liefert in einem anderen Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Probe ein Enzym enthält. Das Verfahren umfaßt die Schritte, dass man (a) die Probe mit einem Peptid-Konstrukt in Kontakt bringt; (b) das Fluorophor anregt; und (c) eine Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe bestimmt, wobei die Präsenz des Enzyms in der Probe zu einer Änderung in der Fluoreszenz-Eigenschaft führt.
  • Peptid-Konstrukte, die bei der praktischen Durchführung der Erfindung nützlich sind, schließen solche mit den folgenden Merkmalen ein: (i) ein Fluorophor; (ii) eine PL gemäß der Erfindung; und (iii) eine Spaltungs-Erkennungsstelle für das Enzym. Darüber hinaus ist das Peptid-Konstrukt vorzugsweise von einer Länge und Orientierung und liegt in einer Konformation vor, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Fluorophor und der PL erlaubt, wenn das Fluorophor angeregt wird.
  • Wenn die Sonde zum Nachweis eines Enzyms verwendet wird, wie beispielsweise eines abbauenden Enzyms (z.B. einer Protease) und ein Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung beobachtet wird, der niedriger ist als ein erwarteter Betrag, ist dies im allgemeinen ein Hinweis auf das Vorhandensein eines Enzyms. Der Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung in der Probe kann beispielsweise bestimmt werden als Funktion der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit, der Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit, des Verhältnisses der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit zu derjenigen Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit oder der Anregungszustands-Lebensdauer der Donor-Einheit.
  • Der Assay ist auch nützlich zur Bestimmung der Menge an Enzym in einer Probe unter Bestimmung dieses Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung zu einer ersten und des jenigen zu einer zweiten Zeit nach Kontakt zwischen dem Enzym und dem Tandem-Konstrukt und Bestimmen der Differenz des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung. Die Differenz hinsichtlich des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung spiegelt die Menge an Enzym in der Probe wider.
  • Die Assay-Verfahren können auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Verbindung die Aktivität eines Enzyms verändert, z.B. in Screening-Assays. So liefert in einem weiteren Aspekt die Erfindung Verfahrensweisen zum Bestimmen der Menge an Aktivität eines Enzyms in einer Probe von einem Organismus. Das Verfahren schließt die Schritte ein, dass man (a) eine Probe, die das Enzym und die Verbindung umfaßt, mit einem Peptid-Konstrukt in Kontakt bringt, wobei dies die Schritte umfaßt, dass man (b) das Fluorophor anregt und (c) eine Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe bestimmt, worin die Aktivität des Enzyms in der Probe zu einer Änderung der Fluoreszenz-Eigenschaft führt. Peptid-Konstrukte, die in diesem Aspekt der Erfindung nützlich sind, sind im wesentlichen ähnlich denjenigen, die unmittelbar vorher beschrieben wurden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an Enzym-Aktivität in der Probe bestimmt als Funktion des Grads an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung in der Probe, und die Menge an Aktivität in der Probe wird verglichen mit einer Standard-Aktivität für dieselbe Menge des Enzyms. Die Differenz zwischen der Menge an Enzym-Aktivität in der Probe und der Standard-Aktivität zeigt an, dass die Verbindung die Aktivität des Enzyms verändert.
  • Repräsentative Beispiele von Enzymen, mit denen die vorliegende Erfindung praktisch durchgeführt werden kann, schließen beispielsweise ein: Trypsin, Enterokinase, HIV-1-Protease, Prohormon-Konvertase, Interleukin-1b-umwandelndes Enzym, Adenovirus-Endopeptidase, Cytomegalovirus-Assemblin, Leishmanolysin, β-Secretase für ein Amyloid-Vorstufen-Protein, Thrombin, Renin, Angiotensin-umwandelndes Enzym, Cathepsin-D und Kininogenase sowie allgemein Proteasen.
  • Proteasen spielen wichtige Rollen in vielen Krankheitsprozessen wie beispielsweise Alzheimersche Krankheit, Bluthochdruck, Entzündungen, Apoptose und AIDS. Verbindungen, die ihre Aktivität blockieren oder erhöhen, haben Potential als therapeutische Mittel. Da die normalen Substrate von Peptidasen lineare Peptide sind und da etablierte Verfahrensweisen zur Herstellung von Nicht-Peptid-Analogen dafür existieren, sind Verbindungen, die die Aktivität von Proteasen beeinflussen, natürliche Subjekte der kombinatorischen Chemie. Ein Screening von Verbindungen, die im Rahmen der kombinatorischen Chemie produziert werden, erfordert einfache enzymatische Assays.
  • Die einfachsten Assays für Proteasen basieren auf einer Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung von einem Donor-Fluorophor zu einem Akzeptor, die an einander gegenüberliegenden Enden einer kurzen Peptid-Kette angeordnet sind, die die potentielle Spaltungsstelle enthält (siehe „C. G. Knight, Methods in Enzymol., 248, 18–34 (1995)"). Eine Proteolyse trennt das Fluorophor und den Akzeptor, was zu einer erhöhten Intensität bei der Emission des Donor-Fluorophors führt. Bestehende Protease-Assays machen Gebrauch von kurzen Peptid-Substraten, die unnatürliche chromophore Aminosäuren einschließen, die durch Festphasen-Peptidsynthese zusammengesetzt werden.
  • Assays gemäß der Erfindung sind ebenfalls nützlich zum Bestimmen und Charakterisieren von Substrat-Spaltungssequenzen von Proteasen oder zum Identifizieren von Proteasen wie beispielsweise von Orphan-Proteasen. In einer Ausführungsform schließt das Verfahren das Ersetzen einer definierten Linker-Einheit-Aminosäure-Sequenz durch eine solche ein, die eine statistisch bestimmte Auswahl von Aminosäuren enthält. Eine Bibliothek von Sonden, die fluoreszierende PL tragen, in denen das Fluorophor und die PL über eine statistisch bestimmte Peptid-Verknüpfungs-Einheit verknüpft sind, können unter Anwendung von Verfahrensweisen des Recombinant Engineerings oder von Verfahrensweisen der synthetischen Chemie erzeugt werden. Ein Screening der Mitglieder der Bibliothek kann bewirkt werden durch Messen eines mit der Spaltung in Verbindung stehenden Signals wie beispielsweise der Fluoreszenz-Energie-Übertragung, nach In-Kontakt-Bringen des Spaltungsenzyms mit jedem der Mitglieder der Bibliothek des Tandem-Konstrukts des Fluoreszenz-Peptids. Der Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung, der niedriger ist als eine erwartete Menge, zeigt das Vorhandensein einer Verknüpfungs-Sequenz an, die durch das Enzym gespalten wird. Der Grad an Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Übertragung in der Probe kann beispielsweise bestimmt werden als Funktion der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit, der Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit oder des Verhältnisses der Menge an Fluoreszenz von der Donor-Einheit zu der Menge an Fluoreszenz von der Akzeptor-Einheit oder der Lebensdauer des Anregungszustandes der Donor-Einheit.
  • In den Tandem-Konstrukten gemäß der Erfindung sind die Donor- und die Akzeptor-Einheit über eine Verknüpfungs-Einheit verbunden. Die Verknüpfungs-Einheit schließt vorzugsweise eine Peptid-Einheit ein, kann jedoch auch jede beliebige andere organische Molekül-Einheit sein. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Ver knüpfungs-Einheit eine Spaltungs-Erkennungs-Stelle ein, die spezifisch für ein Enzym oder ein anderes Spaltungsmittel von Interesse ist. Eine Spaltungs-Stelle in der Verknüpfungs-Einheit ist nützlich, da dann, wenn ein Tandem-Konstrukt mit dem Spaltungsmittel gemischt wird, die Verknüpfungs-Einheit ein Substrat für eine Spaltung durch das Spaltungs-Mittel ist. Das Abreißen der Verknüpfungs-Einheit führt zu einer Trennung des Fluorophors und der PL gemäß der Erfindung. Die Trennung ist meßbar als Änderung der FRET.
  • Wenn das Spaltungsmittel von Interesse eine Protease ist, kann die Verknüpfungs-Einheit ein Peptid umfassen, das eine Spaltungs-Erkennungs-Sequenz für die Protease enthält. Eine Spaltungs-Erkennungs-Sequenz für eine Protease ist eine spezielle Aminosäure-Sequenz, die von der Protease während der proteolytischen Spaltung erkannt wird. Viele Protease-Spaltungsstellen sind in diesem technischen Bereich bekannt, und diese und andere Spaltungsstellen können in die Verknüpfungseinheit eingeschlossen werden. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Matayoshi et al., Science, 247,954 (1990)"; „Dunn et al., Meth. Enzymol., 241, 254 (1994)"; „Seidah et al., Meth. Enzymol., 244, 175 (1994)"; „Thomberry, Meth. Enzymol., 244, 615 (1994)"; „Weber et al., Meth. Enzymol., 244, 595 (1994)"; „Smith et al., Meth. Enzymol., 244, 412 (1994)"; „Bouvier et al., Meth. Enzymol, 248, 614 (1995)", „Hardy et al., in AMYLOID PROTEIN PRECURSOR IN DEVELOPMENT, AGING AND ALZHEIMER'S DISEASE, (Hrsg.) Masters et al., Seiten 190–198 (1994)".
  • Auf einem festen Träger immobilisierte PL-Analoge
  • Die PLs gemäß der Erfindung können auf im wesentlichen jedem beliebigen Polymer, Biomolekül und festem oder halb-festem Material immobilisiert werden, das irgendeine nützliche Konfiguration hat. Darüber hinaus kann jedes beliebige Konjugat, das eine oder mehrere PLs umfaßt, in ähnlicher Weise immobilisiert werden. Wenn der Träger ein Feststoff oder Halb-Feststoff ist, schließen Beispiele von bevorzugten Typen von Trägern zum Immobilisieren der Nucleinsäure-Sonde ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Glas mit gesteuerten Poren, Glasplatten, Polystyrol, mit Avidin beschichtete Polystyrol-Kugeln, Cellulose, Nylon, Acrylamid-Gel und aktiviertes Dextran. Diese festen Träger sind bevorzugt aufgrund ihrer chemischen Stabilität, Leichtigkeit, mit der sie funktionalisiert werden können, und ihrer wohldefinierten Oberfläche. Feste Träger wie beispielsweise Glas mit gesteuerten Poren (CPG; controlled pore glas; 500 Å, 1.000 Å) und nicht-quellendes, hochgradig vernetztes Polystyrol (1.000 Å) sind besonders bevorzugt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Oberfläche eines festen Trägers mit einer PL gemäß der Erfindung oder einer Spezies, die eine PL gemäß der Erfindung einschließt, funktionalisiert. Aus Gründen der Klarheit der Veranschaulichung fokussiert sich die folgende Diskussion darauf, eine reaktive PL an einen festen Träger zu binden. Die folgende Diskussion ist auch in breiter Weise relevant für das Binden einer Spezies, die innerhalb ihrer Struktur eine reaktive PL einschließt, an einen festen Träger und das Binden einer derartigen Spezies und von reaktiven PL-Analogen an andere Moleküle und Strukturen.
  • Die PLs werden vorzugsweise an einen festen Träger dadurch gebunden, daß man eine Bindung zwischen einer reaktiven Gruppe auf der PL und einer reaktiven Gruppe auf der Oberfläche des festen Trägers oder einer Verbindungsgruppe (Linker), die an den festen Träger gebunden ist, ausbildet und dadurch den festen Träger mit einem oder mehreren PL-Analogen derivatisiert. Die Bindung zwischen dem festen Träger und der PL ist vorzugsweise eine kovalente Bindung, obwohl auch ionische Bindungen, dative Bindungen oder andere derartige Bindungen genauso nützlich sind. Reaktive Gruppen, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind im Einzelnen oben diskutiert und schließen beispielsweise Amine, Hydroxyl-Gruppen, Carbonsäuren, Carbonsäure-Derivate, Alkene, Sulfhydryl-Verbindungen, Siloxane usw. ein.
  • Eine große Zahl von festen Trägern, die zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung passend sind, sind im Handel erhältlich und schließen beispielsweise ein: Peptidsynthese-Harze, sowohl mit als auch ohne gebundene Aminosäuren und/oder Peptide (z.B. Alkoxybenzylalkohol-Harz, Aminomethyl-Harz, Aminopolystyrol-Harz, Benzhydrylamin-Harz usw. (Bachem)), mit funktionellen Gruppen versehenes Glas mit gesteuerten Poren (BioSearch Technologies, Inc.) Ionenaustausch-Medien (Aldrich), funktionalisierte Membranen (z.B. -COOH-Membranen; Asahi Chemical Co., Asahi Glas Co. und Tukuyama Soda Co.) und dergleichen.
  • Darüber hinaus sind für Anwendungen, in denen ein passender fester Träger nicht im Handel erhältlich ist, eine große Vielzahl von Reaktionstypen für die Funktionalisierbarkeit einer Oberfläche eines festen Trägers verfügbar. Beispielsweise können Träger, die aus einem Kunststoff wie beispielsweise Polypropylen aufgebaut sind, an ihrer Oberfläche durch Chromsäure-Oxidation derivatisiert und anschließend in hydroxylierte oder Amino-methylierte Oberflächen umgewandelt werden. Der funktionalisierte Träger wird dann mit einer PL mit komplementärer Reaktivität umgesetzt, wie beispielsweise mit einem aktiven PL-Ester, einem entsprechenden Säurechlorid oder einem entsprechenden Sulfonat-Ester. Träger, die aus hochgradig vernetztem Divinylbenzol hergestellt sind, können an der Oberfläche durch Chlormethylierung und anschließende Behandlung der funktionellen Gruppen derivatisiert werden. Darüber hinaus können funktionalisierte Substrate hergestellt werden aus geätztem, reduziertem Polytetrafluorethylen.
  • Wenn der Träger aus einem silikatartigen Material wie beispielsweise Glas aufgebaut ist, kann die Oberfläche durch Umsetzen der Oberfläche mit Si-OH-Gruppen, SiO-H-Gruppen und/oder Si-Si-Gruppen mit einem funktionalisierenden Reagens derivatisiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, in der die Substrate aus Glas hergestellt sind, wird die kovalente Bindung der reaktiven Gruppe an die Glas-Oberfläche erreicht durch Umwandlung von Gruppen auf der Oberfläche des Substrats mit einem Siliciummodifizierenden Reagens wie beispielsweise: (RaO)3-Si-Rb-Xa (2) worin Ra eine Alkyl-Gruppe wie beispielsweise eine Methyl-Gruppe oder Ethyl-Gruppe ist, Rb eine verbindende Gruppe zwischen Silicium und Xa ist und Xa eine reaktive Gruppe oder eine geschützte reaktive Gruppe ist. Silan-Derivate, die Halogene oder andere Abgangs-Gruppen zusätzlich zu den gezeigten Alkoxy-Gruppen aufweisen, sind auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liefert das Reagens, das zum Funktionalisieren des festen Trägers verwendet wird, mehr als eine reaktive Gruppe pro Reagens-Molekül. Bei Verwendung von Reagenzien wie beispielsweise der nachfolgend genannten Verbindung wird jede reaktive Stelle auf der Substrat-Oberfläche im Grundsatz zu zwei oder mehr funktionellen Gruppen „vervielfältigt": (RaO)3-Si-Rb-(Xa)n (3)worin Ra eine Alkyl-Gruppe ist (z.B. eine Methyl-Gruppe oder Ethyl-Gruppe), Rb eine verbindende Gruppe zwischen Silicium und Xa ist, Xa eine reaktive Gruppe oder eine geschützte reaktive Gruppe ist und n eine ganze Zahl zwischen 2 und 50 und noch mehr bevorzugt zwischen 2 und 20 ist. Die Amplifikation einer PL durch ihr Binden an ein Silicium enthaltendes Substrat ist – den Absichten entsprechend – beispielhaft für das generelle Konzept der PL-Amplifikation. Diese Vervielfachungs- bzw. Amplifikations-Strategie ist in gleicher Weise anwendbar auf andere Aspekte der Erfindung, in denen ein PL-Analoges an irgendein anderes Molekül oder einen festen Träger gebunden wird.
  • Eine Zahl von Siloxan-funktionalisierenden Reagenzien kann verwendet werden, beispielsweise:
    • (1) Hydroxyalkyl-Siloxane (Silylieren der Oberfläche; Funktionalisieren mit Diboran; und Umsetzung mit H2O2, um zum Alkohol zu oxidieren); (a) Allyltrichlorsilan → → 3-Hydroxypropyl; (b) 7-Oct-1-enyltrichlorsilan → → 8-Hydroxyoctyl;
    • (2) Diol-(dihydroxyalkyl-)siloxane (Silylieren der Oberfläche und Hydrolysieren zum Diol); (a) Glycidyltrimethoxysilan → → (2,3-Dihydroxypropyloxy-)propyl;
    • (3) Aminoalkylsiloxane (Amine, die keinen Zwischen-Funktionalisierungs-Schritt erfordern); (a) 3-Aminopropyltrimethoxysilan → Aminopropyl;
    • (4) Dimere sekundärer Aminoalkylsiloxane (a) Bis-(3-trimethoxysilylpropyl-)amin → Bis-(silyloxypropyl-)amin.
  • Für Fachleute in diesem technischen Bereich ist es offensichtlich, daß eine Anordnung von ähnlich nützlichen chemischen Funktionalisierungs-Wegen verfügbar ist, wenn von Siloxanen verschiedene Träger-Komponenten verwendet werden. So können beispielsweise Alkylthiole, die wie oben im Kontext der Siloxane-modifizierenden Reagenzien funktionalisiert wurden, an Metall-Filme gebunden und anschließend mit einer PL unter Herstellung der immobilisierten Verbindung gemäß der Erfindung umgesetzt werden.
  • R-Gruppen zur Verwendung als Gruppe Rb in den oben beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Alkyl-Gruppen, substituierte Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen, Arylalkyl-Gruppen, substituierte Aryl-Gruppen, substituierte Arylalkyl-Gruppen, Acyl-Gruppen, Halogen-Gruppen, Hydroxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Alkylamino-Gruppen, Acylamino-Gruppen, Alkoxy-Gruppen, Acyloxy-Gruppen, Aryloxy-Gruppen, Aryloxyalkyl-Gruppen, Mercapto-Gruppen, gesättigte cyclische Kohlenwasserstoff-Gruppen, ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoff-Gruppen, Heteroaryl-Gruppen, Heteroarylalkyl-Gruppen, substituierte Heteroaryl-Gruppen, substituierte Heteroarylalkyl-Gruppen, heterocyclische Gruppen, substituierte heterocyclische Gruppen und Heterocycloalkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  • Nucleinsäure-Aufnahme-Sonden
  • In einer Ausführungsform wird eine eine PL umfassende immobilisierte Nucleinsäure als Aufnahme-Sonde verwendet. Die Nucleinsäure-Sonde kann direkt an einen festen Träger gebunden sein, beispielsweise durch Bindung des 3'-terminalen oder 5'-terminalen Nukleotids der Sonde an den festen Träger. Noch mehr bevorzugt ist jedoch die Sonde an den festen Träger über eine Verbindungs-Gruppe (Linker) (d.h. einen Spacer-Arm, siehe oben) gebunden. Die Bindungs-Gruppe dient dazu, einen Abstand der Sonden von dem festen Träger zu schaffen. Die Bindungs-Gruppe hat am meisten bevorzugt eine Länge von etwa 5 bis etwa 30 Atomen, noch mehr bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 50 Atomen.
  • In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der feste Träger auch als Synthese-Träger bei der Herstellung der Sonde verwendet. Die Länge und chemische Stabilität der Bindungs-Gruppe zwischen dem festen Träger und der ersten 3'-Einheit der Nucleinsäure spielt eine wichtige Rolle bei einer effizienten Synthese und Hybridisierung von Träger-gebundenen Nucleinsäuren. Der Linker-Arm sollte ausreichend lang sein, so daß eine hohe Ausbeute (> 97 %) während einer automatisierten Synthese erreicht werden kann. Die erforderliche Länge des Linkers bzw. Bindungsarms hängt ab von dem speziellen verwendeten festen Träger. Beispielsweise ist eine sechs Atome lange Bindungs-Gruppe allgemein ausreichend, um während einer automatisierten Synthese von Nucleinsäuren eine Ausbeute > 97 % zu erreichen, wenn ein hochgradig vernetztes Polystyrol als der feste Träger verwendet wird. Der Verbindungsarm ist vorzugsweise wenigstens 20 Atome lang, um eine hohe Ausbeute (> 97 %) während einer automatisierten Synthese zu erreichen, wenn CPG als der feste Träger verwendet wird.
  • Eine Hybridisierung einer an einem festen Träger immobilisierten Sonde macht es allgemein erforderlich, daß die Sonde von dem festen Träger um wenigstens 30 Atome entfernt ist, noch mehr bevorzugt um wenigstens 50 Atome. Um diese Entfernung zu erreichen, schließt die Bindungs-Gruppe allgemein einen zwischen der Bindungs-Gruppe und den 3'-Terminus angeordneten Spacer ein. Für eine Nucleinsäure-Synthese ist der Bindungsarm üblicherweise an der 3'-OH-Gruppe des 3'-Terminus über eine Ester-Bindung gebunden, die mit basischen Reagenzien gespalten werden kann, um die Nucleinsäure von dem festen Träger freizusetzen.
  • Eine große Vielzahl von Bindungs-Gruppen ist im Stand der Technik bekannt, die dazu verwendet werden kann, die Nucleinsäure-Sonde an den festen Träger zu binden. Die Bindungs-Gruppe kann aus irgendeiner Verbindung gebildet sein, die nicht signifikant die Hybridisierung der Ziel-Sequenz mit der Sonde stört, die an den festen Träger gebunden ist. Die Bindungs-Gruppe kann beispielsweise gebildet sein aus einer homopolymeren Nucleinsäure, die leicht an die Bindungs-Gruppe über automatisierte Synthese addiert werden kann. Alternativ können Polymere wie beispielsweise funktionalisiertes Polyethylenglycol als Bindungsgruppe verwendet werden. Solche Polymere sind derzeit gegenüber homopolymeren Nucleinsäuren bevorzugt, da sie nicht signifikant die Hybridisierung der Sonde mit der Ziel-Nucleinsäure stören. Polyethylenglycol ist besonders bevorzugt, da es im Handel erhältlich ist, sowohl in organischen als auch in wäßrigen Medien löslich ist, leicht zu funktionalisieren ist und vollständig stabil unter Nucleinsäure-Synthese-Bedingungen und Nach-Synthese-Bedingungen ist.
  • Die Bindungen zwischen dem festen Träger, der Bindungs-Gruppe und der Sonde werden vorzugsweise nicht während der Synthese oder Entfernung basischer Schutzgruppen unter basischen Bedingungen bei hoher Temperatur gespalten. Diese Bindungen können jedoch gewählt sein aus Gruppen, die unter einer Vielzahl von Bedingungen spaltbar sind. Beispiele derzeit bevorzugter Bindungen schließen Carbamat-Bindungen, Ester-Bindungen und Amid-Bindungen ein.
  • Auf Acrylamid immobilisierte Sonden
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine Spezies innerhalb einer Matrix wie beispielsweise einer Acrylamid-Matrix, und die Spezies trägt eine PL oder das Vorhandensein der immobilisierten Spezies wird gesichert unter Verwendung einer Sonde, die eine PL trägt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Immobilisierung bewirkt in Verbindung mit dem „Acrydite"-Prozess, der erfunden und auf den Markt gebracht wurde von der Firma Mosaic Technologies („Cambridge, MA; siehe „Rehman et al., Nucleic Acids Research, 27, 649–655 (1999)"). Die Acrydite-Methode ermöglicht die Immobilisierung von Alken-markierten Aufnahme-Sonden innerhalb eines polymerisierten Polyacrylamid-Netzwerks. Wenn Ziel-Mischungen unter Elektrophorese-Bedingungen über die immobilisierte Sonden-Bande hinaus laufengelassen werden, wird die Ziel-Nucleinsäure im wesentlichen quantitativ eingefangen. Jedoch erfordert der Nachweis dieses Ereignisses derzeit eine zweite Sonde. In einer Ausführungsform werden Sonden, die eine PL und/oder ein Fluorophor tragen, in einer Acrylamid-Matrix immobilisiert und anschließend mit der Ziel-Mischung in Kontakt gebracht. Bei Verwendung von Fluoreszenz-Sonden als Auffang-Sonden können Signale von den Ziel-Mischungen direkt in Realzeit nachgewiesen werden.
  • Mikro-Anordnungen
  • Die Erfindung stellt auch Mikro-Anordnungen bereit, die immobilisierte PLs und mit PLs funktionalisierte Verbindungen bereitstellen. Darüber hinaus stellt die Erfindung Verfahrensweisen zum Abfragen von Mikro-Anordnungen unter Verwendung von Sonden bereit, die mit PLs funktionalisiert sind. Die immobilisierte Spezies und die Sonden sind gewählt aus im wesentlichen jedem beliebigen Typ von Molekül, der einschließt, jedoch nicht beschränkt ist auf kleine Moleküle, Peptide, Enzyme, Nucleinsäuren und dergleichen.
  • Nucleinsäure-Mikro-Arrays bzw. -Mikro-Anordnungen, die aus einer Vielzahl von immobilisierten Nucleinsäuren bestehen, sind revolutionäre Werkzeuge für die Erzeugung von Genom-Informationen, siehe "Debouck et al., in der Ergänzung zu: Nature Genetics, 21, 48–50 (1999)". Die Diskussion, die hiernach folgt, fokussiert sich auf die Verwendung von PLs in Verbindung mit Nucleinsäure-Mikro-Arrays. Es ist beabsichtigt, daß diese Fokussierung veranschaulichend ist und nicht den Umfang von Materialien beschränkt, mit denen dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung praktisch durchgeführt werden kann.
  • So werden in einer anderen bevorzugten Ausführungsform die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Mikro-Array-Format verwendet. Die PLs oder Spezies, die PLs tragen, können selbst Komponenten eines Mikro-Arrays sein oder sie können alternativ dazu als Werkzeug zum Screening von Komponenten des Mikro-Arrays verwendet werden.
  • So liefert in einer bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening eines Mikro-Array. Das Verfahren schließt das In-Kontakt-Bringen der Verbindungen des Mikro-Arrays mit einer PL-tragenden Sonde und das Abfragen des Mikro-Arrays auf Bereiche von Fluoreszenz ein. Die Fluoreszenz-Bereiche sind ein Hinweis auf das Vorhandensein einer Wechselwirkung zwischen der PL-tragenden Sonde und einer Mikro-Array-Komponente. In einer weiteren Version dieses Verfahrens wird das Mikro-Array auf Bereiche abgefragt, in denen Fluoreszenz gequencht wird, was wiederum das Vorhandensein einer Wechselwirkung zwischen der eine PL-tragenden Sonde und einer Komponente des Mikro-Array zeigt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Array immobilisierte, PL-tragende FET-Sonden als die abfragenden Spezies. In dieser Ausführungsform schaltet sich die Sonde an, wenn sie mit ihrem Ziel-Molekül hybridisiert wird. Solche Arrays werden leicht hergestellt und gelesen und können so angelegt werden, daß sie quantitative Ergebnisse bringen. PL-tragende Sonden umfassende Arrays sind wertvolle Werkzeuge für die Expressionsanalyse und das Genom-Screening im klinischen Bereich.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die immobilisierte, PL-tragende Sonde keine FET-Sonde. Ein auf einem derartigen Format basierendes Mikro-Array kann verwendet werden, um Tests auf das Vorhandensein von Wechselwirkungen zwischen einer zu analysierenden Substanz und der immobilisierten Sonde beispielsweise dadurch durchzuführen, daß man das Quenchen einer Fluoreszenz der zu analysierenden Substanz bei Wechselwirkung zwischen der Sonde und einer zu analysierenden Substanz beobachtet.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Mikro-Arrays n Sonden, die identische oder verschiedene Nucleinsäure-Sequenzen umfassen. Alternativ dazu kann das Mikro-Array eine Mischung aus n Sonden umfassen, die Gruppen von identischen und verschiedenen Nucleinsäure-Sequenzen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist n eine Zahl von 2 bis 100, noch mehr bevorzugt von 10 bis 1.000 und noch weiter bevorzugt von 100 bis 10.000. In einer noch weiter bevorzugten Ausfüh rungsform werden die n Sonden mustermäßig auf einem Substrat als n unterscheidbare Orte in einer Weise aufgebracht, die es ermöglicht, die Identität jedes der n Orte abzusichern.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Mikro-Arrays von n PL-tragenden Sonden. Das Verfahren schließt das Binden von PL-tragenden Sonden an ausgewählte Bereiche eines Substrats ein. Eine Vielzahl von Verfahrensweisen ist derzeit verfügbar, um Arrays von biologischen Makromolekülen herzustellen, wie beispielsweise Arrays von Nucleinsäure-Molekülen. Die folgende Diskussion konzentriert sich auf die Anordnung eines Mikro-Arrays von PL-tragenden Sonden; diese Fokussierung erfolgt jedoch aus Gründen der Kürze, und es ist beabsichtig, daß diese veranschaulichend und nicht beschränkend ist.
  • Ein Verfahren zur Herstellung geordneter Arrays von PL-tragenden Sonden auf einem Substrat ist ein „Dot-Blot"-Ansatz. Bei diesem Verfahren überträgt ein Vakuum-Verteiler eine Mehrzahl von z.B. 96 wässrigen Proben aus Sonden von Vertiefungen (wells) mit einem Durchmesser von 3 Millimeter auf ein Substrat. Die Sonde wird auf der porösen Membran dadurch immobilisiert, daß man die Membran erhitzt oder sie UV-Strahlung aussetzt. Eine übliche Variante dieser Verfahrensweise ist ein „Slot Blot"-Verfahren, in dem die Vertiefungen stark längliche ovale Form aufweisen.
  • Eine weitere Verfahrensweise, die zur Herstellung geordneter Arrays von Sonden verwendet wird, macht Gebrauch von einem Array von Stäbchen, die in die Vertiefungen (wells) eingetaucht sind, z.B. in die 96 Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte, und zwar zum Übertragen eines Arrays von Proben auf ein Substrat wie beispielsweise auf eine poröse Membran. Ein Array schließt Stäbchen ein, die so vorgesehen sind, daß sie eine Membran in versetzter Weise tüpfeln und so eine Anordnung von 9.216 Tüpfelchen in einem Bereich von 22 × 22 cm schaffen. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Lehrach et al., HYBRIDIZATION FINGERPRINTING IN GENOME MAPPING AND SE QUENCING, GENOME ANALYSIS, Band 1, Davies et al. (Hrgs.), Cold Spring Harbor Press, Seiten 39–81 (1990)".
  • Eine alternative Verfahrensweise zur Schaffung geordneter Arrays von Sonden ist analog zu der Verfahrensweise, die beschrieben wurde von Pirrung et al. (US-Patent Nr. 5,143,854; erteilt 1992) und auch von Fodor et al. (Science, 251, 767 – 773 (1991)). Dieses Verfahren schließt das Synthetisieren verschiedener Sonden in verschiedenen gesonderten Bereichen eines Teilchens oder eines anderen Substrats ein. Dieses Verfahren wird vorzugsweise angewendet mit relativ kurzen Sonden-Molekülen, z.B. weniger als 20 Basen. Ein verwandtes Verfahren wurde beschrieben von Southern et al. (Genomics, 13, 1008–1017 (1992)).
  • Khrapko et al., DNA Sequence, 1, 375–388 (1991) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäure-Matrix durch Tüpfeln von DNS auf eine dünne Schicht aus Polyacrylamid. Das Tüpfeln erfolgt manuell mit einer Mikropipette.
  • Das Substrat kann auch mit einem Muster versehen werden, indem man Verfahrensweisen wie beispielsweise die Photolithographie („Kleinfield et al., J. Neurosci., 8, 4098–4120 (1998)"), Photoätzen, chemisches Ätzen und Mikrokontakt-Drucken („Kumar et al., Langmuir, 10, 1498 – 1511 (1994)") anwendet. Andere Verfahrensweisen zum Ausbilden von Mustern auf einem Substrat sind Fachleuten mit technischem Sachverstand in diesem Bereich völlig offensichtlich.
  • Die Größe und Komplexität des Musters auf dem Substrat ist nur durch das Auflösungsvermögen der angewendeten Verfahrensweise und den Zweck, für den das Muster beabsichtigterweise erzeugt wird, beschränkt. Beispielsweise werden bei Anwendung der Verfahrensweise des Mikrokontakt-Druckens Merkmale mit einer geringen Größe wie beispielsweise 200 nm schichtmäßig auf das Substrat aufgebracht. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Xia Y., J. Am. Chem. Soc., 117, 3274–3275 (1995)". In ähnlicher Weise werden bei Anwendung der Photolithographie Muster mit Merkmalen einer geringen Größe wie beispielsweise 1 μm erzeugt. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Hickman et al., J. Vac. Sci. Technol., 12, 607–616 (1994)". Muster, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen solche ein, die Merkmale wie beispielsweise Vertiefungen, Einschlüsse, Abtrennungen, Einschnitte, Einläße, Ausläße, Kanäle, Tröge, Beugungsgitter und dergleichen einschließen.
  • In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform wird die Erstellung des Musters dafür angewendet, um ein Substrat mit einer Mehrzahl von benachbarten Vertiefungen, Einschnitten oder Löchern zum Enthalten der Sonden zu erzeugen. Im allgemeinen ist jedes dieser Substrat-Merkmale von den anderen Vertiefungen mittels einer erhobenen Wandung oder Abtrennung isoliert, und die Vertiefungen stehen nicht fließmäßig in Verbindung. So bleibt ein Teilchen oder eine andere Substanz, die in einer besonderen Vertiefung angeordnet wird, im wesentlichen auf die Vertiefung beschränkt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erlaubt der Musteraufbau die Schaffung von Kanälen durch die Vorrichtung, wodurch eine zu analysierende Substanz oder eine andere Substanz in die Vorrichtung eintreten und/oder aus dieser austreten kann.
  • In einer anderen Ausführungsform sind die Sonden dadurch immobilisiert, daß man sie direkt auf ein Substrat „druckt", oder es kann alternativ dazu eine „Lift Off"-Technik (Abhebe-Technik) angewendet werden. Bei der Lift-Off-Technik wird ein mustermäßiges Resist auf das Substrat aufgelegt, eine organische Schicht wird in den Bereichen abgelegt, die nicht von dem Resist bedeckt sind, und das Resist wird anschließend entfernt. Resists, die zur Verwendung mit den Substraten der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschrift „Kleinfield et al., J. Neurosci., 8, 4098–4120 (1998)". Im Anschluß an das Entfernen des Photoresists kann eine zweite CAP, die eine von der ersten Sonde verschiedene Struktur aufweist, an das Substrat in den Bereichen gebunden werden, die anfänglich von dem Resist bedeckt waren. Unter Verwendung dieser Verfahrensweise können Substrate mit Mustern von Sonden mit unterschiedlichen charakteristischen Eigenschaften erzeugt werden. Ähnliche Substrat-Konfigurationen sind durch Mikro-Printen einer Schicht mit den gewünschten charakte ristischen Eigenschaften direkt auf das Substrat zugänglich. Verwiesen wird auf die Druckschrift „Mrkish et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 25, 55–78 (1996)".
  • Spacer-Gruppen
  • Der Begriff „Spacer-Gruppe", wie er in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf Komponenten der PL-tragenden Sonden. Die Spacer-Gruppe verknüpft Donor- und/oder Akzeptor-Einheiten und andere Gruppen mit der Nucleinsäure, dem Peptid oder einer anderen polymeren Komponente der Sonde. Die Spacer-Gruppen können hydrophil sein (z.B. Tetraethylenglycol, Hexaethylenglycol, Polyethylenglycol), oder sie können hydrophob sein (z.B. Hexan, Decan usw.).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das immobilisierte Konstrukt einen Spacer zwischen der reaktiven Gruppe des festen Trägers und dem PL-Analog ein. Die Verknüpfungs-Gruppe ist vorzugsweise gewählt aus C6- bis C30-Alkyl-Gruppen, substitutierten C6- bis C30-Alkyl-Gruppen, Polyolen, Polyethern (z.B. Polyethylenglycol), Polyaminen, Polyaminosäuren, Polysacchariden und Kombinationen daraus.
  • In bestimmten Ausführungsformen ist es vorteilhaft, eine Einheit der Sonde an die polymere Komponente über eine Gruppe gebunden zu haben, die Flexibilität und Abstand von der polymeren Komponente liefert. Unter Verwendung derartiger Spacer-Gruppen werden die Eigenschaften der Einheit, die der polymeren Komponente benachbart ist, moduliert. Eigenschaften, die nützlicherweise gesteuert werden, schließen beispielsweise ein: Hydrophobizität, Hydrophilizität, Oberflächen-Aktivität, die Entfernung des Donors und/oder der PL-Einheit von der Nucleinsäure und die Entfernung des Donors von der PL.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform dient der Spacer dazu, eine Entfernung der PL von einer Nucleinsäure zu schaffen. Spacer mit dieser charakteristischen Eigenschaft haben einige Anwendungen. Beispielsweise kann eine PL, die zu eng an der Nucleinsäure gehalten wird, nicht mit der Donor-Gruppe in Wechselwirkung treten, oder sie kann nur mit einem zu geringen Wert der Affinität in Wechselwirkung treten. Wenn eine PL selbst sterisch anspruchsvoll ist, kann die Wechselwirkung, die zu einem Quenchen führt, in unerwünschter Weise geschwächt werden, oder sie kann überhaupt nicht auftreten, und zwar aufgrund einer sterisch induzierten Behinderung der Annäherung der beiden Komponenten zueinander.
  • Wenn das die PL umfassende Konstrukt durch Bindung beispielsweise an einen festen Träger immobilisiert wird, kann das Konstrukt auch eine Spacer-Einheit zwischen der reaktiven Gruppe des festen Trägers und dem PL-Analog oder einer anderen Sonden-Komponente einschließen, die an den festen Träger gebunden ist.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine Spacer-Gruppe, die in den Sonden gemäß der Erfindung verwendet wird, mit einer Gruppe versehen, die abgespalten werden kann, um eine gebundene Einheit von der polymeren Komponente freizusetzen, wie beispielsweise eine PL, ein Fluorophor, ein Klein-Rillen-Bindemittel, eine interkalierende Einheit und dergleichen.
  • Viele abspaltbare Gruppen sind in diesem technischen Bereich bekannt. Bezug genommen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Jung et al., Biochem. Biophys. Acta, 761, 152–162 (1983)"; „Joshi et al., J. Biol. Chem., 265, 14518–14525 (1990)"; „Zarling et al., J. Immunol., 124, 913–920 (1980)"; „Bouizar et al., Eur. J. Biochem., 155, 141–147 (1986)"; „Park et al., J. Biol. Chem., 261, 205–210 (1986)"; „Browning et al., J. Immunol., 143, 1859–1867 (1989)". Darüber hinaus ist ein großer Bereich abspaltbarer, bifunktioneller (sowohl homobifunktioneller als auch heterobifunktioneller) Spacer-Arme im Handel erhältlich von Lieferanten-Firmen wie beispielsweise von der Firma Pierce.
  • Eine beispielhafte Ausführungsform, die von Spacer-Gruppen Gebrauch macht, ist in den oben angegebenen Formeln VII und VIII gezeigt. In diesen Formeln ist Rb entweder stabil, oder die Gruppe kann durch chemische oder photochemische Reaktionen abgespalten werden. Beispielsweise können Rb-Gruppen, die Ester- oder Disulfid-Bindungen umfassen, durch Hydrolyse bzw. Reduktion abgespalten werden. Auch im Bereich des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Rb-Gruppen, die durch Licht abgespalten werden, wie beispielsweise Nitrobenzyl-Derivate, Phenacyl-Gruppen, Benzoin-Ester usw.. Andere derartige abspaltbare Gruppen sich Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt.
  • Kits
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Kits bereit, die eine oder mehrere der PLs oder der PL-tragenden Zusammensetzungen gemäß der Erfindung enthalten. In einer Ausführungsform schließt ein Kit ein reaktives PL-Derivat und Anleitungen zum Binden dieses Derivats an ein anderes Molekül ein. In einer anderen Ausführungsform schließt das Kit eine PL-markierte Nucleinsäure, die gegebenenfalls auch mit einem zweiten Fluorophor oder Quencher markiert ist, und Anweisungen zur Verwendung dieser Nucleinsäure in einem oder mehreren Assay-Format(en) ein. Andere Formate für Kits sind Fachleuten in diesem technischen Bereich offensichtlich und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Die Erfindung liefert Kits zur praktischen Durchführung der oben beschriebenen Verfahren. Die Kits können irgendwelche der oben beschriebenen Zusammensetzungen einschließen und schließen gegebenenfalls weiter zusätzliche Komponenten wie beispielsweise Anweisungen zur praktischen Durchführung der Verfahren, einen oder mehrere Behälter oder Kompartimente (z.B. zum Halten der Assay-Komponenten, Nucleinsäuren, Antikörper, Inhibitoren oder dergleichen), eine Roboter-Armatur zum Mischen von Kit-Komponenten oder dergleichen ein.
  • Die Erfindung stellt auch integrierte Systeme zur Durchführung der Verfahrensweisen, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen offenbart sind, bereit. Beispielsweise wird bei der Durchführung von Assays in einer Ausführungsform das Liefern individueller Verbindungen oder Verbindungs-Komponenten bewirkt mittels einer Roboter-Armatur, die Fluid aus einer Quelle zu einem Bestimmungsort überträgt, eine Steuer-Einrichtung, die die Roboter-Armatur steuert, einen Markierungs-Detektor, eine Datenspeicher-Einheit, die den Markierungs-Nachweis aufzeichnet, und eine Assay-Komponente wie beispielsweise eine Mikrotiter-Platte, die eine Vertiefung umfaßt. Wenn eine markierte Verbindung verwendet wird, wird sie mittels der Markierungs-Nachweis-Einheit nachgewiesen.
  • Eine Zahl von Roboter-Fluid-Übertragungs-Systemen ist erhältlich oder kann einfach aus bestehenden Komponenten hergestellt werden. Beispielsweise kann eine automatisierte Roboter-Einheit mit der Bezeichnung Zymate XP (Firma Zymark Corporation, Hopkinton, MA) unter Verwendung einer Mikrolab 2200-Pipettier-Station (Firma Hamilton, Reno, NV) zum Übertragen von parallelen Proben in mit 96 Vertiefungen versehene Mikrotiter-Platten verwendet werden, um einige parallel ablaufende gleichzeitige Ligations-Reaktionen in Gang zu setzen.
  • Optische Amplifikation
  • Optische Signale sind wichtig zur Übertragung von Information. Jedoch tritt immer dann, wenn ein optisches Signal durch eine optische Faser übermittelt wird, in bestimmtem Umfang eine Abschwächung ein, so daß es nötig ist, das Signal nach einer bestimmten Distanz (typischerweise in der Größenordnung von etwa 50 bis 100 km) zu verstärken bzw. zu amplifizieren. Üblicherweise wird für diesen Zweck eine elektronische Verstärker-Einheit verwendet. In der Verstärker-Station muß das optische Signal dann in ein elektrisches Signal umgewandelt werden, das in einer elektronischen Verstärker-Einheit verstärkt wird, wonach das verstärkte elektrische Signal zurück in ein optisches Signal umgewandelt wird. Dies schließt nicht nur den Nachteil ein, daß eine Verstärker-Station eine ziemlich komplizierte Struktur mit einer recht großen Zahl von Teilen aufweist unter denen Konverter von optischen in elektrische Signale und Konverter von elektrischen in optische Signale sind, sondern dies impliziert auch, daß die Bandbreite und Bit-Rate des Gesamt-Systems durch die elektronischen Komponenten beschränkt ist. Daher wurden jüngst Verstärker mit optischen Fasern entwickelt, d.h. Verstärker, die das optische Signal direkt verstärken und nicht eine Umwandlung in ein elektrisches Signal erfordern. Solche Vorrichtungen sind beispielsweise offenbart in dem US-Patent Nr. 5,982,973, Patentinhaber Yan et al., erteilt am 9. November 1999; US-Patent Nr. 5,928,222, erteilt an Kleinerman, erteilt am 27. Juli 1999, sowie die Druckschriften „Desurvire, Physics Today, Januar 1994, Seiten 20–27" und „Sloof et al., J. Appl. Phys., 83, 497 (1998)."
  • So stellt in einer weiteren Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Substrat für die Übertragung und Verstärkung (Amplifikation) von Licht bereit, wobei das Substrat eine Verbindung gemäß der Erfindung umfaßt. Die Verbindung gemäß der Erfindung kann in das Substrat in jeder beliebigen Art und Weise einbezogen werden, die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) kovalente Bindung, Beschichtung, Dotierung und dergleichen.
  • Das Substrat kann irgendein Material einschließen, das für eine besondere Anwendung nützlich ist, einschließlich (nicht jedoch beschränkt auf) Glas, organische Polymere, anorganische Polymere und Kombinationen daraus.
  • Bereitgestellt wird auch ein Verfahren zur Verstärkung (bzw. Amplifikation) von Licht, das durch das Substrat übertragen wird, das mit einer Verbindung der Erfindung derivatisiert wurde, wie dies oben beschrieben ist. Das Verfahren umfaßt das Übertragen von Licht durch ein Substrat, wodurch das Licht verstärkt wird.
  • Die Substrate und Verfahrensweisen der Erfindung können in Faser-optischen Vorrichtungen, Sensoren (siehe beispielsweise Kopelman et al., US-Patent Nr. 5,627,922; und Pinkel et al., US-Patent Nr. 5,690,894), Faser-optischen „Kühlschränken" und dergleichen verwendet werden.
  • Medizinische Anwendungen
  • Die Verbindungen gemäß der Erfindung können auch verwendet werden, um maligne Tumore über eine photodynamische Therapie (photodynamic therapy; PDT) zu behandeln. Darüber hinaus können die Komplexe gemäß der Erfindung in vivo und in vitro als chelatisierende Mittel verwendet werden für (1) bestimmte paramagnetische Metall-Ionen zur Erreichung von höherem Kontrast bei Magnetresonanz-Bildgebungsverfahren (magnetic resonance imaging; MRI); und (2) radioaktive Metall-Ionen für die Bildgebung bei Tumoren in der Ein-Photonen-Emissions-Tomographie (single photon emission tomography; SPECT) oder der Positions-Emissions-Tomographie (position emission tomography; PET) und/oder bei einer Radioisotop-vermittelten Strahlungstherapie. So können passend radiomarkierte Phtalamid-Chelate nicht-invasiv in der Nuklearmedizin abgebildet werden, wofür man SPECT oder PET verwendet. Verwiesen wird beispielsweise auf Margerum et al., US-Patent Nr. 6,010,681; und Woodburn et al., US-Patent Nr. 6,022,526.
  • Trennungen
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Spezifität der Verbindungen gemäß der Erfindung für besondere Ionen in Lösung ausgenutzt, um diese Ionen von anderen gelösten Substanzen, einschließlich Ionen, abzutrennen, für die eine Verbindung gemäß der Erfindung eine niedrigere Affinität oder Spezifität hat. In einer bevorzugten Ausführungsform werden PLs zum Trennen eines Lantaniden-Ions von einem anderen verwendet. Viele Beispiele von Ionen-selektiven oder Ionen-spezifischen Chelatisierungsmitteln sind im Stand der Technik bekannt. Verwiesen wird beispielsweise auf die Druckschriften „Izatt et al., SYNTHESIS OF MACROCYCLES, Wiley-Interscience, New York, 1987" und „Martell et al., DETERMINATION AND USE OF STABILITY CONSTANTS, 2. Ausgabe, VCH Publishers, New York, 1992".
  • Die Materialien, Verfahrensweisen und Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden weiter durch Beispiele veranschaulicht, die folgen. Diese Beispiele werden angegeben, um die beanspruchte Erfindung zu veranschaulichen, nicht jedoch um sie zu beschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 veranschaulicht die Synthese exemplarischer Liganden gemäß der Erfindung und die Bildung ihrer Metall-Komplexe. Das Synthese-Schema für die Verbindungen von Beispiel 1 ist in 1 dargelegt.
  • Beispiel 2 beschreibt die Röntgenstruktur-Bestimmung der Verbindungen gemäß der Erfindung. Die Molekül-Modelle, basierend auf den Röntgenkristall-Daten sind in 4 und 5 dargelegt.
  • Beispiel 3 beschreibt die spektrophotometrische Titration beispielhafter Verbindungen gemäß der Erfindung.
  • Beispiel 4 beschreibt die Bestimmung der Quantenausbeute von beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung.
  • Beispiel 5 veranschaulicht hochauflösende Lumineszenz-Messungen von beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung.
  • Beispiel 6 veranschaulicht die Synthese des Liganden H22IAM, seiner Analoge und Metall-Chelate. Das Synthese-Schema für die Verbindungen von Beispiel 6 ist in 8 dargelegt.
  • Beispiel 7 veranschaulicht die Synthese von beispielhaften zweifach gecappten Liganden gemäß der Erfindung und ihrer Metall-Chelate.
  • Beispiel 8 beschreibt die Studien der photophysikalischen und Stabilitäts-Eigenschaften von Komplexen mit dem Liganden H22IAM in wässriger Lösung.
  • Beispiel 9 beschreibt Studien der photophysikalischen und Stabilitäts-Eigenschaften von Komplexen mit den Liganden H22IAM und zweifach gecapptem H22IAM in DMSO.
  • Beispiel 10 veranschaulicht die Synthese des Liganden H22IAM-mono-(N-5-aminopentylsuccinamsäure), 18. Dieser Ligand wurde dafür vorgesehen, den Lumineszenz-Lanthanid-Komplex an immunoreaktive Spezies wie beispielsweise Antikörper zu binden. Eine der vier 2-Hydroxyisophthalamid-Gruppen ist mit einem Linker substituiert, der an seinem terminalen Ende eine Carboxyl-Gruppe aufweist. Das Synthese-Schema ist in 9 dargelegt.
  • Beispiel 11 verschaulicht die Synthese des Linganden H22tetra(6-amino-1-hexanamido-)IAM, 23. Dieser Ligand wurde dafür vorgesehen, den Lumineszenz-Lanthanid-Komplex an ein Biomolekül wie beispielsweise eine immunoreatetive Spezies (z.B. Antikörper) zu binden. Die vier 2- Hydroxyisophthalamid-Gruppen sind mit einem Linker substituiert, der an seinem terminalen Ende primäre Amine aufweist. Die Synthese von 23 ist in 10 dargelegt.
  • Beispiel 12 veranschaulicht die Synthese von Verbindungen gemäß der Erfindung, die ein Grundgerüst mit unterschiedlicher Länge aufweisen. Das Synthese-Schema ist in 21 dargelegt.
  • Beispiel 1
  • Beispiel 1 veranschaulicht die Synthese von beispielhaften Liganden gemäß der Erfindung und die Bildung ihrer Metall-Komplexe. Das Synthese-Schema für die Verbindungen von Beispiel 1 ist in 1 dargelegt.
  • 1.1 Materialien und Verfahrensweisen
  • Solange nichts anderes angegeben ist, wurden die Ausgangsmaterialien von kommerziellen Lieferanten erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. Eine Flash-Säulen-Chromatographie wurde durchgeführt unter Verwendung des Materials Silica Gel 40 – 70 mesh der Firma Merck. Mikroanalysen wurden vom Mikroanalytical Services Laboratory des College of Chemistry der University of Kalifornia, Berkeley, durchgeführt. Massenspektren wurden aufgezeichnet im Maß Spectrometry Laboratory des College of Chemistry der University of Kalifornia, Berkeley. 1H- und 13C-NMR-Spektren wurden aufgezeichnet auf einem Gerät der Bezeichnung AMX 300- oder AMX 400-Bruker-Superconducting Fourier Transform Spectrometer oder auf einem Gerät mit der Bezeichnung DRX 500-Bruker Superconducting Digital Spectrometer. Infrarot-Spektren wurden gemessen unter Verwendung eines Geräts mit der Bezeichnung Nicolet magna IR 550 Fourier Transform Spectrometer. Die UV/Vis-Spektren wurden mittels eines Zweistrahl-Perkin-Elmer-Lambda 9 UV-Visible-Spektrophotometers aufgezeichnet.
  • 1.2 Synthese von 2-Methoxyisophthalsäure-bis-(2-mercaptothiazolid) (1)
  • 2-Methoxiisophthalsäure (0,02 Mol), 2-Mercaptothiazolin (0,04 Mol) und 4-Dimethylaminopyridin (20 mg) wurden unter Stickstoff-Atmosphäre in 150 ml CH2Cl2 gelöst. 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (0,04 Mol) wurde der Reaktionsmischung zugesetzt, die allmählich eine gelbe Farbe annahm. Nach dem Rühren für 5 Stunden wurde die reaktionsmischung filtriet, und das Filtrat wurde bis zur Trockene unter Erhalt eines gelben Öls abgedampft. Die Umkristallisation in heißem Ethylacetat ergab einen hellgelben mikrokristallinen Feststoff. Ausbeute: 55 %. IR (Film aus CDCl3) ν 1229, 1684, 2955 cm–1. 1H NMR (300 MHz, CDCl3, 25 °C): δ 3,42 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2), 3,89 (s, 3H, CH3), 4,60 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2), 7,13 (t, J = 7,7 Hz, 1H, ArH), 7,43 (d, J = 7,6 Hz, 2H, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3, 25 °C); δ 29,2, 55,6, 62,9, 123,1, 128,1, 131,9, 154,7, 167,1, 200,8. Analyse: berechnet (gefunden für) C15H14N2O3S4·0,25 H2O: C, 44,70 (44,75); H, 3,63 (3,53); N, 6,95 (6,82).
  • 1.3 Synthese von Me3(TREMIAM)-tris-(2-mercaptothiazolid) (2)
  • Tris-(2-aminoethyl-)amin (TREN) (1,7 mMol), das in 100 ml CH2Cl2 gelöst worden war, wurde tropfenweise der Verbindung 1 (15,1 mMol), die in 600 ml CH2Cl2 gelöst worden war, zugesetzt. Die reaktionsmischung wurde unter Erhalt eines gelben Öls zur Trockene eingedampft. Das Öl wurde mittels Flash-Siliciumoxid-Säulenchromatographie mit 0 bis 4 % MeOH/CH2Cl2 gereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter Erhalt des Produktes in Form eines gelben Schaums abgedampft. Ausbeute: 70 %. IR (Film aus CDCl3) ν 1635, 2939, 3386 cm–1. 1H NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C): δ 2,83 (s, 6H, CH2), 3,42 (br t, 6H, CH2), 3,84 (s, 9H, CH3), 4,63 (br t, 6H, CH2), 7,18 (t, J = 7,7 Hz, 3H, ArH), 7,39 (d, J = 5,7 Hz, 3H, ArH), 7,73 (br t, 3H, NH), 8,01 (d, J = 6,0 Hz, 3H, ArH). 13C NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C); 6 29,2, 38,2, 53,6, 55,7, 63,2, 124,4, 127,1, 129,1, 132,2, 134,1, 155,6, 165,0, 167,3, 201,4. Analyse: berechnet (gefunden für) Ca42H45N7O9S6: C, 51,26 (51,26); H, 4,61 (4,71); N, 9,96 (10,09).
  • 1.4 Synthese von Me3(zweifach gecapptem TRENSAM) (3)
  • Verbindung 2 (7,0 mMol), die in 400 ml CHCl3 gelöst worden war, und TREN (6,9 mMol), das in 400 ml CHCl3 gelöst worden war, wurden unter Verwendung einer Laborpumpe in einen 5 1-Rundkolben gegeben, der mit 2.800 ml CHCl3 gefüllt war und mit einer mechanischen Überkopf-Röhre ausgerüstet war. Die Mischung wurde unter Stickstoffatmosphäre während der Zugabe auf etwa 40 °C erhitzt. Nach 24 h wurde die Reaktionsmischung an einer Siliciumoxid-Säule gereinigt und mit MeOH/CH2Cl2 bei einem Gradienten von 0 bis 10 % eluiert. Das Lösungsmittel wurde unter Erhalt des Produkts in Form eines farblosen Glases verdampft. Ausbeute: 46 %. IR (Film aus CDCl3) ν 1522, 1652, 2939 cm–1. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C): δ 3,45 (s, 24H, CH2), 3,47 (s, 9H, CH3), 7,15 (t, J = 7.7 Hz, 3H, ArH), 7,54 (br t, 6H, NH), 7,80 (d, J = 7,7 Hz, 6H, ArH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C): δ 39,4; 56,2; 62,5; 124,2; 128,2; 133,1; 155,7; 166,1. (+)-FABMS: m/z: 773 [M++H]. Analyse: berechnet (gefunden) für C39H48N8O9·2MeOH: C, 58,84 (58,68); H, 6,74 (6,73); N, 13,39 (13,19).
  • 1.5 Synthese von H3(zweifach gecapptem TRENSAM)·2HBr (4)
  • Die Verbindung 3 (0,3 mMol) wurde in 30 ml trockenem, entgastem CH2Cl2 gelöst. Der gekühlten Lösung wurde unter Stickstoffatmosphäre BBr3 (42,3 mMol) mittels einer Spritze zugesetzt. Nach dem Rühren für ungefähr 36 h wurde die Lösung unter Erhalt eines blaß orangefarbenen Feststoffs zur Trockene eingedampft. Der Feststoff wurde langsam mit MeOH abgeschreckt und zu 100 ml siedendem Wasser zugesetzt. Man ließ die Lösung für 3,5 h sieden und danach abkühlen, wobei ein weißer Feststoff ausfiel. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und in einem Ofen getrocknet. Ausbeute: 80 %. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25 °C): δ 3,67 (s, 24H, CH2), 6,97 (t, J = 7,9 Hz, 3H, ArH), 8,00 (d, J = 7,8 Hz, 6H, ArH), 9,10 (br s, 6H, NH). 13C-NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 °C): δ 36,2; 57,1; 117,6; 118,9; 134,1; 159,6; 169,0. (+)-FABMS: m/z: 731 [M++H]. Analyse: berechnet (gefunden) für C36H44N8O9Br2·3H2O: C, 45,68 (45,81); H, 5,32 (5,47); N, 11,84 (11,66).
  • 1.6 Synthese von [(zweifach gecapptes TRENSAM)2]Br(DMF)H2O)10
  • Verbindung 4 (0,50 mMol) wurden in 5 ml DMSO und in 10 ml Wasser, dem das Lanthanidsalz (0,24 mMol, Ln(NO3)3 oder LnCl3) zugesetzt worden war, gelöst. Die Suspension wurde unter Rückfluß erhitzt, bis der gesamte Feststoff gelöst war (20 min). Danach wurde ein Überschuß Pyridin (0,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 5 h lang unter Rückfluß erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in iPrOH suspendiert, mit Ultraschall behandelt und filtriert. Ausbeute: 80 %. (+)-FABMS: m/z: 1612 [M++2H]. Analyse: berechnet (gefunden) für C75H109N17O29BrEu: C, 46,13 (46,32); H, 5,63 (5,65); N, 12,19 (12,24).
  • 1.7 Synthese von [Tb(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+ (5)
  • Dieselbe Verfahrensweise wurde verwendet, wie sie beschrieben wurde für die Synthese des Eu3+-Komplexes. Ausbeute: 80 %. (+)-FABMS: m/z: 1619 [M++H].
  • 1.8 Ergebnisse
  • Die makrobicyclischen Liganden wurden synthetisiert unter Bedingungen hoher Verdünnung durch Umsetzen des entsprechenden Polymer-(thiazolid-) Zwischenproduktes mit einem Äquivalent Polyamin (Karpishin et al., J. Am. Chem. Soc. 115: 182 (1993)). Dies ergab den geschützten Liganden in Form von farblosen Schäumen, deren Schutzgruppen unter Verwendung von BBr3 entfernt wurde. Bei Bestrahlung bei 254 und 365 nm in einer wässrigen Lösung ist der Ligand hoch-lumineszent und emittiert blaues Licht.
  • Die Synthese des Metall-Komplexes wird durchgeführt durch Suspendieren des Liganden in einer wässrigen Lösung (oder einer DMSO/Wasser-Mischung) und nachfolgende Zugabe des entsprechenden Lanthanidsalzes. Nach dem Erhitzen unter Rückfluß für etwa 30 Minuten wird ein Überschuß an Base zugesetzt (Pyridin oder Triethylamin), und die Reaktion wird für mehrere Stunden fortgesetzt. Die Bildung des Metall-Komplexes kann überwacht werden durch Bestrahlung der wässrigen Reaktionensmischung mit einer UV-Lampe (254 und 365 nm). Bei Bestrahlung emittiert die Reaktionsmischungen des Tb3+-Komplexes hellgrünes Licht, während diejenige des Eu3+-Komplexes rotes Licht emittiert. Beide Farben sind leicht sichtbar mit dem bloßen Auge. Die Lumineszenz sowohl des Eu3+-Komplexes als auch des Tb3+-Komplexes bleibt sehr hell nach der Isolation und dem Trocknen der Verbindungen. Der Austausch der blauen Fluoreszenz des Liganden durch grüne oder rote Lumineszenz, wenn Tb3+ oder Eu3+ der Lösung zugesetzt werden, deutet darauf hin, dass eine wirksame Energieübertragung von dem Liganden zu dem Metall-Ion stattfindet. Da koordinierendes Wasser dafür bekannt ist, sehr wirksam beim Quenchen der angeregten Zustände von Eu3+ (5D0) und Tb3+ (5D4) zu sein, deutet die starke Lumineszenz in einem wässrigen Lösungsmittel darauf hin, dass die Liganden einen guten Schutz gegen die Bindung von Wasser in der ersten Koordinations-Sphäre des Lanthanid-Kations bieten (Bünzli, J.-C. G. Luminescent Probes; Bünzli, J.-C. G. und Choppin, G.R., Hrsg.; Elsevier: Amsterdam, 1989, Seiten 245).
  • Beispiel 2
  • Beispiel 2 beschreibt die Röntgenstruktur-Bestimmung von beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung. Die Molekül-Modelle, basierend auf den Röntgenkristall-Daten sind in 4 und 5 dargelegt.
  • 2.1 Röntgen-Daten-Sammlung, Struktur-Lösungen und Verfeinerung
  • Alle Röntgen-Struktur-Datensätze wurden auf einem Siemens SMART Area Detector Diffraktometer (SMART; Area-Detector-Software Package, Siemens Industrial Automation, Inc.; Madison, 1994) gesammelt. Kristalle wurden auf Quarz-Kapillaren in Paratone-Öl montiert und wurden in einem Stickstoffstrom auf dem Diffraktometer gekühlt. Eine Peak-Integration erfolgte unter Verwendung des Siemens SAINT-Software Pakets (SAINT; SAX Area-Detector Integration Program, Version 4.024; Siemens In dustrial Automation Inc.; Madison, 1994). Bestimmungen der Raumgruppen erfolgten mit der Software XPREP. Die Strukturen wurden gelöst durch direkte Verfahren und wurden verfeinert unter Verwendung des SHELXTL-Software-Pakets (PC Version SHELXTL; Crystal Structure Analysis Determination Package; Siemens Industrial Automation, Inc.; Madison, 1994). Alle Wasserstoff-Atome wurden an den berechneten Positionen fixiert, und ihre thermischen Parameter wurden isotrop verfeinert. Alle Nicht-Wasserstoff-Atome wurden anisotrop verfeinert.
  • 2.2. Ergebnisse
  • Die Synthese der Lanthanid-Komplexe unter Verwendung eines Überschusses an Liganden ermöglichte die Isolation ausschließlich des ML2-Komplexes. Man ließ die Kristalle von [Eu(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+, die für die Röntgenstrahl-Beugung geeignet sind, wachsen durch Diffusion von Aceton in eine feuchte DMF-Lösung des Komplexes. Die Struktur zeigt das Einhüllen von zwei Liganden des zweifach gecappten TRENSAM um die Hemisphäre des Metall-Zentrums (4). Die Liganden nähern sich dem Metall in einer orthogonalen Weise, in einer Stellung von etwa 90 ° zueinander. Das Eu3-Metall-Zentrum weist eine Koordinationszahl von 8 auf, unter Verwendung von zwei der drei Bindungseinheiten von jedem der zwei unterschiedlichen Kryptaten. Die Polyeder-Koordination um Eu3+ kann beschrieben werden als leicht verzerrtes quadratisches Antiprisma, wobei jede Fläche des Antiprismas aus einem der Makrobicyclen besteht (5). Siehe Kepert, D. L., Inorganic Stereochemistry; Springer-Verlag: Berlin, 1982). Der dritte Arm eines jeden Makrobicyclus koordiniert nicht, und zwar in einer Weise, die ähnlich zu derjenigen ist, die in einigen makrobicyclischen Metall-Oxo-Komplexen wie MoO2 [zweifach gecapptes TRENCAM] ersichtlich war. (Albrecht, M.; Franklin, S. J.; Raymond, K. N., Inorg. Chem. 1994, 33, 5785). Die nicht-koordinierenden Isophthalamid-Liganden sind in einer intramolekularen π-π-Stapel-Wechselwirkung mit einem der gebundenen Chelatoren beteiligt, was dazu beitragen kann, das Metall-Zetrum vor der Lösungsmittel-Koordination zu schützen. Dieser nicht-koordinierende Chelat-Komplex kann auch verantwortlich sein für eine der zwei Hauptbanden, die bei niedriger Energie in dem UV/Vis-Spektrum dieses Komple xes erscheinen (2). Das Raummodell zeigt an, dass die Anordnung der zwei Liganden um das Metall-Ion einen sehr wirksamen Schutz gegen die Deaktivierung des angeregten Zustandes des Lanthanid-Metall-Ions durch Lösungsmittel-Moleküle bereitstellt. Die Struktur zeigt auch, dass der Komplex zum Teil aufgrund der starken intramolekularen Wasserstoffbindung stabilisiert wird, die zwischen dem Carboxylamid-Proton und dem entprotonierten 2-Hydroxyl-Sauerstoff eines jeden Isophthalamid-Chelat-Komplexes gebildet wird (Cohen, S. M.; Raymond, K. N., Manuskript in Vorbereitung (1998)).
  • Beispiel 3
  • Beispiel 3 beschreibt die spektrophotometrische Titration von beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung.
  • 3.1 Spektrophotometrische Titrationen
  • Batch-Titrations-Proben wurden in mit Millipore gereinigtem Wasser mit MES-Puffer, 0,1 M KCl, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,78 mit KOH, hergestellt. Die Proben wurden bei 37 °C 15 h lang vor der Messung inkubiert, um sicherzustellen, dass ein thermodynamisches Gleichgewicht erreicht worden war. Die Liganden-Konzentration betrug bei allen Proben 2,32 × 10–5 M, und das EuCl3 wurde von 0 bis 2,2 Äquivalenten titriert. Die Spektren wurden auf einem Doppelstrahl-Perkin-Elmer-Lambda 9 UV-Visible-Spektrophotometer in einer 1,0 cm-Quarz-Suprasil-Zelle aufgezeichnet. Die Proben wurden bei einer konstanten Temperatur von 25,0 ± 0,2 °C unter Verwendung eines Neslab-RTE-111 Wasserbades gehalten. Die Behandlung der Daten erfolgte unter Verwendung des Software-Pakets SPECFIT 2.10.86.1.
  • 3.2 Ergebnisse
  • Eine Batch-Titration von zweifach gecapptem TRENSAM mit Eu3+ wurde durchgeführt, um das Lösungsverhalten und die Stabilität dieser Komplexe zu bewerten. Die Konzentration der Liganden wurde konstant gehalten und zunehmende Mengen an Lanthanid-Ion wurden einer Reihe von Proben zugesetzt. Die experimentellen Spektren dieser Titration sind in 2A gezeigt. Die Spektren zeigen das Auftreten neuer Banden mit zunehmender Metallkonzentration. Aus den experimentellen Spektren ist leicht ersichtlich, dass zwei verschiedene Typen von Metall-Komplexen gebildet werden, nämlich einer mit einer einzelnen Absorptionsbande und einer mit einer doppelten Absorptionsbande. Unter Verwendung des Programmes SPECFIT deckte die Faktorenanalyse 3 absorbierende Spezies auf, die während der Titration zugegen waren (Gampp, H.; Maeder, M.; Meyer, C. J.; Zuberbühler, A. D. Talanta 1986, 33, 943). Das Spektrum der freien Liganden wurde unabhängig davon gemessen, und das berechnete Spektrum der Metall-Spezies (ML und ML2) wurde entworren, wie dies in 2B gezeigt ist. Ein Vergleich der berechneten und beobachteten Spektren des ML2-Komplexes (der unabhängig in Gegenwart des überschüssigen Liganden synthetisiert worden war) bestätigte ferner die Genauigkeit der mathematischen Behandlung der experimentellen Daten (3). Die Stabilitäts-Konstanten von Ln[zweifach gecapptes TRENSAM]n (logβ11 und log β12 von Eu3+ mit zweifach gecapptem TRENSAM) sind 7,8 für den ML-Komplex bzw. 14,4 für den ML2-Komplex. Diese Stabilitäten sind ausreichend für die Verwendung in Fluorimmunoassay-Systemen (Bünzli, J.-C. G., Luminescent Probes; Bünzli J.-C. G. und Choppin, G. R. Hrsg.; Elsevier: Amsterdam, 1989, Seite 219).
  • Beispiel 4
  • Beispiel 4 zeigt die Bestimmung der Quantenausbeute von beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung.
  • 4.1 Quantenausbeute-Bestimmung
  • Die Quantenausbeute von Probenlösungen, die zweifach gecapptes TRENSAM und Tb3+ [zweifach gecapptes TRENSAM]n enthielten, wurde in Wasser (mit Millipore gereinigt) unter Bezugnahme auf Chininsulfat in 0,05 M H2SO4 Brechungsindex: 1,338, absolute Quantenausbeute: 0,54) bestimmt. Siehe Meech, S. R.; Phillips D. C., J. Photo chem, 1983, 23, 193. Die Quantenausbeuten jedes Eu3+ [zweifach gecapptes TRENSAM]n-Komplexes wurden mit den Lösungen aus der spektrophotometrischen Titration (siehe oben) (stöchiometrisches Verhältnis: M : L = 0,5 für den Eu3+ [zweifach gecapptes TRENSAM]2-Komplex und M : L = 1,0 für den Eu3+ [zweifach gecapptes TRENSAM]-Komplex) bestimmt. Die Messungen unter Liganden-Anregungs-Bedingungen wurden durchgeführt an einem Spex-Fluoro-Max-Spektroflurimeter mit einer Anregungsstrahl-zentrierten 0,100 Zentimeter-Quarz-Suprasil-Lumineszenz-Zelle durchgeführt. Die relative Quantenausbeute (Qx/Qr) wurde unter Verwendung der Gleichung 1 berechnet.
  • Gleichung 1
    • Qx/Qr = [Ar(λr)/Ax(λx)]·[I(λr)/I(λx)]·[n2 x/n2 r]·[Dx/Dr]
  • Der Index r bezieht sich auf die Referenz und x bezieht sich auf die Proben. Die übrigen Begriffe in der Gleichung werden wie folgt definiert. A ist die Absorption bei der Anregungs-Wellenlänge, I ist die Intensität des Anregungslichts bei derselben Wellenlänge, n ist der Brechungs-Index und D ist die integrierte Lumineszenz-Intensität. Die gemessenen Proben wurden hergestellt mit Konzentrationen zwischen 1 × 10–3 bis 1 × 10–4 M.
  • Beispiel 5
  • Beispiel 5 veranschaulicht Hochauflösungs-Lumineszenz-Messungen von beispielhaften Verbindungen gemäß der Erfindung.
  • 5.1 Hochauflösungs-Lumineszenz-Messungen
  • Hochauflösungs-Lumineszenz-Spektren wurden an einem früher beschriebenen Instrumenten-Aufbau gemessen (Bünzli, J.-C. G.; Milicic-Tang, A., Inorg. Chim. Acta 1996, 252, 221). Die Proben wurden als feingepulverte Proben (La, Eu, Tb) und als Monokristalle (Eu) gemessen. Bidestilliertes Wasser wurde als wäßriges Medium verwendet; der pH-Wert der Lösungen war etwa 6,5 . Die Lumineszenz-Spektren wurden bezüglich der Instrumenten-Funktion korrigiert, jedoch nicht die Anregungs-Spektren.
  • 5.2 Ergebnisse
  • Der freie Ligand zweifach gecapptes TRENSAM sowie die Eu3+ und Tb3+-Metall-Komplexe, die mit diesem Liganden gebildet sind, sind in Wasser außerordentlich fluoreszent. 6 zeigt die Emissionsspektren in wäßriger Lösung von [Eu (zweifach gecapptes TRENSAM)2]+, [Tb (zweifach gecapptes TRENSAM)2]+, und freies zweifach gecapptes TRENSAM, bei einer Anregung von 320, 338 bzw. 302 nm. Das Emissions-Spektrum des freien Liganden zweifach gecapptes TRENSAM zeigte eine starke breite Fluoreszenz-Bande mit einem Zentrum bei etwa 398 nm, das zu dem blau emittierten Licht führt. Nach Zugabe des Metall-Ions jedoch beinhalten die Spektren der Komplexe nur starke enge Linien, die von den Metall-zentrierten f → f-Übergängen stammen. Darüber hinaus verschwindet die breite Ligand-Fluoreszenz-Bande vollständig nach der Metall-Komplexierung, was auf eine wirksame Umwandlung des UV-Lichts, das durch den Liganden absorbiert wird, in die sichtbare rote (Eu3+) oder grüne (Tb3+)-Lumineszenz der Lanthanid-Ionen hinweist.
  • Hochauflösungs-Festkörper-Messungen wurden durchgeführt an kristallinen Proben des [Eu (zweifach gecapptes TRENSAM)2]+-Komplexes. Die Analyse der 5D0 → 7FJ-Übergänge, angegeben als Kristallfeld-Aufspaltung, zeigt, dass die 7F1-Ebene sich in drei nahezu äquidistante Komponenten aufspaltet, was auf eine geringe Seitensymmetrie hinweist. 7F2 spaltete sich auf in drei Komponenten und 7F4 in fünf bis sechs Komponenten, welche in Kombination mit der sehr geringen Intensität des 5D0 → 7F0 auf eine D2-Seitensymmetrie (Anzahl der erlaubten Übergänge: 0, 3, 3 und 6 für J = 0, 1, 2 und 4) hinweist. Die Lumineszenz-Daten bestätigen daher die Röntgenstrahl-Analyse der Polyeder-Koordination um Eu3+ beschrieben als verzerrtes quadratisches Antiprisma (D4d → D4 → D2). Das Emissions-Spektrum einer 10–4 M wässrigen Lösung gibt im wesentlichen dieselben Merkmale wieder wie das Emissions-Spektrum der festen Probe bei 295 K und das 5D0 ← 7F0-Anregungs-Spektrum zeigt ein einzelnes breites band, das bei 17.243 cm–1 (fwhh = 11,9 cm–1) hat, was auf eine EuIII-Umgebung in Lösung hinweist, ähnlich zu derjenigen im festen Zustand.
  • Die Quantenausbeuten der Eu(zweifach gecapptes TRENSAM)n-Komplexe wurden in Wasser mit 0,1 M KCl, 0,05 MES-Puffer, der auf einen pH-Wert von 5,78 mit KOH eingestellt worden war, bestimmt. Beide Eu(zweifach gecapptes TRENSAM)n-Komplexe haben eine hohe Lumineszenz mit Quantenausbeuten für EuL- und EuL2-Komplexe von ungefähr 1 % bzw. 10 %. Die Quantenausbeute, die in Wasser für Tb(zweifach gecapptes TRENSAM)2 gemessen wurde, betrug wenigstens 36 %. Die Quantenausbeute des freien Liganden in Wasser wurde gemessen und betrug 9 %.
  • Die Quantenausbeuten dieser Komplexe sind viel höher als diejenigen, die für Polypyridin-Komplexe gefunden wurden, die in kürzlich entwickelten Einschritt-Luminenszenz-Assay-Systemen verwendet wurden, in denen die Quantenausbeute in Wasser 2 % betrug (Mathis, G. Clin. Chem. 1993, 39, 1953; Mathis, G. Clin. Chem. 1995, 41, 1391). Darüber hinaus is zweifach gecapptes TRENSAM ungewöhnlich insofern, als es hoch lumineszente Komplexe mit sowohl Tb3+ als auch Eu3+ bildet. In den meisten Ligand-Systemen, die untersucht worden waren, wurde eine starke Lumineszenz nur entweder mit Tb3+ oder Eu3+ aber nicht mit beiden beobachtet. Die Ursache, warum diese Liganden derartige Lumineszenz-Komplexe mit beiden Metall-Ionen ergeben, wird weitere spektroskopische Messungen erfordern. Diese Experimente werden die allgemeine elektronische Struktur des Komplexes und insbesondere die Positionen der Donor-Energie-Ebenen des Liganden und der Akzeptor-Metall-Orbitale bestimmen (Petoud, S.; Bünzli, J.-C. G.; Schenk, K. J.; Piguet, C. Inorg. Chem. 1997, 36, 1345).
  • Beispiel 6
  • Beispiel 6 veranschaulicht die Synthese des Liganden H22IAM, seiner Analoge und Metall-Chelate. Das Synthese-Schema für die Verbindungen von Beispiel 6 ist in 8 dargelegt.
  • 6.1 Synthese von Tetrakis-(thiazolin-)Me4H22IAM, 7
  • Tetrakis-(2-aminoethyl-)ethylendiamin (H22) (2,8 mMol) wurde in 150 ml CH2Cl2 gelöst und tropfenweise der Verbindung 1 (82,9 mMol), die in 600 ml CH2Cl2 gelöst worden war, zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde unter Erhalt eines gelben Öls zur Trockene eingedampft. Das Öl wurde mittels Flash-Silica-Gel-Säulenchromatographie (Gradient: 0 bis 15 % MeOH in CH2Cl2) gereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter Erhalt des Produktes 7 in Form eines gelben Schaums verdampft. Ausbeute: 83,8 %. IR (Film aus CH2Cl2) ν 1522, 1653, 2942 cm–1. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 2,67 (s, 4H, CH2), 2,71 (t, J = 6,2 Hz, 8H, CH2), 3,39 (br t, 8H, CH2), 3,48 (s, J = 5,8 Hz, 8H, CH2), 3,76 (s, 12H, OCH3), 4,59 (t, J = 7,2 Hz, 8H, CH2), 7,14 (t, J = 7,7 Hz, 4H, ArH), 7,35 (d, J = 5,8 Hz, 4H, ArH), 7,79 (br t, 4H, NH), 7,97 (d, J = 6,0 Hz, 4H, ArH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 29,1; 37,9; 50,6; 53,5; 55,7; 63,1; 124,3; 127,2; 129,1; 132,0; 133,9; 155,6; 164,9; 167,3; 201,4. Berechnet (gefunden) für C58H64N10O12S8·2CH2Cl2: C, 47,43 (47,45); H, 4,51 (4,52); N, 9,22 (9,54).
  • 6.2 Synthese von Me4H22IAM, 8
  • 7 (1,1 mMol) wurde in 10 ml CH2Cl2 gelöst. Dieser Lösung wurden 1,5 ml wässriges Methylamin (40 Gewichtsprozent) zugesetzt und anschließend wurde die zweiphasige Mischung heftig geschüttelt. Innerhalb von 30 s verschwand die gesamte gelbe Farbe. Die Mischung wurde zur Trockene eingedampft und der verbleibende Rückstand wurde mittels Flash-Silica-Gel-Säulenchromatographie (Gradient: 0 bis 15% MeOH in CH2Cl2) gereinigt. Die Entfernung des Lösungsmittels und die Trocknung im Ofen ergab 8 in Form eines weißen Schaums. Ausbeute: 84,1 %. IR (Film aus CDCl3) ν 1539, 1652, 3296 cm–1. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 2,74 (br m, 12H, CH2), 2,87 (d, J = 4.5 Hz, 12H, NCH3), 3,40 (br d, 8H, CH2), 3,70 (s, 12H, OCH3), 7,02 (t, J = 7,5 Hz, 4H, ArH), 7,50 (br d, 4H, NH), 7,62 (d, J = 7,5 Hz, 4H, ArH), 7,72 (d, J = 8,0 Hz, 4H, ArH), 7,83 (br t, 4H, NH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 26,7; 37,7; 51,7; 53,3; 63,1; 124,5; 127,4; 128,7; 133,1; 133,5; 155,6; 165,5; 166,2. Berechnet (gefunden) für C50H64N10O12·2H2O: C, 58,13 (58,30); H, 6,63 (6,59); N, 13,56 (13,75).
  • 6.3 Synthese von H4H22IAM·2HBr, 9
  • 8 (0,9 mMol) wurde in 40 ml trockenem entgastem CH2Cl2 gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt, und BBr3 (48,0 mMol) wurde unter Stickstoffatmosphäre mittels einer Spritze zugesetzt. Die blaß-gelbe Aufschlämmung wurde 48 h lang gerührt, wonach die Lösung mit MeOH langsam gequencht wurde. Die Mischung wurde mit Wasser (Gesamtvolumen: 100 ml) verdünnt und unter Sieden erhitzt, bis die gesamte gelbe Farbe verschwunden war. Die resultierende farblose Lösung wurde unter Sieden auf ein Volumen von 50 ml erhitzt und danach abgekühlt unter Erhalt eines weißes Feststoffes. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt und im Ofen getrocknet. Ausbeute: 74 %. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 °C) δ 2,81 (d, J = 4,5 Hz, 12H, NCH3), 3,48 (br s, 8H, CH2), 3,76 (br s, 12H, CH2), 6,92 (t, J = 7,5 Hz, 4H, ArH), 7,97 (d, J = 7,6 Hz, 4H, ArH), 8,02 (d, J = 7,6 Hz, 4H, ArH), 8,87 (br s, 4H, NH), 8,97 (br s, 4H, NH), 10,09 (br s, 4H, OH). 13C-NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 °C) δ 26,5; 35,0; 52,9; 116,6; 118,5; 119,8; 132,0; 134,6; 160,2; 166,9; 169,4. Berechnet (gefunden) für C46H58N10O12Br2·5H2O: C, 46,32 (46,34); H, 5,75 (5,70); N, 11,74 (11,66). (+)-FABMS: m/z: 941 [M++H].
  • 6.4 Synthese von [Eu(H22IAM)]+, 10
  • 8 (0,09 mMol) und EuCl2·7H2O (0,09 mMol, 99,999 %) wurden in einer Mischung aus 5 ml H2O und 1,5 ml MeOH suspendiert und erhitzt. Bei Rückfluß-Temperatur ist die Lösung klar und 1,4 ml Pyridin wurden zugesetzt. Ein weißer Feststoff begann auszufällen. Die Reaktionsmischung ist rot, wenn sie mit UV-Licht bei 354 nm bestrahlt wird. Nach 20 h Reaktionszeit, wurde das Lösungsmittel reduziert und die Mischung wurde auf 4 °C abgekühlt. Nach der Filtration des weißen Feststoffes und Trocknen in einem Vakuum-Ofen wurden 95 mg des Produktes gewonnen. Ausbeute: 81,7 %. Berechnet (gefunden) für EuC46H54N10O12·1Br·4H2O: C, 44,45 (44,67); H, 5,03 (5,01); N, 11,27 (11,09).
  • 6.5 Synthese von [Tb(H22IAM)]+, 11
  • 8 (0,18mMol) und Tb(NO3)3·6H2O (0,18 mMol, 99,999 %) wurden in einer Mischung aus 11,0 ml H2O und 2,5 ml MeOH suspendiert. Die Verfahrensweise war ähnlich zu derjenigen, wie sie für die Synthese von [(H22IAM)]+ beschrieben wurde. Berechnet (gefunden) für TbC46H52N10O12·1Br·5H2O: C, 43,66 (43,70); H, 4,94 (4,97); N, 11,08 (11,20).
  • 6.6 Synthese von [La(H22IAM)]+, 12
  • 8 (0,05 mMol) und LaCl2·H2O (0,05 mMol, 99,999 %) wurden in einer Mischung aus 2,5 ml H2O und 1 ml MeOH suspendiert. Die Verfahrensweise war ähnlich zu derjenigen, wie sie für die Synthese von [Eu(H22IAM)]+ beschrieben wurde. 46 mg eines weißen Produktes wurden nach der Isolierung und dem Trocknen gewonnen. Ausbeute: 74,8 %. Berechnet (gefunden) für LaC46H54N10O12·1Br·4H2O: C, 44,92 (44,91); H, 5,08 (5,09); N, 11,39 (11,15).
  • Beispiel 7
  • Beispiel 7 veranschaulicht die Synthese von beispielhaften zweifach gecappten Liganden gemäß der Erfindung und ihre Metall-Chelate.
  • 7.1 Synthese von Me4-zweifach gecapptes H22IAM, 13
  • 7 (2,3 mMol), das in 400 ml CHCl3 gelöst worden war, und H22-Amin (2,2 mMol), das in 400 ml CHCl3 gelöst worden war, wurden unter Verwendung einer Laborpumpe einem 5 1-Rundkolben zugesetzt, der mit 2400 ml CHCl3 gefüllt war und mit einem mechanischen Overhead-Rührer und einem klein Rückfluß-Kühler ausgestattet war. Die Reaktionsmischung wurde auf ungefähr 55 °C erhitzt und unter Stickstoff-Atmosphäre gehalten. Nach etwa 31 h wurde die Mischung zur Trockene eingedampft und der verbleibende Rückstand wurde durch Flash-Silica-Gel-Säulenchromatographie (Gradient: 0 bis 20 % MeOH in CHCl3) gereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter Erhalt des Produktes in Form eines blaß-bernsteinfarbenen Schaums erhalten. Diese Verbindung existiert in zwei Konformations-Isomeren, wie dies durch 1H- und 13C-NMR angezeigt wurde (dies wurde auch für geschütztes, zweifach gecapptes H22TAM gefunden). Es werden nur die Spektren für das Haupt-Isomer angegeben. Ausbeute: 44 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 2,69 (br s, 32H, CH2), 2,80 (s, 8H, CH2), 3,42 (br s, 12H, OCH3), 7,00 (br t, 4H, ArH), 7,53 (br s, 8H, NH), 7,65 (d, J = 7,5 Hz, 8H, ArH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 37,9, 51,2; 53,2; 62,8; 124,4; 128,1; 132,8; 155,4; 165,7. Berechnet (gefunden) für C56H72N12O12·1MeOH·0,5CH2Cl2: C, 58,54 (58,18); H, 6,58 (6,81); N, 14,25 (14,16). (+)-FABMS: m/z: 1106 [M++H], 1144 [M++K].
  • 7.2 Synthese von H4-zweifach gecapptem H22IAM·4HBr, 14
  • 13 (0,74 mMol), wurde in 40 ml trockenem, entgastem CH2Cl2 gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt, und BBr3 (48,0 mMol) wurde unter N2(g) mittels einer Spritze zugesetzt. Die blaß-gelbe Aufschlämmung wurde 24 h lang gerührt, wonach die Lösung langsam mit MeOH abgeschreckt wurde. Die Mischung wurde mit MeOH (Gesamtvolumen: 100 ml) verdünnt und unter Sieden erhitzt, bis die meiste gelbe Farbe verschwunden war. Die resultierende Aufschlämmung wurde unter Sieden auf ein Volumen von 50 ml erhitzt und danach unter Erhalt eines beigen Feststoffs abgekühlt. Das Produkt wurde durch Filtration gewonnen und im Ofen getrocknet. Der Ligand unterliegt in gewissem Umfang einer unbestimmten Konformations-Dynamik bei Raumtemperatur, was das 1H- und das 13C-NMR-Spektrum verbreiterte. Ausbeute: 91 %. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, 90 °C) δ 3,45/3,77 (br s, 40H, CH2), 6,70 (br t, 4H, ArH), 7,85 (br d, 8H, ArH), 8,64 (br s, 8H, NH). 13C-NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 °C) δ 16,8; 37,0 (br); 52,6 (br); 109,4; 118,2; 133,8 (br); 159,9; 167,8 (br). Berechnet (gefunden) für C52H68N12O12Br4·4H2O: C, 43,23 (42,11); H, 5,30 (5,44); N, 11,63 (11,26). (+)-FABMS: m/z: 1050 [M++H].
  • 7.3 Synthese von [Tb(zweifach gecapptes H22IAM)], 15
  • 14 (0,50 mMol) wurden in 5 ml DMSO und 10 ml Wasser, dem Tb(NO3)3·6H2O (0,24 mMol, 99,999 %) zugesetzt worden waren, gelöst. Die Suspension wurde unter Rückfluß (30 min) erhitzt, wonach ein Überschuß an Triethylamin (0,5 ml) zugesetzt wurde. Die Mischung wurde 5 h lang unter Rückfluß erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde verdampft, um das Wasser zu entfernen, und die verbleibende Lösung wurde mit THF unter Ausfällen eines weißen Feststoffes verdünnt. Der Feststoff wurde durch Filtration gewonnen und im Ofen getrocknet. Ausbeute: 80 %. (+)-FABMS: m/z: 1203 [M++H].
  • Beispiel 8
  • In Beispiel 8 sind Studien an den photophysikalischen und den Stabilitäts-Eigenschaften von Komplexen mit dem Ligand H22IAM in wässriger Lösung dargelegt.
  • 8.1 Bedingungen für die wässrigen Messungen bei niedriger Konzentration
  • Um die Hydrolyse des Lanthanids zu vermeiden, ist es wünschenswert, einen Phosphat-Puffer zu verwenden, wenn die Messungen der Lösung des Lanthanid-Komplexes unterhalb einer Konzentration von 10–7 M durchgeführt werden. Die angegebenen Messungen werden gemessen in einer Lösung, die mit einem 0,01 M Kaliumphosphat-Puffer (8,02 ml K2HPO4 + 1,98 ml KH2PO4 verdünnt auf 1000 ml) bei einem pH-Wert von 7,4 (physiologischer pH-Wert) gepuffert ist. Der Phosphat-Puffer wird üblicherweise in der Fluoroimmuno-Assay-Technologie verwendet. Der pH-Bereich dieses Puffers ist kompatibel mit den Meßbedingungen der zeitausgelösten Fluoroimmuno-Assays als auch der Konjugation mit Antikörpern.
  • Die starke blaue Lumineszenz des Liganden H22IAM kann mit dem bloßen Auge bemerkt werden. Das Maximum der Emission befindet sich um 425 nm herum. Die Anregungsspektren der Verbindung zeigen Anregungsbanden bei 240 und 340 nm, wobei die Letztere wirksamer ist für die Anregung des Komplexes. Das Maximum der breiten Absorptionsbande befindet sich bei 340 nm.
  • 13 ist ein normalisiertes Anregungsspektrum -(gepunktete Linie λan = 417 nm) und Emissionsspektrum -(durchgezogene Linie, λex = 350 nm) Spektrum des Liganden H22IAM ~ 10–6 M in mit Millipore gereinigtem Wasser.
  • 14 ist ein UV/Vis-Spektrum von [Tb(H22IAM)]+ 8,2·10–7 M in mit Millipore gereinigtem Wasser, 1,000 cm-Zelle.
  • Es konnte keine signifikante Emissions-Bande, die durch den Liganden hervorgerufen wird, in den Lumineszenz-Spektren der Komplexe [Tb(H22IAM)]+ und [Eu(H22IAM)]+ beobachtet werden. Diese Beobachtung zeigt an, dass eine wirksame Energieübertragung vom Liganden auf das Metall in beiden Komplexen stattfindet, nämlich im Eu3+ und Tb3+-Komplex.
  • 15 ist ein normalisiertes Emissions-Spektrum von [Tb(H22IAM)]+ und [Eub(H22IAM)]+ in mit Millipore gereinigtem Wasser. [Tb(H22IAM)]+ 8,2·10–7 M, λex = 354 nm; [Eu(H22IAM)]+ ~ 10–6 M, λex = 350 nm.
  • 8.2 Quantenausbeuten
  • Tabelle 3 zeigt die absoluten Quantenausbeuten von [Tb(H22IAM)]+ bei einer Konzentration von 8,2·10–7 M in belüftetem, mit Milipore gereinigtem Wasser, gemessen durch Vergleich mit Chininsulfat in H2SO4 in einer Konzentration von 0,05 M (absolute Quantenausbeute: 0,5460). Die Proben und Bezugsproben wurden gemessen bei derselben Absorption und bei derselben Wellenlänge λex. Die Lösungen wurden 48 h vor dem Experiment hergestellt. Die Lösung A wurde vor dem Licht geschützt und die Lösung B wurde Umgebungslicht während einer Dauer von 48 h ausgesetzt.
  • Tabelle 3
    Figure 01250001
  • Der hohe Wert der Quantenausbeute, der mit dem Komplex [Tb(H22IAM)]+ erhalten wurde, zeigt eine hohe Wirksamkeit der Energieübertragung von dem Liganden auf das Tb3+-Kation.
  • 8.3 Lebensdauer
  • Eine vorläufige Messung der Lebensdauer des Tb3+ in einer Lösung mit einer Konzentration von 8,2·10–7 M [Tb(H22IAM)]+ wurde durchgeführt unter Verwendung einer Laser-Anregung und einem schnellen Erfassungssystem. Ein einzelner Wert der Lebensdauer von 2,56 ms wurde erhalten unter Liganden-Anregung (λex = 352 nm; λan = 545 nm). Dieses Ergebnis zeigt, dass das Tb3+-Kation gut durch den Liganden H22IAM gegen eine Wasser-Koordinierung geschützt ist, was die Nicht-Strahlungs-Deaktivierung verhindert.
  • 8.4 Stabilität in Wasser
  • Eine Abschätzung der Stabilität des [Tb(H22IAM)]+-Komplexes kann durch Durchführen eines Verdünnungs-Experiments erhalten werden. Die Lumineszenz eines Moleküls ist größtenteils von seiner Quantenausbeute und seinem Extinktions-Koeffizienten abhängig. Da Lanthanid-Kationen einen extrem niedrigen Extinktions-Koeffizienten haben, muß ein Ligand, der mit dem Lanthanid koordiniert ist, in der Lage sein, als „Antenne" zu agieren. Eine „Antenne" ist ein Molekül, das in der Lage ist, eine hohe Menge UV-Licht zu absorbieren und die resultierende Energie auf das Lanthanid-Kation zu übertragen. Dies impliziert, dass die Lumineszenz des Lanthanid-Kations nur dann beobachtet werden kann, wenn der Komplex noch in Lösung gebildet wird und verwendet werden kann, um die Stabilität des lumineszenten Lanthanid-Komplexes abzuschätzen. Eine Stammlösung von [Tb(H22IAM)]+ in Phophat-Puffer wurde nacheinander verdünnt und die Emissions-Spektren wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in 16 dargelegt, welche Emissions-Spektren des Komplexes [Tb(H22IAM)]+ in 0,01 M Phosphat-Puffer bei verschiedenen Konzentrationen enthält. λex = 347 nm.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass die Luminenszenz der Komplexe in einer 10–15 M Lösung nachgewiesen werden kann, was eine sehr hohe thermodynamische Stabilität dieser Komplexe andeutet. Dieses Verhalten kann nicht das Ergebnis einer kinetischen Trägheit sein, da die Komplexe in Wasser synthetisiert sind.
  • Beispiel 9
  • Beispiel 9 beschreibt Studien der photophysikalischen und Stabilitäs-Eigenschaften von Komplexen mit den Liganden H22IAM und zweifach gecapptes H22IAM in DMSO.
  • 9.1 Quantenausbeuten
  • Um quantitative Werte der Energieübertragung und des Quench-Effekts in Lösungsmittel zu erhalten, wurden die relativen Quantenausbeuten von [Tb(H22IAM)]+ und [Tb(zweifach gecapptes H22IAM)]+ in DMSO bestimmt, unter Verwendung von [Tb(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+ als Referenz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben, welche die relativen Quantenausbeuten von [Tb(H22IAM)]+ 9,98·10–5 M und [Tb(zweifach gecapptes H22IAM)]+ 9,19·10–5 M angibt, bestimmt in DMSO unter Verwendung von [Tb(zweifach getapptes TRENSAM)2]+ 1,071·10–4 als Referenz. Probe und Referenz wurden bei derselben Absorption und bei derselben Wellenlänge λex gemessen mit der Ausnahme, dass bei der mit „a" gekennzeichneten Probe, die Probe bei 378 nm angeregt wurde und die Referenz bei 372 nm.
  • Tabelle 3
    Figure 01270001
  • Der Vergleich der Quantenausbeuten von [Ln(H22IAM)]+ und [Ln(zweifach gecapptes H22IAM)]+ ergab bessere Lumineszenz-Eigenschaften für den stabileren Komplex, der mit [Ln(H22IAM)]+ gebildet wurde. Ein weiteres interessantes Ergebnis wurde erhalten von dem Emissions-Spektrum des [Tb(zweifach gecapptes TRENSAM)2]+-Komplexes. Zusätzlich zu dem typischen Übergang, der von den 5D4-Bereichen des Tb3+ entsteht, kann ein breites Band, das von den Elektronen-Bereichen der Liganden hervorgeht, bei höherer Energie beobachtet werden. Diese Beobachtung zeigt, dass die Energieübertragung Ligand → Ln im Gegensatz zu Wasser nicht ganz wirksam ist, wo keine Emission beobachtet wurde, die von dem Liganden hervorgeht.
  • 9.2 Stabilität in DMSO
  • Um die Stabilität von [Tb(H22IAM)]+ und [Tb(zweifach gecapptes H22IAM)]+ in DMSO zu bestimmen, wurden die Emissions-Spektren dieser Komponenten bei verschiedenen Konzentrationen gemessen.
  • Die Ergebnisse dieser Studien sind in 17 gezeigt, welche normalisierte Emissions-Spektren von [Tb(H22IAM)]+ bei verschiedenen Konzentrationen zeigt. λex = 335 nm (9,98·10–5 M) und λex = 347 nm für alle anderen Konzentrationen. Die Signale, die sich aus dem Tb3+ ergaben, konnten durch eine zeitaufgelöste Messung diskriminiert und verstärkt werden. 18 zeigt die normalisierten Emissions-Spektren von [Tb(zweifach gecapptes H22IAM)+ bei verschiedenen Konzentrationen. λex = 365 nm (9,19·10–5 M) und λex = 351 nm für alle anderen Konzentrationen. Das Signal, das sich aus dem Tb3+ ergab, konnte durch eine zeitaufgelöste Messung diskriminiert und verstärkt werden.
  • Beispiel 10
  • Beispiel 10 veranschaulicht die Synthese des Liganden H22IAM-Mono-(N-5-aminopentylsuccinamsäure), 18. Dieser Ligand wurde dafür vorgesehen, den luminenszenten Lanthanid-Komplex mit einer immonoreaktiven Spezies, wie beispielsweise Antikörper, zu verbinden. Eine der vier 2-Hydroxyisophthalamid-Gruppen wurde mit einem Linker substituiert, der an seinem terminalen Ende eine Carboxyl-Gruppe aufwies. Das Synthese-Schema ist in 9 dargelegt.
  • 10.1 Synthese von 10-Amino-4-oxo-5-aza-decansäure, 16
  • Zu einer Lösung aus 1,5-Pentandiamin (2,5 g, 24 mMol) in trockenem Methanol (20 ml) wurde eine Lösung aus Bernsteinsäure-Anhydrid (2 g, 20 mMol) in trockenem Methylenchlorid (20 ml) während einer Zeit von 2 h tropfenweise zugesetzt. Das Produkt wurde in Form eines weißen Feststoffes ausgefällt und durch Filtration gewonnen. Ausbeute: 80 %. 1H-NMR (500 MHz, D2O, 25 °C) δ 1,280 (quint., J = 7,5, 2H, CH2), 1,449 (quint., J = 7,5, 2H, CH2), 1,577 (quint., J = 7,5, 2H, CH2), 2,337 (s, 4H, CH2), 2,886 (t, J = 7,5, 2H, CH2), 3,072 (t, J = 7,5, 2H, CH2), 13C-NMR (500 MHz, D2O, 25 °C) δ 22,73; 26,22; 27,66; 32,34; 33,13; 38,76; 39,37; 175,72; 180,90.
  • 10.2 Me4H22IAM-mono-(N-S-aminopentyl-)succinamsäure-Derivat, 18
  • Zu einer Lösung aus Me4H22IAM-tetrakis-(thiazolid) (7, 8) (5,5 g, 4 mMol) in CH2Cl2 (500 ml) wurde 16 (0,2 g, 1 mMol) in CH2Cl2 (200 ml) über eine Zeitdauer von 24 h tropfenweise zugesetzt und die Mischung wurde für weitere 24 h gerührt. Danach wurde Methylamin (0,1 ml, 40 %ige wäßrige Lösung) zugesetzt. Die charakteristische gelbe Farbe des Thiazolids verschwand; die Lösung wurde zur Trockene eingedampft und die entsprechenden Fraktionen wurden mittels einer Flash-Silica-Gel-Chromatographiesäule (Gradient: 5 bis 10 % CH3OH in CH2Cl2) unter Erhalt von 0,59 g (51 %) eines reinen Produktes in Form eines weißen Schaums getrennt. (+)-FABMS: m/z: 1154,7 [M+H+]. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 1,246 (br s, 2H, CH2), 1,371 (br s, 2H, CH2), 1,469 (br s, 2H, CH2), 2,263 (br s, 2H, CH2), 2,355 (br s, 2H, CH2), 2,737 (br s, 12H, NCH2), 2,858 (s, 4H, CH2), 3,015 (br s, 2H, CH2), 3,275 (br s, 2H, CH2), 3,439 (s, 8H, NCH2), 3,694 (s, 12H, OCH3), 6,930 (s, 1H, NH), 7,020 (t, J = 7,5, 4H, ArH), 7,5–7,6 (m, 8H, 4NH + 4ArH), 7,722 (d, 4H, J = 7,0, ArH), 7,94–8,0 (m, 4H, NH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25° C), δ 21,50; 23,8; 26,57; 28,63; 30,66; 31,24; 37,19; 38,90; 39,43; 44,91; 50,88; 52,95; 62,99; 63,03; 124,31; 127,34; 127,40; 128,41; 128,45; 128,66; 132,91; 133,39; 155,46; 155,52; 165,62; 166,12; 173,02; 175,10; 176,51.
  • 10.3 H22IAM-mono-(N-5-aminopentyl-succinamsäure-)derivat, 19
  • 18 (0,58 g, 0,5 mMol) wurde in trockenem entgastem CH2Cl2 (20 ml) gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt, und BBr3 (1 ml, 11,4 mMol) wurde mittels einer Spritze unter Stickstoff zugesetzt. Die resultierende blaß-gelbe Aufschlämmung wurde 48 h lang gerührt, wonach das flüchtige Produkt unter Vakuum entfernt wurde und der Rückstand mit Methanol abgeschreckt wurde (30 ml). Die Methanol-Lösung wurde mit Wasser (40 ml) verdünnt und unter Sieden erhitzt, bis eine farblose transparente Lösung erhalten wurde. Das Volumen wurde auf 10 ml reduziert. Die Lösung wurde abgekühlt, und ein weißer Feststoff begann auszufällen. 46 mg des Produktes wurden durch Filtration gewonnen und unter Vakuum getrocknet. Das Filtrat dieser Lösung wurde durch Zentrifugation gewonnen und weitere 213 mg des Feststoffes wurden nach dem Trocknen erhalten. Ausbeute: 40 %. (+)-FABMS: m/z: 1097,7. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 °C) δ 1,24–1,60 (m, 6H, CH2), 2,812 (m, 4H, CH2), 3,476 (br s, 12H, NCH2), 3,702 (br s, 8H, NCH2), 6,923 (t, J = 7,7, 4H, ArH), 7,684 (br s, 1H, NH), 7,95–8,04 (m, 8H, ArH), 8,818 (br s, 4H, NH), 8,943 (br s, 4H, NH). 1H-NMR (500 MHz, D2O, 25 °C) δ 1,297 (quint, J = 7,2, 2H, CH2), 1,444 (quint, J = 7,2, 2H, CH2), 1,579 (quint, J = 7,2, 2H, CH2), 2,664 (s, 4H, CH2), 2,889 (t, J = 7,2, 2H, CH2), 3,099 (t, J = 7,2, 2H, CH2), 3,437 (br s, 8H, NCH2), 3,653 (br s, 12H, NCH2), 6,5–6,7 (m, 4H, ArH), 7,3 – 7,5 (m, 8H, ArH). Berechnet (gefunden) für C54H69N11O15(HBr)2·9H2O: C, 45,16 (45,14); H, 5,49 (6,25); N, 10,46 (10,73).
  • 10.4 Tb[H22IAM-mono-(N-5-aminopentyl-succinamsäure-)derivat], 19
  • 18 (0,042 mMol) und Tb(NO3)3·6H2O (0,042 mMol, 99,999 %) wurden in 30 ml MeOH suspendiert. Die Suspension wurde unter Rückfluß erhitzt und wurde klar. Das Lösungsmittel wurde auf 7 ml reduziert und ein großer Überschuß Pyridin wurde zugesetzt. Ein weißer Feststoff, der eine grüne Farbe bei Bestrahlung mit UV (354 nm) stark emittierte, fiel sofort aus. Die Suspension wurde 15 h lang unter Rückfluß gehalten. Nach dem Abkühlen der Lösung auf 4 °C und Filtration des Produktes wurden 46 mg des Feststoffs nach dem Trocknen in einem Vakuum-Ofen gewonnen. Ausbeute: 63 %. Berechnet (gefunden) für TbC54H68N11O15Br2(NO3)·7H2O: C, 40,09 (39,95); H, 5,11 (4,76); N, 10,39 (10,42).
  • 10.5 Eu[H22IAM-mono-(N-5-aminopentyl-succinamsäure-)derivat], 20
  • 18 (0,014 mMol) wurde in 12 ml H2O, das EuCl3·7H2O (0,014 mMol, 99,999 %) enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde unter Rückfluß erhitzt. Nachdem die Lösung klar war, wurde ein Überschuß Pyridin zugesetzt (30 Tropfen). Ein weißer Niederschlag entstand sofort und wurde erneut gelöst durch Zugabe weiteren Pyridins. Nach Erhitzen unter Rückfluß für weitere 15 h wurde das Lösungsmittel entfernt und der weiße Feststoff wurde in MeOH erneut gelöst. Der Feststoff wurde durch Zugabe von Pyridin erhalten und eine starke rote Emission wurde bei Bestrahlung mit UV (354 nm) beobachtet. 11,4 mg der Verbindung wurden nach Filtration und Trocknen gewonnen. Ausbeute: 53 %. Berechnet (gefunden) für EuC54H68N11O15Br2Cl·5H2O: C, 41,89 (41,55); H, 5,08 (5,07); N, 9,95 (10,24).
  • Beispiel 11
  • Beispiel 11 veranschaulicht die Synthese des Liganden H22tetra(6-amino-1-hexanamido-)IAM, 23. Dieser Ligand wurde dafür vorgesehen, den lumineszenten Lanthanid-Komplex mit einer immunoreaktiven Spezies, wie beispielsweise Antikörpern, zu verbinden. Die vier 2-Hydroxyisophthalamid-Gruppen wurden durch einen Linker substituiert, der an seinem terminalen Ende primäre Amine aufwies. Die Synthese von 23 ist in 10 dargelegt.
  • 11.1 Synthese von 6-(Z-amino-)1-hexylamin, 21
  • Eine Lösung aus 1,6-Hexandiamin (0,050 mMol) in CH2Cl2 (50 ml) wurde mit 1,0 Äquivalent Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Zu dieser halb neutralisierten Amin-Lösung wurde eine Lösung aus Z-Thiazolid in CH2Cl2 (50 ml) langsam während einer Zeitdauer von 8 h unter Rühren zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde mit einer 2 M KOH-Lösung (100 ml) gewaschen und danach zur Trockene eingedampft. Der Rest wurde danach durch Chromatographie (Gradient: 3 bis 15 % CH3OH in CH2Cl2) gereinigt. 6-(Z-amino-)1-hexanamin wurde in Form eines weißen halbfesten Stoffs erhalten. Ausbeute: 52 %. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 1,3193 (br s, 4H, CH2), 1,4255 (br d, 2H, CH2), 1,4875 (br d,), 2,6671 (t, 2H, J = 7,0, 2H, CH2), 3,1765 (q, 2H, J = 6,5, 2H, CH2), 4,8532 (br s, 1H, NH), 5,0827 (s, 2H, OCH2), 7,28 – 7,38 (m, 5H, ArH).
  • 11.2 Me4H22tetra-(6-(Z-amino-)1-hexanamido-)IAM, 22
  • Zu einer Lösung aus Me4H22tetrakis-(thiazolid-)IAM (7, 8) (0,8 mMol) in CH2Cl2 (50 ml) wurde 21 (4 mMol) zugesetzt. Die Mischung wurde gerührt, bis die charakteristische gelbe Farbe des Tetrathiazolids verschwand. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockene eingedampft, und die passenden Fraktionen wurden mittels einer Flash-Silica-Gel-Säule (Gradient: 2 bis 7 % CH3OH in CH2Cl2) gewonnen und wurden zur Trockene unter Erhalt von 0,89 g (59 %) reinen Produkts in Form eines weißen Schaums verdampft. (+)-FABMS: m/Z: 1874,9 [MH+]. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 1,333 (br s, 16H, CH2), 1,465 (br t, 8H, J = 6,5, CH2), 1,556 (br t, 8H, J = 6,5, CH2), 2,688 (s, 4H, CH2), 2,720 (t, 8H, J = 6,0, CH2), 3,132 (q, 8H, J = 6,5, CH2), 3,366 (q, 8H, J = 6,5, CH2), 3,460 (q, 8H, J = 6,0, CH2), 3,765 ( s, 12H, NH), 5,041 (s, 8H, OCH2), 5,096 (s, 8H, NH), 7,073 (t, 4H, J = 7.5, ArH), 7,26 – 7,38 (m, 20H, ArH), 7,517 (t, 4H, J = 5.7, NH), 7,675 (d, 4H, J = 7.5, ArH), 7,812 (d, 4H, J = 7,5, ArH), 7,857 (t, 4H, J = 5,5, NH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) δ 26,22; 26,51; 29,31; 29,78; 37,72; 39,70; 40,78; 51,88; 53,40; 63,17; 66,40; 124,61; 127,34; 127,92; 127,96; 129,03; 133,69; 136,59; 155,53; 156,43; 165,44.
  • 11.3 H22tetra-(6-amino-1-hexanamido-)IAM, 23
  • 22 (0,25 g, 0,13 mMol) wurden in trockenem, entgastem CH2Cl2 (20 ml) gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt, und BBr3 (0,5 ml, 5,7 mMol) wurde mittels einer Spritze unter Stickstoff zugesetzt. Die resultierende blaß-gelbe Aufschlämmung wurde 48 h lang gerührt, wonach die flüchtigen Komponenten unter Vakuum entfernt wurden und der Rückstand mit Methanol (20 ml) abgeschreckt wurde. Die Methanol-Lösung wurde mit Wasser (40 ml) verdünnt und unter Sieden erhitzt, bis eine farblose transparente Lösung nach einer Reduktion des Volumens auf 10 ml erhalten wurde. Die Lösung wurde abgekühlt und die Verbindung erschien in Form eines Gels, das von dem Wasser durch Zentrifugation abgetrennt wurde. Nach dem Trocknen (im Vakuum über Nacht) wurden 234 mg weißer Feststoff gewonnen. (+)-FABMS: m/Z: 1281,7 [MH+]. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), 25 °C) δ 1,310 (br s, 16H, CH2), 1,541 (br s, 16H, CH2), 2,731 (q, 8H, J = 6,0, CH2), 3,277 (q, 8H, J = 6,0, CH2), 3,468 (br s, 12H, CH2), 3,764 (br s, 8H, CH2), 6,922 (t, 4H, J = 7,8, ArH), 7,968 (s, 4H, NH), 8,019 (d, J = 7,8, 4H, ArH), 8,084 (d, J = 7,8, 4H, ArH), 8,993 (br s, 4H, NH).
  • 11.4 Tb[H(2,2)tetra-(6-amino-1-hexanamido-)IAM], 24
  • 23 (0,042 mMol) wurde in 12 ml einer Lösung aus MeOH, die Tb(NO3)3·6 H2O (0,042 mMol, 99,999 %) enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde unter Rückfluß erhitzt und der Feststoff wurde gelöst. 45 Tropfen Collidin wurden der resultierenden Lösung zugesetzt. Eine starke grüne Emission der Lösung wurde bei Bestrahlung mit UV beobachtet. Nach dem Erhitzen unter Rückfluß für 13 h wurde das Lösungsmittel verdampft, bis ein weißer Feststoff ausfiel. Das Produkt wurde filtriert und mit Et2O gewaschen. Nach dem Trocknen des Produktes (Vakuum-Ofen) wurden 67 mg des Produktes gewonnen. Berechnet (gefunden) für TbC66H96N14O12(NO3)(HBr)7·9H2O: C, 35,65 (35,60); H, 5,44 (5,48); N, 9,45 (9,43).
  • Beispiel 12
  • Beispiel 12 veranschaulicht die Synthese von Verbindungen gemäß der Erfindung, die Grundgerüste variabler Laugen aufweisen. Das Synthese-Schema ist in 21 dargelegt.
  • 12.1 Synthese von 2-Methoxy-1-(2-mercaptothiazolid-)isophthalamidmethylamid, 44
  • Zu einer Lösung aus 1 (20 g, 0,050 Mol) in Methylenchlorid (200 ml) wurde eine Mischung aus 2 ml Methylamin-Lösung (40 Gewichtsprozent in Wasser, d = 0,902) und 50 ml Isopropanol tropfenweise über eine Zeitdauer von 8 h zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockene eingedampft und der Rest wurde durch eine Flash-Silica-Gel-Säule (Gradient: 1 bis 5 % Methanol in Methylenchlorid) gereinigt. 5,8 g des erwünschten Produktes wurden in Form eines gelben kristallinen Feststoffs erhalten. Ausbeute: 81 %, bezogen auf das Methylamin. 7,8 g des nicht umgesetzten Dithiazolids wurden während der Trennung ebenso wiedergewonnen. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) (14) δ: 3,012 (d, J = 5,0, 3H, NHCH3), 3,449 (t, J = 7,5, 2H, CH2), 3,866 (s, 3H, OCH3), 4,660 (t, J = 7,5, 2H, CH2), 7,227 (t, J = 7,5, 1H, ArH), 7,416 (d, J = 7,5, 1H, ArH), 7,425 (s, br, 1H, Amid-H), 8,124 (d, J = 7,5, 1H, ArH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C) (15) δ 26,30; 28,73; 55,32; 62,62; 123,81; 126,78; 128,70; 131,49; 155,06; 164,98; 201,15.
  • 12.2 Synthese von Me4H(3,2)IAM, 45
  • Zu einer Lösung aus H(3,2-)Amin (1 Mmol) in CH2Cl2 (50 ml) wurde Verbindung 44 (4,8 mMol) zugesetzt. Die Mischung wurde so lange gerührt, bis eine Dünnschicht-Chromatographie ergab, dass die Reaktion beendet war. Die Reaktionsmischung wurde mittels einer Flash-Silica-Gel-Säule (Gradient: 2 bis 7 % CH3OH in CH2Cl2) gereinigt. Das reine Produkt wurde in Form eines weißen Schaums erhalten. Ausbeute: 81 %. (+)-FABMS: m/z: 1011,8 [MH+]. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C), δ 1,624 (quint, J = 6,5, 2H, CH2), 2,524 (t, J = 6,5, 4H, CH2), 2,649 (t, 8H, J = 6,5, CH2), 2,935 (d, 12H, J = 5,0, CH2), 3,448 (q, J = 6,5, 8H, CH2), 3,777 (s, 12H, CH3), 7,097 (t, 4H, J = 7,5, ArH), 7,451 (t, 4H, J = 5,5, Amid-H), 7,714 (d, 4H, J = 7,5, ArH), 7,813 (t, 4H, J = 5,5, Amid-H), 7,856 (d, J = 7,5, 4H, ArH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C), δ 24,15; 26,67; 37,83; 52,06; 53,21; 63,09; 124,54; 127,53; 128,41; 133,23; 133,63; 155,60; 165,46; 165,99.
  • 12.3 Synthese von H4H(3,2)IAM, 47
  • 45 (0,5 mMol) wurde in trockenem entgastem CH2Cl2 (20 ml) gelöst und die resultierende Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt. BBr3 (11,4 mMol) wurde mittels einer Spritze unter Stickstoff zugesetzt. Die resultierende blaß-gelbe Aufschlämmung wurde 48 h lang gerührt. Die flüchtigen Komponenten wurden danach unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde mit Methanol (30 ml) abgeschreckt. Die Methanol-Lösung wurde mit Wasser (40 ml) verdünnt und unter Sieden erhitzt, bis eine farblose transparente Lösung erhalten wurde und das Volumen wurde auf 10 ml reduziert. Die Lösung wurde abgekühlt und ein weißer Niederschlag erschien, der durch Filtration und Trocknen unter Vakuum gewonnen wurde. Ausbeute: 62 %. (+)-FABMS: m/z: 1874,9 [MH+]. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, 25 °C), δ 2,467 (quint, J = 6,0, 2H, CH2), 2,871 (s, 12H, CH3), 3,625 (t, 8H, J = 6,0, CH2), 3,65 – 3,75 (m, 8H, CH2), 3,85 – 3,95 (m, 4H, CH2), 6,734 (t, 4H, J = 7,5, ArH), 7,678 (d, 4H, J = 7,5, ArH), 7,772 (t, 4H, J = 7,5, ArH).
  • 12.4 Synthese von Me4H(4,2)IAM, 46
  • Diese Verbindung wurde nach derselben Verfahrensweise, wie sie für Verbindung 45 beschrieben wurde, hergestellt, mit der Ausnahme, dass H(4,2-)amin anstelle von H(3,2-)amin verwendet wurde. Ausbeute: 84 %. (+)-FABMS: m/z: 1025,9 [MH+]. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C), δ 1,412 (s,br, 4H, CH2), 2,490 (s,br, 4H, CH2), 2,643 (t, 8H, J = 6,0, CH2), 2,945 (d, 12H, J = 5,0, CH2), 3,464 (q, J = 6,5, 8H, CH2), 3,767 (s, 12H, CH3), 7,111 (t, 4H, J = 7,5, ArH), 7,396 (q, 4H, J = 5,0, Amid-H), 7,752 (d, 4H, J = 7,5, ArH), 7,795 (t, 4H, J = 5,0, Amid-H), 7,839 (d, J = 7,5, 4H, ArH). 13C-NMR (500 MHz, CDCl3, 25 °C), δ 24,01; 26,23; 37,64; 49,72; 52,58; 52,41; 53,64; 62,65; 124,03; 127,29; 128,00; 132,79; 133,00; 155,29; 165,20; 165,87.
  • 12.5 Synthese von H4H(4,2)IAM, 48
  • Bei dieser Verbindung wurden die Schutzgruppen entfernt durch das klassische Verfahren der Entfernung von Schutzgruppen mittels BBr3, das für Verbindung 47 beschrieben wurde. Das reine Material wurde in Form eines weißen Feststoffs gewonnen. Ausbeute: 71 %. (+)-FABMS: m/z: 969,7 [MH+]. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 °C), δ 1,766 (s, br, 4H, CH2), 2,812 (d, J = 5,0, 12H, CH3), 3,31 (s, br, 4H, CH2), 3,386 (s, br, 8H, CH2), 3,714 (d, br, J = 5,5, 8H, CH2), 6,948 (t, 4H, J = 7,5, ArH), 7,984 (d, 8H, J = 7,5, ArH), 8,844 (t, J = 5,5, 4H, Amid-H), 8,984 (d,br, J = 5,5, 4H, Amid-H), 9,549 (s, br, 2H, Phenol-H). 1H-NMR (500 MHz, D2O-NaOD, 25 °C), δ 1,313 (s, br, 4H, CH2), 2,388 (s, br, 4H, CH2), 2,593 (t, J = 6,0, 8H, CH2), 2,755 (s, br, 12H, CH3), 3,343 (t, J = 6,0, 8H, CH2), 6,477 (t, 4H, J = 7,5, ArH), 7,816 (d, 8H, J = 7,5, ArH).

Claims (119)

  1. Lumineszierendes Lanthaniden-Metall-Chelat, umfassend ein Metall-Ion der Lanthaniden-Reihe und ein komplexierendes Mittel, das wenigstens eine 2-Hydroxyisophthalamidyl-Einheit umfasst.
  2. Chelat nach Anspruch 1 mit einer Quanten-Ausbeute von wenigstens etwa 0,1.
  3. Chelat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Lanthaniden-Metall-Ion ein aus der Gruppe Europium, Terbium und Kombinationen daraus gewähltes Ion ist.
  4. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend weiter wenigstens eine Salicylamidyl-Einheit.
  5. Verbindung mit einer Struktur gemäß Formel (I)
    Figure 01360001
    worin R1, R2, R4, R5, R6, R7, R10 und R20 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen, worin zwei oder mehr der Reste R2, R4, R5, R7 und, wenn R3 eine substituierte Alkyl-Gruppe ist, ein Substituent R3 gegebenenfalls be nachbart sind von wenigstens einer Linker-Einheit unter Bildung wenigstens eines Rings; R3, R8 und R9 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, Aryl-Gruppen und substituierten Aryl-Gruppen; R11, R12, R13, R21, R22 und R23 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, H,-NR14R15, -NO2,-OR16,-COOR17, worin R14, R15, R16 und R17 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen, worin R12 gegebenenfalls einen mit Ring R", R13 oder beiden bilden kann und R22 gegebenenfalls einen Ring mit R21, R23 oder beiden bilden kann, wobei die Ringe Ringe sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ringsystemen, die besteht aus zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, substituierten zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, Aryl-Ring-Systemen, substituierten Aryl-Ring-Systemen, Heteroaryl-Ring-Systemen, substituierten Heteroaryl-Ring-Systemen, Heterocyclyl-Ring-Systemen und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen; und Q1 für -OR18 steht; Q für -OR19 steht, worin R18 und R19 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung; a für 0 oder 1 steht, mit der Maßgabe, dass dann, wenn a 0 ist, N2' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 2' gebunden ist; z für 0 oder 1 steht, mit der Maßgabe, dass dann, wenn z 0 ist, N1' kovalent direkt an die Carbonyl-Gruppe 1' gebunden ist.
  6. Verbindung nach Anspruch 5, worin z für 0 steht.
  7. Verbindung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin R3 ein linearer C1- bis C6 -Kohlenwasserstoff ist.
  8. Verbindung nach Anspruch 6, worin R8 für (CH2)P steht; R4 für eine Alkyl-Gruppe steht, die mit einer Einheit substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel (II) aufweist:
    Figure 01380001
    worin R29, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen, worin zwei oder mehr der Reste R2, R7 und R29 gegebenenfalls von wenigstens einer Linker-Einheit benachbart sind und so wenigstens einen Ring bilden; R31, R32 und R33 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, H, -NR24R25, -NO2, -OR26, -COOR27; worin R24, R25, R26 und R27 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen, worin R32 gegebenenfalls einen Ring mit R31, R33 oder beiden bilden kann, wobei die Ringe Ringe sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ringssystemen, die besteht aus zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, substituierten zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, Aryl-Ring-Systemen, substituierten Aryl-Ring-Systemen, Heteroaryl-Ring-Systemen, substituierten Heteroaryl-Ring-Systemen, Heterocyclyl-Ring-Systemen und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen; R3 für (CH2)X steht; Q3 für -OR28 steht, worin R28 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, einer enzymatisch labilen Gruppe, einer hydrolytisch labilen Gruppe und einer einzelnen negativen Ladung; P und X Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus den ganzen Zahlen von 1 bis einschließlich 5; und z für 0 steht.
  9. Verbindung nach Anspruch 8, worin zwei oder mehr der Reste R2, R7 und R29 von wenigstens einer Linker-Einheit unter Bildung wenigstens eines Rings benachbart sind.
  10. Verbindung nach Anspruch 8, worin R2, R6 und R29 zusammen eine einzelne Linker-Einheit umfassen.
  11. Verbindung nach Anspruch 10, worin die Linker-Einheit eine Struktur gemäß Formel (III) aufweist:
    Figure 01390001
    worin b, e und f Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich.
  12. Verbindung nach Anspruch 11, welche eine Struktur gemäß Formel (IV) aufweist:
    Figure 01400001
    worin b, b', e, e', f und f' Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus den ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich.
  13. Verbindung nach Anspruch 8 mit einer Struktur gemäß Formel (V):
    Figure 01400002
  14. Verbindung nach Anspruch 13 mit einer Struktur gemäß Formel (VI):
    Figure 01400003
  15. Verbindung nach Ans nach 8, worin R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, C1- bis C10-Alkyl-Gruppen und substituierten C1- bis C10-Alkyl-Gruppen.
  16. Verbindung nach Anspruch 15, worin R1, R2, R3, R5, R6, R7 ,R8 ,R9, R10, R29, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, C2- bis C6-Alkyl-Gruppen und substituierten C2- bis C6-Alkyl-Gruppen.
  17. Verbindung nach Anspruch 8, worin R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Aryl-Gruppen, substituierten Aryl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  18. Verbindung nach Anspruch 8, worin R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H und mit polyzyklischen Aryl-Gruppen substituierten Alkyl-Gruppen.
  19. Verbindung nach Anspruch 8, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47 und Kombinationen daraus, ein primäres Alkylamin ist.
  20. Verbindung nach Anspruch 19, worin das primäre Alkylamin eine C1- bis C10-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  21. Verbindung nach Anspruch 20, worin das primäre Alkylamin eine C2- bis C6-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  22. Verbindung nach Anspruch 8, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47 und Kombinationen daraus, ein Polyether ist.
  23. Verbindung nach Anspruch 22, worin der Polyether eine Gruppe ist, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomeren und Kombinationen daraus, worin Polyether ein Molekulargewicht von etwa 60 Dalton bis etwa 10.000 Dalton aufweist.
  24. Verbindung nach Anspruch 23, worin der Polyether ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 Dalton bis etwa 1.000 Dalton aufweist.
  25. Verbindung nach Anspruch 8, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47 eine reaktive Gruppe zum Konjugieren der Verbindung an eine Verbindung umfasst, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Molekülen und Oberflächen.
  26. Verbindung nach Anspruch 8, worin die Reste R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R29, R46 und R47 und Kombinationen daraus Gruppen sind, die gewählt sind aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  27. Verbindung nach Anspruch 26, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel (VII) aufweist:
    Figure 01420001
    worin X eine Gruppe ist, die gewählt ist aus O, S und NR50, worin R50 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen; Y eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und j und k Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  28. Verbindung nach Anspruch 27, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel (VIII) aufweist:
    Figure 01430001
  29. Verbindung nach Anspruch 8, worin R1, R2, R5, R6, R7, R10, R29, R46 und R47 für H stehen.
  30. Verbindung nach Anspruch 5, worin R4 eine Alkyl-Gruppe ist, die mit einer Gruppe substituiert ist, die eine Struktur gemäß Formel (II) aufweist; R5 eine Alkyl-Gruppe ist, die substituiert ist mit einer Einheit, die eine Struktur gemäß Formel (IX) aufweist:
    Figure 01430002
    worin R39, R40 und R45 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen; und R41, R42 und R43 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, H, -NR34R35, -NO2, -OR36, -COOR37; worin R34, R35, R36 und R37 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen, worin R42 gegebenenfalls einen Ring mit R41, R43 oder beiden bilden kann, wobei die Ringe Ringe sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe von Ring-Systemen, die besteht aus zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, substituierten zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, Aryl-Ring-Systemen, substituierten Aryl-Ring-Systemen, Heteroaryl-Ring-Systemen, substituierten Heteroaryl-Ring-Systemen, Heterocyclyl-Ring-Systemen und gesättigten Heterocyclyl-Ring-Systemen.
  31. Verbindung nach Anspruch 30 mit einer Struktur gemäß Form (X)
    Figure 01440001
    worin M, N, P und Z Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen zwischen 1 und 5 einschließlich.
  32. Verbindung nach Anspruch 31, worin R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C1- bis C10-Alkyl-Gruppen und substituierten C1- bis C10-Alkyl-Gruppen.
  33. Verbindung nach Anspruch 32 worin R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C2- bis C6-Alkyl-Gruppen und substituierten C2- bis C6-Alkyl-Gruppen.
  34. Verbindung nach Anspruch 31, worin R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Aryl-Gruppen, substituierten Aryl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  35. Verbindung nach Ans nach 31 worin R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit polyzyklischen Aryl-Gruppen substituierten Alkyl-Gruppen.
  36. Verbindung nach Anspruch 31, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47 und Kombinationen daraus, ein primäres Alkylamin ist.
  37. Verbindung nach Anspruch 31, worin das primäre Alkylamin eine C1- bis C10-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  38. Verbindung nach Anspruch 37, worin das primäre Alkylamin eine C2- bis C6-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  39. Verbindung nach Anspruch 31, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R1, R2, R6, R7, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47 und Kombinationen daraus ein Polyether ist.
  40. Verbindung nach Anspruch 39, worin der Polyether eine Verbindung ist, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomeren und Kombinationen daraus, worin der Polyether ein Molekulargewicht von etwa 60 Dalton bis etwa 10.000 Dalton aufweist.
  41. Verbindung nach Anspruch 39, worin der Polyether ein Molekulargewicht von etwa 100 Dalton bis etwa 1.000 Dalton aufweist.
  42. Verbindung nach Anspruch 31, worin R1, R2, R6, R7, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47 und Kombinationen daraus Gruppen sind, die gewählt sind aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  43. Verbindung nach Anspruch 42, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur entsprechend Formel (VII) aufweist:
    Figure 01460001
    worin X eine Gruppe ist, die gewählt ist O, S und NR50, worin R50 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen; Y eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und j und k Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  44. Verbindung nach Anspruch 43, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel (VIII) aufweist:
    Figure 01470001
  45. Verbindung nach Ans nach 31 worin R1, R2, R6, R7, R10, R20, R29, R39, R40, R45, R46 und R47 für H stehen.
  46. Verbindung nach Anspruch 31 mit einer Struktur gemäß Formel (XI).
    Figure 01470002
  47. Verbindung nach Anspruch 30, worin R1, R6, R29 und R39 zusammen eine einzelne Linker-Einheit umfassen.
  48. Verbindung nach Anspruch 47, worin die einzelne Linker-Einheit eine Struktur gemäß Formel (XII) aufweist:
    Figure 01480001
    worin b, e, f, g und h Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Zahlen zwischen 1 und 5 einschließlich.
  49. Verbindung nach Anspruch 48 mit einer Struktur gemäß Formel (XIII):
    Figure 01480002
    worin R2, R7, R10, R20, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen; R11, R12, R13, R21, R22, R23, R31, R32, R33, R41, R42 und R43 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Alkyl-Gruppen, substituierten Alkyl-Gruppen, H, -NR10R11, -NO2, -OR12, -COOR13 oder zwei oder mehrere der Reste R5, R6 und R7 unter Bildung eines Ring-Systems verbunden sind, welches ein Ring-System ist, das gewählt ist aus zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, sub stituierten zyklischen Alkyl-Ring-Systemen, Aryl-Ring-Systemen, substituierten Aryl-Ring-Systemen, Heteroaryl-Ring-Systemen, substituierten Heteroaryl-Ring-Systemen, Heterocycyl-Ring-Systemen und gesättigten Heterocykyl-Ring-Systemen; Q1, Q2, Q3 und Q4 für OR18, OR19, OR28 bzw. OR38 stehen, worin R18, R19, R28 und R38 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus H und einer einzelnen negativen Ladung; b und b' Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 5 einschließlich; und e, e', f, f', g, g', h und h' Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Zahlen von 0 bis 3.
  50. Verbindung nach Anspruch 49, worin R2, R7, R10, R20, R40, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C1- bis C10-Alkyl-Gruppen und substituierten C1- bis C10-Alkyl-Gruppen.
  51. Verbindung nach Anspruch 50, worin R2, R7, R10, R20, R40, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus C2- bis C6-Alkyl-Gruppen und substituierten C2- bis C6-Alkyl-Gruppen.
  52. Verbindung nach Anspruch 49, worin R2, R7, R10, R20, R40, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Aryl-Gruppen, substituierten Aryl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  53. Verbindung nach Anspruch 52, worin R2, R7, R10, R20, R40, R45, R46 und R47 Gruppen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus mit polyzyklischen Aryl-Gruppen substituierten Alkyl-Gruppen.
  54. Verbindung nach Anspruch 49, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R2, R7, R10, R20, R40, R45, R46 und R47 und Kombinationen daraus ein primäres Alkylamin ist.
  55. Verbindung nach Anspruch 54, worin das primäre Alkylamin eine C1- bis C10-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  56. Verbindung nach Anspruch 55, worin das primäre Alkylamin eine C2- bis C6-Alkyl-Kette ist, die eine Amin-Einheit in der ω-Position trägt.
  57. Verbindung nach Anspruch 49, worin eine Gruppe, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus R2, R7, R10, R20, R40, R45, R46 und R47 und Kombinationen daraus, ein Polyether ist.
  58. Verbindung nach Anspruch 57, worin der Polyether eine Verbindung ist, die gewählt ist aus Ethylenglycol, Ethylenglycol-Oligomeren und Kombinationen daraus, worin der Polyether ein Molekulargewicht von etwa 60 Dalton bis etwa 10.000 Dalton aufweist.
  59. Verbindung nach Anspruch 58, worin der Polyether ein Molekulargewicht von etwa 100 Dalton bis etwa 1.000 Dalton aufweist.
  60. Verbindung nach Anspruch 49, worin R2, R7, R10, R20, R40, R45, R46 und R47 und Kombinationen daraus Gruppen sind, die gewählt sind aus ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen, substituierten ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppen und Kombinationen daraus.
  61. Verbindung nach Anspruch 60, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel (VII) aufweist:
    Figure 01500001
    worin, X eine Gruppe ist, die gewählt ist aus O, S und NR50, worin R50 eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H, Alkyl-Gruppen und substituierten Alkyl-Gruppen; Y eine Gruppe ist, die gewählt ist aus H und einer einzelnen negativen Ladung; und j und k Zahlen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 1 bis 18.
  62. Verbindung nach Anspruch 61, worin die substituierte ω-Carboxyl-Alkyl-Gruppe eine Struktur gemäß Formel (VIII) aufweist:
    Figure 01510001
  63. Verbindung nach Anspruch 49 mit einer Struktur gemäß Formel (XIV):
    Figure 01510002
  64. Verbindung nach Anspruch 5 mit einer Struktur gemäß Formel (XV):
    Figure 01510003
    worin D ein Dendrimer ist; und w eine Zahl ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen von 4 bis 100 einschließlich.
  65. Verbindung nach Anspruch 64, worin die Verbindung eine Struktur gemäß Formel (XVI) aufweist:
    Figure 01520001
  66. Verbindung nach Anspruch 64, worin das Dendrimer ein Polypropylenimin-Dendrimer ist.
  67. Verbindung nach Anspruch 64, worin das Dendrimer von einer Generation ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Generation 2 bis Generation 10 einschließlich.
  68. Verbindung nach Anspruch 64, worin w eine Zahl ist, die gewählt ist der Gruppe, die besteht aus ganzen Zahlen zwischen 8 und 50 einschließlich.
  69. Komplex nach einem der Ansprüche 5 bis 68, worin die Verbindung kovalent an ein Träger-Molekül gebunden ist.
  70. Verbindung nach Anspruch 69, worin das Träger-Molekül ein Molekül ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus kleinen molekularen bioaktiven Mitteln, synthetischen Polymeren und Biomolekülen.
  71. Verbindung nach Anspruch 70, worin das Biomolekül eine Verbindung ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Antikörpern, Antigenen, Peptiden, Nucleinsäuren, Enzymen, Haptenen, Kohlehydraten und pharmakologisch aktiven Mitteln.
  72. Komplex, gebildet zwischen einem Metall-Ion und der Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 71.
  73. Komplex nach Anspruch 72, worin das Metall-Ion ein Ion der Lanthaniden-Reihe ist.
  74. Komplex nach Anspruch 73, worin das Lanthaniden-Ion ein Ion ist, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Terbium, Samarium, Europium, Dysprosium und Neodym.
  75. Komplex nach Anspruch 73 oder Anspruch 74, welcher zirkular polarisierte Lumineszenz emittiert.
  76. Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 75, welcher Lumineszenz durch elektrochemische Anregung des Komplexes produziert.
  77. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe ein Enzym enthält, wobei das Verfahren umfasst: (a) ein In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Peptid-Konstrukt, das umfasst: (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76; (ii) einen Quencher von Lichtenergie mit einer Absorptionsbande, die mit einer Emissionsbande des Komplexes überlappt; und (iii) eine Spaltungs-Erkennungs-Stelle für das Enzym; worin das Peptid in einer Konformation vorliegt, die eine Fluoreszenzenergie-Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) ein Anregen des Komplexes; und (c) ein Bestimmen einer Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe, worin die Präsenz des Enzyms in der Probe zu einer Änderung der Fluoreszenz-Eigenschaft führt.
  78. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Verbindung eine Aktivität eines Enzyms ändert, wobei das Verfahren umfasst: (a) ein In-Kontakt-Bringen einer das Enzym und die Verbindung umfassenden Probe mit einem Peptid-Konstrukt, das umfasst: (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76; (ii) einen Quencher von Licht-Energie mit einer Absorptionsbande, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt; und (iii) eine Spaltungs-Erkennungs-Stelle für das Enzym, worin das Peptid in einer Konformation vorliegt, die eine Übertragung von Fluoreszenz-Energie zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) ein Anregen des Komplexes; und (c) ein Bestimmen einer Fluoreszenz-Eigenschaft der Probe, worin die Aktivität des Enzyms in der Probe zu einer Änderung der Fluoreszenz-Eigenschaft führt.
  79. Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz, wobei das Verfahren umfasst: (a) ein In-Kontakt-Bringen der Ziel-Sequenz mit einem Nachweis-Oligonucleotid, das eine einsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz umfasst, wobei das Nachweis-Oligonucleotid daran gebunden aufweist: (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76; (ii) einen Quencher von Licht-Energie, der eine Absorptionsbande aufweist, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt; worin die Nachweis-Nucleinsäure in einer Konformation vorliegt, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) Hybridisieren der Ziel-Bindungs-Sequenz mit der Ziel-Sequenz, wodurch man die Konformation des Nachweis-Oligonucleotids verändert und so eine Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter hervorruft; und (c) Nachweisen der Änderung des Fluoreszenz-Parameters, wodurch man die Nucleinsäure-Ziel-Sequenz nachweist.
  80. Verfahren nach Anspruch 79, worin das Nachweis-Oligonucleotid ein Format aufweist, das gewählt ist aus molekularen Baken, Skorpion-Sonden, Sunrise-Sonden, Licht-An-Sonden und TaqManTM-Sonden.
  81. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer Nucleinsäure-Ziel-Sequenz, wobei das Verfahren umfasst: (a) ein Hybridisieren eines Nachweis-Oligonucleotids an die Ziel-Sequenz, das eine einsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekular gebundene Sekundärstruktur in 5'-Position der Ziel-Bindungs-Sequenz umfasst, worin wenigstens ein Teil der Ziel-Sequenz einen einsträngigen Schwanz bildet, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz zur Verfügung steht, wobei das Nachweis-Oligonucleotid daran gebunden aufweist: (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76; (ii) einen Quencher von Licht-Energie, der eine Absorptionsbande aufweist, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt, worin die Nachweis-Nucleinsäure in einer Konformation vorliegt, die eine Übertragung von Fluoreszenz-Energie zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) Synthetisieren eines komplementären Stranges in einer Primer-Verlängerungs-Reaktion unter Verwendung der intramolekular gebundenen Sekundärstruktur als Matrize, wodurch man die intramolekular gebundene Sekundärstruktur dissoziert und eine Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter bewirkt; (c) Nachweisen der Änderung des Fluoreszenz-Parameters, wodurch die Nucleinsäure-Ziel-Sequenz nachgewiesen wird.
  82. Verfahren nach Anspruch 81, worin die intramolekular gebundene Sekundärstruktur eine Struktur ist, die gewählt ist aus Hairpins (Haarnadeln), Stem-Loop-Strukturen (Stamm-Schleifen-Strukturen), Pseudoknoten, Dreifach-Helices und konformationsmäßig unterstützten Strukturen.
  83. Verfahren nach Anspruch 81 oder Anspruch 82, worin die intramolokular gebundene Sekundärstruktur eine vollständig oder partiell einsträngige Endonuclear-Erkennungs-Stelle umfasst.
  84. Verfahren nach einem der Ansprüche 81, 82 oder 83, worin der komplementäre Strang in einer Ziel-Amplifikations-Reaktion synthetisiert wird.
  85. Verfahren nach einem der Ansprüche 81, 82 oder 83, worin der komplementäre Strang durch Verlängerung der Ziel-Sequenz unter Verwendung des Nachweis-Oligonucleotids als Matrize synthetisiert wird.
  86. Verfahren nach einem der Ansprüche 81 bis 85, worin die Änderung der Fluoreszenz als Indikation des Vorhandenseins der Ziel-Sequenz nachgewiesen wird.
  87. Verfahren nach einem der Ansprüche 81 bis 86, worin der Fluoreszenz-Parameter in Real-Zeit nachgewiesen wird.
  88. Verfahren nach einem der Ansprüche 81 bis 87, worin die intramolekular basengepaarte Sekundärstruktur einen Teilabschnitt der Ziel-Bindungs-Sequenz umfasst.
  89. Verfahren zum Nachweis der Amplifikation einer Ziel-Sequenz, umfassend in einer Amplifikations-Reaktion (a) ein Hybridisieren eines Nachweis-Oligonucleotids an die Ziel-Sequenz, umfassend eine einsträngige Ziel-Bindungs-Sequenz und eine intramolekular gebundene Sekundärstruktur in 5'-Position zu der Ziel-Bindungs-Sequenz, worin wenigstens ein Teilabschnitt der Ziel-Sequenz einen einsträngigen Schwanz bildet, der für eine Hybridisierung mit der Ziel-Sequenz verfügbar ist, wobei das Nachweis-Oligonucleotid daran gebunden aufweist: (i) einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76; (ii) einen Quencher von Lichtenergie, der eine Absorptions-Bande aufweist, die mit einer Emissions-Bande des Komplexes überlappt; worin die Nachweis-Nucleinsäure in einer Konformation vorliegt, die eine Fluoreszenz-Energie-Übertragung zwischen dem Komplex und dem Quencher erlaubt, wenn der Komplex angeregt ist; (b) Verlängern des hybridisierten Nachweis-Oligonucleotids auf der Ziel-Sequenz mit einer Polymerase unter Herstellung eines Nachweis-Oligonucleotid-Verlängerungs-Produkts und Trennen des Nachweis-Oligonucleotid-Verlängerungs-Produkts von der Ziel-Sequenz; (c) Hybridisieren eines Primers an das Nachweis-Oligonucleotid-Verlängerungs-Produkts und Verlängern des Primers mit der Polymerase, wodurch man die intramolekular gebundene Sekundär-Struktur linearisiert und eine Änderung in einem Fluoreszenz-Parameter produziert; und (d) Nachweisen der Änderungen des Fluoreszenz-Parameters, wodurch man die Ziel-Sequenz nachweist.
  90. Verfahren nach Anspruch 89, worin die Ziel-Sequenz amplifiziert wird durch ein Verfahren, das gewählt ist aus Strand Displacement Amplification (Strang-Verdrängungs-Amplifikation). Polymerase-Ketten-Reaktion, 3SR, TMA und NASBA.
  91. Verfahren nach Anspruch 89 oder Anspruch 90, worin die Sekundärstruktur weiter eine partiell oder vollständig einsträngige Restriktions-Endonuclease-Stelle umfasst.
  92. Verfahren nach einem der Ansprüche 89 bis 91, worin eine Änderung der Fluoreszenz-Intensität nachgewiesen wird.
  93. Verfahren nach Anspruch 92, worin eine Änderung der Fluoreszenz-Intensität in Real-Zeit nachgewiesen wird.
  94. Verfahren nach einem der Ansprüche 89 bis 93, worin die intramolekular basengepaarte Sekundärstruktur einen Teil der Ziel-Bindungs-Sequenz umfasst.
  95. Verfahren zum Sicherstellen, ob eine erste Nucleinsäure und eine zweite Nucleinsäure miteinander hybridisieren, wobei die erste Nucleinsäure einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76 umfasst, wobei das Verfahren umfasst: (a) ein In-Kontakt-Bringen der ersten Nucleinsäure mit der zweiten Nucleinsäure; (b) das Nachweisen einer Veränderung in einer Fluoreszenz-Eigenschaft einer Verbindung, die gewählt ist aus der ersten Nucleinsäure, der zweiten Nucleinsäure und einer Kombination daraus, wodurch man sicherstellt, ob eine Hybridisierung stattfindet.
  96. Verfahren nach Anspruch 95, worin die zweite Nucleinsäure einen Quencher von Lichtenergie kovalent daran gebunden umfasst.
  97. Mikroarray, umfassend einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76, wobei der Quencher direkt an einen festen Träger oder an ein Träger-Molekül konjugiert ist, das an den festen Träger gebunden ist.
  98. Mikroarray nach Anspruch 97, worin das Träger-Molekül ein Molekül ist, das gewählt ist aus einer Nucleinsäure, einem Peptid, einer Peptid-Nucleinsäure und Kombinationen daraus.
  99. Mikroarray nach Anspruch 97, worin der feste Träger geteilt ist in einen ersten Bereich und einen zweiten Bereich, wobei der erste Bereich daran gebunden einen ersten Komplex aufweist, der an ein erstes Träger-Molekül gebunden ist, und der zweite Bereich daran gebunden einen zweiten Komplex aufweist, der an ein zweites Träger-Molekül gebunden ist.
  100. Mikroarray nach Anspruch 98, worin das erste und das zweite Träger-Molekül Moleküle sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus Nucleinsäuren, Peptiden und Peptid-Nucleinsäuren.
  101. Mikroarray nach Anspruch 98, worin der erste Quencher von Licht-Energie und der zweite Komplex unterschiedliche Strukturen aufweisen.
  102. Verfahren zum Testen eines Mikroarrays auf die Gegenwart einer Verbindung, wobei das Verfahren umfasst: (a) ein In-Kontakt-Bringen des Mikroarrays mit einer Sonde, die mit der Verbindung in Wechselwirkung steht, wobei die Sonde einen Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76 umfasst; (b) ein Nachweisen eines Unterschieds in einer Fluoreszenz-Eigenschaft einer Verbindung, die gewählt ist aus der Sonde, der Verbindung und Kombinationen daraus, wodurch man die Gegenwart der Verbindung sicherstellt.
  103. Verfahren nach Anspruch 102, worin die Verbindung eine Verbindung ist, die gewählt ist aus Nucleinsäuren, Peptiden, Peptid-Nucleinsäuren und Kombinationen daraus.
  104. Verwendung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 73 bis 76 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Wachstums durch Strahlungstherapie, wobei der Komplex Radio-Sensibilisierungs-Eigenschaften aufweist.
  105. Verwendung eines photoempfindlichen Komplexes nach einem der Ansprüche 73 bis 76 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Läsion oder einer durch melanodermes Gewebe verborgenen Läsion durch photodynamische Therapie.
  106. Verwendung nach Anspruch 105, worin die photodynamische Therapie eine Therapie der Photo-Bestrahlung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 700 bis 900 Nanometern ist.
  107. Verwendung nach Anspruch 106, worin die Photo-Bestrahlung eine Bestrahlung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 730 bis 770 Nanometern ist.
  108. Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76, worin die Verbindung eine Komponente einer Tinte oder eines Farbstoffs umfasst.
  109. Komplex nach einem der Ansprüche 73 bis 76, worin der Komplex eine Komponente eines Substrats für die Transmission und Amplifikation von Licht umfasst.
  110. Komplex nach Anspruch 109, worin das Substrat ein Material gewählt aus Glas, organischen Polymeren, anorganischen Polymeren und Kombinationen daraus umfasst.
  111. Verfahren zum Amplifizieren von Licht, das durch ein Substrat durchgelassen wird, wobei das Verfahren das Durchlassen von Licht durch ein Substrat gemäß Anspruch 109 umfasst, wodurch das Licht amplifiziert bzw. verstärkt wird.
  112. Verfahren zur Durchführung eines Fluoreszenz-Essays einer zu analysierenden Substanz, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Verdrängen eines Bindungspartners von einem Bindungspartner-Erkennungseinheit-Komplex mit der zu analysierenden Substanz, wodurch man einen Komplex aus zu analysierender Substanz und Erkennungseinheit und einen freien Bindungspartner bildet, wobei der Bindungspartner und der freie Bindungspartner eine Verbindung nach einem der Ansprüche 5 bis 68 umfassen; (b) das Bilden eines fluoreszierenden Komplexes zwischen einem Lanthaniden-Ion und einer Verbindung, die ein komplexierendes Mittel umfasst, das wenigstens eine Phthalamidyl-Einheit umfasst, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus dem Bindungspartner, dem freien Bindungspartner und Kombinationen daraus; und (c) Nachweisen des fluoreszierenden Komplexes.
  113. Verfahren nach Anspruch 112, worin die Erkennungs-Einheit, der Bindungspartner und die zu analysierende Substanz Verbindungen sind, die unabhängig voneinander gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus bioaktivem Materialien, Biomolekülen und Kombinationen daraus.
  114. Material nach Anspruch 113, worin das Biomolekül eine Verbindung ist, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Haptenen, Antikörpern, Antigenen, Kohlehydraten, Nucleinsäuren, Peptidnen, Enzymen und Rezeptoren.
  115. Verfahren nach einem der Ansprüche 112 bis 114, worin eine oder mehrere der Verbindungen, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus der Erkennungs-Einheit, dem Bindungspartner und der zu analysierenden Substanz, an einer Oberfläche befestigt sind.
  116. Verfahren nach einem der Ansprüche 112 bis 115, worin der fluoreszierende Komplex gebildet wird vor dem Verdrängen des Bindungspartners von dem Komplex aus Bindungspartner und Erkennungseinheit.
  117. Verfahren nach einem der Ansprüche 112 bis 115, worin der fluoreszierende Komplex gebildet wird nach dem Verdrängen des Bindungspartners von dem Komplex aus Bindungspartner und Erkennungseinheit.
  118. Verfahren nach einem der Ansprüche 112 bis 115, welches weiter das Trennen des freien Bindungspartners von einer Verbindung aus der Gruppe umfasst, die besteht aus dem Paar Erkennungseinheit-Bindungspartner, dem Paar zu analysierende Substanz-Bindungspartner und Kombinationen daraus.
  119. Verfahren nach Anspruch 118, worin der fluoreszierende Komplex im Anschluss an die Trennung gebildet wird.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014203266A1 (de) 2014-02-24 2015-08-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Zusammensetzung mit FRET-Paar in definierter Geometrie

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998055026A1 (en) * 1997-06-05 1998-12-10 Kairos Scientific Inc. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy
ATE285394T1 (de) * 1999-02-18 2005-01-15 Univ California Phthalamid-lanthanid komplexe zur verwendung als lumineszenzmarker
US6406297B1 (en) * 1999-02-18 2002-06-18 The Regents Of The University Of California Salicylamide-lanthanide complexes for use as luminescent markers
DE19936997B4 (de) * 1999-08-02 2007-06-14 Biolitec Ag Verfahren zur Applikation von Photosensibilisatoren (PS) mittels Multiplikatoren in der photodymamischen Therapie
PE20010635A1 (es) 1999-10-08 2001-08-15 Smithkline Beecham Corp Inhibidores de fab i utiles para el tratamiento de infecciones bacterianas
US7897140B2 (en) * 1999-12-23 2011-03-01 Health Research, Inc. Multi DTPA conjugated tetrapyrollic compounds for phototherapeutic contrast agents
CA2444597A1 (en) * 2001-04-06 2002-10-06 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Fab i inhibitors
ATE380342T1 (de) * 2001-05-07 2007-12-15 Hipep Lab Peptidimmobilisierte grundplatte und vefahren zum testen eines zielproteins unter verwendung derselben
US6846915B2 (en) * 2001-08-13 2005-01-25 The Regents Of The University Of California Hydroxypyridonate and hydroxypyrimidinone chelating agents
US20020106811A1 (en) * 2002-04-14 2002-08-08 Jefferson Trent D. Method for authentication of an item
CA2490692A1 (en) 2002-06-27 2004-01-08 Health Research, Inc. Fluorinated chlorin and bacteriochlorin photosensitizers for photodynamic therapy
WO2004005289A2 (en) * 2002-07-02 2004-01-15 Health Research, Inc. Efficient synthesis of pyropheophorbide a and its derivatives
US7790709B2 (en) 2002-12-06 2010-09-07 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds, methods of making them and their use in therapy
US6661815B1 (en) * 2002-12-31 2003-12-09 Intel Corporation Servo technique for concurrent wavelength locking and stimulated brillouin scattering suppression
WO2004082586A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Phamaceutical compositions comprising inhibitors of fab i and further antibiotics
US7473548B2 (en) * 2003-04-25 2009-01-06 Medtronic, Inc. Optical detector for enzyme activation
WO2005001415A2 (en) 2003-05-23 2005-01-06 Epix Pharmaceuticals, Inc. Optically pure and enriched isomers of chelating ligands and contrast agents
US20050019955A1 (en) * 2003-07-23 2005-01-27 Dahl Jeremy E. Luminescent heterodiamondoids as biological labels
FR2863053B1 (fr) * 2003-11-28 2007-04-06 Univ Claude Bernard Lyon Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee
EP1706452B1 (de) * 2003-12-30 2008-09-03 The Regents of the University of California, Office of the President Aromatische triamid-lanthanid-komplexe
DE102004018326B4 (de) 2004-04-13 2023-02-23 Endress + Hauser Flowtec Ag Vorrichtung und Verfahren zum Messen einer Dichte und/oder einer Viskosität eines Fluids
EP1737918A4 (de) * 2004-04-19 2008-11-26 Rhode Island Education Thermofluoreszenzpigmente für sicherheitsanwendungen
EP2848614A3 (de) * 2004-06-04 2015-07-29 Debiopharm International SA Acrylamidderivate und ihre Verwendung als Antibiotika
JP5243684B2 (ja) * 2004-11-04 2013-07-24 ユー・ディー・シー アイルランド リミテッド 有機金属錯体、発光性固体、有機ｅｌ素子及び有機ｅｌディスプレイ
WO2006121889A2 (en) * 2005-05-06 2006-11-16 Epix Pharmaceuticals, Inc. Chemical exchange saturation transfer contrast agents
JP2009518399A (ja) * 2005-12-05 2009-05-07 アフィニウム ファーマシューティカルズ， インク． Ｆａｂｉ阻害剤および抗菌剤としてのヘテロ環アクリルアミド化合物
US8557601B2 (en) 2006-07-10 2013-10-15 The Regents Of The University Of California Luminescent 1-hydroxy-2-pyridinone chelates of lanthanides
WO2008009122A1 (en) 2006-07-20 2008-01-24 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Acrylamide derivatives as fab i inhibitors
EP2051968B1 (de) 2006-08-15 2020-04-29 The Regents of the University of California Lumineszierende makrozyklische lanthanid-komplexe
FR2906393B1 (fr) * 2006-09-21 2008-12-19 Inst Nat Sciences Appliq Procede de marquage d'un materiau comprenant au moins une matrice minerale et materiau correspondant
US20080241838A1 (en) * 2006-12-29 2008-10-02 Applera Corporation, Applied Biosystems Group Methods and systems for detecting nucleic acids
US20080213780A1 (en) * 2007-01-25 2008-09-04 Lumiphore, Inc. Multi-color time resolved fluorophores based on macrocyclic lanthanide complexes
WO2008098374A1 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Salts, prodrugs and polymorphs of fab i inhibitors
US20110098309A1 (en) * 2007-07-12 2011-04-28 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting the formation of amyloid-beta diffusable ligands using acylhydrazide compounds
US8962677B2 (en) * 2007-07-12 2015-02-24 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Methods of restoring cognitive ability using non-peptidic compounds
US9006283B2 (en) 2007-07-12 2015-04-14 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying amyloid β oligomers using non-peptidic compounds
US20090043109A1 (en) * 2007-08-07 2009-02-12 Spangler Brenda D Asymmetric one- and two-photon fluorophores for simultaneous detection of multiple analytes using a common excitation source
WO2009079566A2 (en) 2007-12-18 2009-06-25 Acumen Pharmaceuticals, Inc. Novel addl receptor polypeptides, polynucleotides and host cells for recombinant production
US8492158B2 (en) * 2008-03-31 2013-07-23 Applied Biosystems, Llc Electrochemical labels derived from siderophores
FR2934684B1 (fr) 2008-07-31 2012-11-16 Cis Bio Int Methode de detection de l'internalisation de proteines membranaires.
US8617421B2 (en) * 2008-09-18 2013-12-31 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Lanthanide metal-organic frameworks and uses thereof
WO2010051544A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Lumiphore, Inc. Rapid homogeneous diagnostic testing platform based on lanthanide fluorescent resonance energy transfer
WO2011025790A1 (en) 2009-08-24 2011-03-03 Lumiphore, Inc. Macrocyclic hopo chelators
JP2013515744A (ja) * 2009-12-24 2013-05-09 ルミフォア，インコーポレイテッド 放射性医薬品錯体
EP2616817A4 (de) 2010-09-15 2014-04-09 Endacea Inc Verfahren zur verwendung und kit zur messung von lipopolysacchariden mit einem zeitgesteuerten assay auf fluoreszenzbasis
DE102011001368B4 (de) * 2011-03-17 2013-01-31 Bundesanstalt für Materialforschung und -Prüfung (BAM) Lanthanoid-Chelate enthaltende Partikel, deren Herstellung sowie deren Verwendung in der Bioanalytik
FR2977674B1 (fr) 2011-07-06 2015-08-14 Cisbio Bioassays Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule
EP2753674B1 (de) * 2011-08-19 2016-02-10 DHR Finland Oy Lumineszierende lanthanidchelate mit drei chromophoren und ihre verwendung
US9944657B2 (en) 2011-08-19 2018-04-17 Radiometer Turku Oy Luminescent lanthanide chelates having three chromophores an their use
FR2980271B1 (fr) 2011-09-16 2013-10-11 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps
WO2013092992A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-27 Dhr Finland Oy Novel luminescent lanthanide chelates with enhanced excitation properties
WO2013124544A1 (fr) 2012-02-22 2013-08-29 Cisbio Bioassays Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure.
FR2988174B1 (fr) 2012-03-19 2014-04-25 Cisbio Bioassays Procede de determination de la capacite d'un anticorps a maintenir des cellules a proximite l'une de l'autre
AU2013279021C1 (en) 2012-06-19 2017-03-16 Debiopharm International Sa Prodrug derivatives of (E)-N-methyl-N-((3-methylbenzofuran-2-yl)methyl)-3-(7-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-1,8-naphthyridin-3-yl)acrylamide
EP2920157B1 (de) 2012-11-16 2019-09-11 Lumiphore, Inc. Di-macrocyclen
US11453652B2 (en) 2013-03-15 2022-09-27 Lumiphore, Inc. Di-macrocycles
DK3129350T3 (da) * 2014-04-09 2021-11-22 Lumiphore Inc Makrocyklusser
CA2972080A1 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Lumiphore, Inc. Functionalized linear ligands and complexes thereof
FR3032797B1 (fr) 2015-02-13 2017-03-03 Cisbio Bioassays Procede de quantification d'une proteine d'interet presente dans un echantillon biologique
CA2995210A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 The General Hospital Corporation Manganese-based chelate conjugates for molecular mr imaging
KR20180114177A (ko) 2016-02-26 2018-10-17 데비오팜 인터네셔날 에스 에이 당뇨병성 족부 감염의 치료제
EP3507592A4 (de) 2016-09-02 2020-01-15 Lumiphore Inc. Makrocyclische liganden mit hängenden chelatbildenden gruppen und komplexe davon
WO2018130988A1 (en) * 2017-01-12 2018-07-19 Nestec S.A. Cryptate derivatives and their use as luminescent lanthanide complexes
US10247667B2 (en) 2017-04-26 2019-04-02 Fibremark Solutions Limited Photon marker system for fiber material
KR101986010B1 (ko) * 2017-07-05 2019-09-03 연세대학교 산학협력단 연속적인 원편광이색성 박막, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 광학 소자
FR3069644A1 (fr) 2017-07-28 2019-02-01 Cisbio Bioassays Methode pour mesurer la modulation de l'activation d'un recepteur couple a une proteine g
EP3752289A1 (de) 2018-02-15 2020-12-23 ProciseDx Inc. Testküvette
JP7206570B2 (ja) 2018-02-15 2023-01-18 プロサイズディーエックス インコーポレーテッド 分析装置
JP7378432B2 (ja) 2018-03-07 2023-11-13 ルミフォア，インク． ペンダントキレート部分を有する大環状リガンドおよびその錯体
EP3591024B1 (de) 2018-07-05 2021-01-13 Université de Strasbourg Ultrahelle lumineszierende lanthanid-nanopartikel enthaltend terbium mit längerer lebensdauer im angeregten zustand
FR3084365B1 (fr) 2018-07-27 2020-10-23 Cisbio Bioassays Anticorps a domaine unique qui se lient a la proteine g alpha
FR3092172B1 (fr) 2019-01-30 2021-02-12 Cisbio Bioassays Méthode pour mesurer la modulation de l’activation d’un récepteur couplé à une protéine G avec des analogues du GTP
WO2020232262A1 (en) 2019-05-16 2020-11-19 Procisedx Inc. Assay detection methods for vcam-1 and calprotectin
EP3821250B1 (de) 2019-05-16 2022-05-04 ProciseDx Inc. Testverfahren zum nachweis von vcam-1 und alpha-2-makroglobulin in blut
WO2020236528A1 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Procisedx Inc. Assay methods for the detection of human serum albumin, vitamin d, c-reactive protein, and anti-transglutaminase autoantibody
WO2021242725A1 (en) 2020-05-28 2021-12-02 Procisedx Inc. Predetermined calibration curve
CN112174988B (zh) * 2020-11-04 2022-07-19 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 三聚稀土铽配合物及其制备方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE561256A (de) * 1956-10-02
US4748184A (en) * 1982-07-26 1988-05-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Aryl substituted aminomethyl benzene derivatives having antiarrhythmic utility
US4577042A (en) * 1983-03-17 1986-03-18 California Institute Of Technology Homogeneous coordination compounds as oxidation catalysts
FR2588265B3 (fr) * 1985-10-04 1988-01-15 Inst Francais Du Petrole Procede d'adoucissement d'une charge d'hydrocarbures contenant des produits soufres
US4855225A (en) * 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US5047519A (en) * 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
SE8703682L (sv) * 1987-09-24 1989-03-25 Wallac Oy Homogen bestaemningsmetod som utnyttjar affinitetsreaktioner
SE8801702D0 (sv) * 1988-05-05 1988-05-05 Pharmacia Ab Sett vid bestemning av enzymatisk aktivitet
US5049280A (en) * 1989-03-29 1991-09-17 The Regents Of The University Of California 2,3-dihydroxyterephthalamides as highly effective metal ion sequestering compounds
AU9163491A (en) * 1990-12-17 1992-07-22 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Derivatized tris-catechol chelating agents
TW213864B (de) * 1991-08-01 1993-10-01 Squibb & Sons Inc
DE4222255A1 (de) 1992-07-07 1994-01-13 Bayer Ag Fotochemische Markierung von Nukleinsäuren mit Europiumchelat-Reagenzien und ihre Verwendung in Gensondentestsystemen
TW275070B (de) * 1992-12-22 1996-05-01 Ciba Geigy Ag
WO1995027705A1 (en) * 1994-04-08 1995-10-19 Bracco International B.V. Aromatic amide compounds and metal chelates thereof
US5622821A (en) * 1994-06-29 1997-04-22 The Regents Of The University Of California Luminescent lanthanide chelates and methods of use
DE19525924A1 (de) * 1995-07-04 1997-01-09 Schering Ag Kaskaden-Polymer-Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
DE19728021A1 (de) * 1997-07-01 1999-01-07 Clariant Gmbh Metall-Komplexe als Bleichaktivatoren
US5989823A (en) * 1998-09-18 1999-11-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction
ATE285394T1 (de) * 1999-02-18 2005-01-15 Univ California Phthalamid-lanthanid komplexe zur verwendung als lumineszenzmarker
US6406297B1 (en) * 1999-02-18 2002-06-18 The Regents Of The University Of California Salicylamide-lanthanide complexes for use as luminescent markers
US20040034223A1 (en) * 2002-02-07 2004-02-19 Covalent Partners, Llc. Amphiphilic molecular modules and constructs based thereon
US8916692B2 (en) * 2003-11-07 2014-12-23 Robert C. Leif Reagent system and method for modifying the luminescence of lanthanide(III) macrocyclic complexes
EP1706452B1 (de) * 2003-12-30 2008-09-03 The Regents of the University of California, Office of the President Aromatische triamid-lanthanid-komplexe
EP2051968B1 (de) * 2006-08-15 2020-04-29 The Regents of the University of California Lumineszierende makrozyklische lanthanid-komplexe
US20080213780A1 (en) * 2007-01-25 2008-09-04 Lumiphore, Inc. Multi-color time resolved fluorophores based on macrocyclic lanthanide complexes
WO2010051544A2 (en) * 2008-10-31 2010-05-06 Lumiphore, Inc. Rapid homogeneous diagnostic testing platform based on lanthanide fluorescent resonance energy transfer

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102014203266A1 (de) 2014-02-24 2015-08-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Zusammensetzung mit FRET-Paar in definierter Geometrie
DE102014203266B4 (de) 2014-02-24 2018-07-19 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Zusammensetzung mit FRET-Paar in definierter Geometrie

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