DE3303871A1 - Fluorogene phosphorsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur fluorimetrischen bestimmung von phosphatasen - Google Patents

Fluorogene phosphorsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur fluorimetrischen bestimmung von phosphatasen

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Description

BAYER AKTIENGESELLSCHAFT 5090 Leverkusen, Bayerwerk
Zentralbere ich
Patente, Marken und Lizenzen Sft/by-c
Fluorogene Phosphorsäureester, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur fluor!metrischen Bestimmung von Phosphatasen
Die Erfindung betrifft neue fluorogene, leicht wasserlösliche Phosphorsäureester, die unter dem Einfluß von Phosphatasen ein stark fluoreszierendes farbiges Anion bilden und zu einer vorteilhaften Bestimmungsmethode für Phosphatasen verwendet werden können.
Fluorimetrische Verfahren zur Bestimmung von Phosphatase-Aktivitäten sind bereits seit längerem bekannt (Guilbault, Enzymatic Methods of Analysis, Pergamon Press 1970). Die Fluorimetrie ist so empfindlich, daß hiermit auch äußerst geringe Enzymkonzentrationen nachgewiesen und bestimmt werden können. Bekannte fluorimetrisch verwendete Phosphatase-Reagenzäen sind Phosphorsäureester des ümbelliferons (G.G. Guilbault et al., Anal. Letters j_ (1968) 333), des 4-Methylumbelliferons (H.N. Fernley, P.G. Walker, Biochem. J. 9_7 (1965) 95), des Flavonols (D.B. Land, E. Jakim, Anal. Biochem. J^, (1966) 481), des ^-Naphthols (D.W. Moss, elin. chim.
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Acta _5* (1960) 283), des ß-Naphthols (L.J. Greenberg, Biochem. Biophys. Res. Comm. 9_ (1962) 430) und des 3-O-Methyl-fluoresceins (H.D. Hill et al., Anal. Biochem. 2± (1968) 9).
Alle diese Reagenzien besitzen nur eine sehr begrenzte Wasserlöslichkeit.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Reagenzien für den fluorimetrisehen Nachweis und zur Bestimmung von Phosphatasen zur Verfügung zu- stellen, welche eine wesentlich bessere Wasserlöslichkeit aufweisen. Diese Aufgabe wird mittels der erfindungsgemäßen Phosphorsäureester gelöst.
Gegenstand der Erfindung sind neue Phosphorsäureester der Formel
(D
worin die Reste M gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, ein Alkali- oder Ammoniumion, das durch 1-4, gegebenenfalls eine Hydroxygruppe enthaltenden C1 bis C5-Alkylreste, vorzugsweise C.- bis Cg-Alkylreste substituiert sein kann, stehen.
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ic
Erfindungsgemäß bevorzugt sind Phosphorsäureester der Formel
Die erfindungsgemäßen Phosphorsäureester der Formel (I) können hergestellt werden, indem man Hydroxyverbindungen der Formel
OH
(SO3M1J3
(II) ,
vorzugsweise solche der Formel
M1·
worin die Reste M gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff oder ein Alkali- oder Ammoniumion stehen,
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zunächst mit einem Phosphorpentahalogenid, wie Phosphorpentachlorid oder -bromid - vorzugsweise in Gegenwart eines Säurefängers - in einem Molverhältnis von vorzugsweise etwa 1:3 umsetzt und die erhaltene Dihalogenphosphonyloxy-Verbindung anschließend hydrolysiert.
Als Säurefänger eignen sich besonders flüssige organische Basen, beispielsweise Triethylamin oder Dimethylanilin, Pyridin, Picolin, Picolingemische, Kollidin oder Chinolin.
Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungs- oder Verdünnungsmittels im Temperaturbereich von -5 bis 1000C, vorzugsweise bei 20-900C durchgeführt .
Als Lösungs- und Verdünnungsmittel eignen sich unter den Reaktionsbedingungen inerte organische Flüssigkeiten, wie Toluol, Chlorbenzol, Dichlorbenzol, Di- J chlormethan, Chloroform, Tetrachlormethan, Dichlorethan, Dichlorpropan, Trichlorethylen, Acetonitril, Dioxan, Tetrahydrofuran oder eine der obengenannten organischen Basen, wie Pyridin.
Die Hydrolyse der intermediären Dihalogenphosphonyloxy-Verbindungen zu I kann z.B. durch vorsichtiges Erwärmen mit Wasser auf etwa 500C, schonender jedoch bei Temperaturen von 0-250C durch Neutralisation mit Alkali-
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hydroxid- oder Alkalicarbonat-Lösung oder wäßrigem Ammoniak, Aminen oder Ammoniumhydroxiden durchgeführt werden. Anschließend dampft man die erhaltenen Alkalioder Ammoniumsalze im Vakuum zur Trockne ein.
Geeignete Amine sind beispielsweise Dipropylamin, Dibutylamin, Triethylamin, Trimethylamin, Tripropylamin, Tributylamin, Diethanolamin, N-Methy!diethanolamin, Triethanolamin, Propanolamin, Dipropanolamin und Tr ipropanolamin. Als Ammoniumhydroxide seien Tetramethyl-, Tetraethyl-, Tetrapropyl- und Tetrabutylammoniumhydroxid erwähnt.
Die saure Form, (I) mit M=H, gewinnt man zweckmäßig dadurch, daß man die wäßrige Lösung des Alkali- oder Ammoniumsalzes über eine saure Ionenaustauscher-Säule filtriert und die erhaltene Lösung gewünschtenfalls eindampft.
Die als Ausgangsverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Hydroxypyrentrisulfonsäuren (II) sind in an sich bekannter Weise durch Tetrasulfonierung von Pyren und anschließende Alkalischmelze herstellbar
(R) und im Handel unter dem Namen Pyranin / erhältlich.
Die neuen Verbindungen der Formel (I) sind wasserlösliche, nur schwach farbige Substanzen, die im wäßrigen Medium von alkalischer oder saurer Phosphatase zum stark fluoreszierenden, intensiv gelb gefärbten Anion von (II) gespalten werden.
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Die neuen Phosphatase-Reagenzien der Formel (I) eignen sich zum direkten Phosphatase-Nachweis in biologischen Materialien. Besonders vorteilhaft können sie zur quantitativen fluorimetrisehen Bestimmung der alkalischen oder sauren Phosphatasen in der klinischen Analytik verwendet werden.
Sie können zur Bestimmung der Phosphataseaktivität in den verschiedensten Körperflüssigkeiten (Serum; cerebrospinale Flüssigkeiten; Urin) verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich, die erfindungsgemäßen Reagenzien analog zur Lehre der US-PS 3 772 340 zur Messung der Bakterienkonzentration in Flüssigkeiten (z.B. bakteriell infiziertem Urin) heranzuziehen. Zu diesem Zweck werden zunächst in an sich bekannter Weise (z.B. osmometrischer Schock; Sphäroplastenbildung) die bakteriellen Enzyme, darunter auch Phosphatasen, freigesetzt. Aus der mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen bestimmten Phosphataseaktivität lassen sich dann Rückschlüsse auf die Zahl der vorhandenen Bakterien ziehen.
Bei der Bestimmung der Phosphataseaktivität können die erfindungsgemäßen Verbindungen wegen ihrer hervorragenden Wasserlöslichkeit in Form wäßriger Lösungen, gegebenenfalls auf den gewünschten pH-Wert gepuffert (z.B. ca. 4,5 - 7 für saure Phosphatasen; ca. 7-10 für alkalische Phosphatasen), eingesetzt werden. Es ist jedoch auch möglich, die neuen Phosphorsäureester in an sich bekannter Weise auf Träger aufzubringen und
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die Nachweisreaktion in heterogener Phase ablaufen zu lassen. Geeignete Trägermaterialien sind z.B. Filterpapier oder auf einem Kunststoff (z.B. Polystyrol) aufgebrachtes, mit einem organischen Bindemittel versehenes Siliziumdioxid. Es lassen sich auf diese Weise Teststreifen herstellen, die nach dem Aufbringen der zu' untersuchenden Flüssigkeit zu fluoreszieren beginnen und deren Fluoreszenz mittels der in der klinischen Analytik üblichen Fluorimeter gemessen werden kann. Die quantitative Bestimmung der Phosphatase-Aktivität in einer unbekannten Probe ist möglich, wenn man den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz-Intensität in der wäßrigen Lösung bzw. auf dem Teststreifen mit jenem von Standards mit bekanntem Phosphatasegehalt vergleicht.
Bei den im folgenden beschriebenen Versuchen wurden als Standards folgende Phosphatasepräparate der Firma Sigma Chemical Co. verwendet:
a) alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1): Typ I-S (P7640)
(aus Rinderhodenmucosa)
b) saure Phosphatasen (EC 3.1.3.2): Typ III (P6 76 0)
Typ IV-S (P1146) Typ V (P126-7)
(aus Weizenkeimlingen, Kartoffeln, Milch und Rinderhoden).
EC ist die Bezeichnung für den international gültigen Enzymkatalog.
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Beispiel 1
In 200 ml trockenes Pyridin werden unter Kühlung und Rühren unter Wasserausschluß bei 0-50C 25 g (0,12 mol) Phosphorpentachlorid und - sobald eine klare Lösung entstanden ist - bei der gleichen Temperatur 21 g 6-Hydroxy-1,3,8-pyrentrisulfonsäure-trinatriumsalz (0,04 mol) eingetragen und ohne weitere Kühlung 20 h verrührt. Die Temperatur steigt im Verlauf der Reaktion von selbst auf etwa 350C und sinkt dann auf Raumtemperatur ab. Die entstandene Lösung wird auf 700 ml Eiswasser aufgetragen. Man stellt durch Zutropfen von etwa 54 g 45 %iger Natronlauge (0,6 mol) auf pH 7 ein, läßt die Lösung 20 h rühren, filtriert, dampft das Filtrat mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei 400C Badtemperatur im Wasserstrahlvakuum ein und verrührt den Rückstand mit 200 ml Methanol 15h bei Raumtemperatur. Der kristalline Niederschlag wird abgesaugt, mit wenig Methanol gewaschen und bei 400C im Vakuum getrocknet. Man erhält 52 g eines schwach gelblichen, hervorragend wasserlöslichen Kristallpulvers, welches neben etwas NaCl und Natriumphosphat als Hauptbestandteil die Verbindung der Formel
ONa
NaO3S
NaO-S SO^Na enthält.
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In analoger Weise werden unter Verwendung von wäßriger KOH bzw. wäßrigem Ammoniak oder einer wäßrigen Lösung von Triethanolamin die entsprechenden K- bzw. Ammoniumsalze hergestellt.
Zur Verfolgung der enzymatischeri Hydrolyse durch Phosphatasen regt man im Fluorimeter bei ca. 450 nm an und mißt die Extinktion bei 495 nm.
Beispiel 2
In einem Fluorimeter füllt man bei 230C die Küvette mit 3 ml einer 0,1 molaren wäßrigen citratgepufferten (0,05 mol Citrat/Liter) Lösung des Na-Salzes gemäß Beispiel 1 vom pH 7,8, stellt die Anregungswellenlänge auf 450 nm und die Emissionswellenlänge auf 495 nm ein, fügt 0,1 ml der auf saure Phosphatase-Aktivität zu bestimmenden Körperflüssigkeit (Serum, cerebrospinale Flüssigkeit), deren Gehalt in der Größenordnung von 0,1 mg Phosphatase pro ml liegen soll, hinzu und verfolgt die zeitliche Änderung der Fluoreszenzintensität über einen Zeitraum von etwa 1 bis 3 min im Vergleich zu vorher angefertigten Eichkurven. Der anfangs lineare Anstieg der Fluoreszenzintensität ist ein direktes Maß für die Enzymaktivität. Die Nachweisgrenze für Phosphatasen liegt bei der vorstehend beschriebenen Anordnung bei ca. 1 χ 10 Enzymeinheiten pro ml.
Als Eichsubstanz kann Phosphatase aus Rinderhodenmucosa
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(Enzym-Katalog Nr. 3.1.3.1, Typ I-S), käuflich erhältlich bei Sigma Chemical Co. unter der Nr. p-7640, verwendet werden.
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Claims (10)

  1. Patentansprüche
    1J Verbindungen der Formel
    worin
    die Reste M gleich oder verschieden sind und
    für Wasserstoff, ein Alkali- oder Ammoniuinion, das durch 1-4, gegebenenfalls eine Hydroxygruppe enthaltende C1- bis Cg-Alkylreste substituiert sein kann, stehen.
  2. 2. Verbindungen der Formel
    worin
    M die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat,
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  3. 3. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß. man eine Verbindung der Formel
    OH
    worin
    die Reste M gleich oder verschieden sund und für Wasserstoff oder ein Alkali- oder Ammoniumion stehen,
    zunächst mit einem Phosphorpentahalogenid umsetzt und die erhaltene Dihalogenphosphonyloxy-Verbindung anschließend hydrolysiert.
  4. 4. . Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
    daß man als Phosphorpentahalogenid Phosphorpentachlorid oder -bromid in etwa 2-fachem molarem Überschuß gegenüber der Hydroxypyrenverbindung einsetzt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit den Phosphorpentahalogenid in Gegenwart eines Säurefängers durchführt.
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  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säurefänger eine flüssige organische Base einsetzt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säurefänger Triethylamin, Dimethy!anilin, Pyridin, Picolin, Picolingemische, Kollidin oder Chinolin einsetzt.
  8. 8. Fluorogene Phosphorsäureester enthaltende Testmittel für den fluorimetrischen Nachweis von Phosphatasen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als fluorogene Phosphorsäureester Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2 enthalten.
  9. 9. Testmittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphorsäureester in einem Trägermaterial enthalten sind.
  10. 10. Verfahren zur Bestimmung von Phosphatase-Aktivität in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 bzw. einem Testen
    mittel nach Anspruch 8 oder 9 in Kontakt bringt und den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzaktivität in der Probe verfolgt.
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