DE2943580C2 - L-Phenylalanyl-sowie N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-naphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents

L-Phenylalanyl-sowie N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-naphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Info

Publication number
DE2943580C2
DE2943580C2 DE2943580A DE2943580A DE2943580C2 DE 2943580 C2 DE2943580 C2 DE 2943580C2 DE 2943580 A DE2943580 A DE 2943580A DE 2943580 A DE2943580 A DE 2943580A DE 2943580 C2 DE2943580 C2 DE 2943580C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
phenylalanyl
benzoyl
arginine
solution
general formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2943580A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2943580A1 (de
Inventor
Setsuro Toyonaka Fujii
Mamoru Chiba Sugimoto
Takashi Funabashi Yaegashi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Torii & Co Ltd Tokyo Jp
Original Assignee
Torii & Co Ltd Tokyo Jp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Torii & Co Ltd Tokyo Jp filed Critical Torii & Co Ltd Tokyo Jp
Publication of DE2943580A1 publication Critical patent/DE2943580A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2943580C2 publication Critical patent/DE2943580C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/30—Naphthol derivatives, e.g. alpha-naphthyl-esters, i.e. alpha-NE, beta-naphthyl-esters, i.e. beta-NE
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft eine Phenylalanylvalylargininnaphthylester, ein Verfahren, zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität der in Anspruch 3 genannten Enzyme, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrat verwendet werden.
Derzeit sind viele Verfahren zur Bestimmung von Enzym-Aktivitäten bekannt Eines dieser Verfahren besteht darin, daß man einen Alkylester einer Aminosäure als Substrat mit einem Enzym in Kontakt bringt und die Enzym-Aktivität aufgrund des Hydrolysegrads des Alkylesters bestimmt Ein Beispiel für diese Arbeitsweisen ist die bekannte Hestrin- Methode. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren bei dem man ein Enzym mk einem Alkylester einer Aminosäure in Kontakt bringt, nach einer vorgegebenen Zeitspanne die verbleibenden Estergruppen mit Hydroxylamin in eine Hydroxamsäure überführt, diese unter Farbentwicklung mit Eisen-III-Chlorid reagieren läßt und die Farbe als Extinktion mißt und scht:eßlich aus der Extinktion die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse des Esters, d. h. die Enzym-Aktivität, bestimmt
Aus Anal. Biochem. 61,1974,200-208 (CA. 82,1975, 12776) ist es bekannt Plasmin mittels a-N-Methyl-a-N-tosyl-L-lysin-/?-naphthylester als Substrat durch Messung der freigesetzten Menge an jJ-Naphthol zu bestimmen. Es gibt auch eine Methode, bei der man ein p-Nitroanilid als Substrat einsetzt (vgl. Thromb. Res. I 1972,267 - 278, DE-OS 23 22 116). Bei diesen Methoden ist jedoch eine beträchtliche Menge an Enzym
CH3
CHCH3
erforderlich, und wenn die Enzymkonzentration gering ist oder das Enzym eine geringe Aktivität besitzt so hat es sich als schwierig erwiesen, die Enzym-Aktivität zu bestimmen.
Erfindungsgemäß wurden ausgedehnte Untersuchungen angestellt, um Verbindungen aufzufinden, welche die drei nachstehenden Bedingungen erfüllen: Sie müssen eine Affinität für ein Enzym besitzen, die Bestimmung der Enzym-Aktivität muß einfach durchführbar sein und die Empfindlichkeit der Verbindungen bei der Bestimmung muß gut sein. Überraschend wurden erfindungsgemäß Verbindungen erhalten, welche im Vergleich zu den üblichen Verbindungen sich hinsichtlich der vorstehenden Erfordernisse als ausgezeichnet erwiesen haben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Aminosäurederivate bereitzustellen, welche als ausgezeichnetes Substrat für Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Eesterase, Thrombin and Faktor Xa brauchbar sind. Der Erfindung liegt auch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Aminosäurederivate zu schaffen. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine neue Verwendung zu schaffen zur Bestimmung der Aktivität der genannten Enzyme unter Anwendung der neuen Aminosäurederivate als Substrat für das Enzym.
Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Bereitstellung von L-Phenylalanyl-L-valyl-L-argininnaphtylestern der allgemeinen Formel I:
R1-NH CO—NH CO-NH
worin Ri für Wasserstoff oder Benzoyl steht
Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung der Phenylalanylvalylargininnaphthylester
der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist daß man jeweils in an sich bekannter Weise
A) ein
der allgemeinen Formel II:
CH3
CHCH3
(Π)
R3NH CONH COOH
in der R3 Benzoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, mit einem I^Argininnaphthylester der allgemeinen Formel III:
NH
R4-N-^
(ΠΙ)
in der R4 eine Aminoschutzgruppe bedeutet, kondensiert und
B) aus der Verbindung der allgemeinen Formel IV
NH
CH3 NH-/
I MH P
CHCH3 (CH2J3 1Nn K"
COO
in der R3 und R4 die genannten Bedeutungen besitzen, die Aminoschutzgruppe(n) abspaltet.
Die Ausgangsverbindungen der allgemeinen For- kann hergestellt werden, indem man ein Argininderivat melll, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Ver- der allgemeinen Formel III' mit einer geeigneten bindungen der allgemeinen Formel I eingesetzt werden, Schutzgruppe:
können hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel V: 20 NH
I NH-R4
(CM2J3 (111 )
(V) R4—HN COOH
worin R4 dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt und
R3HN COOH 30 R4' eine Aminoschutzgruppe darstellt, welche von der
Gruppe R4 verschieden ist, naphthyliert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel III" erhält: worin R3 dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt, mit
einer Verbindung der allgemeinen Formel VI: .NH
35
CH3 CH3 f
( NH K< (DT')
CH (VI)
40
R4—HN COOR2
H2N COOR5
worin R2, R4 und R4- dieselben Bedeutungen wie zuvor besitzen und anschließend selektiv nur die Amino-45 schutzgruppe in der α-Position aus der Verbindung III" worin R5 fur Alkyl steht, zu einem Ester der allgemei- entfernt
nen Formel VII kondensiert: Bei der Herstellung der Verbindung IV löst man die
Verbindung II und das Argininderivat III in einem geeigneten Lösungsmittel auf und gibt zur erhaltenen 50 Lösung ein Aktivierungsmittel, das üblicherweise
Z K3 C H3 eingesetzt wird, beispieslweise Dicydchexylcarbcdiiniid
X / (DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA), ein Alkylchlor-
(VII) carbonat oder dergleichen, und anschließend, erforderli-
Achenfalls, eine Base, beispielsweise Triäthylamin oder 55 dergleichen. Dann rührt man die erhaltene Mischung, rn mw nnrti} wodurch die Verbindung IV hergestellt wird. Zu den
uu Mti CUUK5 eingesetzten Lösungsmitteln gehören übliche Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Dichlormethan, Diworin R3 und R5 dieselben Bedeutungen wie zuvor methylformamid, Tetrahydrofuran und dergleichen in besitzen und anschließend den Ester der allgemeinen 60 dem Umfang, in dem die Ausgangsmaterialien darin Formel VII hydroylsiert Andernfalls kann man die von löslich sind. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich L. Lubiewska-Nakonicczana, B. Rzeszetarska und E von 0° bis 40° C liegen.
Taschner, Justus LJebigs Ann. Chem, 741, 157 (1970) Nach Beendigung der Reaktion kann man die
offenbarten Verbindungen als Verbindungen der allge- Verbindung IV aus der Reaktionsmischung auf übliche meinen Formel II verwenden. 65 Weise isolieren. Wenn man DCC als Aktivierungsmittel
Das Argininausgangsderivat der allgemeinen Formel verwendet^wird der ausgefäUte Dicyclohexylhamstoff III umfaßt auch den NGJ^Dibenzyloxycarbonyl:L-ar- (DCU) durch Filtrieren entfernt und ein geeignetes ginin-1-naphtylester und ähnliche Verbindungen und Extraktionslösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat,
wird zum Filtrat zugegeben. Danach wäscht man den Extrakt mit wäßriger Zitronensäurelösung, wäßriger, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und/oder gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und verdampft dann unter vermindertem Druck, um das Lösungsmittel zu entfernen. Hierbei erhält man die Verbindung IV.
Die Aminoschutzgruppe der Verbindung IV wird auf übliche Weise entfernt Wenn man als Aminoschutzgruppe Benzyloxycarbonyl einsetzt, wird die Verbindung IV in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, und ein Katalysator, beispielsweise Palladium-auf-Aktivkohle oder dergleichen, wird zur erhaltenen Lösung zugegeben, um die Schutzgruppe reduktiv zu entfernen. Man kann auch die Verbindung IV zu einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure zugeben. Dann wird die in Form des Hydrobromids ausgefällte Verbindung durch Filtrieren isoliert, wodurch man die Verbindung I erhält
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden verwendet als Substrate zur Bestimmung der Aktivität von Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Esterase, Thrombin und Faktor Xa. Wenn man die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I mit einem solchen Enzym in Kontakt bringt, dient die Verbindung somit als Substrat, und Naphthol wird durch Hydrolyse mit dem Enzym nach einem vorgegebenen Zeitraum freigesetzt nachdem die Menge an Naphthol bestimmt wird, um die Enzym-Aktivität zu messen. Die Tatsache, daß man die Enzym-Aktivität sehr leicht bestimmen kann, ist für eine quantitative Analyse einer Enzympräparation, eine Diagnose durch Messung der Enzymverteilung im Blut, eine Diagnose durch Messung der Enzymkonzentration in Blut oder Urin, oder dergleichen, von wesentlicher Bedeutung.
Wenn man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Enzym-Aktivität bestimmt, so bringt man das Enzym mit einer vorgegebenen Menge der erfindungsgemäßen Verbindung I in einer geeigneten Pufferlösung in Kontakt Nach einer vorgegebenen Zeitspanne bei vorgegebener Temperatur wird die Menge an freigesetztem Naphthol gemessen, wodurch die Enzym-Aktivität bestimmt wird. Als Pufferlösung kann man eine Lösung verwenden, welche den optimalen pH für das Enzym aufweist Man kann die Reaktion unter geeigneten, konstanten Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Zeit durchführen, obgleich es bevorzugt ist, die bei einer Temperatur von 25 bis 37° C nach 30 Minuten freigesetzte Menge an Naphthol zu messen.
Die Messung der Naphtholmenge kann anhand einer der bekannten Methoden durchgeführt werden, beispielsweise durch physikochemische Methoden, wie Gaschromatographie oder Dünnschichtchromatographie, oder durch chemische Methoden, wie durch die Eisen-III-Chloridreaktion, die Diazokupplungsreaktion oder durch die Methode des Fast-Violet-B-Salzes (FVB). Bevorzugt im Hinblick auf Einfachheit und Empfindlichkeit der Bestimmung ist jedoch eine Methode, bei der das FVB zur Reaktionsmischung zugegeben wird, um eine Farbe zu entwickeln und die Extinktion mit Hilfe eines Photometers bestimmt wird
Die Menge des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Naphtols entspricht der Enzym-Aktivität
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es -möglich, eine Änderung der Enzymkonzentration im Blut oder im Urin, bedingt durch verschiedene Erkrankungen, ohne weiteres festzustellen.
Die Erfindung ist durch die nachstehenden Beispiele und die Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung sind die Standardkurven für die Konzentration des Th rombins angegeben.
Beispiel 1
Herstellung von L-Phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-dihydrochlorid
Man löst in 10 ml Ν,Ν-Dimethylformamid (DMF) 796 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valin (vgl. L Lubiewska-Nakonieczna, B. Rzeszotarska und E. Taschner, Justus Liebigs Ann. Chem, 741, 157 (1970)) und 1,36 g N^N^Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-inaphthylester-trifluoracetat auf und gibt dann 533 mg DCC, 351 mg 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 0,31 ml Triäthylamin (TEA) zur Lösung unter Eiskühlung zu. Die erhaltene Mischung wird bei derselben Temperatur 3 Stunden gerührt und dann noch 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Nach beendeter Reaktion wird der ausgefallene DCU durch Filtrieren entfernt und man gibt Äthylacetat zum Filtrat zu. Die erhaltene Mischung wird mit 10%iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck eingedampft, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der
Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert Man erhält 810 mg (Ausbeute 43%) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-NG,NG-dibenzyloxycarbonal-L-arginin-1-naphthylester in Form eines weißen Pulvers mit Schmelzpunkt 174 bis 176° C
IRv^cm-·: 3400,3250,1740,1720,1640.
NMR δ ppm (CDCl3+DMSOd6):
0,9 (6H, d), 2,0 (4H, breit), 2,6 (IH, m), 3,l(2H,m),4,0-5,0(lHx3,m), 5,0 (2H,s), 5,2(2H,s), 5,3 (2H,s), 7,2—8,1 (aromatische Protonen).
Man löst 720 mg des obigen Esters in 5 ml DMF und gibt 300 mg 10% Palladium-auf-Aktivkohle (Pd-C) und 0,80 g Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung (98 mg HCl/g) zur Lösung. Die erhaltene Mischung wird 3 Stunden gerührt, während man Wasserstoffgas hindurchgibt Danach wird das Pd-C durch Filtrieren entfernt, Zum Filtrat gibt man 100 ml wasserfreien Diäthyläther und sammelt das auf diese Weise ausgefällte weiße Pulver, wobei man 440 mg (Ausbeute 93%) L-Phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-dihydrochlorid mit Schmelzpunkt 113 bis 118° C (Zers.) erhält
-1:3650,1750,1650.
Das als Ausgangsmaterial verwendete NG,NG-pibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l -naphthylester-triflüorace- - tat wird folgendermaßen hergestellt:
Man löst 9,1 g Να-4-Methoxybenzyloxycarbonyl-NGJ>JG-dibenzyioxycarbonyl-L-arginin (vgL Z. Naturf. 20b, 429 (1965) F. Weygand, E. Nintz) in 30 ml wasserfreiem Pyridin und gibt 7,9 g Ι,Γ-Dinaphthylsulfit zu. Die erhaltene Mischung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Man gibt zur Reaktionsmischung Äthylacetat zu und wäscht die Mischung mit
230241/306
9 10
lO°/oiger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbi- zum Rückstand zu und rührt die erhaltene Mischung,
carbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in wobei man 200 mg (Ausbeute 53%) N-Benzoyl-L-phe-
dieser Reihenfolge, trocknet über wasserfreiem Magne- nylalanyl-L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-hydrochlo-
siumsulfat und dampft dann unter vermindertem Druck rid in Form eines weißen Pulvers mit Schmelzpunkt 75
zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit wasserfreiem 5 bis 85° C (Zers.) erhält. Diäthyläther gewaschen, wobei man 9,0 g (Ausbeute
82%) Nflc-4-Methoxybenzyloxycarbonyl-NG,NG-diben- IRv**cm-':3200,1750,1640. zyloxycarbonyl-L-arginin-1-naphthylester in Form einer blaßgelben viskosen öligen Substanz erhält. Das als Ausgangsmaterial eingesetzte N-Benzoyl-L-
i ο phenylalanyl-L-valin wurde wie folgt hergestellt:
IRv^cm-':3400,1760,1720,1690. In 100ml Tetrahydrofuran (THF) werden 13,5g
N-Benzoyl-L-phenylalanin und 8,4 g L-Valinmethyl-
NMR ό ppm (CDCU): ester-hydrochlorid aufgelöst Danach gibt man unter
l,9(4H,m),3,7(3H,s),4,l(2H,m), Eiskühlen 13,8g DPPA und 14,0ml TEA zur Lösung.
4,8(lH,m),5,l(2Hx2,s),5,2(2H,s), 15 Die erhaltene Mischung wird bei Raumtemperatur 24
6,7—8,0(aromatischeProtonen). Stunden gerührt Die Reaktionsmischung wird dann
unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft
Zu 8,0 g des obigen Esters gibt man 15 ml und der Rückstand wird in Äthylacetat aufgelöst Man
Trifluoressigsäure und rührt die erhaltene Mischung 30 wäscht die Lösung mit 10%iger Zitronensäurelösung,
Minuten unter Eiskühlung. Nach der Reaktion dampft 20 gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter
man die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge, trocknet
ein, um die Trifluoressigsäure zu entfernen. Dann gibt über wasserfreiem Magnesiumsulfat und dampft dann
man wasserfreien Diäthyläther zum Rückstand zu, um unter vermindertem Druck' zur Trockne ein. Den
diesen aufzulösen. Anschließend läßt man die erhaltene Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat/n-Hexan
Lösung stehen. Die auf diese Weise ausgefallenen 25 um. Hierbei erhält man 73 g (Ausbeute 38%) N-Ben-
farblosen nadeiförmigen Kristalle werden gesammelt zoyl-L-phenylalanyl-L-valinmethylester in Form eines
Man erhält 4,5 g (Ausbeute 61%) NG,NG-Dibenzyloxy- weißen Pulvers mit Schmelzpunkt 160bis 163°C. carbonyl-L-arginin-l-naphthylester-trifluoracetat mit
Schmelzpunkt 149 bis 151°C. IRvm.icm-'^OO, 1730,1630.
IRÄm-':3400,1760,1720,1665. Man |öst 5,7 g des obigen Esters in 100 ml Methanol
und gibt dann zur Lösung 24 ml einer IN NaOH-Lö-
NMR <5 ppm (CDCl3+DMSO-de): sung. Die erhaltene Lösung wird 2 Stunden bei
2,1 (4H, m), 40 (2H m) 4,5 (IH ml Raumtemperatur gerührt Man konzentriert die Reak-
5,1(2Hs) 5,2(2H si, ' 35 ti°nsnuscnunS unter vermindertem Druck und gibt
71 KniärrJi^tiLt D ♦ \ destilliertes Wasser und Äthylacetat zum Rückstand.
7,1 -^aromatische Protonen). Die ^^ Mischung ^ dann geschüttdt Man
Beispiel 2 trennt die wäßrige Schicht ab und macht mit 10%iger
Herstellung von N-Benzoyl-L-phenylalanyl- Chlorwasserstoff säure schwach sauer. Die auf diese
L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-hydrochlorid 40 Weise ausgefaUte ο ige Substanz mit mit Athylacetat
r ' extrahiert Man wascht den Extrakt mit Wasser,
Man löst 368 mg N-Benzoyl-L-phenyl-L-alanylvalin trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und
und 682 mg NG.NG-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l- dampft dann unter vermindertem Druck ein, um das
naphthylester-trifluoracetat in 15 ml DMF und gibt Lösungsmittel zu entfernen. Man kristallisiert den
dann 268 mg DCC, 135 mg HOBt und 0,14 ml TEA zur 45 Rückstand aus Äthylacetat/n-Hexan um. Hierbei erhält
erhaltenen Lösung unter Eiskühlung zu. Die erhaltene man 3,0 g (Ausbeute 54%) N-Benzoyl-L-phenylalanyl-
Mischung wird bei derselben Temperatur 3 Stunden L-valin mit Schmelzpunkt 191° C.
gerührt und dann bei Raumtemperatur weitere 24
Stunden gerührt Die auf diese Weise ausgefallenen IRv^cm-':3350,1710,1630. Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt und aus 50
Chloroform umkristallisiert Hierbei erhält man 600 mg B e i s ρ i e 1 3
(Ausbeute 63%) des N-Benzoyi-L-phenyialanyl-L- w _, ., · . _ ~-_ ,.
valyl-NO^-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthyl- Messung der Aktivität von Thrombin
estersmitSchmelzpunktieabisiee-C * M_ unter Anwendung von
r N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-
IRv™cm-':3300,1745,1720,1630. * 1-naphthylester-hydrochlorid als Subsfrat
Zu 1,7 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gibt
Man suspendiert 0,5 g des obigen Esters in 10 ml man 0,1 ml einer wäßrigen Thrombin-Lösung in
DMF und gibt dann 200 mg 10% Pd-C und 1,0 g unterschiedlichen Konzentrationen (0,025, 0,05, 0,075
Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung (110 mg HCl/g) 60 und 0,1 internationale Einheiten von Thrombin in 0,1 ml)
zu. Die erhaltene Mischung wird bei Raumtemperatur 2 und 0,2 ml N-Benzoyi-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-
Stunden gerührt, während man Wasserstoffgas durch- l-naphthylester-hydrochloridlösung (1,5 mM) zu und
leitet Die Reaktionsmischung wird filtriert, um das Pd-C inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 25" Q
zu entfernen, und 40 ml wasserfreier Diäthyläther Man kühlt die Mischung in Eiswasser ab und gibt 0,1 ml
werden zum Filtrat zugesetzt Die erhaltene Mischung 65 1% FVB zu. Die erhaltene Mischung läßt man 10
wird 24 Stunden lang in Eiswasser stehengelassen. Die Minuten bei 0° C stehen und gibt dann noch 1 ml Eisessig
überstehende Flüssigkeit wird durch Dekantieren zu. Die auf diese Weise entwickelte Farbe wird als
entfernt, dann gibt man 40 ml wasserfreien Diäthyläther Extinktion (505 nm) mit Hilfe eines Spektrophotome-
ters gemessen. Hierdurch wird die Menge an freigesetztem Naphthol, das durch Hydrolyse mit dem Enzym entstanden ist, bestimmt. Als Kontrolle verwendet man dieselbe Pufferlösung wie zuvor, die jedoch kein Thrombin enthält. Die Menge an freigesetztem Naphthol entspricht der Enzym-Aktivität.
Die gleiche Arbeitsweise wurde auch unter Anwendung von L-Phe-L-Val-L-Arg-l-naphtylester-2HCl als Substrat durchgeführt
D'e Ergebnisse der Extinktionsmessungen bei jeder Thrombinkonzentration nach der vorstehenden Methode sind in der Zeichnung angegeben.
Vergleichsbeispiel 1 Messung der Aktivität von Thrombin
unter Verwendung von N^-Tosyl-L-argininmethyl ester-hydrochlorid als Substrat
Zu 0,1 ml einer wässerigen Thrombin-Lösung in unterschiedlichen Konzentrationen (0,025, 0,05, 0,075 und 0,1 internationale Einheiten von Thrombin in 0,1 ml) gibt man 03 ml NÄ-Tosyl-L-argininmethylester-hydrochloridlösung (10 Mikromol/0,4 ml 5% DMSO) und 0,6 ml Phosphatpufferlöfung (pH 7,4) und inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37° C. Danach gibt man 1,5 ml einer Hydroxylaminlösung (Mischung gleicher Mengen an 2 M NH^H-Hydrochlorid und 3,5 M NaOH) zu. Man läßt die erhaltene Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man 1 ml 18°/oige Trichloressigsäurelösung, 1 ml 4 N Chlorwasserstoffsäure und 1 ml 10%ige Eisen-III-Choridlösung zu. Die erhaltene Mischung wird gründlich gerührt und dann 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert Die auf diese Weise entwickelte Farbe der überstehenden Flüssigkeit wird als Extinktion (530 nm) mit Hilfe eines Spektrophotometers gemessen. Der erhaltene Wert entspricht der Menge an Substrat, das durch das Thrombin nicht hydrolysiert wurde. Somit entspricht die Enzym-Aktivität dem Unterschied zwischen dem ohne Verwendung des Enzyms erhaltenen Wert (Kontrolle) und dem nach der Enzyrnreaktion erhaltenen Wert.
Vergleichsbeispiel 2 Messung der Aktivität von Thrombin
unter Verwendung von N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid-hydrochlorid.
Zu 2,15 ml 0,1 μΜ tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gibt ίο man 0,1 ml einer wässerigen Thrombin-Lösung in unterschiedlichen Konzentrationen (0,025, 0,05, 0,075 und 0,1 internationale Einheiten von Thrombin in 0,1 ml) und 0,25 ml N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid-hydrochloridlösung als 1 millimolare wässerige Lösung zu und inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37°C. Zur Mischung gibt man 03 ml Eisessig und mißt die entwickelte Farbe als Extinktion (405 nm) mit Hilfe eines Spektrophotometers.
Die Ergebnisse der Messungen im Beispiel 3, im Vergleichsbeispiel 1 und im Vergleichsbeispiel 2 sind in der Zeichnung dargestellt Es ist zu ersehen, daß die Methode gemäß Beispiel 3 (N-Benzoyl-Verbindung) eine Bestimmungsempfindlichkeit aufweist, die ungefähr 30mal größer als die des Vergleichsbeispiels 2 und ungefähr 5mal größer als die des Vergleichsbeispiels 1 ist.
In der Zeichnung betrifft die Kurve A eine Standardkurve, die im Beispiel 3 erhalten wurde, Kurve B betrifft eine im Vergleichsbeispiel 1 erhaltene Standardkurve, und Kurve Cbetrifft eine im Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Kurve. Die Zahlen in Klammern auf der Abszisse geben die Enzymkonzentrationen für die Kurve B an. Die Kurve D betrifft das L-Phe-L-VaI-L-Arg-1 -naphthylester-HCl (analog Beispiel 3 hergestellt). Tabelle I zeigt die relative Empfindlichkeit bei Messung der Aktivität einiger der Enzyme nach den Methoden des Beispiels 3 und des Vergleichsbeispiels 2.
Tabelle I
Enzym Substrat
Thrombin Kallikrein Plasma Gewebe Faktor Xa Urokinase N-Benzoyl-L-phenyl- 5,0 12,5 30 15 40
alanyl-L-valyl-L-argi-
nin-1-naphthylester
N-Benzoyl-L-phenyl- 1.0 1,0 1.0 1,0 1,0
alanyl-L-valyl-L-argi-
nin-p-nitroanilid
Vergleichsbeispiel 3
Messung der Reaktionsgeschwindigkeit des bekannten iX-N-Methyl-«-N-tosyl-L-lvsin-^-naphthylesters (CA. 82,1975,12776), der als Verbindung 1 bezeichnet wird, und des erfindungsgemäßen Benzoyl-Phe-Val-Arg-1-Naphthylesters (Verbindung 2) bei der Bestimmung von drei verschiedenen Enzymen. Wie Tabelle II zeigt, sind die mit der erfindungsgemäßen Verbindung 2 erhaltenen Reaktionsgeschwindigkeiten wesentlich höher als die der bekannten Verbindung 1.
Tabelle Π Thrombin 10"3 Kallikrein Plasmin
Verbindung (1) Mx 10"3 1,1XlO"4 UXiO"2
Verbindung (2) 9,5 x μ
μ
μ 		2,4XlO"2 2,3XlO"2
Einheiten: Thrombin
Kallikrein
Plasmin 		mol/min/IU
mol/min/KU
mol/min/CU 		bei 25°C
bei 250C
bei 25°C
Mit den erfindungsgemäßen Verbindungen werden also überraschenderweise wesentlich höhere Reaktionsgeschwindigkeiten erhalten, wodurch sich auch sehr kleine Enzym-Aktivitäten zuverlässig und leicht bestimmen lassen.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

1 "■■ 2
Patentansprüche:
1. IvPhenylalanyl- sowie N-Benzoyl-L·phenylalanyl-L·va!yl-L·aΓginin-naphthylester der allgemeinen Formel I:
R1-NH CONH CONH COO
woi in
R1 für Wasserstoff oder Benzoyl steht.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise
A) ein L·Phenylalanyl-L·valinderivat der allgemeinen Formel II:
CH3
CH2 CHCH3 (Π)
Λ Λ
R3NH CONH COOH
in der R3 Benzoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, mit einem I^Argininnaphthylester der allgemeinen Formel III:
(ΠΙ)
in der R4 eine Aminoschutzgruppe bedeutet, kondensiert und B) aus der Verbindung der allgemeinen Formel IV
NH /. CH3
CHCH3 (CHj)3 "n R( (IV)
R3-NH CONH CONH COO
jg; in der R3 und R4 die genannten Bedeutungen besitzen, die Aminoschutzgruppe(n) abspaltet.
3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Substrat zur Bestimmung der Aktivität von Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Esterase, Thrombin und Faktor Xa.
DE2943580A 1978-10-30 1979-10-29 L-Phenylalanyl-sowie N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-naphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung Expired DE2943580C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP13339578A JPS5559150A (en) 1978-10-30 1978-10-30 Aminoacid derivative

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2943580A1 DE2943580A1 (de) 1980-05-14
DE2943580C2 true DE2943580C2 (de) 1982-10-14

Family

ID=15103739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2943580A Expired DE2943580C2 (de) 1978-10-30 1979-10-29 L-Phenylalanyl-sowie N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-naphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4308201A (de)
JP (1) JPS5559150A (de)
DE (1) DE2943580C2 (de)
FR (1) FR2440358A1 (de)
GB (1) GB2034325B (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1982000641A1 (en) * 1980-08-25 1982-03-04 Ab Kabivitrum Peptide substrates for determination of protease activity
JPS5753445A (en) * 1980-09-16 1982-03-30 Torii Yakuhin Kk Peptide compound
US4568636A (en) * 1981-03-25 1986-02-04 Pentapharm Ag Tripeptide derivatives
US4428874A (en) 1981-03-25 1984-01-31 Pentapharm A.G. Tripeptide derivatives
US4434096A (en) 1981-06-30 1984-02-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes
JPS5925699A (ja) * 1982-08-03 1984-02-09 Torii Yakuhin Kk 酵素活性測定方法
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE380258B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trypsin och andra enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser

Also Published As

Publication number Publication date
FR2440358B1 (de) 1983-11-10
US4308201A (en) 1981-12-29
DE2943580A1 (de) 1980-05-14
JPS5559150A (en) 1980-05-02
JPS6126918B2 (de) 1986-06-23
GB2034325B (en) 1982-12-15
GB2034325A (en) 1980-06-04
FR2440358A1 (fr) 1980-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1538160B1 (de) Substituierte Isochinolin-3-Carbonsäureamide, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
DE3348172C2 (de)
DE2552570B2 (de) Tri- und Tetrapeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Serinproteasen
EP0157384B1 (de) Substrate für Hydrolasen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
DE2920292A1 (de) L- gamma -glutamyl-3-carboxy-4-hydroxyanilid und dessen salze, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung zur bestimmung der aktivitaet von gamma -glutamyltranspeptidase
DE2919545C3 (de) L-Leucin-4-hydroxyanilid-derivate, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität von Leucinaminopeptidase
DE2943580C2 (de) L-Phenylalanyl-sowie N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-naphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
DE2649171A1 (de) Neue dipeptidderivate und deren salze, sowie verfahren zur messung der enzymaktivitaet unter verwendung dieser dipeptidderivate
DE2808111A1 (de) Neue dipeptidderivate und deren verwendung zur messung der enzymatischen aktivitaet
DE2943581C2 (de) D-oder L-Valyl-L-leucyl-L-lysinnaphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
EP0052870A1 (de) Aminosäurederivate und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE3136508C2 (de) L-Phenylalanyl-L-argininderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
DE2932381A1 (de) Peptid-derivate des 7-amino-4methylcumarins
DE2840636C2 (de)
DE3586999T2 (de) Verfahren zur bestimmung von leucinaminopeptidase (lap).
DE2943582C2 (de) L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-argininderivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
EP0285000A2 (de) Chromogene Verbindungen, ihre Herstellung und Verwendung als Enzymsubstrate
DE3034618C2 (de) Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Angiotensin-konvertierenden Enzyms
EP1551864B1 (de) Substrate zur Bestimmung von TAFI(a)
DE3136511C2 (de) L-Leucyl-L-alanyl-L-argininderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
EP0465998B1 (de) Neue Beta-Galactosidase-Substrate für den CEDIA
DE3329394A1 (de) Chromogene und fluorogene carbonsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur bestimmung von hydrolasen
DD155954A1 (de) Verfahren zur herstellung von n tief alpha aryl-bzw.n tief alpha heteroarylsulfonylaminoacylierten amidinophenylalaninamiden
DE3685724T2 (de) Synthetisches peptid-substrat fuer die bestimmung von trypsin und alpha-1-antitrypsin.
DE3415636A1 (de) Verfahren zur selektiven bestimmung der aktivitaet von kathepsin-b und peptidsubstrate

Legal Events

Date Code Title Description
OAP Request for examination filed
OD Request for examination
D2 Grant after examination
8339 Ceased/non-payment of the annual fee