DE3136508C2

DE3136508C2 - L-Phenylalanyl-L-argininderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE3136508C2
Application number: DE3136508A
Authority: DE
Inventors: Setsuro Toyonaka Fujii; Mamoru Sakura Sugimoto; Takashi Funabashi Yaegashi
Original assignee: Torii & Co Ltd Tokyo Jp
Current assignee: Torii & Co Ltd Tokyo Jp
Priority date: 1980-09-16
Filing date: 1981-09-15
Publication date: 1983-07-21
Also published as: GB2085447B; JPS5753446A; US4379764A; FR2490222A1; JPS6342635B2; DE3136508A1; FR2490222B1; GB2085447A

Abstract

Die Erfindung betrifft Phenylalanylargininderivate der allgemeinen Formel (I) (Formel) worin R ↓1 für Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe steht, R ↓2 und R ↓3 Wasserstoff oder Guanidinoschutzgruppen darstellen, und R ↓4 für Naphthyl steht. Diese Verbindungen werden als Substrate für verschiedene Enzyme, beispielsweise für Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, C1-Esterase u.dgl., verwendet. Man kann somit die Wirksamkeit von Enzymen mes sen, indem man die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrat verwendet.

Description

Die Erfindung betrifft L-Phenylalanyl-L-argininderivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von. Kallikrein, wobei die Verbindungen als Substrat dienen.

Bislang gibt es zahlreiche Methoden zur Bestimmung der Wirksamkeit von Enzymen. Eine Methode besteht darin, daß man einen Alkylester einer Aminosäure als Substrat mit einem Enzym zusammenbringt und die Wirksamkeit des Enzyms anhand des Hydrolysegrads des Alkylesters bestimmt. Ein Beispiel für diese Methode ist die bekannte Hestrin-Methode. Es handelt sich hierbei um eine Arbeitsweise, bei der man ein Enzym mit einem Alkylester einer Aminosäure in Kontakt bringt, nach einem vorgegebenen Zeitraum die restlichen Estergruppen mit Hydroxylamin in Hydroxamsäure überführt, diese mit Eisen-III-Chlorid reagieren läßt, um eine Farbe zu entwickeln und die Farbe als Extinktion mißt. Hierdurch wird die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse des Esters bestimmt und somit ergibt sich aus der Extinktion auch die Wirksamkeit des Enzyms.

Es gibt auch Verfahren, bei denen ein p-Nitroanilid einer Aminosäure als Substrat eingesetzt wird und die Fähigkeit zur Hydrolyse dieser Verbindung als Index dient. Bei diesen Arbeitsweisen ist eine beträchtliche Menge an Enzym erforderlich, und wenn die Enzymkonzentration niedrig ist oder das Enzym eine geringe Wirksamkeit besitzt, so stößt die Messung der Wirksamkeit des Enzyms auf Schwierigkeiten.

Der Erfindung liegt nun die Au'gabe zugrunde, neue Aminosäurederivatc, die sich als ausgezeichnetes Substrat für Kallikrein eignen, nid ein Verfahren zur Herstellung dieser Aminosäurederivate zu schaffen.

Es wurden ausgedehnte Untersuchungen vorgenommen, um Verbindungen zu schaffen, welche die nachfolgenden drei Bedingungen erfüllen: Affinität gegenüber Kallikrein, leichte Bestimmbarkeit der Menge an Kallikreiri und gute Bestimmungsempfindlichkeit. Überraschenderweise wurden Verbindungen gefunden, die als Substrat brauchbar sind und im Vergleich mit den üblichen Verbindungen den drei Bedingungen in ausgezeichneter Weise gerecht werden. ^p.s wurde auch eine einfache Arbeitsweise zur Bestimmung der Aktivität von Kallikrein unter Anwendung der genannten Verbindungen geschaffen.

Gegenstand der Erfindung sind deshalb L-Phenylalanyl-L-argininderivate der allgemeinen Formel I:

H=N

CH₂

(CH₂),

NH

NH₂

(IV)

R₁-NH CO-NH COOR₄

R₁ für ein Wasserstoffatom oder für Acetyl, Benzoyl

oder Benzyloxycarbonyl steht und
R₄ Naphthyl bedeutet.

Das Verfahren zur Herstellung der Phenylalanylargininderivate der allgemeinen Formel (1) ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel II:

10

CH, (Π)

(CH₂),

NH-R₃

(ffl)

H₂N

COOR₄

worin R₂ und R₃ eine Benzyloxycarbonylgmppe darstellen und R₄ tür Naphthyl steht, kondensiert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel IV erhält:

40

NH

R, —N

CH₂ (CH₂), ^{NH R}'

R/-NH CO —NH COOR₄

(IV)

worin Ri', R₂ und R3 die angegebenen Bedeutungen besitzen, und anschließend R₂ und R3 sowie gewünschtenfalls Ri'abspaltet.

In den Formeln (I), (II), (III) und IV) sind die Aminoschutzgruppen Benzyloxycarbonyl-, Acetyl- und Benzoylgruppen. Die Guanidinoschutzgruppen ist die Benzyloxycarbonylgruppe.

Als Ausgangsverbindung (II) zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) kann man kommerziell zugängliche Verbindungen verwenden.

Zu den Argininderivaten der allgemeinen Formel (III) gehören N^.N^-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthyl-estertrifluoracotat und dergleichen. Diese Verbindungen können hergestellt werden, indem man ein Argininderivat der allger. einen Formel (ΙΙΓ):

4
NH

R₂-

(CHJ₃

(UI')

R₅-HN

COOH

worin R₂ und R₃ die oben genannte Bedeutung besitzen und R5 für eine Aminoschutzgruppe steht, die von derjenigen für die R₂- und R₃-Gruppen verschieden ist, naphthyliert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel III":

R₁'-NH COOH -^ü

worin R₁' für Acetyl-, Benzoyl- oder Benzyioxycarbonylgruppe steht, mit einem Argininderivat der allgemeinen Formel III:

NH

R,—N

NH

NH-R₃

cm")

R₅-NH COOR₄

erhält, worin R₂, R₃. R₄ und R5 die obigen Bedeutungen besitzen, und anschließend R₅ aus der Verbindung (IH") selektiv entfernt.

Zur Herstellung der Verbindung (IV) löst man die Verbindung (11) und das Argininderivat (III) in einem geeigneten Lösungsmittel und gibt zur erhaltenen Lösung ein Aktivierungsmittel, das üblicherweise eingesetzt wird, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA) oder ein Alkylchlorcarbonat- Anschließend setzt man erforderlichenfalls eine Base zu, beispielsweise Triäthylamin, und rührt die erhaltene Mischung, um die Verbindung (IV) herzustellen. Zu den eingesetzten Lösungsmitteln gehören übliche Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Dichlormethan, Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, soweit die Ausgangsmaterialien darin löslich sind. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von O bis 40° C liegen.

Nach Beendigung der Reaktion läßt sich die Verbindung (IV) aus der Reaktionsmischung auf übliche Weise isolieren. Wenn man DCC als Aktivierungsmittel einsetzt, wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff (DCU) durch Filtrieren entfernt, und man gibt ein geeignetes Extraktionslösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat, zum Filtrat. Danach wird der Extrakt mit einer wäßrigen Zitronensäurelösung, einer gesättigten wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und/oder einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend dampft man unter verringertem Druck ein, um das Lösungsmittel zu entfernen und die Verbindung (I V) zu gewinnen.

Die Aminoschutzgruppe und/oder die Guanidino schutzgruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel (IV) werden auf übliche Weise entfernt. Wenn es sich bei der Ami.ioschutzgruppe und der Guanidinoschutzgruppc um Benzyloxycarbonyl handelt, löst man die Verbindung (IV) in einem geeigneten Lösungsmittel und gibt einen Katalysator, beispielsweise Palladiumauf-Aktivkohle, zu der erhaltenen Lösung, um die Schutzgruppe reduktiv zu entfernen. Oder man gibt die Verbindung (IV) zu einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure und gewinnt das ausgefallene Hydrobromidsalz der gewünschten Verbindung durch

Filtrieren, wobei man die Verbindung (I) erhält.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind als ausgezeichnete Substrate für Kallikrein, aber auch beispielsweise für Trypsin, Plasmin, Urokinase. CI-Esterase oder Thrombin geeig- , net. Wenn man die erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einem Enzym in Kontakt bringt, dient die Verbindung als Substrat, wobei durch Hydrolyse mit dem Enzym Naphthol freigesetzt wird. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne mißt man die m Menge an Naphthol, um die Wirksamkeit des Enzyms zu bestimmen. Die Tatsache, daß die Aktivität eines Enzyms äußerst leicht gemessen werden kann, ist beispielsweise für die quantitative Analyse einer Enzympräparation, für die Diagnose durch Messung des ι ·, Enzymspiegels im Blut oder die Diagnose durch Messung der Enzymkonzentration im Blut oder Urin, äußerst wichtig.

Wenn man die Aktivität von Kallikrein bestimmt, so wird das En/ym imi einer vuigegebenen Menge der .-u Verbindung der allgemeinen Formel (1) in einer geeigneten Pufferlösung in Kontakt gebracht, und nach einer vorgegebenen Zeitspanne bei vorgegebener Temperatur wird die Menge an freigesetztem Naphthol gemessen. Bei der Pufferlösung kann es sich um eine _>·, geeignete Pufferlösung mit optimalem pH für das Enzym handeln. Die Reaktion kann unter geeigneten konstanten Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Zeit durchgeführt werden, obgleich es bevorzugt ist. bei einer Temperatur von 25 bis 37⁰C nach 30 Minuten die Menge an freigesetztem Naphthol zu messen.

Die Messung der Menge an Naphthol kann nach irgendeiner bekannten Methode erfolgen, beispielsweise durch physiko-chemische Methoden, z. B. Gaschromatographie oder Dünnschichichromatographie. oder durch chemische Methoden, beispielsweise durch die Eisen-III-Chloridreaktion, die Diazokupplungsreaktion oder die Fast-Violet-B-Sab (FVB)-Methode. Im Hinblick auf Einfachheit und Bestimmungsempfindlichkeit ist die Methode bevorzugt, bei der man das FVB zur Reaktionsmischung zugibt, um eine Farbe zu entwikkeln. und die Extinktion mit Hilfe eines Photometers bestimmt.

Wenn man die Aktivität eines Enzyms mißt und hierbei Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-l-naphthylester als Substrat einsetzt, ist die Bestimmungsempfindlichkeit größer als wenn die Wirksamkeit unter Verwendung von N^-Benzoyl-L-argininäthylester oder N'-Tosyl-L-argininmethylester (TAME) bestimmt wird, die bisher nach der Hestrin-Methode als Substrat für Enzyme verwendet wurden. Insbesondere hat der Acetyl-L-phenylaianyl-L-arginin-1-naphthylester eine Bestimmungsempfindlichkeit gegenüber Kallikrein, die ungefähr lOSmal höher als die von N'-Benzoyl-L-argininäthylester oder die von N'-Tosyl-L-argininmethylester ist.

Die Menge des mit der genannten Methode bestimmten Naphthols entspricht der Aktivität oder der Menge des Enzyms.

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich eine Änderung der Enzymkonzentration im Blut oder Urin aufgrund verschiedener Erkrankungen ohne weiteres feststellen. So besteht beispielsweise eine Beziehung zwischen nennenswerter Hypertension und der Kallikreinkonzentration im Urin einer hypertensiven Person, und es ist bekannt, daß nennenswerte Hypertension durch Messung der Kallikreinkonzentration diagnostiziert werden kann. Bisher wurden die nachfolgenden Methoden zur Messung der Kallikreinkonzentration im Urin angewendet:

1. Test mit TAME (Tohoku ). Mcd.. 116 [1975] von MasahideSeino);

2. Bioassay (Tohoku ). Exp. Med.. 87 [1965] von Keishi Abc):

3. Radioimmunoassay.

Diese Methoden sind in ihrer Durchführung kompliziert und die Ergebnisse fluktuieren sehr stark. Darüber hinaus sind die Methoden kostspielig und häufig für eine klinische Untersuchung unbequem. Wenn man dagegen die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I einsetzt, lassen sich Kallikreinkonzentrationen im Urin durch einen einfachen Arbeitsgang aus einer kleinen Menge Urin bestimmen.

Die Bestimmung der Aktivität von Enzymen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist

45

50

55 Enzym enthält, sondern auch bei Systemen mit mehreren verschiedenen Enzymen möglich. Die Messung der Enzymverteilung im Urin oder Blut ist nämlich zur Diagnose von Erkrankungen von Interesse, jedoch wurden die konventionellen Methoden wegen ihrer Komplexität nicht sehr häufig durchgeführt. Erfindungsgemäß werden jedoch diese Komplexitäten und Schwierigkeiten vermieden. Wenn beispielsweise die Wirkss ;i!;eit eines im Urin enthaltenen Enzyms gemessen wird, läßt sich ein Enzymspiegel bzw. eine Enzymzusammensetzung im Urin bestimmen, die bisher noch nicht bestimmbar war. Hie-zu gibt man Urin auf einen geeigneten Träger, trer,nt die Enzyme durch Elektrophorese oder ähnliches voneinander, taucht die Enzyme in eine wäßrige Lösung der erfindungsgemäßen Verbindung (I) während eines geeigneten Zeitraums ein und gibt das zuvor erwähnte Farbentwicklungsagens dazu.

Die Erfindung wird durch die Beispiele und die Zeichnung näher erläutert. Die Zeichnung zeigt Standardkurven der Konzentration von Kallikrein im menschlichen Urin, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge (ng) Kallikrein aufgetragen ist und wobei sich die Zahlen in Klammern auf die Mengen an Kallikrein im Fall des N^A-Tosylargininmethylesters beziehen. Die Kurve A stellt eine Standardkurve dar, die nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhalten wurde, und die Kurve B stellt eine Standardkurve dar. die nach dem Verfahren des Vergleichsbeispiels 1 erhalten wurde.

Beispiel 1

Herstellung von L-Phenylalanyl-L-arginin-1 -naphthylesterdihydrochlorid

898 mg Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin und 2,05 g N^.N'-'-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthylestertrifluoracetat löst man in 8 ml Dimethylformamid (DMF), gibt 681 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 405 mg 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 304 mg Triäthylamin (TEA) zu der erhaltenen Lösung, wobei man rührt und mit Eis kühlt. Danach rührt man die Mischung 3 Stunden bei derselben Temperatur. Man läßt die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und rührt die Mischung für weitere 24 Stunden. Nach Beendigung der Reaktion entfernt man die ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff-(DCU)-Kristalle durch Filtration, gibt Äthylacetat zu dem Filtrat, wäscht dann die

Mischung mit lO'Vbiger wäßriger Ziironensäurclösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung, wobei diese Reihenfolge einzuhalten ist. trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und entfernt dann das Lösungsmittel durch Verdampfen bei vermindertem Druck. Man sammelt das so ausgefüllte weiße Pulver und kristallisiert aus Chloroform-Diäthyläther um, wobei man 1,1 g (Ausbeute 43%) Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N'⁾,N'"-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthylester erhält. Fp. 125 bis 130'C.

': 3380, 3280, 1750, 1720, 1650.

NMR δ ppm (CDCl,): 1.6-2.2

4H, b. N-CH₂CH₂CH₂CH

3,0 2 H. d, CH₂C

3.8-4.2 2H. b. Ν —(

4.4-5.0 H, b. -CH χ 2

5.0, 5.1. 5.3 jedes 211, s.

CH₂OCO

7,1-8.0 (27 H, m, aromatische Protonen).

M ·η löst 935 mg des obigen Esters in DMF und gibt zu der erhaltenen Lösung 0.5 g 10%iges Palladium-auf-Aktivkohle (Pd-C) und 0.98 ml einer 2n Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung. Danach leitet man Wasserstoffgas unter Kühlen mit Eis und unter Rühren 4 Stunden durch die erhaltene Mischung. Nach Beendigung der Reaktion entfernt man die Pd-C durch Filtration, gibt 300 ml wasserfreien Diäthyläther tropfenweise zu dem Filtrat, wobei ein weißes Pulver ausfällt, und sammelt das Pulver durch Filtration, wobei man 450 mg (Ausbeute 78%) L-Phenylalanyl-L-arginin-1 -naphthylester-dihydrochlorid erhält, Fp. 215'C (Zers.).

IR ν ti', cm ': 3380,3180, 1740, 1650.

NMRöppm (DMSO-d,,): 1,6-2,2 4H. b. N-CH₃CH₂CH₂CH

3,0-3,6

4H, b.

CH₂CH . -NH-CH₂CH₂-

4,0-4,5, 4,5-4,9 jedes IH, b, —CH ,

7,1-8,7 (12 H. m, aromatische Protonen).

Beispiel 2

Herstellung von Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-1 -naphthylester-hydrochlorid

Man löst 2,07 g Acetyl-L-phenylalanin und 6,80 g N^N^-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthylestertrifluoracetat in 15 ml DMF, gibt dann unter Kühlen in Eis 2,27 g DCC, 135 g HOBt und 1,01 g TEA zu der erhaltenen Mischung und rührt während 3 Stunden. Dann läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und rührt die Mischung für weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Reaktion entfernt man das so ausgefällte DCU durch Filtration, gibt Äthylacetat zu dem Filtrat, wäscht die erhaltene Mischung mit 10%iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung, wobei man diese Reihenfolge beachtet, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat, verdampft dann das Lösungsmittel bei vermindertem Druck und kristallisiert den Rückstand aus Chloroform-Diäthyläther um, wobei man 5,55 g (Ausbeute 73%) eines weißen Pulvers erhält, Fp. 179 bis 179,5° C, das Acetyl-L-nhenylalanyl-N^N^-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-1 -naphthylester darstellt.

10

IR v ^" cm ': 3380, 3260, 17M), 1720, 1640.

NMRiPPm(CDCI₁): 1.6-2.2 4 H. b, N-CH₂CH₂CH .

1.8 (3 H, s. CH)CONH-),

3.0

2 H. d. CH₂CH

3.8-4.2 2 11, b. N-CH₂C _i;-

4.7-5.0 |2H, b. — CH χ 2 ,

5.12. 5.21 jedes 2 H, s. ((^qN-CH₂OCO-

7,0-8,0 (22 H, m, aromatische Protonen).

Man löst 5,3 g des obigen F.sters in 100 ml DMF, gibt dann 3,0 g 10% Pd-C und 7,0 ml einer 2n Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung zu der erhaltenen Lösung und rührt die erhaltene Lösung unter Kühlen in Eis 6 Stunden lang, wobei man Wasserstoffgas durch sie hindurchleitet. Nach der Beendigung der Reaktion entfernt man das Pd-C durch Filtration und gibt

3250. 1750. 1650. wasserfreien Diälhyläther /u dem Filirat, worauf eine ölige Substanz präzipitiert. Man dekantiert die überstehende Flüssigkeit ab, gibt nochmals wasserfreien in Diäthyläther zu dem Rückstand und rührt die Mischung. wobei man 3.1 g (Ausbeute 84%) eines weißen Pulvers von Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-1-naphthylesterhvdrochlorid erhält. Fp. 115° C (Zers.).

NMR δ ppm (CDCl,): l.b-2.2 |4H, b, N — CH₂CHjCH₂C¹It

3.2

3 H. d. CH₂CH

3.8-4.2 2H.b. N-CH₂CH₂-

4.8-5.1 2H. b. -CH χ 2

Beispiel 3

5.1, 5 2 jedes 2 H,

-CH₂OCO-

7.1-7.9 (27 H, m, aromatische Protonen).

Herstellung von Benzoyl-L-phenylalanyl-L-arginin-1-naphthylester-hydrochlorid

Man löst 808 mg Benzoyl-L-phenylalanin und 2,05 g N^J,N^u-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-1 -naphthylestertrifluoracetat in 8 ml DMF, gibt dann unter Kühlen in Eis 681 mg DCC, 405 mg HOBt und 304 mg TEA hinzu und rührt die Mischung während 3 Stunden und dann bei Raumtemperatur für weitere 24 Stunden. Na~h Beendigung der Reaktion entfernt man das so ausgefällte DCU durch Filtration, gibt Athylacetat zu dem Filtrat, wascht dann die Mischung mit einer 10%igen Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge und trocknet dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat. Man entfernt das Lösungsmittel durch Verdampfen bei vermindertem Druck und kristallisiert den so erhaltenen Rückstand aus Chloroform-Diäthyläther um, wobei man !,4 g (Ausbeute 57%) Benzoy!-L-pheny!alanyl-N^Ä,N"-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-1 -naphthylester erhält, Fp.l77bisl85°C.

IR ι·^: cm ': 3380, 3270. 1750. 1720. 1630.

NMR δ ppm (CDCIj): 1,6-2.2

H. b. Ν —CM_: —CH₂-CH₂-CH

3,15

H. d. <(OV"^C "2 —

3,8-4,2

H, b, N-CH₂-CH₂-

4.8-5.1 2 H. b. — CII

5,1, 5,2 jedes

H. s. (Q)—CH₂OCO-

7.1 -7.9 (27 II. in. aromatische Protonen).

Man löst 1.07 g des obigen Esters in 10 ml DMF, gibt danach 0,5 g 10% Pd-C und 1,65 ml einer 2n Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung hinzu und rührt die Mischung unter Kühlen in Eis während 3 Stunden, wobei man Wasserstoffgas durch sie hindurchleitet. Nach Beendigung der Reaktion filtriert man die Reaktionsmischung, um Pd-C zu entfernen, gibt dann 500 ml wasserfreien Diathyläther zu dem Filtrat, sammelt das so präzipitierte weiße Pulver und trocknet 3 Stunden bei 1 IOC i. V. über P₂O-,, wobei man 700 mg (Ausbeute 92^0/i>) Benzoyi-L-phenylalanyl-L-arginin-lnaphthslester-hydroehlorid erhält, Fp. 112^: C(Zers.).

IR ν ™[ cm ■': 3250, 1750, 1640.

NMR (5 ppm (DMSO-dJ: 1,6-2.2 4 H. b. — ΓΗ-- CH-CII, CH

3.0-3,5 14H. b, <^OV-CH;CH . -NH-CH₂CH,-

4,5-5.0 2 H, b. -CH χ 2 .

7.1-8.0 (Π H. m. aromatische Protonen).

Beispiel 4

Bestimmung der Aktivität von Kallikrein unter

Verwendung von Acetyl-L-phenylalanyl-L-argtnin-

1 -naphthylester als Substrat

Zu 1.7 r.il einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7.0) gibt man 0,1 ml aus menschlichem Urin stammendes Kallikrein in verschiedenen Konzentrationen und 0,2 ml einer 1,0 mM wäßrigen Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-l-naphthylesterlösung. Danach inkubiert man die Mischung bei 25°C 30 Minuten lang. Zu der Mischung gibt man 20 Mikroliter einer 8%igen Natriumlaurylsulfatlösung und kühlt die erhaltene Mischung mit Eiswasser. Zu der Mischung gibt man 0,2 ml einer 1% Fast-Violet-B-Salz (FVB)-Lösung, läßt die Mischung 10 Minuten bei 0°C stehen und gibt dann 2 ml Eisessig hinzu. Die Absorption der so entwickelten Farbe (505 nm) mißt man mit Hilfe eines Spektrophotometers, um die durch Hydrolyse mit dem Enzym freigesetzte Naphtholmenge zu bestimmen. Zur Kontrolle ersetzt man die Mischung aus der Pufferlösung und dem Vi Kallikrein durch 0,1 ml der obigen Pufferlösung, die frei von Kallikrein ist. Die freigesetzte Naphtholmenge entspricht der Wirksamkeit des Enzyms.

Die für jede Kallikreinkonzentration nach der obigen

Methode erhaltenen Ergebnisse sind in der Kurve A der 5') Zeichnung wiedergegeben.

Vergleichsbeispiel 1

Bestimmung der Aktivität von Kallikrein unter

Verwendung von N*-Tosyl-L-arginin-methyIester

als Substrat

Zu 0,5 ml Kallikrein, das aus menschlichem Urin stammt, gibt man 0,4 ml einer N*-Tosylargininmethylesterlösung (10 Mikromol/0,4 ml von 5% DMSO) und 0,1ml einer 10OmM Phosphatpufferlösung (pH 7,4). Man inkubiert die Mischung 30 Minuten bei 37° C, gibt 13 ml einer Hydroxylaminlösung (eine Mischung von gleichen Teilen 2 M NH₂OH-Hydrochlorid und 3,5 M

NaOH) zu und läßt dann die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dazu gibt man 1 ml einer 18 Gew.-%igen Trichloressigsäurelösung, 1 ml von 4 N Chlorwasserstoffsäure und 1 ml einer 10 Gew.-°/oigen Eisen-III-Chloridlösung, rührt die erhaltene Mischung kräftig und zentrifugiert dann 10 Minuten bei 3000 U.p.M. Die Absorption (530 nm) der in der überstehenden Flüssigkeit entwickelten Farbe mißt man mit Hilfe eines Spektrophotometers. Der erhaltene Wert entspricht der verbleibenden Substratmenge, die mit Kallikrein nicht hydrolysiert wurde. Daher entspricht die Wirksamkeit des Enzyms dem Unterschied zwischen dem Wert, den man erhält, wenn man kein Enzym (Kontrolle) verwendet, und dem Wert, den man nach de: Enzymreaktion erhält ;>

Die für jede Kallikreinkonzentration nach der oben beschriebenen Methode erhaltenen Werte sind in der Kurve B der Zeichnung gezeigt

Vergleichsbeispiel 2
Die Verbindungen des Standes der Technik

1) a-N-Methyl-a-N-tosyl-L-lysin-ß-naphthylester

2) N-Acetyl-L-methionin-a-naphthylester

3) Acetyl-L-phenyl-L-argin-ethylester

4) H-L-Pro-L-Phe-L-Arg-a-naphthylester

wurden mit der erfindungsgemäßen Verbindung

5) Acetyl-L-phenyl-L-arginin-a-naphthylester

hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und der Spezifität bei der Bestimmung von Kallikrein verglichen.

Die Versuchsdurchführung erfolgte gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, wobei jedoch im Falle der Verbindung 3 auf das in Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chenu 259, 1978, 1667-73 beschriebene Verfahren ausgewichen werden mußte, da die Dehydrogenase unter den Reaktionsbedingungen nicht reagierte. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt

Tabelle

Empfindliciik.it der Verbindungen 1 bis 5 Lei der Bestimmung von Nallikrei i

Verbindung Kallikrein

0.21

13,6

524_t8

722,0

1517,1

1) Me-Tos-Lys-^NE
2) Ac-Mei-aNE
3} Ac-Phe-Arg-EE

4) Pro-Phe-Arg-ύτΝΕ

5) Ac-Phe-Arg-ffNE

Einheit: Δ OD/min/mg Enzym OD = optische Dichte

Dichte ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Verbindung (5) im Vergleich zu den Verbindungen de:

Stands der Technik eine überlegene Empfindlichkeil und Spezifität bei der Bestimmung von Kallikrein aufweist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. L-Phenylalanyl-L-argininderivate der allgemeinen Formel I

Η—Ν

NH

NH₂ ,ο

R₁-NH CO —NH COOR₄

15

Ri für ein Wasserstoffatom oder für Acetyl,

Benzoyl oder Benzyloxycarbonyl steht und R₄ Naphthyl bedeutet.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel II:

(H)

r,'_NH COOH

worin R₁' fur Acetyl, Benzoyl oder Benzyloxycarbonyl steht, mit einem Argininderivat der allgemeinen Formel III:

NH

(CH₂),

NH-R₃

(III)

H₂N COOR4

R₂ und R₃ eine Benzyloxycarbonylgruppe bedeuten und
Ri für Naphthyl steht,

kondensiert und aus der erhaltenen Verbindung der Formel IV:

NH

NH-R₃

(CH₂),

R,'-NH CO-NH COOR₄

worin Ri', R2 und R 3 die angegebenen Bedeutungen besitzen, R2 und R3 sowie gewünschtenfalls Ri' abspaltet.

3. Verwendung der L-Phenylalanyl-L-argininderivate gemäß Anspruch 1 als Substrat zur Bestimmung der Aktivität von Kallikrein.