CH641151A5

CH641151A5 - L-leucyl-4-hydroxyanilid-derivat, verfahren zu dessen herstellung, sowie verwendung desselben.

Info

Publication number: CH641151A5
Application number: CH467779A
Authority: CH
Inventors: Takeshi Nagasawa; Katsumasa Kuroiwa; Tadami Akatsuka; Osamu Kodama; Mitoshi Shimamoto
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1978-06-01
Filing date: 1979-05-19
Publication date: 1984-02-15
Also published as: JPS54157691A; DE2919545C3; GB2022079A; SE7904731L; DE2919545A1; FR2427327B1; US4209459A; GB2022079B; FR2427327A1; DE2919545B2; JPS5630341B2; SE445214B

Description

Die Erfindung betrifft ein L-Leucyl-4-hydroxyanilid--derivat, ein Verfahren zu dessen Herstellung, sowie eine Verwendung desselben.

Wie allgemein bekannt ist, stellt Leucin-aminopeptidase (im folgenden als LAP bezeichnet) ein Enzym dar, welches in der Lage ist, von L-Peptiden Leucin freizusetzen bzw. abzuspalten, und zwar insbesondere von solchen Peptidver-bindungen, welche am Aminoende Leucingruppen aufweisen. Dieses Enzym ist in Geweben von Lebewesen weit verbreitet und kommt ebenfalls in Seren vor. Es ist bekannt, dass sich der LAP-Gehalt eines Serums in Abhängigkeit vom Zustand des jeweiligen Lebewesens, von welchem das Serum stammt, stark schwankt. Die LAP-Aktivität im Serum eines Patienten, welcher an akuter Hepatitis, einem Häpatom, einem metastatischen Häpatom, einer Leberzirrhose oder an Cholangie leidet, nimmt zu. Aus diesem Grunde wird die LAP-Aktivität als eine Indikation der vorstehend genannten Krankheiten gewertet und der Nachweis der LAP-Aktivität wurde zu einem unentbehrlichen Test zur Diagnose dieser Krankheiten.

Zum Nachweis der LAP-Aktivität wurden mehrere Methoden vorgeschlagen, wobei in den meisten derselben die aus synthetischen Substraten durch Einwirkung von LAP freigesetzten Verbindungen colorimetrisch bestimmt werden.

Da jedoch sämtliche dieser Methoden Nachteile und Vorteile aufwiesen, war es erforderlich, neue synthetische Substrate zu entwickeln. Zum Beispiel erfordert die L-Leu-cyl-ß-naphthylamid-Methode (Cancer, Band 11, 283 [1958]) ß-Naphtylamin als Standardsubstanz. Aufgrund ihrer Carci-nogenität stellt ß-Naphthylamin eine der Substanzen dar, deren kommerzielle Herstellung verboten wurde und bei der Verwendung von ß-Naphthylamin ist es erforderlich, eine entsprechende Schutzausrüstung zu tragen und. die grösste Sorgfalt anzuwenden. Der Einfluss von Serumbestandteilen ist bei einer Methode, bei welcher L-Leucyl-p-nitronanilid als Substrat verwendet wird und das gelbe p-Nitroanilin, welches gebildet wird, wird colorimetrisch bestimmt (Klin. Wo-chenschr., Band 45, 474 [1967]). Die colorimetrische Bestimmung von p-Nitroanilin nach der Kondensation mit Di-methylaminozimtaldehyd lässt in ihrer Reproduzierbarkeit zu wünschen übrig, da die Farbentwicklung gegenüber Temperaturveränderungen zu empfindlich ist. Kürzlich wurde ein Versuch unternommen, die LAP-Aktivität unter Verwendung von einem L-Leucyl-p-aminoanilid-derivat als Substrat zu bestimmen und das gebildete p-Aminoanilid-derivat 5 nach otxidativer Kondensation mit einem geeigneten Kuppler (japanische, offengelegte Patentschrift 52 691/77 [Kokai]) colorimetrisch zu bestimmen. Dieses Verfahren weist insofern Nachteile auf, da die Substratreaktivität mit der von L-Leu-cyl-ß-naphthylamid vergleichbar oder etwas geringer ist und io die Methode zu hohe Aktivitätswerte ergibt, wenn sie bei einem Serum einer Schwangeren angewandt wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Substrat zum Nachweis der LAP-Aktivität zur Verfügung zu stellen, welches in Wasser in ausreichendem Masse löslich ist und mit wel-15 chem die Nachteile der bekannten Methoden in bezug auf Sicherheit, Reproduzierbarkeit, Stabilität, Reaktivität und Selektivität vermieden werden.

Ausserdem ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis der LAP-Aktivität unter Verwendung des 20 genannten Substrates zu schaffen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen des genannten Substrates zur Verfügung zu stellen.

Im Rahmen der Erfindung wurden Untersuchungen zur 25 Verbesserung der üblichen Methoden zum Nachweis der LAP-Aktivität, die die vorher genannten Nachteile aufweisen, durchgeführt. Es wurden neue Substrate mit ausgezeichneten Eigenschaften gefunden.

Die vorstehende Aufgabe wird erfindüngsgemäss da-30 durch gelöst, dass ein L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat gemäss der Formel

CH

35 CH

NH~

3\ !

J JÏCH - CH2 - CH - CO

R

OH

oder ein Säureadditionssalz desselben, welche als Substrat beim Nachweis der LAP-Aktivität geeignet sind, zur Ver-40 fügung gestellt wird. In der vorstehend genannten Formel bedeutet R eine Carboxyl- oder Sulfogruppe.

Wie nachfolgend beschrieben, stellt die erfindungsgemäs-se Verbindung ein ausgezeichnetes Substrat dar, welches keine der vorstehend genannten Nachteile der üblichen Sub-45 strate, wie sie zum Nachweis der LAP-Aktivität verwendet werden, aufweist.

Die erfindungsgemässe Verbindung ist in Wasser in ausreichendem Masse löslich und weist gegenüber LAP eine Substratreaktivität auf, die zweimal so hoch oder höher ist so als die eines der üblichen Substrate. Dies wird in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt.

TABELLE 1 Substratreaktivität

55

Substrat

Relative Substratreaktivität

60 übliches Substrat:

L-Leucyl-ß-napthylamid 100

L-Leucyl-4-N,N-diäthylaminoanilid 81

L-Leucyl-p-nitroanilid 95

65 erfindungsgemässes Substrat:

L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid 223

L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid 263

3

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Die vorstehend genannten Eigenschaften zeigen die Vorteile des erfindungsgemässen Substrates, wie die einfache Herstellung der Reagentien, die Reduktion der zum Nachweis erforderlichen Zeit, die Reduktion der für die Bestimmung erforderlichen Probenmenge, usw.

Wie vorstehend beschrieben, erfolgt die Verwendung der Verbindung zum Nachweis der LAP-Aktivität. Bei der Durchführung der Bestimmung lässt man das erfindungs-gemässe Substrat mit LAP eines Serums in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 reagieren und unterwirft das bei der Reaktion gebildete 4-Hydroxyanilin--derivat einer oxidativen Kondensation mit einem geeigneten Kuppler unter Bildung einer gefärbten Substanz, welche dann zur Bestimmung der LAP-Aktivität im Serum colorimetrisch bestimmt wird. -

Geeignete Kuppler für die Farbentwicklung im sauren Milieu stellen Anilinverbindungen dar, wie z.B. N,N-Di-äthylanilin, während Kuppler für die Farbentwicklung im Alkalischen zu den Phenol- und Naphtholverbindungen gehören, wie z.B. m-Cresol.

Das bei der vorstehend genannten oxidativen Kondensation am besten geeignete Oxidationsmittel ist Natriumme-taperjodat, obwohl verschiedene andere, wie Wasserstoffperoxid, Persulfate und dergleichen ebenfalls verwendet werden können.

Die durch oxidative Kondensation eines Kupplers und dem Reaktionsprodukt von LAP und der erfindungsgemässen Verbindung gebildete gefärbte Substanz weist in Abhängigkeit von der Art des Kupplers einen weiten Wellenlängenbereich von 560 bis 770 nm auf. Die Farbentwicklung wird durch eine Veränderung der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit nur sehr wenig beeinflusst und ist in ausreichendem Masse stetig, um den wichtigsten Anforderungen an ein Reagenz, welches zu einem derartigen Nachweis verwendet wird, zu entsprechen.

Nach den üblichen Methoden wird die Colorimetrie bei einer unterhalb 56'0 nm liegenden Wellenlänge durchgeführt, wohingegen die colorimetrische Bestimmung der erfindungsgemässen Methode bei einer über 560 nm liegenden Wellenlänge erfolgt. Aus diesem Grunde wird die colorimetrische Bestimmung der erfindungsgemässen Methode kaum durch die Anwesenheit von Verunreinigungen im Serum beeinflusst, weshalb es nicht erforderlich ist, für jede Probe eine Blindprobe durchzuführen, wodurch sich eine Einsparung an Arbeit und Zeit ergibt.

Darüber hinaus war es bei den konventionellen Methoden schwierig, die nachteiligen Effekte von reduzierenden Substanzen im Serum, wie z.B. Harnsäure und Ascorbin-säure, zu eliminieren, wohingegen bei dem erfindungsgemässen Verfahren der Effekt derartiger reduzierender Substanzen die Genauigkeit der Messung nur sehr wenig beeinflusst, da diese reduzierenden Substanzen durch die im Überschuss vorliegenden oxidierenden Mittel zersetzt werden.

Wie die voranstehenden Ausführungen zeigen, ist zum Nachweis bzw. der Bestimmung der LAP-Aktivität die erfin-dungsgemässe Verbindung als Substrat den bisher bekannten Substraten gegenüber weit überlegen.

Die neue Verbindung gemäss der Erfindung kann hergestellt werden, indem man ein aktiviertes L-Leucin, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit einem p-Hydroxyanilin--derivat umsetzt und dann die Schutzgruppe von dem bei dieser Reaktion gebildeten Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat entfernt.

Beispiele von aktiviertem L-Leucin, welche als Ausgangsmaterial verwendet werden, umfassen aktivierte Ester entsprechend der Formel

0

II

X - NH - CHC - V

I

cm

CH

10

CH.

CK-

worin X eine N-Schutzgruppe darstellt, wie ein tert-Butyl-oxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Benzyloxycar-15 bonyl oder Phthalyl und Y eine aktivierende Gruppe darstellt, wie

CH.

20 — S

- 0 - N;

25

/

A

\

o

^C1n

(n = 3 oder 5)

30

oder — 0

r\

NO

2"

35 Die freigesetzte Verbindung (HY) ist vorzugsweise

40

H - S

S

.0

oder

HO - Ns

X

welche in Wasser oder einer sauren wässrigen Lösung lös-45 lieh sind.

Die Entfernung der Schutzgruppe kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden, indem man die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel und im allgemeinen in Gegenwart eines Amins durchführt. Geeigneso te organische Lösungsmittel umfassen Tetrahydrofuran, Di-methylformamid, Dioxan und Äthylacetat; geeignete Amine sind tertiäre Amine, wie Triäthylamin, N-Methylmorpho-lin und N-Äthylmorpholin. «Triton B» (Benzyltrimethyl-am-monium-hydroxid) kann ebenfalls verwendet werden. 55 Das präparative Verfahren wird im einzelnen in den nachstehend gegebenen Beispielen erläutert, die jedoch die Erfindung nicht einschränken sollen.

Beispiel 1

60 Herstellung von L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid-hydro-

chlorid

In 100 ml Dimethylformamid wurden 7,7 g (0,05 Mol) 5-Aminosalicylsäure und 14 ml (0,10 Mol) Triäthylamin auf-65 gelöst. Zu der Lösung wurden tropfenweise innerhalb einer Stunde bei — 5°C bis 0°C eine Lösung aus 17,3 g (0,05 Mol) tert-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-4,6-dimethylpyrimidin-2-yl--thioester in 150 ml Tetrahydrofuran gegeben. Unter Rüh-

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4

ren wurde bei Raumtemperatur das Gemisch weitere 18 Stunden lang umgesetzt. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 300 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde sukzessive mit kalter 5 %iger Salzsäure, Wasser und gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, dann über einem Gemisch aus Magnesiumsulfat und Aktivkohle entfärbt und getrocknet. Die auf diese Weise behandelte Äthylacetatschicht wurde destilliert, um das Äthylacetat zu entfernen, wobei eine kristalline Substanz zurückblieb. Diese Substanz wurde weiter aus einem Äthylacetat-Petroleumäther-Gemisch umkristallisiert, wobei 12,4 g (68%) weisse Kristalle erhalten wurden. Schmelzpunkt 168 bis 170°C; spezifische Drehung: [a]D20 = —16,4 (C = 1, DMF).

Elementaranalyse: C18H26N208 (Molekulargewicht 366,4)

Gefunden %: C 58,98 H 7,28 N 7,88

Berechnet %: C 59,01 H 7,15 N 7,65 Dünnschichtchromatografie:

Rf = 0,39 (CHC13 : MeOH : AcOH : H20 = 80: 20 : 2,5 : 5).

In 30 ml eines Gemisches aus 2,4 N Salzsäure und Essigsäure wurden 10 g (0,027 Mol) tert-Butyloxycarbonyl-L--leucyl-3-carboxy-4-hydroxyaniIid, welches vorstehend erhalten wurde, aufgelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang umgesetzt, um die tert-Butyloxycarbo-nylgruppe zu entfernen. Das Reaktionsgemisch wurde zu 500 ml getrocknetem Äther gegeben. Die sich bildenden weissen Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt und getrocknet, wobei quantitativ 8,3 g des gewünschten L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyaniIid-hydrochlorid's erhalten wurden. Schmelzpunkt: 217°C (Zersetzung); spezifische Drehung: [a]D20 = +36,3 (C = 1, MeOH); Rf = 0,70 (n-BuOH : AcOH : H20 = 4:1:1).

Elementaranalyse: 311,783)

Gefunden %: Berechnet %:

c13h19n2o4ci

Yx H20 (Molekulargewicht

C 50,15 C 50,04

H H

6,57 6,47

N 8,82 N 8,98

Beispiel 2

Herstellung von L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid

Zu 200 ml Methanol wurden 7,6 g (40 mMol) 3-Sulfo-5 -4-hydroxyanilin und 18,4 ml (40%ige Lösung in Methanol) Triton B gegeben. Das Gemisch wurde erwärmt unter Bildung einer homogenen Lösung und dann eingedampft, um das Methanol zu entfernen. Der Rückstand wurde in 50 ml Dimethylformamid, welchem 15,5 g (40 mMol) Benzyloxy-10 carbonyl-L-leucyl-4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-thioester zugemischt waren, aufgelöst und bei Raumtemperatur 48 Stunden lang umgesetzt. Nach Zugabe von 300 ml Äthylacetat wurde das Reaktionsgemisch sukzessive jeweils 2mal mit 60 ml kalter 5 N Salzsäure, 60 ml 2 N Salzsäure und 60 ml 15 5%iger Salzsäure, welche mit Natriumchlorid gesättigt war, gewaschen. Die auf diese Weise behandelte Äthylacetatlö-sung wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und durch Destillation das Äthylacetat entfernt, wobei Ben-zyloxycarbonyl-L-leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid als öliger 20 Rückstand erhalten wurde. Der ölige Rückstand wurde mit 47 ml eines Gemisches aus 25 %iger Bromwasserstoffsäure und Essigsäure gemischt, bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt und dann in 470 ml Äther gegossen. Die gebildeten Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt, mit 25 Äthyläther gewaschen und aus einem Äthylalkohol-Äthyl-äther-Gemisch umkristallisiert, wobei 5,8 g (41 %) L-Leu-cyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid erhalten wurden. Schmelzpunkt: 214 bis 217°C; spezifische Drehung: [a]D20 = +57,6 (C = 1, H20); Rf = 0,52 (n-BuOH : AcOH : H20 = 4 :

30 1 : 1).

Elementaranalyse: Cj2H18N205S. 3/7 HBr. H20 (Molekulargewicht 355,417)

Gef.: %: C 40,41 H 5,68 N 7,86 S 9,11 Br 9,42 35 Ber. %: C 40,55 H 5,79 N 7,88 S 9,02 Br 9,42

Fig. 1 bis 3 stellen Infrarotabsorptionsspektren von jeweils tert-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-3-carboxy-4-hydroxy-anilid, L-Leucyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid-hydrochlorid und 40 L-Leucyl-3-sulfo-4-hydroxyanilid dar.

v

I Blatt Zeichnungen

Claims

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2. Verbindung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Carboxylgruppe bedeutet.

2

PATENTANSPRÜCHE 1. L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivat entsprechend der allgemeinen Formel nh2 «

ch3\ - i /r\

- CH0 - CH - CO - NK -U OH CH^ 2 W

worin R eine Carboxylgruppe oder eine Sulfogruppe darstellt oder ein Säureadditionssalz desselben.
3. Verbindung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Sulfogruppe darstellt.
4. Verfahren zur Herstellung von L-Leucyl-4-hydroxy-anilid-derivaten gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein aktiviertes L-Leucin, dessen Aminogruppe geschützt ist, mit einem p-Hydroxyanilidderivat umgesetzt wird und1 darauf die Schutzgruppe von dem gebildeten Leu-cyl-4-hydroxyanilid-derivat entfernt wird.
5. Verwendung von L-Leucyl-4-hydroxyanilid-derivaten gemäss Anspruch 1 zum Nachweis bzw. zur Bestimmung der Leucin-aminopeptidase-Aktivität.