DE68928412T2 - Herstellung und verwendung von fluoreszierenden benzothiazolderivaten - Google Patents

Herstellung und verwendung von fluoreszierenden benzothiazolderivaten

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Description

    1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet von fluoreszierenden Substraten, und sie betrifft auch das Gebiet biologischer Assays bzw. Testverfahren.
    • 2. Hintergrund
  • Die Messung der Zustände oder der Anwesenheit von Substanzen in einer Umgebung durch die Detektion der Rate der Hydrolyse eines Mittels ist allgemein bekannt. Insbesondere ist die Verwendung von fluoreszierenden Substraten für solche Messungen bekannt, obgleich eine solche Verwendung typischerweise nicht für Messungen sehr niedriger Mengen an hydrolysierenden Mitteln wie Enzymen praktikabel ist. Im allgemeinen steigt die Fluoreszenz der Verbindung durch Entfernung eines chemischen Restes. Die Verbindungen des Stands der Technik sind jedoch ungeeignet gewesen zum Messen von geringen Mengen an Enzym in einer wäßrigen Umgebung.
    • A. Enzymmessung
  • Im allgemeinen wurde die Messung von alkalischer Phosphatase (AP) bei der Diagnose verschiedener Krankheiten eingesetzt, und zwar aufgrund ihres allgegenwärtigen Vorkommens in Zellmembranen von Geweben im Körper; Fernley, N.H., Mammilian Alkaline Phosphatases, in: Boyer, P.D. (Hrsg.), The Enzymes, Band IV, Academic Press, New York 1971, Seite 417- 447. Verschiedene Esterasen wuren ebenfalls für die klinische Diagnose von Krankheiten bestimmt; Bergmeyer, H.U., Methods of Enzymatic Analysis, 3. Ausgabe, Band IV, 1-143, Verlag Chemie 1984. Mit den jüngsten Fortschritten bei biologischen Techniken könnten diese Enzzme als Marker in Kombination mit biologischen Sonden zur Detektion bzw. zum Nachweis von komplementären biologischen Molekülen verwendet werden. Somit mißt die Aktivität des Enzyms indirekt die Menge des zu der Sonde komplementären biologischen Substanz. Obgleich verschiedene Esterasen verwendet werden können, liefert die Messung der alkalischen Phosphatase ein zweckdienliches Assay für die Detektion und Messung von komplementären biologischen Molekülen; Bergmeyer, supra, at Vols, 10-11.
  • Fruher wurde der Spiegel an AP unter Anwendung der UV-Sichtbares Licht-Spektrophotometrie, dem Radioimmunoassay (RIA) und fluoreszenten Substraten überwacht.
  • Man versuchte, UV-Verbindungen für Assays von AP zu verwenden, z. B. Thymolphthaleinmonophosphat, Coleman, C.M., Clin. Chim. Acta, 13:401 (1966), Phenolphtaleinmonophosphat, Wilkerson, J.H. und Vodden, A.V., Clin. Chem., 12:701 (1966) und para-Nitrophenylphosphat, Neuman, H. und Van Vrudendaal, M., Clin. Chim. Acta, 17:183 (1967). Diese Verbindungen sind etwa eintausend Mal weniger empfindlich als effiziente fluoreszierende Verbindungen, notwendig zur Bestimmung von 10 attomol/ml (10 x 10&supmin;¹&sup8; mol/ml) an AP.
  • Es wurden eine Vielzahl von fluoreszenten Substraten in der Literatur beschrieben, welche im AP-Assaynachweis verwendet wurden. Keines dieser Substrate war vollkommen befriedigend, und zwar aus einer Vielzahl von Gründen.
  • 7-Hydroxycoumarinphosphat, Glazer, R. und Haynes, M., Anal. Letters, 1(5):333-45 (1968) und Sherman, William R. und Robine, Eli. Anal. Chem, 40/4:803-51 (1968), erfordert einen hohen Substratspiegel von 10 mM, um das Enzym zu sättigen. Seine Stokes-Verschiebung beträgt 78 nm (Anregung von 376 nm und Emission von 454 nm) und die Raman-Fluoreszenz liegt bei 422 nm. Da das Raman in der Nähe des Fluoreszenzmaximums liegt, kann es das bei 454 nm erzeugte Signal maskieren. Somit könnten diese Faktoren nachteilige Wirkungen auf das Vermögen des Substrates haben, sehr niedrige Spiegel an AP schnell zu messen.
  • 2-Benzoxazolyl-7-hydroxycoumarinphosphat, Wolfbeis, Otto S. und Koller, Ernst, Mikrochemica Acta, 389-95 (1985), weist eine niedrige Stokes-Verschiebung von 44 nm auf (Anregung von 427 nm mit einer Emission von 471 nm). Ein zweites Negativum, das mit diesem Substrat assoziiert ist, ist seine niedrige Stabilität in wäßriger Lösung bei einem Tris-pH von 9,5, selbst bei -15 ºC.
  • 2-Phenyl-7-hydroxycoumarinphosphat, Otto S. und Koller, Ernst, Mikrochemica Acta, 389-95 (1985), weist eine höhere Stokes-Verschiebung von 88 nm (Anregung von 383 nm mit einer Emission von 471 nm) auf, jedoch besitzt es eine schlechte Stabilität in wäßriger Lösung, wie für die vorstehende Verbindung angemerkt.
  • Fluoresceinphosphat weist eine Stokes-Verschiebung von 25 nm (Anregung von 490 nm und Emission von 515 nm) auf. Diese geringe Stokes-Verschiebung macht es für die Bestimmung von AP bei niedrigen Spiegeln völlig ungeeignet; siehe Tiffany, T.O.; Watsky, M.B.; Burtis, C.A. und Thacker, L.H., Clin. Chem., 19/8:871-82 (1973).
  • 3-Hydroxy-2-naphthanilid-6-bromo-, 3-Hydroxy-2-naphthyl-o-anisidinphosphat, Guilbault, G.G., Newer Fluoremetric Methods for the Analysis of Biologiacally Important Compounds, In: Fluorescence Techniques in Cell Biology, Thaer, A.A. und Sernetz, M., Hrsg., Springer-Verlag, N.Y., Heidelberg, Berlin, 235-42 (1983); Vaughn, A.; Guilbault, G. und Hackney, D., Anal. Chem., 43/6:721-4 (1971) und Guilbault, G.G., J. Res. NBA, 76A/6:607-12 (1972), besitzt eine Stokes-Verschiebung von 110 nm (Anregung von 405 nm und Emission von 515 nm). Gleichwohl wird in der Druckschrift von 1971 angemerkt, daß eine restliche Fluoreszenz bei 515 nm vorliegt, aufgrund des verbleibenden phosphorylierten Substrates, welches die letztendliche Sensitivität des Substrates verringert wurde. Auch dieses Substrat wurde nur in einem Festflächenassay bei intakten Zellen zur mikroskopischen Visualisierung der Anwesenheit von AP verwendet. Aufgrund der Struktur dieses Substrates ist es wahrscheinlich, daß das hydrolysierte Produkt unter den basischen wäßrigen Bedingungen von Assays für biologisches Material unlöslich ist. Dies wurde die Brauchbarkeit des Substrates beschränken.
  • 2-Hydroxy-3-naphthoesäureanilidphosphat, Tsou, K.C. und Matsukawa, Sadao, J. Med. Chem., 11/15:1097-9 (1968), besitzt eine Stokes-Verschiebung von 220 nm (Anregung von 300 nm und Emission von 520 nm). Gleichwohl wurde dieses Substrat nur in einem histochemischen Assaysystem verwendet. Das hydrolysierte Produkt 2-Hydroxy-3-naphthoesäureanilid besitzt eine geringe Löslichkeit was seine Verwendung in einem kinetischen oder Endpunkt-Assay komplizieren könnte. Auch wird berichtet, daß seine Hintergrund-Fluoreszenz bei 520 nm relativ hoch ist, was angibt, daß seine letztendliche Empfindlichkeit niedrig sein könnte, und zwar aufgrund der hohen Werte des Hintergrundrauschens.
  • 3-O-Methylfluoresceinphosphat (3-O-MFP), Hill, Hoyle D., Summer, George K. und Waters, Michael D., Anal. Biochem., 24:9-17 (1968); Wolfbeis, Otto S. und Koller, Ernst, Mikrochemica Acta, 389-95 (1985); Hashimoto, Shinya, Kobayashi, Kensei; Fujiwara, Kitao, Harabuchi, Hiroki und Fuwa, Keiichiro, Bunseki Kagakü, 32:E177-E184 (183) und Norgaard, Aage, Kjeldsen, Keld, Larsen, Jim Stenfatt; Larsen, Christian Gronhoj und Larsen, Frederik Gronhoj, Scand. Clin. Lab. Invest., 45/2:139-44 (1985), besitzt eine Stokes-Verschiebung von 15 nm. Hashimoto et al. haben ebenfalls auf die Probleme der Hydrolyse des Phosphats unter wäßrigen Bedingungen, die für das Assay von AP geeignet sind, hingewiesen.
  • Riboflavin-5-phosphat, Glazer, R. und Haynes, M., Anal. Letters, 1(5):333-45 (1968) und Takeuchi, T. und Nogami, S., Acta Pathol. Japan, 4, 277 (1954), wurde nur in Gewebe-AP- Assays verwendet. Über die letztendliche Empfindlichkeit des Assays wurde nichts berichtet.
  • Flavondiphosphat besitzt eine Emissionswellenlänge von 510 nm; Glazer, R. und Haynes, M. Anal. Letters, 1(5):33-45 (1968) und Land, D.B. und Jackim, E. Anal. Biochem., 16:481 (1966). Die Anregungswellenlange wurde nicht berichtet. Die Autoren berichteten, daß es ein stabileres Substrat als 3-O-MFP und ein empfindlicherer Fluoreszenzindikator als Beta- Naphtholphosphat war. Diese Substanz erfordert die Entfernung von zwei Phosphatgruppen, bevor eine Iniziierung der Fluoreszenz festgestellt werden kann. Dieses würde drastische Probleme für ein kinetisches Assays erfordern, bei dem nur eine Fraktion des Ausgangssubstrates zum Monophosphat, welches nicht fluoreszent ist, umgewandelt wird. Dann wurde das Monophosphat zu dem 3-Hydroxy-flavon umgewandelt werden müssen, bevor die Fluoreszenzemission festgestellt werden könnte.
  • 4-Methylumbelliferylphosphat (4-MUP), Wollbeis, Otto S. und Koller, Ernst, Microchemical Acta, 389-95 (1985); Cornish, Coralie J., Neale, Francis C. und Posen, Solomon, Amer. J. Clin. Pathol., 53/1:68-76 (1970) und Sherman, William R. und Robine, Eli, Anal. Chem., 40/4:803-5 (1978), besitzt eine Stokes-Verschiebung von 82 nm mit einer Anregung bei 367 nm. Die Emission liegt bei 449 nm. Das Raman erster Ordnung beträgt 416 nm, was 1/120 von der des 4-Methylumbelliferons (4-MU) entspricht. Die Emission trägt zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz bei. Cornish et al. berichten, daß 4-MUP eine Emission bei 465 nm aufweist, welche 1/120 von der des 4-Methylumbelliferons (4-MU) ist. Es wurde von diesen Autoren ebenfalls festgestellt, daß das 4-MUP in basischem Trispuffer zerfällt. Sie waren in der Lage, dieses Hydrolyseproblem zu verringern, indem das 4-MUP in einem Bicarbonat/Carbonat- Puffer hergestellt wurde. Hashimoto, Shinya, Kobayashi, Kensei, Fujiwara, Kitao, Harabuchi, Hiroki und Fuwa, Keiichiro, Bunseki Kagaku, 32:E177-E184 (1983) berichteten, daß ihre Durchsicht der Literatur zeigten, daß 4-MUP "das am meisten versprechende Substrat flir eine weitere Untersuchung bezüglich gelöster Enzyme (AP) in natürlichen Gewässern bzw. in Wassermiheus zu sein scheint. Unter Verwendung dieses Substrats mit einer 48-stündigen Inkubation betrug der niedrigste Grenzwert der Bestimmung der AP-Aktivität 1 x 10&supmin;¹² mol l&supmin;¹ min&supmin;¹. Andererseits betrug die des herkömmlichen spektrophotometrischen Verfahrens unter Verwendung von p-NPP 0,4 x 10&supmin;&sup9; mol l&supmin;¹ min&supmin;¹".
  • DeLuca, Marlene und McElroy, W.D., Meth. Anal. Chem., 40/4:803-5 (1968) berichten, daß L- (+)-Luciferin (LH) in einer waßrigen Lösung mit einem pH von 9,0 eine stark fluoreszierende Verbindung mit einem Anregungswert von 385 nm und mit einer Emission bei etwa 540 nm ist. In einer waßrigen Lösung beträgt die Quantenausbeute 0,62. LH ist eine instabile Verbindung in waßrigen basischen Lösungen.
  • Von 2-Carbamoyl-6-methoxybenzothiazol, ein Intermediat in der Synthese von LH, wird in Methods of Enzymology, Band 57, Seite 19 berichtet. Es wurde von keiner Fluoreszenz bei diesem Material berichtet, und dieses wurde in unseren Experimenten verifiziert.
    • B. Messung der Umweltbedingung
  • Da Umweltfaktoren dafür bekannt, sind, eine Hydrolyse von Phosphatgruppen zu bewirken, kann die Feststellung bzw. Überwachung der Rate der Hydrolyse indirekt verschiedene Umweltzustände bzw. -bedingungen angeben. Z.B. können Extrema in der Temperatur oder dem pH-Wert oder Metalle als hydrolysierende Kräfte agieren. Demzufolge ist es von Wert, eine fluoreszierende Verbindung zu haben, welche durch die Anheftung eines chemischen Restes inhibiert wird und welche durch Abspaltung des chemischen Restes mittels hydrolysierender Kräfte eine wiederhergestellte Fluoreszenz zeigt.
  • Die Verwendung kolorimetrischer Testes in bezug auf die Anwesenheit von Sauerstoff ist im Fachbereich bekannt, z. B. kolorimetrische Tests für anaerobe Umgebungen Fluoreszierende Verbindungen können ebenfalls zur Messung des Sauerstoffanteils verwendet werden. Im allgemeinen, wenn fluoreszierende Verbindungen eine charakteristisch "lange Lebenszeit" besitzen, ist die Verbindung in der Lage, durch Anwesenheit von Sauerstoff gequencht zu werden. Dies tritt auf, da Elektronen in der fluoreszierenden Verbindung auf ein niedrigeres Energieniveau fallen, wenn sie Lichtenergie abgeben. Wenn die Zeitdauer, in der die Elektronen zurückfallen, ausreichend ist, wird etwas der von dem fallenden Elektron abgegebenen Energie durch Sauerstoffmoleküle nutzbar gemacht. Die minimale "Lebensdauer" für das fallende Elektron beträgt etwa 10&supmin;¹&sup5; Sekunden, jedoch flihrt eine längere Lebensdauer zu einer empfindlicheren Sauerstoffmessung. Demzufolge ist es von Wert, eine fluoreszierende Verbindung mit "langer Lebensdauer" zu haben, um Oxidation zu messen.
    • C. Direkt Detektion, Assaying oder Überwachen biologischer Moleküle
  • Marker für biologische Liganden sind im Fachbereich allgemein bekannt, und diese schließen radioaktive Substanzen, kolorimetrische Indikatoren und fluoreszierende Verbindungen ein. Typischerweise werden diese Substanzen entweder in den biologischen Liganden eingebracht, wie bei der Verwendung radioaktiver Nukleotide, oder sie werden chemisch an den Liganden gebunden, wie bei der Verwendung von Glutaraldehyd oder verschiedenen chemischen "Extensionsarmen", welche verwendet werden, um fluoreszierende Marker an Antikörpern zu binden.
  • Demzufolge liefert die vorliegende Erfindung die folgenden Vorteile:
  • 1. Fluoreszierende Verbindungen, welche in einer wäßrigen Umgebung Stabilität beibehalten;
  • 2. Fluoreszierende Verbindungen, welche über dem Hintergrundrauschen leicht detektierbar smd;
  • 3. Fluoreszierende Verbindungen, welche nach Anknüpfung eines chemischen Restes ihre Fluoreszenz stark verringern, jedoch nach Entfernung des chemischen Restes stark fluoreszierend sind;
  • 4. Fluoreszierende Verbindungen, welche eine Stokes-Verschiebung zeigen, die zur Verwendung als eine Assayindikation oder als anderer Marker ausreicht;
  • 5. Fluoreszierende Verbindungen, welche ein Mittel zum Nachweis von wenigstens etwa 10- attomolaren (10&supmin;¹&sup8; molaren) Konzentration an alkalischer Phosphatase bereitstellen;
  • 6. Fluoreszierende Verbindungen, welche eine "lange Lebensdauer" besitzen und ein Mittel zum Nachweis oxidierender Mittel bereitstellen;
  • 7. Fluoreszierende Verbindungen, welche Fluoreszenzcharakteristika in einer Vielzahl von Lösungsmitteln beibehalten;
  • 8. Nicht-fluoreszierende Phosphatverbindungen, welche in Wasser stabil sind und fluoreszierende Verbindungen bei einer Hydrolyse bilden können;
  • 9. Eine Klasse an fluoreszierenden Verbindungen, von der einige Vertreter mittels sichtbarem Licht angeregt werden können.
  • Die WO87/02667 beschreibt D-Luciferinderivate, wie D-Luciferyl-L-phenylalanin, welches bei Spaltung Luciferin ergibt, welches dann ein Substrat für Luciferase ist, welche eine biolumineszente Verbindung freisetzt. Aus der Menge des bei der Reaktion mit Luciferase emittierten Lichtes kann die Menge des Ligand-Enzym-Konjugats quantitativ bestimmt werden, was flir den Nachweis eines mit einem Enzym markierten Liganden verwendet werden kann.
  • Suzuki et al. (Tetrahedron 28, 4075-4082, 1972) beschreiben Leuchtkäfer- bzw. Glühwürmchenoxyluciferin, 2-(6'-Hydroxybezothiazol-2'-yl)-4-hydroxythiazol, welches als ein Produkt der Leuchtkäfer-Chemiluniineszenz und in vivo-Biolumineszenz identifiziert wurde.
  • Die US-A-4456599 beschreibt neue Phosphate von 6 (oder 5)-Hydroxy-2-benzothiazolsulfonamiden, welche für die topische Behandlung von erhöhtem intraokularem Druck brauchbar ist.
  • Suzuki et al. (Agr. Biol. Chem. 36 Seiten 2213-2221, 1972) beschreibt die Synthese von mehreren 4-Thiazolin-Derivaten durch die Kondensation von geeignetem Arylcyanid und Ethylthioglycolat (oder Derivaten). Die Reaktionsrate beeinflussende Faktoren werden diskutiert.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Derivaten von Benzothiazol (BT) als Fluoreszenzsubstrate. Stark fluoreszierende Derivate von BT können zu nicht-fluoreszierenden Derivaten durch die Anknüpfung eines chemischen Restes an dem BT-Derivat umgewandelt werden. Wenn der chemische Rest abgespalten wird oder in anderer Weise von dem nichtfluoreszierenden Derivat dissoziiert, wird die Fluoreszenz wiederhergestellt.
  • Bisher wurde nicht gezeigt, daß einfache Benzothiazolderivate fluoreszent sind. Obgleich einige wenige fluoreszierende Benzothiazolverbindungen in der Literatur angeführt sind, wurde die eigentliche Fluoreszenzcharakteristik weder berichtet, noch war sie bekannt. Fruher wurde von 2-Carbamoyl-6-methoxybenzothiazol berichtet, das es ein nicht-fluoreszierendes Derivat von Luciferin ist, sieht supra, und dies wurde unter unseren Händen bestätigt. Sowohl 2-Cyano-6- hydroxybenzothiazol (CBT), Deluca, M.A. und McElroy, W.D., Methods of Enzymology, 57:15-24 (Academic Press), als auch 2-Carbamoyl-6-hydroxybenzothiazol, Faure, R. et al., Org. Magn. Reson. 11:617-27 (1978), wurden in der Literatur berichtet, doch wurde weder die Fluoreszenz solcher Verbindungen, noch wurde die Inhibierung der Fluoreszenz solcher Verbindungen durch die Anheftung eines chemischen Restes vorgestellt. Es gab keinen Hinweis darauf, daß Benzothiazolderivate fluoreszierend sein könnten, unter was für Bedingungen eine solche Fluoreszenz gezeigt wird und unter was für Bedingungen die Fluoreszenz inhibiert wird. Somit sind die Fluoreszenzeigenschaften von CBT sowie von ABT und anderen BT-Derivaten im Hinblick auf die Berichte von diesen Verbindungen vor der vorliegenden Erfindung unerwartet.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der fluoreszierenden Derivate von BT ohne Anheftung eines chemischen Restes. Diese Verbindungen können verwendet werden, um biologische Moleküle nachzuweisen, wie z.B. durch die Markierung biologischer Moleküle. Derivate von BT können ebenfalls verwendet werden, um Sauerstoffanteile zu messen. Wenn Sauerstoff die von den angeregten Elektronen, die auf niedrigere Energiestufen in den fluoreszierenden Derivaten von BT fallen, emittierte Energie aufnimmt, nimmt die Fluoreszenz von fluoreszierenden Derivaten vom BT-Molekül ab. So gibt die Abnahme der Fluoreszenz die Menge an in dem Assaysystem vorhandenen Sauerstoff an.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit der fluoreszierenden Derivate von BT, die Fluoreszenz in organischen Lösungsmitteln beizubehalten. Somit ist sowohl die Verwendung in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln für den Nachweis und die Messung von Bedingungen und Substanzen in einer Umgebung möglich.
  • Die vorliegende Erfindung sieht eine Fluoreszenzmarkerverbindung vor, die zum Nachweis der enzymatischen Aktivität eines ausgewählten Enzyms in der Lage ist, wobei der Marker folgende Formel hat:
  • wobei:
  • (a) wenigstens einer der Kohlenstoffe an irgendeiner der Positionen 4, 5, 6 oder 7 an einer anionischen Gruppe gebunden ist, die an einer fluoreszenzhemmenden Gruppe gebunden ist, wobei die anionische Gruppe und die fluoreszenzhemmende Gruppe durch eine Bindung verbunden sind, die durch das ausgewählte Enzym spaltbar ist;
  • (b) der Rest X mindestens 2 Atome umfaßt und die Resonanz des Benzothiazolrings erweitert;
  • wobei sie im wesentlichen nicht-fluoreszierend ist und durch welchen die Spaltung der Bindung zwischen der anionischen Gruppe und der fluoreszenzhemmenden Gruppe vermittels des Enzyms ein Reaktionsprodukt erzeugt wird, welches stark fluoreszierend ist.
  • Eine anionische Gruppe in Resonanz mit dem Benzolring, z.B. ein ionisierbarer Wasserstoff, ist für die Addition eines für die Inhibierung der Fluoreszenz geeigneten, chemischen Restes notwendig. Der an dem 2-Kohlenstoff gebundene zweiatomige chemische Rest ist eine notwendige Erweiterung des Resonanzsystems zur Fluoreszenz. Es wurde hierin festgestellt, daß mit erhöhter Länge und Konjugation des am 2-Kohlenstoff gebundenen chemischen Restes die Wellenlänge des von der Verbindung emittierten Lichtes und die Anregungswellenlänge ebenfalls erhöht sind. Somit wird mit Erhöhung der Anzahl an Atomen im chemischen Rest, der an dem 2-Kohlenstoff gebunden ist, die Fluoreszenz in tieferem Farbton erscheinen.
  • Hierin wird die folgende Terminologie so verwendet, wie sie unten definiert ist:
  • ABT: 2-Carbamoyl-6-hydroxybenzothiazol
  • BBT: 2'-(2-Benzothiazolyl)-6'-hydroxybenzothiazol
  • CBT: 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol
  • Stokes-Verschiebung: Ein physikalische Konstante, die für lumineszierende Moleküle charakteristisch ist, die den Unterschied zwischen der Wellenlänge des Anregungs- und des Emissionsmaximums angibt.
  • Rayleigh-Streuung: Interferenz, die durch das als Ergebnis der durch die Anregung durch Photonenenergie bedingen Elektronenvibration emittierten Lichtes bedingt ist.
  • Raman: Erscheint in Fluoreszenzspektren bei höheren und niedrigeren Wellenlängen als der Rayleigh-Streuungspeak. Diese Raman-Banden sind Satelliten des Rayleigh-Streuungspeaks mit einer konstanten Frequenzdifferenz zu der Anregungstrahlung. Diese Banden werden bedingt durch die Vibrationsenergie, die von diesem Anregungsphoton entweder hinzuaddiert oder subtrahiert wird.
  • Fluoreszenzeffizienz: Die Menge an emittiertem Licht als Anteil des zur Anregung verwendeten.
  • Anregungswellenlänge: Die Wellenlänge des Lichtes, das zur Erzeugung der Fluoreszenzemission verwendet wird, gemessen in willkürlichen Einheiten.
  • Emissionswellenlänge: Die Wellenlänge an Licht, das durch ein fluoreszierendes Molekül nach der Anregung emittiert wird.
  • Km: Die Substratkonzentration, bei der die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion halbmaximal ist.
  • Turnoverzahl: Die Anzahl an Substratmolekülen, die pro Zeiteinheit durch ein einzelnes Enzymmolekül umgewandelt wird, wenn das Enzym der geschwindigkeitsbeschrankende Faktor ist.
  • Molare Absoptivität: Die Intensität einer Absorptionsbande im UV- oder sichtbaren Spektrum.
  • Substrat: Das Molekül, auf das das Enzym eine katalytische Wirkung ausübt.
  • Enzym: Katalysator, der in der Lage ist, die Geschwindigkeit spezifischer chemischer Reaktionen zu steigern.
  • Resonanz: Wenn der Beitrag jeder von mehreren Strukturen in gewisser Weise gewichtet werden soll, die mit dem Bindungsgrad einhergeht, den jede haben würde, wenn sie ein tatsächliches Molekül mit der spezifischen Geometrie darstellen würde.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Figur A repräsentiert die Struktur von CBT, ABT und BBT.
  • Die Figur B repräsentiert die Struktur von CBTP, ABTP und BBTP.
  • Die Figur C ist ein Diagramm, das einen Weg illustriert, durch den BBTP verwendet wird, um alkalische Phosphatase (AP) zu bestimmen.
  • Die Figur D zeigt einen Weg, durch welchen BBTP verwendet wird, um ein zu einem Antikörper komplementäres Material zu messen, bei dem alkalische Phosphatase (AP) gebunden ist. Der Antikörper/AP-Komplex ist an einem komplementären Molekül gebunden. Die AP wirkt dahingehend, daß sie den Phosphatrest von phosphoryliertem BBT abspaltet und die Fluoreszenz dadurch wiederherstellt. Die Messung der Fluoreszenz gibt somit die Anwesenheit und Menge des komplementären Moleküls an.
  • Die Figur E ist ein Graph, der die Empfindlichkeit von BBTP gegenüber AP zeigt. Es wurde gezeigt, daß BBTP 0,3 Attomol AP in einem Volumen von 3,0 ml mißt. Mit einem geeigneten Instrumentarium könnte das Zellvolumen auf 10 oder 100 Mikroliter verringert werden, was zu einer projezierten Empfindlichkeit von 0,001 bis 0,01 Attomol führen würde. Es ist festzustellen, daß eine Empfindlichkeit von 0,001 Attomol 600 in einer 60 minütigen Assayzeit bestimmten Kopien an AP entsprechen wurde.
  • Die Figur F ist ein Graph, der die Hydrolyserate von BBTP bei 35 ºC und die entsprechende Zunahme in der Hintergrundfluoreszenz zeigt. Ebenfalls ist die Reaktionsgeschwindigkeit bei 10 aM-, 100 aM und 1000 aM-Lösungen von AP mit BBTP angeführt.
  • Die Figur G ist ein Graph der Hintergrundfluoreszenz von BBTP gegen die Zeit in einer wäßrigen Lösung bei 4 ºC und 35 ºC.
  • Die Figur H ist ein Graph der Hintergrundfluoreszenz von ABTP gegen die Zeit in einer wäßrigen Lösung bei 4 ºC und 35 ºC.
  • Die Figur I ist ein Graph der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von BBTP gegen die Zeit bei 4 ºC.
  • Die Figur J ist ein Graph der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von ABTP mit AP gegen die Zeit bei 4 ºC.
  • Die Figur K ist ein Graph, der die Fluoreszenz von ABT gegen die Konzentration zeigt.
  • Die Figur L ist ein Graph, der die Fluoreszenz von BBT gegen die Konzentration zeigt.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die folgende Beschreibung liefert Details der Art und Weise, in der die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erstellt und verwendet werden können, um sehr geringe Mengen an Enzymen oder anderen hydrolysierenden Mitteln unter Verwendung eines fluoreszierenden Substrates nachzuweisen oder zu messen. Diese Beschreibung sollte nicht als spezifische Beschränkung der Erfindung ausgelegt werden, obgleich sie für die vorliegende Erfindung exemplarisch ist. Solche Variationen, welche innerhalb des Blickfeldes eines im Fachbereich erfahrenen Fachmannes liegen wurden, sind dergestalt anzusehen, daß sie innerhalb des Umfanges dieser Erfindung fallen.
  • Insbesondere die Verbindungen 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol (CBT), 2-Carbamoyl-6- hydroxybenzothiazol (ABT), 2'-(2-Benzothiazolyl)-6'-hydroxybenzothiazol (BBT) sind in einer basischen wäßrigen Lösung von 445 nm - 580 nm (ABT und CBT) und von 460 nm - 660 nm (BBT) fluoreszent, wobei das Maximum für die Emission bei 510 nm, 518 nm bzw. 561 nm auftritt. Die Anregung tritt über einen Bereich von 320 nm - 430 nm (CBT), 325 - 440 nm (ABT) und 330 nm - 480 nm (BBT) auf, wobei das Maximum bei 381 nm, 381nm bzw. 419 nm auftritt. Siehe die Figur A bezüglich der Strukturen dieser Verbindungen und die Tabelle 1 bezüglich einer Zusammenfassung der oben erwähnten Daten.
  • Ein chemischer Rest kann den fluoreszierenden Derivaten von Hydroxybenzothiazol hinzugesetzt werden, welcher in starkem Maße das Fluoreszenzvermögen des Moleküls inhibiert. Wenn die Anbindung des chemischen Restes zu einem geeigneten Substrat für ein Enzym flihrt, wird der Rest von dem nicht-fluoreszierenden Derivat vom Hydroxybenzothiazolmolekül abgespalten, und die Fluoreszenz wird wiederhergestellt. Auf diese Weise können z.B. CBT, ABT und BBT als ein Fluoreszenzmarker für den Nachweis enzymatischer Aktivität verwendet werden. Ein Phophatrest kann z.B. an BBT addiert werden, um das nichtfluoreszierende Derivat 2-(2-Benzothiazol)-6-hydroxybenzothiazolphosphat (BBTP), ein geeignetes Substrat für alkalische Phosphatase, herzustellen. Bei Abspaltung des Phosphatrestes durch alkalische Phosphatase (AP) liefert die Fluoreszenz mithin die Messung der enzymatischen Aktivität. Die enzymatische Reaktion von AP mit BBTP ist in Figur C gezeigt. Die molekulare Struktur von hergestellten Phosphatderivaten ist in der Figur B gezeigt.
  • Andere chemische Reste können an BBT gebunden werden. Beispiele schließen chemische Reste, die ein ausreichendes Substrat für Cholinesterase, Cholesterolesterase, Lipasen liefern, und jedweden Rest, welcher in der Lage ist, von dem nicht-fluoreszierenden Derivat von Hydroxybenzothiazol durch ein Enzym abgespalten zu werden, ein. Reste, die in der Lage sind, durch andere hydrolytische Kräfte abgespalten zu werden, können ebenfalls zum Zwecke des Assaynachweisens dieser hydrolysierenden Kräfte gebunden werden.
  • Darüber hinaus können CBT, ABT und BBT indirekt oder direkt für ein Assay biologischer Moleküle verwendet werden. Das Enzym kann an biologischen Liganden, wie monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon, Nukleinsäuresonden oder anderen biologischen Zusammensetzungen, die zum Nachweis eines komplementären Moleküls in der Lage sind, gebunden werden. Auf diese Weise bindet das/der Enzym/Ligand an einem komplementären biologischen Molekül, und unter Zugabe eines Substrates, bestehend aus CBT, ABT oder BBT, mit einem geeigneten chemischen Rest unter geeigneten Bedingungen, spaltet das Enzym den chemischen Rest und zeigt CBT, ABT oder BBT eine starke Fluoreszenz. Der Nachweis oder die Messung dieser Fluoreszenz ermöglicht den Nachweis und die Messung des biologischen Materials, das zu der Sonde komplementär ist. Es ist zu beachten, daß solche Assays unter Verwendung von biologischen Proben, wie Urin, Blut oder Gewebeprobe, durchgeführt werden können. Ein Beispiel der Verwendung einer phosphorylierten CBT- Zusammensetzung und alkalischer Phosphatase ist in Figur D gezeigt. Die direkte Messung von biologischen Molekülen kann bewerkstelligt werden, indem ABT, BBT oder CBT an einen biologischen Liganden vermittels von Verfahren, die dem Fachmann im Fachgebiet bekannt sind, gebunden wird und das Fluoreszenzsignal nachgewiesen wird.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von CBT, ABT oder BBT, um freie Radikale, wie die Sauerstoffkonzentration, insbesondere in Blut zu messen. Da freie Radikale wie Sauerstoff die während der Fluoreszenz ausgestrahlte Energie sich aneignen kann, kann eine Abnahme der Fluoreszenz von Derivaten mit dem Sauerstoffgehalt korrelliert werden. Somit kann die Messung der Fluoreszenz eingesetzt werden, um die Sauerstoffkonzentration zu bestimmen.
  • Es ist festzustellen, da CBT, ABT und BBT Fluoreszenzcharakteristika in unterschiedlichen Lösungsmitteln beibehalten, die Verbindung verwendet werden kann, um solche Messungen in unterschiedlichen Lösungsmitteln durchzuführen, siehe Tabelle 3.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen 1. Verwendete Gerätschaft
  • Das UV/VIS-Instrument war ein Beckman Modell der Nummer 25. Das NMR-Instrument war ein Varian Modell EM360A, 60 MHz Protoneneinheit, oder eine GN-500 Einheit mit 500 MHz von General Electric. Die NMR-Verschiebungen wurden unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard aufgezeichnet. Ein Fluorometer war ein Spsex II Fluorolog Modell 112 mit einem einzelnen Monochromator für die Anregung und einem Doppelmonochromator für die Emission. Es wurde unter Anwendung der Frontseitenfluoreszenz laufengelassen. Das zweite Fluorometer war ein Turner Modell 111 mit von Turner gekauften Filtern. Die Schmelzpunkt waren nicht korreliert und wurden auf einem Thomas Hoover-Kapillarschmelzpunktinstrument bestimmt. Das HPLC-Instrument war eine Waters- Dualpumpeneinheit (Modell M-6000), die mit einer Lösungsmittelprogrammiervorrichtung (Modell 660) und einem UV/VIS-Detektor mit fester Wellenlange (Modell 440) ausgestattet war. Die verwendete Säule war eine 3,9 x 25 mm große Umkehrphasensäule von Waters, C-18, 10 Mikrometer, unregelmäßiges Silikagel. Die für die HPLC-Analyse verwendete Lösung A wurde unter Verwendung von 300 ml Wasser mit HPLC-Güteklasse und 750 ml Methanol mit HPLC-Güteklasse mit 5,52 g Mononatriumphosphatmonohydrat hergestellt. Wenn nicht anders angegeben, betrug die für die HPLC-Analyse verwendete Strömung 1,0 ml pro Minute. Die verwendeten Reaktorgefäße haben eine Größe von 1 ml bis 10 ml und waren aus Pyrexglas hergestellt, welche ein Silikonseptum mit einer Teflonfläche auf der Reagenzienseite und einen internen magnetischen Teflon-Rührstab aufwies. Der pH-Wert wurde unter Verwendung eines Fisher Accumet digital Modell 520 bestimmt. Bevor die Gerätschaft, die mit den Substratlösungen in Kontakt kam, verwendet wurde, wurde sie in 1N Salzsäure drei Stunden lang eingetaucht und dann gründlich mit frisch destilliertem, entionisiertem Wasser gespült. Dies stellt für gewöhnlich sicher, daß die vorhandene Umgebungs-AP zerstört wurde. Jede einzelne Charge an verwendetem Rinderserumalbumin von Sigma wurde bezüglich des Anteils an vorliegendem AP evaluiert.
    • 2. Verwendete Reagenzien
  • Wenn nicht anders angegeben waren die verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel von der ACS-Reagenziengüteklasse. Das verwendete DEA wurde vor der Verwendung in Glas vakuumdestilliert. Das verwendete Tetrahydrofuran (THF) wurde über Calciumhydrid getrocknet und sofort vor der Verwendung destilliert. Das verwendete Wasser war frisch deionisiert (2 Megaohm) und destilliert. Das AMPD wurde von JBL Scientific, Katalognummer 1250A, zur Verfügung gestellt. Triethylamin, Benzothiazol und 2-Amino-thiophenol wurden von Aldrich erhalten. Trimethylbromsilan wurde von Petrarch Systems erhalten. Das 2-Chlor-6- hydroxybenzothiazol, 2-Amino-6-hydroxybenzothiazol und 2-Cyano-6-methoxybenzothiazol wurden freundlicherweise von Professor Neil Bagett, Department of Clinical Chemistry of the University of Birmingham, Birmingham, Großbritannien, zur Verfügung gestellt. Diese Verbindungen wurden unter Verwendung der von Bowie, L.J. (1978) Methods in Enzymology (Deluca, M.A., Hrsg.), Band 57, Seiten 15-28, Academic Press, N.Y., beschriebenen Verfahren hergestellt.
    • 3. Fluoreszenzeigenschaften a. Fluoreszenzeigenschaften von CBT, ABT und BBT
  • Die Fluoreszenzeigenschaften von CBT, ABT und BBT, Benzothiazol (BT), 2-Chlor-6- hydroxybenzothiazol (Cl-BT), 2-Amino-6-hydroxybenzothiazol (Amino-BT) und 2-Cyano-6- methoxybenzothiazol (CN-Methoxy-BT) wurden in einer wäßrigen Lösung mit einem pH von 10,2 mit 0,1 M 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (AMPD), gemessen. Die ungefähre Fluoreszenzeffizienz wurde bestimmt, indem die entsprechende Verbindung in einem geeigneten Lösungsmittel (Methanol oder Ethanol) gelöst wurden, wodurch man 10 mg pro 10 ml Lösungsmittel erhielt. Dann wurden 100 Miktoliter dieser Lösung zu 9,9 ml Puffer, der 0,1 M 2- Amino-2-methyl-1,3-propandiol (AMPD), pH-Wert von 10,0, enthielt, hinzugesetzt. Eine von der Hand gehaltene Fluoreszenzquelle (254 nm) wurde verwendet, um die Lösung in einer Quarzzelle anzuregen, und Sichtprüfüngen wurden aufgezeichnet. Wenn diese Lösung fluoreszierend war, wurde sie 1/10 verdünnt und wurde die Messung wiederholt. Es wurde herausgefunden, daß BT, Cl-BT, Amino-BT und CN-Methoxy-BT alle um mindestens drei Größenordnungen niedriger in ihrer Fluoreszenzefflzienz waren als CBT, ABT und BBT. Somit scheint es, daß wenn der Benzothiazolrest eine ionisierbare Gruppe in dem Benzolring enthält, und eine Gruppe in der Position zwei, welche die Konjugation ausdehnt, Fluoreszenzfähigkeiten dramatisch erhöht werden können.
  • Die Fluoreszenzeigenschatten von CBT, ABT und BBT wurden gemessen und mit jenen von 4- Methyl-umbelliferon (4-MU) verglichen. Diese Information wird in Tabelle 1 dargelegt.; siehe Wollbeis, Otto 5. und Koller, Ernst, Mikrochemica Acta, 389-95. Zunächst betrug das molare Absorptionsvermögen (Emax) von CBT, ABT und BBT 15 500 (wäßrige 0,10 M AMPD, pH 10,2), 13 300 (wäßrige 0,392 M Natriumcarbonat, pH 11,0) und 33 000 (wäßrige 0,1 M DEA, pH 10,0). Diese molaren Absorptionsvermogen wurden bei 378 nm, 368 nm bzw. 415 nm bestimmt. Als zweites stellte man fest, daß das Anregungsmaximum sowohl für CBT als auch ABT bei 381 nm lag, wobei BBT sein Anregungsmaximum bei 419 nm hatte. Das Emissionsmaximum lag bei 510 nm, 518 nm bzw. 561 nm für CBT, ABT bzw. BBT. Die Stokes-Verschiebung betrug 129 nm, 137 nm bzw. 142 nm. Diese Daten wurden unter Verwendung der Spsex II-Frontflächen-Fluoreszenz in 0,10 M AMPD, pH 10,0, gesammelt. Das Raman für Wasser lag bei 433 nm für CBT. Somit stört das Raman für Wasser nicht das Assay. Diese Daten zeigen deutlich, daß diese Verbindungen die gewünschte Stokes-Verschiebung besaßen und daß das Wasser-Raman gut von der Fluoreszenzemission entfernt wurde.
  • Der nächste zu bestimmende Faktor war die Fluoreszenzeffizienz. Typischerweise wurde eine Fluoreszenzeffizienz von etwa 1 % als praktikabel angesehen, und 4-MU besitzt eine charakteristische Effizienz von 20-40 %. Ein Vergleich wurde zwischen CBT und 4-MU vorgenommen. Jede Verbindung wurde bei ihrem Anregungsinaximum angeregt. Unter Verwendung der Frontseitenfluoreszenz wurde festgestellt, daß 4-MU 6,86 Zähmpulse/Femtomol und daß CBT unter identischen Bedingungen 2,85 Zählimpulse/fm ergaben. Somit lag CBT sehr nahe an der Fluoreszenzeffizienz von 4-MU; siehe die Figuren K und L bezüglich der Fluoreszenzempfindlichkeit von ABT und BBT. Fluoreszenzdaten wurden unter Verwendung eines Turner-Modells 111 gesammelt. Die Kurven sind linear sowohl beim 1x- und 3x-Bereich über 10 bis 100 Nanomolar hinweg.
    • b. Fluoreszenzeigenschaften von CBTP
  • CBT wurde phosphoryliert unter Bildung von CBTP-2-cyano-6-hydroxybenzothiazolphosphat (CBTP). Die Struktur ist in Figur B gezeigt. Unerwarteterweise zeigt CBTP ein sehr geringes Fluoreszennniveau, was anzeigt, daß der Phosphatrest drastisch die Fluoreszenz von CBT inhibiert.
  • Die Fluoreszenzdaten für CBTP wurden wie folgt bestimmt. Ein mg CBTP wurde in 2,0 ml Puffer gelöst: 0,10 M AMPD, 0,10 M NaCl, 1,0 mM MgCl&sub2;, 0,10 mM ZnCl&sub2;, pH 10,2. Diese Stammlösung wurde von 10 Mikrolitern auf 500 Mikrolitern in Puffer verdünnt. Die Einstellungen betrugen 700 Volt auf der Hochspannungsseite. Das Anregungsmaximum betrug 377 nm mit einer maximalen Fluoreszenz von 53 000 cps bei 504 nm. Eine geringe Menge an AP wurde hinzugesetzt, um das CBTP unter Bildung von CBT zu hydrolysieren. Nachdem dieses abgeschlossen war, waren die Ablesungen bei 501 nm außerhalb des Skalenbereiches. Durch Verringerung der Hochspannung auf 500 Volt betrug das Anregungsmaximum 378 nm, mit einer maximalen Fluoreszenz von 808 000 cps bei 501 nm. Diese Verringerung von 700 auf 500 Volt auf der Hochspannungs-Stromversorgung verringert die Empfindlichkeit um etwa eine Größenordnung. Somit besitzt CBTP keine meßbare Fluoreszenz, wenn es von 300 bis 400 nm angeregt wird. Die festgestellte geringe Fluoreszenz war wahrscheinlich auf geringe Mengen an CBT, das als Verunreinigung in dem CBTP vorlag, zurückzuführen; siehe Tabelle 2.
  • Außerdem zeigt CBTP keine meßbare Emission bei 505 nm, welches die Emissionswellenlänge für das erwartete hydrolysierte Produkt, CBT, war. Dies bestätigt die geringe Interferenz in dem AP-Assay, welche durch die Emission von CBTP bedingt ist.
  • Die nächsten für CBTP zu bestimmenden kritischen Faktoren war der ungefähre Km-Wert und die Turnoverzahl mit AP. Dadurch wird bestimmt, wie schnell und effizient AP den Phosphatrest von CBT abspaltet. Das CBTP-di(AMPD)-Salz wurde direkt mit para-Nitrophenylphosphat, Ditris-Salz (pNPP, Di-tris) und 4-Methylumbelliferylphosphat, Di-(AMPD)-Salz, verglichen. Das UV/VIS-Assay wurde in 0,1 M AMPD, pH 10,2, 30 ºC unter Anwendung von 375 nm für CBT (15 000 Emax) und 405 nm für pNPP-di-tris (18 000 Emax) und 363 nm für 4-MU verglichen. Das verwendete Enzym Kalberdarm-AP, (Calzyme), 30 000 U/ml, 1/20 000 verdünnt in AMPD- Puffer. Die Referenzseite enthielt 500 Miktoliter Puffer, wie beschrieben. Z. B. enthielt die Probenseite 465 Mikroliter Puffer, 25 Mikroliter Substratlösung (Stammlösung lag bei 20 mM Substrat in AMPD-Puffer) und 10 Miktoliter des 1/20 000 verdünnten AP-Enzyms. Es wurde festgestellt, daß CBTP eine Turnoverzahl besaß, die zu 78 % der von pNPP und zu 95 % der von 4-MUP unter identischen Bedingungen entsprach. Somit besitzt CBTP eine hohe Turnoverzahl mit AP. Die maximale Geschwindigkeit des CBTP-Turnovers mit AP lag unter diesen Bedingungen bei 2 mM. Es wurde ebenfalls herausgefunden, daß ABTP und BBTP einen Km-Wert von etwa 2 mM unter ahnlichen Bedingungen besaßen. Wie es im Rahmen der Kenntnis im Fachbereich liegt, können diese Verbindungen in einem breiten Bereich von AP- Konzentrationen verwendet werden, welche üblicherweise zwischen etwa 0,05 mM und etwa 20 mM praktisch sind.
  • Ein Schlüsselfaktor, welcher die letztendliche Empfindlichkeit der Fluoreszenzmessungen beschrankt, bei denen ein Enzym mit einem Substrat unter Bildung einer fluoreszierenden Verbindung reagiert, resultiert aus der Störung durch Hintergrundfluoreszenz. Dieses Hintergrundrauschen ist auf vier Faktoren zurückzuführen: Raman-Fluoreszenz des Wassers, die Rayleigh-Streuung, Schwanz-Fluoreszenzemission von dem Ausgangssubstrat und Fluoreszenzemmision von in dem Substrat vorliegenden freien hydrolysierten Substrat. Um zu bestimmen, ob die Hintergrundfluoreszenz durch verunreinigendes hydrolysiertes Substrat ein Problem darstellt, wurde HPLC-Läufe bezüglich 4-MUP und CBTP durchgeführt, um genau den Anteil an hydrolysiertem Substrat, der jeweils vorliegt, zu bestimmen. Das CBTP wies 0,08 % CBT auf, und das 4-MUP enthielt 0,07 % 4-MU (bezogen auf das Gewicht). Da die Anteile an freiem hydrolysiertem Substrat vergleichbar waren und die Fluoreszenzempfindlichkeit innerhalb eines Faktors von 2,4 für 4-MU und CBT lag, wie oben ersichtlich, war dann der gemessene Fluroeszenzhintergrund auf eine Kombination der ersten drei Faktoren, wie oben beschrieben zurückzuführen. Unter Benutzung der Frontseiten-Fluoreszenz ergab eine 1 mM Lösung von 4-MUP einen anfanglichen Hintergrundsablesewert von 297640 cps (Anregung: 366 nm; Emission: 444 nm). Unter Verwendung von 1 mM CBTP (Anregung: 391 NM; Emission: 505 nm) betrug die Hintergrundsablesung 42 518 Zählimpulse/min. Diese Ablesewerte wurden in 0,10 M AMP, 0,1 M NaCl, pH 10,2, aufgenommen. Somit ist ersichtlich, daß das 4- MUP ein beträchtlich höheres Hintergrundrauschen als das CBTP aufweist.
  • Als nächstes wurde die Fluoreszenz von CBT in unterschiedlichen Lösungsmitteln in Gegenwart oder Abwesenheit der Base Cyclohexylamin (CA) untersucht. Diese Daten sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Das Experiment wurde laufengelassen, indem 5 mg CBT in 10 ml Dimethylsulfoxid gelöst wurde. Diese Lösung (10 Mikroliter) wurde 9,99 ml des entsprechenden Lösungsmittels (Lösung 1) hinzugesetzt. Diese Lösung wurde in eine UV-Quarzzelle überführt und mit einer durch die Hand gehaltenen 254 nm-Lichtquelle angeregt. Die Fluoreszenz wurde nach Sichtprufüngen aufgezeichnet. Zehn Mikroliter Cyclohexylamin (CA) wurde der Lösung #1 hinzugesetzt, und die Fluoreszenz wurde wie oben aufgezeichnet (Lösung 2). Als letztes wurden 100 Mikroliter CA zu Lösung 2 hinzugesetzt und die Fluoreszenz aufgezeichnet. Unterschiedliche Lösungen können somit verwendet werden, und es wird die charakteristische grüne Fluoreszenz festgestellt, die gesehen wird, wenn CBT in einer wäßrigen, gepufferten, basischen Lösung vorliegt.
  • Eine pH-Untersuchung der Fluoreszenz wurde in wäßriger Lösung mit 0,10 M Natriumphosphat, pH 8,85 und 0,10 M HCl durchgeführt. Diese Untersuchung wurde in analoger Weise zu dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Lösungen zeigten solange die charakteristische hochgrüne Fluoreszenz, bis der pH-Wert unter 3 lag. Zwischen einem pH-Wert von 3 und 1, einer extrem saurem Umgebung, verlor die CBT-Lösung ihre Fluoreszenz. Somit war klar, daß CBT seine Fluoreszenz über einen weiten pH-Bereich beibehält.
  • Es wurde herausgefunden, daß CBTP sich zu ABTP in einer wäßrigen basischen Umgebung umwandelt. Diese Umwandlung resultiert in nicht linearen Kinetiken, wenn CBTP mit AP umgesetzt wird. So, wenn nicht die Reaktionen bei 4 ºC schnell durchgeführt werden, wandelt sich CBTP zu ABTP um.
    • c. Fluoreszenzeigenschaften von BBTP
  • Die Empfindlichkeit von BBTP zum Nachweis von AP wurde als nächstes bestimmt; siehe Figur E. Der das Enzym verdünnende Puffer enthielt 0,10 M Diethanolamin, 1,0 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM Zinkchlorid, 0,005 % Natriumazid bei pH 9,0. Das verwendete Enzym war Calzyme, #27-5-24, 30 000 Einheiten/mg, enthaltend 0,15 mM alkalisches Phosphat. Reihenverdünnungen wurden vorgenommen, um eine 300 fM (10&supmin;¹&sup5; M) (Lösung E)- und eine 30 fM (Lösung F)-Verdünnung zu erhalten.
  • Der Substratlösungspuffer enthielt 2,4 M DEA, pH 9,0, 0,23 mM Magnesiumchlorid, 0,005 % Natriumazid und 1,0 mM Substrat. Ein bis 10 Mikroliter von entweder der Lösung E oder F wurden zu 3,0 ml der Substratlösung gegeben, welche bereits in dem Turner-Modell 111 bei einer Temperatur von 35 ºC äquilibriert worden war. Die Neigung wurde unter Einsatz eines Streifenschreibers gemessen. Die für 4-MUP, CBTP und ABTP verwendeten Filter waren der 760er auf der Anregungsseite und ein 2A und 47B auf der Emissionsseite. Für BBTP war der Anregungsfilter ein 47B und der Emissionsfilter ein 16er. Diese Neigungen wurden gegen die Konzentration des AP aufgetragen. Die Figur E zeigt, daß unter Verwendung von BBTP man eine 100 aM-Lösung von AP in 30 Minuten oder eine 10 aM-Lösung in sechs Stunden vermessen kann. Dieses System verwendete ein 3,0 ml großes Reagenzienvolumen, wenn jedoch das Reagenzienvolumen auf 100 Mikroliter verringert wird, können 6 000 Kopien oder 0,01 Attomol AP in 30 Minuten oder 600 Kopien oder 0,001 Attomol in sechs Stunden vermessen werden.
    • d. Stabilität von BBTP und ABTP
  • Die Lösungsstabilität von BBTP in einer wäßrigen Lösung von 2,4 mM DEA, pH 9,0, 0,23 mM Magnesiumchlorid und 0,005 % Natriumazid wurde bei 35 ºC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur F aufgeführt, sie zeigt auch die Empfindlichkeit von BBTP bei 10 aM, 100 aM und 1000 aM AP. Die Daten für die Hintergrundfluoreszenz zeigt, daß BBTP ein sehr stabiles Substrat selbst in einer basischen wäßrigen Umgebung, die Metalle enthält, ist. Sie zeigen auch den Beitrag des Hintergrundrauschens bei Messungen sehr geringer Mengen an AP, einschließlich der Vermessung einer 10 aM-Lösung von AP über den Hintergrundablesungen nach sechs Stunden.
  • Neben diesem wurde herausgefunden, daß wäßrige Lösungen von 1,0 mM BBTP in dem oben beschriebenen Puffer hergestellt und bei 4 ºC stehengelassen werden konnten. Die ABTP- Stabilität bei 4 ºC wurde ebenfalls bestimmt. Die in den Figuren G und H gezeigten Ergebnisse zeigen eine Stabilität von BBTP und ABTP bei 4 ºC.
  • Als nächstes wurden die wäßrigen Lösungen von BBTP und ABTP hergestellt und bei 4 ºC gelagert. Dann wurde die Reaktionsgeschwindigkeit dieser Lösungen von BBTP und ABTP mit AP gemessen, siehe Figuren I bzw. J. Dies zeigt, daß diese Lösungen stabil waren und keine Verbindungen sich bildeten, welche AP inhibieren könnten. Die Daten zeigen deutlich, daß sowohl BBTP als auch ABTP sich in Lösung nicht zersetzten und Inhibitoren für AP bildeten.
  • Die in Figur E verwendeten Vorläufer konnten aus zwei Gründen nicht für 4-MUP angewendet werden. Zu allererst waren die von einer 1 mM-Lösung erhaltenen Hintergrundablesungen auf dem Turner-Modell 111 außerhalb des Skalenbereiches. Wenn die Konzentration auf 0,030 mM gesenkt wurde, war die Hintergrundablesung mit der einer 1 mM-Lösung von BBTP oder ABTP vergleichbar. Da der Km-Wert für 4-MUP in diesem Puffer etwa 30 Mikromolar beträgt, wird dann der Turnover von 4-MUP gesenkt, was die Empfindlichkeit des Substrates für AP vermindert. Es wurde herausgefunden, daß mit frisch hergestellten 30 mikromolaren Lösungen von 4-MUP etwa die Hälfte oder ein Drittel des Signals erhalten wurde, daß mit einer 1,0 mM- Lösung von BBTP erhalten wurde. Als zweites wurde festgestellt, daß basische wäßrige Lösungen von 4-MUP, die Magnesium enthielten, bei dem 4-MUP dazu führten, daß es hydrolysiert und 4-Methylumbelliferon bildet. Dieses führt zu einer beträchtlichen Zunahme des Hintergrundrauschens. Dieses beschränkt den Test insofern, als daß 4-MUP mit Puffer für gewöhnlich innerhalb 8 Stunden der Verwendung rekonstituiert werden muß, selbst wenn diese Lösung bei 4 ºC gelagert werden muß.
    • 4. Synthese von BT-Derivaten a. Synthese von 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol (CBT)
  • Das für diese Synthese verwendete Verfahren wird in Deluca, M.A. und McEloy, W.D., Methods of Enzymology, 57, Seiten 15-24, Academic Press beschrieben. Das Produkt entsprach dem angegebenen Schmelzpunkt und den UV-Daten. Die HPLC zeigte, daß dieses Material zu 98 % rein war (nach Flächenprozenten). Das Lösungsmittelprogramm verwendete Wasser für Lösungsmittel A und Methanol für Lösungmittel B. Die Fließrate betrug 2,0 ml/min mit einer Programmzeit von 10 Minuten ausgehend von 100 % A bis zu einem Endzustand von 40 % B unter Verwendung der Kurve 7 auf einer Waters Lösungsmittel-Programmvorrichtung, was zu einem leicht konvexen Lösungsmittelprogramm führte. Der Produktpeak wurde bei 254 nm überwacht, und es wurde herausgefunden, daß er eine Retentionszeit von 17,3 Minuten aufwies. Die 500 MHz-NMR-Spektren in Dimethylsulfoxid (db) verifizierten die Struktur; siehe Tabelle 4.
    • b. Synthese von 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazoldimethylphosphatester
  • Fünfhundert mg (2,84 mmol) 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol wurden in ein 10 ml großes Reaktorgefäß gegeben, welches mit einer Teflonkappe verschlossen werden konnte und ein magnetisches Rührstäbchen auwies. Ein 5,0 ml großer Miquot von THF wurde hinzugesetzt, und bei Rühren löste sich das 2-CBT schnell und ergab eine klare, leicht rote Lösung. Danach erfolgte die Zugabe von 0,550 ml (402 mg, 3,97 mmol) Triethylamin. Die resultierende klare Lösung wurde auf 4 ºC gekühlt, indem sie in ein Eisbad gestellt wurde. Als nächstes wurde 512 mg (3,54 mmol) Dimethylchlorphosphat, gelöst in 1,5 ml THF, dieser Lösung während eines Zeitraums von 60 Sekunden hinzugesetzt. Nach etwa 20 Minuten wurde das 10 ml große Reaktorgefäß vom Eisbad entfernt und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt.
  • Zu diesem Zeitpunkt war die Reaktionsmasse eine dicke Aufschlämmung. Das Triethylammoniumchloridsalz wurde durch Saugfiltration entfernt. Das Filtrat wurde in einen Rundkolben überführt und am Rotationsverdampfer unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat gelöst, gefolgt von der Zugabe von 20 ml Wasser plus 10 ml mit NaCl gesättigtem Wasser. Die Phasen wurden getrennt und die Ethylacetatschicht wurde aufbewahrt. Die wäßrige Phase wurde mit 40 ml Ethylacetat rückgewaschen, und diese wurde mit der früheren Ethylacetatschicht vereinigt. Die vereinigte Ethylacetatlösung wurde zweimal mit einer Mischung aus 15 ml wäßriger gesättigter NaCl-Lösung und 5 ml Wasser gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und auf einem Rotationsverdampfer unter vollständigem Vakuum konzentriert. Etwa 5 ml Ethylether wurden dem Konzentrat hinzugesetzt, welcher das dicke Öl löste. Dieses wurde auf -20 ºC gekühlt, und weiße Kristalle bildeten sich schnell. Die weißen Kristalle wurden mittels Filtration isoliert. Der Schmelzpunkt des Produktes, 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazoldimethylphosphatester (6-CBT- DMP), betrug 54,0-55,1 ºC. Die HPLC zeigte eine Reinheit von 96,4 % (nach der Fläche). Die Säule hatte eine Größe von 3,9 mm x 25 mm mit einer Fließrate von 1,0 ml/min und mit einem linearen Programm von 100 % Wasser zu 100 % Methanol mit einer Programmzeit von 30 Minuten. Das Produkt wurde bei 254 nm überwacht. Die Retentionszeit für das Produkt betrug 23,4 Minuten. Das NMR-Spektrum wurde bestimmt. Das für das NMR verwendete Lösungsmittel war Deuterochloroform mit TMS als interner Standard. Es lag ein Dublett, zentriert bei Delta 3,9, vor, mit einer Kopplungskonstanten von 10 Hz und einem Integrationswert für 6,00 Hs. Es lag ein Multiplett, zentriert bei 7,9, vor, welches 3,08 Stunden integriert wurde.
    • c. Synthese von 2-Carbamoyl-6-hydroxybenzothiazol (ABT)
  • CBT, 14,0 g oder 0,079 mol, wurde in 60 ml entionisiertem Wasser suspendiert. Der pH-Wert dieser Lösung wurde auf 11,5 unter Verwendung von etwa 12 ml 6,0 M Natriumhydroxid eingestellt. Dies führte zu einer ktaren dunklen bernsteinfarbigen Lösung, welche über Nacht unter Stickstoff gerührt wurde. Am nächsten Morgen wurde ein 30 minütiges Programm von Wasser nach Methanol in linearer Weise durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß 95 % (nach der Fläche) des Ausgangsmaterials in eine einzelne Verbindung umgewandelt worden war. Die Retentionszeit von CBT und ABT betrugen 15,1 bzw. 13,2 Minuten.
  • Das Produkt wurde isoliert, indem ein gleiches Volumen an Wasser hinzugesetzt wurde und der pH-Wert auf 1,9 mit 6 N Salzsäure gesenkt wurde. Die braunen Feststoffe wurden mit Wasser gespült. Die nassen Feststoffe wurden in 400 ml Methanol bei 60 ºC gelöst, heiß filtriert und über Nacht auf -15 ºC gekühlt. Die Kristalle wurden mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Methanol, Diethylether gespült und vakuumgetrocknet. Die HPLC zeigte einen einzelnen Peak bei 13,2 Minuten. Die Ausbeute betrug 7,58 g oder 49 %. Der 500 MHz-NMR-Lauf in DMSO- d6 ist in Tabelle 5 gezeigt. Man beachte, daß die Peaks bei 7,910 und 8,297 den Amidwasserstoffen zugewiesen wurden und der Peak bei 10,106 dem Phenolwasserstoff. Alle diese Peaks (7,910, 8,297 und 10,106) verschwanden mit Zugabe von Deuteriumoxid. Dies wird bei einem Amid erwartet. Das NMR entsprach dem, was für das gezeigte Produkt erwartet wurde.
  • Mit einem pH von 11 in wäßriger Lösung oder bei einem höheren pH-Wert länger behandeltes ABT bildete 2-Carboxyl-6-hydroxybenzothiazol, welches isoliert und identifiziert wurde. Die NMR-Spektren entsprachen dem, was erhalten wurde. Diese Verbindung war ebenfalls stark fluoreszierend mit einer erwarteten großen Stokes-Verschiebung und reagierte mit AP in einer wäßrigen basischen Umgebung. Diese Verbindung zeigte eine niedrigere Turnoverzahl mit AP und wurde nicht ausführlich untersucht.
    • d. Synthese von 2-Carbamoyl-6-hydroxybenzothiazoldimethylphosphat
  • Drei Gramm (0,015 mol) 2-Carbamoyl-6-hydroxybenzothiazol (ABT) wurden in 30 ml THF gelöst. Dann wurden 1,72 g (0,017 mol) Triethylamin der gerührten Reaktionslösung hinzugesetzt, direkt gefolgt von der Zugabe von 2,6 g (0,018 mol) in 7 ml THF gelöstem Dimethylchlorphosphat während 5 Minuten. Diese Lösung wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
  • Die Aufschlämmung wurde saugfiltriert und bis zur Trockne unter Vakuum konzentriert. Die Feststoffe wurden in 100 ml Chloroform gelöst, 3 mal mit einer wäßrigen Natriumcarbonatlösung, zweimal mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und bis zur Trockne im Vakuum konzentriert. Die Feststoffe wurden mit Diethylether aufgeschlämmt und filtriert. Die Ausbeute betrug 1 g oder 22 %. Die HPLC wurde laufengelassen unter Verwendung eines 10 minütigen linearen Programms von Wasser zu Methanol. Es zeigte sich, daß das Produkt zu 96 % rein war (nach der Fläche), mit einer Retentionszeit von 14,1 Minuten. Das NMR in Deuterochloroform zeigte die erwarteten Peaks, wie sich aus dem Produkt ergibt: δ von 3,9 mit einer Kopplungskonstanten von 10 Hz (6,4 H), δ von 7,6, Kopplungskonstanten von 10 und 2 Hz (.9 H), breiter Peak bei 8,0 (1,0 H), und ein Dublett bei 8,25, Kopplungskonstante von 10 Hz (1,0 H).
    • e. Synthese von 2-Carbamoyl-6-hydroxybenzothiazolphosphat-di-(2-amino-2-methyl-1,3- propandiol)-Salz
  • Ein Gramm (0,0033 mol) 2-Carbamoyl-6-hydroxybenzothiazoldimethylphosphat wurde in 20 ml THF gelöst. Zu dieser Lösung wurde Trimethylbromsilan (0,0264 mol) hinzugesetzt. Die Lösung wurde in einem Reaktorgefäß bei Raumtemperatur 12 Stunden lang unter Verschluß gehalten. Nach der HPLC verblieben 4 % Ausgangsmaterial und 21 % Monomethylphosphat nach 12 Stunden. Weitere 0,0066 mol Trimethylbromsilan wurden hinzugesetzt, und eine HPLC zeigte nach weiteren 5 Stunden, daß die Reaktion abgeschlossen war. Somit vervollständigten 0,0132 mol Trimethylbromsilan und weitere vier Stunden die Reaktion.
  • Der Gefäßinhalt wurde in 30 ml Methanol, das 5,9 g AMPD enthielt, gegossen. Die Lösung wurde sofort trübe, und sie wurde 18 Stunden lang in einen Gefrierschrank gestellt. Das Produkt wurde mittels Saugfiltration gesammelt, mit gekühltem Methanol gewaschen und vakuum getrocknet. Die Ausbeute an gelben Kristallen betrug 0,98 g oder 62 %. Ein HPLC-Lauf unter Verwendung eines 10 minütigen linearen Programms von Wasser nach Methanol zeigte einen einzelnen Peak bei 6,1 Minuten, welcher sich auf 99,1 % belief (nach dem Flächenprozentwert). Die NMR-Spektren mit 500 MHz in Deuteriumoxid verifizierten die zugewiesene Struktur; siehe Tabelle 6.
    • f. Synthese von 2'-(2-Benzothiazolyl)-6'-hydroxybenzothiazolphosphat-bis-(2-amino-2- methyl-1,3-propandiol)-Salz
  • Die CBTP-bis-AMPD-Salze, 2,0 g oder 0,0043 mol, wurden in 10 ml entionisiertem Wasser in einem 30 ml großen Becherglas gelöst. Das 2-Aminothiophenol, 0,54 g oder 0,0043 mol, wurde in 10 ml Methanol gelöst und in einem Schuß der wäßrigen Lösung hinzugesetzt. Das Becherglas wurde mit Parafilm bedeckt, und es wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht in einen Gefrierschrank gestellt.
  • Die Feststoffe wurden am nächsten Morgen gesammelt und mit Methanol und Diethylether gespült. Diese rohen Kristalle wurden getrocknet, wodurch man 1,1 g mit einer Reinheit von 96,4 %, gemäß der HPLC, erhielt. Das rohe Produkt wurde gereinigt, indem es mit einer Mischung von Wasser/Methanol (Volumen: 50/50) 20 Stunden lang aufgeschlämmt wurde, gefolgt von einer Vakuumfiltration, Spülen mit Wasser und Methanol und Vakuumtrocknung. Das Produkt wog 0,81 g und belief sich auf 98,6 % nach der HPLC-Analyse (Flächenprozentwert) mit einer Retentionszeit von 15,3 Minuten. Das Programm verwendete ein 5 minütiges lineares Programm, 0 bis 100 % Lösungsmittel B, ausgehend von Lösung A und endend mit Methanol. Die NMR-Spektren mit 500 MHz in Deuteriumoxid verifizierten die Struktur; siehe Tabelle 7.
  • Das Produkt, 100 mg, wurde in 10 ml einer wäßrigen Lösung, die 0,1 M AMPD, pH 10,0, mit 1,0 mM Magnesiumchlorid enthielt, gelöst. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine mit der Hand gehaltene 254-nm-Lichtquelle verwendet, um einen kleinen Teil der Lösung anzuregen, welcher dann in eine UV-Quarzzelle überführt wurde. Die Lösung ergab eine sehr schwache blaue Fluoreszenz. Dann wurden 100 Mikroliter AP, 0,30 mikromolar hinzugesetzt. Ein kleiner Teil wurde der UV-Quarzzelle hinzugegeben und wie zuvor angeregt, und eine sehr helle orange Fluoreszenz war sichtbar. Am folgenden Morgen zeigte eine HPLC, daß das gesamte CBTP-bis- AMPD verbraucht worden war und sich in dem HPLC-Lauf ein neuer Peak gebildet hatte. Dieser Peak wurde als 2'-(2-Benzothiazolyl)-6-hydroxybenzothiazol (BBT) mittels der NMR- Spektren mit 500 MHz identifiziert; siehe Tabelle 8.
  • Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, einschließlich Homologa und Derivaten der beschriebenen Verbindungen, ohne daß man von dessen Wesen oder wesentlichen Charakteristika davon abweicht. Die bevorzugte Ausführungsform ist in allen Hinsichten als veranschaulichend und nicht als beschränkend anzusehen, wobei der Umfang der Erfindung durch die anhängigen Ansprüche angezeigt wird. Tabelle 1 Fluoreszenzeigenschaften von CBT, ABT und BBT Tabelle 2 Vergleich der Fluoreszenzeigenschaften von CBTP bis CBT Tabelle 3 Fluoreszenz von CBT in unterschiedlichen Lösungsmitteln mit und ohne Base Tabelle 4 NMR-Spektren von CBT mit 500 MHz Tabelle 5 NMR-Spektren von ABT mit 500 MHz
  • * Bei Zugabe von H&sub2;O verschwand eines der Wasserstoffe, wobei ein Dublett bei 7,910 zurückblieb. Tabelle 6 NMR-Spektren von ABTP mit 500 MHz Tabelle 7 NMR-Spektren von CBTP mit 500 MHz
  • * Erscheint als zwei Tripletts Tabelle 8 NMR-Spektren von BBT mit 500 MHz
  • * Erscheint als zwei Tripletts

Claims (29)

1. Markerverbindung zum Nachweis enzymatischer Aktivität eines ausgewählten Enzyms, wobei die Markerverbindung folgende Strukturformel aufweist:
wobei
a) wenigstens einer der kohlenstoffe an irgendeiner der Positionen 4, 5, 6 oder 7 mit dem Rest einer Ionisierbaren anionischen Gruppe verbunden ist, wobei der Rest mittels einer durch das ausgewählte Enzym abspaltbaren Bindung an eine fluoreszenzhemmende Gruppe gebunden ist;
b) die Gruppe X wenigstens zwei Atome umfaßt und die Resonanz des Benzothiazolrings erweitert, jedoch nicht eine Gruppe
ist, wobei R&sub1; Hydroxy, Alkyloxy, Alkenyloxy, Amino, eine Aminosäure oder Oligopeptid ist;
wobei die Verbindung im wesentlichen nicht-fluoreszierend ist, und derart ausgebildet ist, daß die Spaltung der Bindung zwischen dem anionischen Gruppenrest und der fluoreszenzhemmenden Gruppe die anionische Gruppe regeneriert und ein Reaktionsprodukt ergibt, welches stark fluoresziert.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die ionisierbare anionische Gruppe eine Hydroxylgruppe ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Enzym eine alkalische Phosphatase, eine Cholinesterase, eine Cholesterolesterase oder eine Lipase ist.
4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei das Enzym alkalische Phosphatase ist.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei X Cyano, Carbamoyl oder 2-Benzothiazolyl ist.
6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei X 2-Benzothiazolyl ist.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die fluoreszenzhemmende Gruppe ein Phosphatanteil, ein Esteranteil oder ein Lipidanteil ist.
8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei der Rest der ionisierbaren anionischen Gruppe und die fluoreszenzhemmende Gruppe zusammen eine Bindung -O- P(O)(OH)&sub2; bilden.
9. Verbindung nach Anspruch 8, wobei die -O-P(O)(OH)&sub2;-Gruppe an Position 6 angebunden ist, und die Kohlenstoffatome in den Positionen 4, 5 und 7 nicht substituiert sind.
10. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die fluoreszenzhemmende Gruppe durch Hydrolyse entfernbar ist.
11. 2-Carbamoyl-6-Hydroxybenzothiazolphosphat (ABTP).
12. 2-(2-Benzothiazol)-6-Hydroxybenzothiazolphosphat (BBTP).
13. 2-Cyano-6-Hydroxybenzothiazolphosphat (CBTP).
14. Verfahren zur Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur überwachung einer Umweltbedingung, wobei:
a) die Umweltbedingung die Entfernung der fluoreszenzhemmenden Gruppe der Verbindung bewirken kann;
b) die Verbindung der Umweltbedingung ausgesetzt wird; und
c) die Umweltbedingung durch Überwachung der Fluoreszenz der Verbindung nach Entfernung des chemischen Anteils überwacht wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Umweltbedingung ein Temperaturextrem, ein pH-Extrem oder die Anwesenheit eines Metalls ist.
16. Verfahren zur Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis eines biologischen Moleküls in einer Testprobe, wobei
a) eine Zusammensetzung, durch welche die fluoreszenzhemmende Gruppe von der Verbindung entfern bar ist, an einen biologischen Liganden, der an das biologische Molekül bindbar ist, angefügt wird;
b) die Zusammensetzung/der Ligand von Absatz a) unter Bedingungen, die zur Bindung der Zusammensetzung/des Liganden an das biologische Molekül geeignet sind, mit der Testprobe in Berührung gebracht wird;
c) die Verbindung unter Bedingungen, die zur Entfernung der fluoreszenzhemmenden Gruppe von der Verbindung geeignet sind, mit der Testprobe oder einem Teil davon in Berührung gebracht wird; und
d) das biologische Molekül durch Nachweis der Fluoreszenz der Verbindung nach Entfernung der fluoreszenzhemmenden Gruppe nachgewiesen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung, durch welche die fluoreszenzhemmende Gruppe der Verbindung entfern bar ist, ein Enzym ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Enzym aus der Gruppe, die Phosphatase, Esterase und Lipase umfaßt, ausgewählt ist.
19. Verfahren zur Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis eines Enzyms in einer Probe, wobei
a) durch das Enzym die floueszenzhemmende Gruppe von der Verbindung entfernbar ist;
b) die Probe unter Bedingungen, die geeignet sind, daß das Enzym die fluoreszenzhemmende Gruppe von der Verbindung entfernt, mit der Verbindung in Berühmng gebracht wird; und
) das Enzym durch Nachweis der Fluoreszenz der Verbindung nach Entfernung der fluoreszenzhemmenden Gwppe nachgewiesen wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das Enzym Phosphatase und die fluoreszenzhemmende Gruppe einen Phosphatanteil umfaßt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 14, 15 oder 20, wobei die Verbindung aus der Gruppe, die ABTP, BBTP und CBTP umfaßt, ausgewählt ist.
22. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei das Enzym eine Esterase ist und die fluoreszenzhemmende Gruppe einen Esteranteil umfaßt.
23. Verfahren nach Anspwch 18 oder 19, wobei das Enzym eine Lipase ist und die fluoreszenzhemmende Gruppe einen Lipidanteil umfaßt.
24. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der biologische Ligand aus der Gruppe ausgewählt ist, die einen Antikörper, ein Antikörperfragment und eine Nukleinsäure umfaßt.
25. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Testprobe eine biologische Probe umfaßt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die biologische Probe aus der Gruppe ausgewählt ist, die Urin, Blut und Gewebe umfaßt.
27. Verfahren nach Anspruch 24 oder 26, wobei der biologische Ligand ein Antikörper, die Zusammensetzung, durch die die fluoreszenzhemmende Gruppe von der Verbindung entfernbar ist, eine Phosphatase ist, und die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die eine der Verbindungen nach den Ansprüchen 11 bis 13, ABTP, BBTP und CBTP umfaßt.
28. Verfahren zur Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis von wenigstens einer ungefähr zehn-attomolaren Konzentration eines Enzyms in einer Testprobe, wobei
a) die Verbindung unter Bedingungen, die zur Entfernung der fluoreszenzhemmenden Gruppe geeignet sind, mit der Testprobe in Berührung gebracht wird; und
b) die zehn-attomolare Konzentration des Enzyms durch Nachweis der Fluoreszenz der Verbindung nach Entfernung der fluoreszenzhemmenden Gruppe nachgewiesen wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Enzym alkalische Phosphatase und die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die die Verbindungen gemäß den Ansprüchen 11 bis 13, ABTP, BBTP und CBTP, umfaßt.
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