DE3136508C2 - L-Phenylalanyl-L-argininderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
L-Phenylalanyl-L-argininderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Phenylalanylargininderivate der allgemeinen Formel (I) (Formel) worin R ↓1 für Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe steht, R ↓2 und R ↓3 Wasserstoff oder Guanidinoschutzgruppen darstellen, und R ↓4 für Naphthyl steht. Diese Verbindungen werden als Substrate für verschiedene Enzyme, beispielsweise für Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, C1-Esterase u.dgl., verwendet. Man kann somit die Wirksamkeit von Enzymen mes sen, indem man die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrat verwendet.
Description
Die Erfindung betrifft L-Phenylalanyl-L-argininderivate,
ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von.
Kallikrein, wobei die Verbindungen als Substrat dienen.
Bislang gibt es zahlreiche Methoden zur Bestimmung
der Wirksamkeit von Enzymen. Eine Methode besteht darin, daß man einen Alkylester einer Aminosäure als
Substrat mit einem Enzym zusammenbringt und die Wirksamkeit des Enzyms anhand des Hydrolysegrads
des Alkylesters bestimmt. Ein Beispiel für diese Methode ist die bekannte Hestrin-Methode. Es handelt
sich hierbei um eine Arbeitsweise, bei der man ein Enzym mit einem Alkylester einer Aminosäure in
Kontakt bringt, nach einem vorgegebenen Zeitraum die restlichen Estergruppen mit Hydroxylamin in Hydroxamsäure
überführt, diese mit Eisen-III-Chlorid reagieren
läßt, um eine Farbe zu entwickeln und die Farbe als Extinktion mißt. Hierdurch wird die Fähigkeit des
Enzyms zur Hydrolyse des Esters bestimmt und somit ergibt sich aus der Extinktion auch die Wirksamkeit des
Enzyms.
Es gibt auch Verfahren, bei denen ein p-Nitroanilid einer Aminosäure als Substrat eingesetzt wird und die
Fähigkeit zur Hydrolyse dieser Verbindung als Index dient. Bei diesen Arbeitsweisen ist eine beträchtliche
Menge an Enzym erforderlich, und wenn die Enzymkonzentration niedrig ist oder das Enzym eine geringe
Wirksamkeit besitzt, so stößt die Messung der Wirksamkeit des Enzyms auf Schwierigkeiten.
Der Erfindung liegt nun die Au'gabe zugrunde, neue
Aminosäurederivatc, die sich als ausgezeichnetes Substrat für Kallikrein eignen, nid ein Verfahren zur
Herstellung dieser Aminosäurederivate zu schaffen.
Es wurden ausgedehnte Untersuchungen vorgenommen, um Verbindungen zu schaffen, welche die
nachfolgenden drei Bedingungen erfüllen: Affinität gegenüber Kallikrein, leichte Bestimmbarkeit der
Menge an Kallikreiri und gute Bestimmungsempfindlichkeit. Überraschenderweise wurden Verbindungen
gefunden, die als Substrat brauchbar sind und im Vergleich mit den üblichen Verbindungen den drei
Bedingungen in ausgezeichneter Weise gerecht werden. p.s wurde auch eine einfache Arbeitsweise zur
Bestimmung der Aktivität von Kallikrein unter Anwendung der genannten Verbindungen geschaffen.
Gegenstand der Erfindung sind deshalb L-Phenylalanyl-L-argininderivate
der allgemeinen Formel I:
H=N
CH2
(CH2),
NH
NH2
(IV)
R1-NH CO-NH COOR4
R1 für ein Wasserstoffatom oder für Acetyl, Benzoyl
oder Benzyloxycarbonyl steht und
R4 Naphthyl bedeutet.
R4 Naphthyl bedeutet.
Das Verfahren zur Herstellung der Phenylalanylargininderivate
der allgemeinen Formel (1) ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise
eine Verbindung der allgemeinen Formel II:
10
CH, (Π)
(CH2),
NH-R3
(ffl)
H2N
COOR4
worin R2 und R3 eine Benzyloxycarbonylgmppe darstellen
und R4 tür Naphthyl steht, kondensiert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel IV erhält:
40
NH
R, —N
CH2 (CH2), NH R'
R/-NH CO —NH COOR4
(IV)
worin Ri', R2 und R3 die angegebenen Bedeutungen
besitzen, und anschließend R2 und R3 sowie gewünschtenfalls
Ri'abspaltet.
In den Formeln (I), (II), (III) und IV) sind die Aminoschutzgruppen Benzyloxycarbonyl-, Acetyl- und
Benzoylgruppen. Die Guanidinoschutzgruppen ist die Benzyloxycarbonylgruppe.
Als Ausgangsverbindung (II) zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) kann man kommerziell zugängliche Verbindungen verwenden.
Zu den Argininderivaten der allgemeinen Formel (III) gehören N^.N^-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthyl-estertrifluoracotat
und dergleichen. Diese Verbindungen können hergestellt werden, indem man ein Argininderivat der allger. einen Formel (ΙΙΓ):
4
NH
NH
R2-
(CHJ3
(UI')
R5-HN
COOH
worin R2 und R3 die oben genannte Bedeutung besitzen
und R5 für eine Aminoschutzgruppe steht, die von derjenigen für die R2- und R3-Gruppen verschieden ist,
naphthyliert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen
Formel III":
R1'-NH COOH -ü
worin R1' für Acetyl-, Benzoyl- oder Benzyioxycarbonylgruppe
steht, mit einem Argininderivat der allgemeinen Formel III:
NH
R,—N
NH
NH-R3
cm")
R5-NH COOR4
erhält, worin R2, R3. R4 und R5 die obigen Bedeutungen
besitzen, und anschließend R5 aus der Verbindung (IH") selektiv entfernt.
Zur Herstellung der Verbindung (IV) löst man die Verbindung (11) und das Argininderivat (III) in einem
geeigneten Lösungsmittel und gibt zur erhaltenen Lösung ein Aktivierungsmittel, das üblicherweise
eingesetzt wird, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA) oder ein
Alkylchlorcarbonat- Anschließend setzt man erforderlichenfalls
eine Base zu, beispielsweise Triäthylamin, und rührt die erhaltene Mischung, um die Verbindung (IV)
herzustellen. Zu den eingesetzten Lösungsmitteln gehören übliche Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform,
Dichlormethan, Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, soweit die Ausgangsmaterialien darin löslich
sind. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von O bis 40° C liegen.
Nach Beendigung der Reaktion läßt sich die Verbindung (IV) aus der Reaktionsmischung auf übliche
Weise isolieren. Wenn man DCC als Aktivierungsmittel einsetzt, wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff
(DCU) durch Filtrieren entfernt, und man gibt ein geeignetes Extraktionslösungsmittel, beispielsweise
Äthylacetat, zum Filtrat. Danach wird der Extrakt mit einer wäßrigen Zitronensäurelösung, einer gesättigten
wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und/oder einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen
und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Anschließend dampft man unter verringertem Druck
ein, um das Lösungsmittel zu entfernen und die Verbindung (I V) zu gewinnen.
Die Aminoschutzgruppe und/oder die Guanidino schutzgruppe der Verbindungen der allgemeinen
Formel (IV) werden auf übliche Weise entfernt. Wenn es sich bei der Ami.ioschutzgruppe und der Guanidinoschutzgruppc
um Benzyloxycarbonyl handelt, löst man die Verbindung (IV) in einem geeigneten Lösungsmittel
und gibt einen Katalysator, beispielsweise Palladiumauf-Aktivkohle,
zu der erhaltenen Lösung, um die Schutzgruppe reduktiv zu entfernen. Oder man gibt die
Verbindung (IV) zu einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure und gewinnt das ausgefallene
Hydrobromidsalz der gewünschten Verbindung durch
Filtrieren, wobei man die Verbindung (I) erhält.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind als ausgezeichnete Substrate für
Kallikrein, aber auch beispielsweise für Trypsin, Plasmin, Urokinase. CI-Esterase oder Thrombin geeig- ,
net. Wenn man die erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einem Enzym in Kontakt
bringt, dient die Verbindung als Substrat, wobei durch Hydrolyse mit dem Enzym Naphthol freigesetzt wird.
Nach einer vorgegebenen Zeitspanne mißt man die m Menge an Naphthol, um die Wirksamkeit des Enzyms zu
bestimmen. Die Tatsache, daß die Aktivität eines Enzyms äußerst leicht gemessen werden kann, ist
beispielsweise für die quantitative Analyse einer Enzympräparation, für die Diagnose durch Messung des ι ·,
Enzymspiegels im Blut oder die Diagnose durch Messung der Enzymkonzentration im Blut oder Urin,
äußerst wichtig.
Wenn man die Aktivität von Kallikrein bestimmt, so
wird das En/ym imi einer vuigegebenen Menge der .-u
Verbindung der allgemeinen Formel (1) in einer geeigneten Pufferlösung in Kontakt gebracht, und nach
einer vorgegebenen Zeitspanne bei vorgegebener Temperatur wird die Menge an freigesetztem Naphthol
gemessen. Bei der Pufferlösung kann es sich um eine _>·,
geeignete Pufferlösung mit optimalem pH für das Enzym handeln. Die Reaktion kann unter geeigneten
konstanten Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Zeit durchgeführt werden, obgleich es bevorzugt ist. bei
einer Temperatur von 25 bis 370C nach 30 Minuten die Menge an freigesetztem Naphthol zu messen.
Die Messung der Menge an Naphthol kann nach irgendeiner bekannten Methode erfolgen, beispielsweise
durch physiko-chemische Methoden, z. B. Gaschromatographie oder Dünnschichichromatographie. oder
durch chemische Methoden, beispielsweise durch die Eisen-III-Chloridreaktion, die Diazokupplungsreaktion
oder die Fast-Violet-B-Sab (FVB)-Methode. Im Hinblick
auf Einfachheit und Bestimmungsempfindlichkeit ist die Methode bevorzugt, bei der man das FVB zur
Reaktionsmischung zugibt, um eine Farbe zu entwikkeln.
und die Extinktion mit Hilfe eines Photometers bestimmt.
Wenn man die Aktivität eines Enzyms mißt und hierbei Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-l-naphthylester
als Substrat einsetzt, ist die Bestimmungsempfindlichkeit größer als wenn die Wirksamkeit unter
Verwendung von N^-Benzoyl-L-argininäthylester oder
N'-Tosyl-L-argininmethylester (TAME) bestimmt wird,
die bisher nach der Hestrin-Methode als Substrat für Enzyme verwendet wurden. Insbesondere hat der
Acetyl-L-phenylaianyl-L-arginin-1-naphthylester eine
Bestimmungsempfindlichkeit gegenüber Kallikrein, die ungefähr lOSmal höher als die von N'-Benzoyl-L-argininäthylester
oder die von N'-Tosyl-L-argininmethylester
ist.
Die Menge des mit der genannten Methode bestimmten Naphthols entspricht der Aktivität oder der
Menge des Enzyms.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich eine Änderung der Enzymkonzentration im
Blut oder Urin aufgrund verschiedener Erkrankungen ohne weiteres feststellen. So besteht beispielsweise eine
Beziehung zwischen nennenswerter Hypertension und der Kallikreinkonzentration im Urin einer hypertensiven
Person, und es ist bekannt, daß nennenswerte Hypertension durch Messung der Kallikreinkonzentration
diagnostiziert werden kann. Bisher wurden die nachfolgenden Methoden zur Messung der Kallikreinkonzentration
im Urin angewendet:
1. Test mit TAME (Tohoku ). Mcd.. 116 [1975] von
MasahideSeino);
2. Bioassay (Tohoku ). Exp. Med.. 87 [1965] von Keishi
Abc):
3. Radioimmunoassay.
Diese Methoden sind in ihrer Durchführung kompliziert und die Ergebnisse fluktuieren sehr stark. Darüber
hinaus sind die Methoden kostspielig und häufig für eine klinische Untersuchung unbequem. Wenn man dagegen
die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I einsetzt, lassen sich Kallikreinkonzentrationen
im Urin durch einen einfachen Arbeitsgang aus einer kleinen Menge Urin bestimmen.
Die Bestimmung der Aktivität von Enzymen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist
45
50
55 Enzym enthält, sondern auch bei Systemen mit
mehreren verschiedenen Enzymen möglich. Die Messung der Enzymverteilung im Urin oder Blut ist nämlich
zur Diagnose von Erkrankungen von Interesse, jedoch wurden die konventionellen Methoden wegen ihrer
Komplexität nicht sehr häufig durchgeführt. Erfindungsgemäß werden jedoch diese Komplexitäten und
Schwierigkeiten vermieden. Wenn beispielsweise die Wirkss ;i!;eit eines im Urin enthaltenen Enzyms
gemessen wird, läßt sich ein Enzymspiegel bzw. eine Enzymzusammensetzung im Urin bestimmen, die bisher
noch nicht bestimmbar war. Hie-zu gibt man Urin auf einen geeigneten Träger, trer,nt die Enzyme durch
Elektrophorese oder ähnliches voneinander, taucht die Enzyme in eine wäßrige Lösung der erfindungsgemäßen
Verbindung (I) während eines geeigneten Zeitraums ein und gibt das zuvor erwähnte Farbentwicklungsagens
dazu.
Die Erfindung wird durch die Beispiele und die Zeichnung näher erläutert. Die Zeichnung zeigt
Standardkurven der Konzentration von Kallikrein im menschlichen Urin, wobei auf der Ordinate die
Absorption und auf der Abszisse die Menge (ng) Kallikrein aufgetragen ist und wobei sich die Zahlen in
Klammern auf die Mengen an Kallikrein im Fall des NA-Tosylargininmethylesters beziehen. Die Kurve A
stellt eine Standardkurve dar, die nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhalten wurde, und die Kurve B stellt
eine Standardkurve dar. die nach dem Verfahren des Vergleichsbeispiels 1 erhalten wurde.
Herstellung von L-Phenylalanyl-L-arginin-1
-naphthylesterdihydrochlorid
898 mg Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin und 2,05 g
N^.N'-'-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthylestertrifluoracetat
löst man in 8 ml Dimethylformamid (DMF), gibt 681 mg Dicyclohexylcarbodiimid (DCC),
405 mg 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 304 mg Triäthylamin (TEA) zu der erhaltenen Lösung, wobei
man rührt und mit Eis kühlt. Danach rührt man die Mischung 3 Stunden bei derselben Temperatur. Man
läßt die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und rührt die Mischung für weitere 24 Stunden. Nach
Beendigung der Reaktion entfernt man die ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff-(DCU)-Kristalle durch Filtration,
gibt Äthylacetat zu dem Filtrat, wäscht dann die
Mischung mit lO'Vbiger wäßriger Ziironensäurclösung,
gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter
Natriumchloridlösung, wobei diese Reihenfolge einzuhalten ist. trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat
und entfernt dann das Lösungsmittel durch Verdampfen bei vermindertem Druck. Man sammelt das so
ausgefüllte weiße Pulver und kristallisiert aus Chloroform-Diäthyläther
um, wobei man 1,1 g (Ausbeute 43%) Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N'),N'"-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthylester
erhält. Fp. 125 bis 130'C.
': 3380, 3280, 1750, 1720, 1650.
NMR δ ppm (CDCl,): 1.6-2.2
4H, b. N-CH2CH2CH2CH
3,0 2 H. d, CH2C
3.8-4.2 2H. b. Ν —(
4.4-5.0 H, b. -CH χ 2
5.0, 5.1. 5.3 jedes 211, s.
CH2OCO
7,1-8.0 (27 H, m, aromatische Protonen).
M ·η löst 935 mg des obigen Esters in DMF und gibt zu der erhaltenen Lösung 0.5 g 10%iges Palladium-auf-Aktivkohle
(Pd-C) und 0.98 ml einer 2n Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung. Danach leitet man Wasserstoffgas
unter Kühlen mit Eis und unter Rühren 4 Stunden durch die erhaltene Mischung. Nach Beendigung
der Reaktion entfernt man die Pd-C durch Filtration, gibt 300 ml wasserfreien Diäthyläther tropfenweise
zu dem Filtrat, wobei ein weißes Pulver ausfällt, und sammelt das Pulver durch Filtration, wobei
man 450 mg (Ausbeute 78%) L-Phenylalanyl-L-arginin-1
-naphthylester-dihydrochlorid erhält, Fp. 215'C (Zers.).
IR ν ti', cm ': 3380,3180, 1740, 1650.
NMRöppm (DMSO-d,,): 1,6-2,2
4H. b. N-CH3CH2CH2CH
3,0-3,6
4H, b.
CH2CH . -NH-CH2CH2-
4,0-4,5, 4,5-4,9 jedes IH, b, —CH ,
7,1-8,7 (12 H. m, aromatische Protonen).
Herstellung von Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-1
-naphthylester-hydrochlorid
Man löst 2,07 g Acetyl-L-phenylalanin und 6,80 g
N^N^-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthylestertrifluoracetat
in 15 ml DMF, gibt dann unter Kühlen in Eis 2,27 g DCC, 135 g HOBt und 1,01 g TEA zu der
erhaltenen Mischung und rührt während 3 Stunden. Dann läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur
ansteigen und rührt die Mischung für weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der
Reaktion entfernt man das so ausgefällte DCU durch Filtration, gibt Äthylacetat zu dem Filtrat, wäscht die
erhaltene Mischung mit 10%iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter
Natriumchloridlösung, wobei man diese Reihenfolge beachtet, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat,
verdampft dann das Lösungsmittel bei vermindertem Druck und kristallisiert den Rückstand aus Chloroform-Diäthyläther
um, wobei man 5,55 g (Ausbeute 73%) eines weißen Pulvers erhält, Fp. 179 bis 179,5° C, das
Acetyl-L-nhenylalanyl-N^N^-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-1
-naphthylester darstellt.
10
IR v ^" cm ': 3380, 3260, 17M), 1720, 1640.
NMRiPPm(CDCI1): 1.6-2.2 4 H. b, N-CH2CH2CH .
1.8 (3 H, s. CH)CONH-),
3.0
2 H. d. CH2CH
3.8-4.2 2 11, b. N-CH2C i;-
4.7-5.0 |2H, b. — CH χ 2 ,
5.12. 5.21 jedes 2 H, s. ((^qN-CH2OCO-
7,0-8,0 (22 H, m, aromatische Protonen).
Man löst 5,3 g des obigen F.sters in 100 ml DMF, gibt dann 3,0 g 10% Pd-C und 7,0 ml einer 2n Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung
zu der erhaltenen Lösung und rührt die erhaltene Lösung unter Kühlen in Eis 6 Stunden lang, wobei man Wasserstoffgas durch sie
hindurchleitet. Nach der Beendigung der Reaktion entfernt man das Pd-C durch Filtration und gibt
3250. 1750. 1650. wasserfreien Diälhyläther /u dem Filirat, worauf eine
ölige Substanz präzipitiert. Man dekantiert die überstehende
Flüssigkeit ab, gibt nochmals wasserfreien in Diäthyläther zu dem Rückstand und rührt die Mischung.
wobei man 3.1 g (Ausbeute 84%) eines weißen Pulvers von Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-1-naphthylesterhvdrochlorid
erhält. Fp. 115° C (Zers.).
NMR δ ppm (CDCl,): l.b-2.2 |4H, b, N — CH2CHjCH2C1It
3.2
3 H. d. CH2CH
3.8-4.2 2H.b. N-CH2CH2-
4.8-5.1 2H. b. -CH χ 2
5.1, 5 2 jedes 2 H,
-CH2OCO-
7.1-7.9 (27 H, m, aromatische Protonen).
Herstellung von Benzoyl-L-phenylalanyl-L-arginin-1-naphthylester-hydrochlorid
Man löst 808 mg Benzoyl-L-phenylalanin und 2,05 g
NJ,Nu-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-1 -naphthylestertrifluoracetat
in 8 ml DMF, gibt dann unter Kühlen in Eis 681 mg DCC, 405 mg HOBt und 304 mg TEA hinzu
und rührt die Mischung während 3 Stunden und dann bei Raumtemperatur für weitere 24 Stunden. Na~h Beendigung
der Reaktion entfernt man das so ausgefällte DCU durch Filtration, gibt Athylacetat zu dem Filtrat, wascht
dann die Mischung mit einer 10%igen Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter
Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge und trocknet dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat.
Man entfernt das Lösungsmittel durch Verdampfen bei vermindertem Druck und kristallisiert den so erhaltenen
Rückstand aus Chloroform-Diäthyläther um, wobei man !,4 g (Ausbeute 57%) Benzoy!-L-pheny!alanyl-NÄ,N"-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-1
-naphthylester erhält, Fp.l77bisl85°C.
IR ι·^: cm ': 3380, 3270. 1750. 1720. 1630.
NMR δ ppm (CDCIj): 1,6-2.2
H. b. Ν —CM: —CH2-CH2-CH
3,15
H. d. <(OV"C "2 —
3,8-4,2
H, b, N-CH2-CH2-
4.8-5.1 2 H. b. — CII
5,1, 5,2 jedes
H. s. (Q)—CH2OCO-
7.1 -7.9 (27 II. in. aromatische Protonen).
Man löst 1.07 g des obigen Esters in 10 ml DMF, gibt
danach 0,5 g 10% Pd-C und 1,65 ml einer 2n
Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung hinzu und rührt
die Mischung unter Kühlen in Eis während 3 Stunden, wobei man Wasserstoffgas durch sie hindurchleitet.
Nach Beendigung der Reaktion filtriert man die Reaktionsmischung, um Pd-C zu entfernen, gibt dann
500 ml wasserfreien Diathyläther zu dem Filtrat, sammelt das so präzipitierte weiße Pulver und trocknet
3 Stunden bei 1 IOC i. V. über P2O-,, wobei man 700 mg
(Ausbeute 920/i>) Benzoyi-L-phenylalanyl-L-arginin-lnaphthslester-hydroehlorid
erhält, Fp. 112: C(Zers.).
IR ν ™[ cm ■': 3250, 1750, 1640.
NMR (5 ppm (DMSO-dJ: 1,6-2.2 4 H. b. — ΓΗ-- CH-CII, CH
3.0-3,5 14H. b, <^OV-CH;CH . -NH-CH2CH,-
4,5-5.0 2 H, b. -CH χ 2 .
7.1-8.0 (Π H. m. aromatische Protonen).
Bestimmung der Aktivität von Kallikrein unter
Verwendung von Acetyl-L-phenylalanyl-L-argtnin-
1 -naphthylester als Substrat
Zu 1.7 r.il einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7.0)
gibt man 0,1 ml aus menschlichem Urin stammendes Kallikrein in verschiedenen Konzentrationen und 0,2 ml
einer 1,0 mM wäßrigen Acetyl-L-phenylalanyl-L-arginin-l-naphthylesterlösung.
Danach inkubiert man die Mischung bei 25°C 30 Minuten lang. Zu der Mischung
gibt man 20 Mikroliter einer 8%igen Natriumlaurylsulfatlösung
und kühlt die erhaltene Mischung mit Eiswasser. Zu der Mischung gibt man 0,2 ml einer 1%
Fast-Violet-B-Salz (FVB)-Lösung, läßt die Mischung 10 Minuten bei 0°C stehen und gibt dann 2 ml Eisessig
hinzu. Die Absorption der so entwickelten Farbe (505 nm) mißt man mit Hilfe eines Spektrophotometers,
um die durch Hydrolyse mit dem Enzym freigesetzte Naphtholmenge zu bestimmen. Zur Kontrolle ersetzt
man die Mischung aus der Pufferlösung und dem Vi Kallikrein durch 0,1 ml der obigen Pufferlösung, die frei
von Kallikrein ist. Die freigesetzte Naphtholmenge entspricht der Wirksamkeit des Enzyms.
Die für jede Kallikreinkonzentration nach der obigen
Methode erhaltenen Ergebnisse sind in der Kurve A der 5') Zeichnung wiedergegeben.
Vergleichsbeispiel 1
Bestimmung der Aktivität von Kallikrein unter
Verwendung von N*-Tosyl-L-arginin-methyIester
als Substrat
Zu 0,5 ml Kallikrein, das aus menschlichem Urin stammt, gibt man 0,4 ml einer N*-Tosylargininmethylesterlösung
(10 Mikromol/0,4 ml von 5% DMSO) und 0,1ml einer 10OmM Phosphatpufferlösung (pH 7,4).
Man inkubiert die Mischung 30 Minuten bei 37° C, gibt 13 ml einer Hydroxylaminlösung (eine Mischung von
gleichen Teilen 2 M NH2OH-Hydrochlorid und 3,5 M
NaOH) zu und läßt dann die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dazu gibt man 1 ml einer 18
Gew.-%igen Trichloressigsäurelösung, 1 ml von 4 N Chlorwasserstoffsäure und 1 ml einer 10 Gew.-°/oigen
Eisen-III-Chloridlösung, rührt die erhaltene Mischung
kräftig und zentrifugiert dann 10 Minuten bei 3000 U.p.M. Die Absorption (530 nm) der in der überstehenden
Flüssigkeit entwickelten Farbe mißt man mit Hilfe eines Spektrophotometers. Der erhaltene Wert entspricht
der verbleibenden Substratmenge, die mit Kallikrein nicht hydrolysiert wurde. Daher entspricht
die Wirksamkeit des Enzyms dem Unterschied zwischen dem Wert, den man erhält, wenn man kein Enzym
(Kontrolle) verwendet, und dem Wert, den man nach de: Enzymreaktion erhält ;>
Die für jede Kallikreinkonzentration nach der oben beschriebenen Methode erhaltenen Werte sind in der
Kurve B der Zeichnung gezeigt
Vergleichsbeispiel 2
Die Verbindungen des Standes der Technik
Die Verbindungen des Standes der Technik
1) a-N-Methyl-a-N-tosyl-L-lysin-ß-naphthylester
2) N-Acetyl-L-methionin-a-naphthylester
3) Acetyl-L-phenyl-L-argin-ethylester
4) H-L-Pro-L-Phe-L-Arg-a-naphthylester
wurden mit der erfindungsgemäßen Verbindung
5) Acetyl-L-phenyl-L-arginin-a-naphthylester
hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und der Spezifität bei der Bestimmung von Kallikrein verglichen.
Die Versuchsdurchführung erfolgte gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, wobei jedoch im
Falle der Verbindung 3 auf das in Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chenu 259, 1978, 1667-73 beschriebene
Verfahren ausgewichen werden mußte, da die Dehydrogenase unter den Reaktionsbedingungen nicht reagierte.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt
Empfindliciik.it der Verbindungen 1 bis 5 Lei der
Bestimmung von Nallikrei i
0.21
13,6
524t8
722,0
1517,1
1) Me-Tos-Lys-^NE
2) Ac-Mei-aNE
3} Ac-Phe-Arg-EE
2) Ac-Mei-aNE
3} Ac-Phe-Arg-EE
4) Pro-Phe-Arg-ύτΝΕ
5) Ac-Phe-Arg-ffNE
Einheit: Δ OD/min/mg Enzym OD = optische Dichte
Dichte ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Verbindung (5) im Vergleich zu den Verbindungen de:
Stands der Technik eine überlegene Empfindlichkeil und Spezifität bei der Bestimmung von Kallikrein
aufweist.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
1. L-Phenylalanyl-L-argininderivate der allgemeinen
Formel I
Η—Ν
NH
NH2 ,ο
R1-NH CO —NH COOR4
15
Ri für ein Wasserstoffatom oder für Acetyl,
Benzoyl oder Benzyloxycarbonyl steht und R4 Naphthyl bedeutet.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
jeweils in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel II:
(H)
r,'_NH COOH
worin R1' fur Acetyl, Benzoyl oder Benzyloxycarbonyl
steht, mit einem Argininderivat der allgemeinen Formel III:
NH
(CH2),
NH-R3
(III)
H2N COOR4
R2 und R3 eine Benzyloxycarbonylgruppe bedeuten
und
Ri für Naphthyl steht,
Ri für Naphthyl steht,
kondensiert und aus der erhaltenen Verbindung der Formel IV:
NH
NH-R3
(CH2),
R,'-NH CO-NH COOR4
worin Ri', R2 und R 3 die angegebenen Bedeutungen
besitzen, R2 und R3 sowie gewünschtenfalls Ri'
abspaltet.
3. Verwendung der L-Phenylalanyl-L-argininderivate
gemäß Anspruch 1 als Substrat zur Bestimmung der Aktivität von Kallikrein.
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